CN111333643B - 一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针 - Google Patents

一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针 Download PDF

Info

Publication number
CN111333643B
CN111333643B CN201811550629.8A CN201811550629A CN111333643B CN 111333643 B CN111333643 B CN 111333643B CN 201811550629 A CN201811550629 A CN 201811550629A CN 111333643 B CN111333643 B CN 111333643B
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
fluorescent probe
light stability
nuclear
brightness
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811550629.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111333643A (zh
Inventor
徐兆超
乔庆龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Original Assignee
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian Institute of Chemical Physics of CAS filed Critical Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority to CN201811550629.8A priority Critical patent/CN111333643B/zh
Publication of CN111333643A publication Critical patent/CN111333643A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111333643B publication Critical patent/CN111333643B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B57/00—Other synthetic dyes of known constitution
    • C09B57/08—Naphthalimide dyes; Phthalimide dyes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/06—Peri-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N21/643—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" non-biological material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
    • C09K2211/1033—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom with oxygen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1044—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing two nitrogen atoms as heteroatoms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供了一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针，一类可用于细胞核荧光成像的萘酰亚胺类探针，该荧光探针具有合成原料低廉、方法简单且易于衍生等优点。研究发现，该探针在萘酰亚胺母体的4‑,5‑位引入的环己二胺结构使分子有很强的刚性，可以有效地抑制非辐射跃迁过程，此类染料在乙醇中的摩尔消光系数达到46443M‑1cm‑1，量子产率达到0.73，有很高的亮度和光稳定性；该探针结构有很强的刚性，有明显的共振型染料环境不敏感的特性；此外，该探针有很好的刚性和平面性，可以***细胞核中的核酸链中，且该探针有合适的脂溶性，能够快速透过细胞膜，因而可以实现对细胞核快速、精准的定位，能够快速标记细胞核并利用于细胞核荧光成像等领域。

Description

一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针
技术领域
本发明属于荧光成像技术领域，具体涉及一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针。
背景技术
由于细胞核在遗传物质转录的重要性，细胞核的标记在生物学以及多种病理研究中至关重要。随着对细胞核的研究的不断深入，研究者们对细胞核荧光染料的性质与功能要求也不断提高，尤其超分辨荧光成像技术的迅速崛起促使新型的高稳定性、高亮度细胞核荧光染料的开发与应用。
目前常用的细胞核荧光染料包括有：(1)SYTO/POPO系列等(基于花菁染料)，此类标记试剂能够***DNA双链，可用可见光激发，荧光亮度高；但是此类荧光标记染料带有正电荷，无法精准标记细胞核，光稳定极差。(2)最为普遍的细胞核染料DAPI、Hoechst系列激发波长为紫外光360nm，对细胞损害大，最合适激发光无法与荧光成像技术的激光匹配(通常最短波长为405nm激光器)。此外，此类细胞核染料荧光发射光谱宽(容易发生串色)，细胞透膜性差，染色时间长(通常30分钟以上)，在活细胞染色实验中受到严格限制。以上细胞核荧光染料均很难满足超分辨技术对荧光稳定性、荧光亮度、长时间染色等性能的需求，因而开发高亮度、高稳定性、能快速标记细胞核的荧光染料迫在眉睫。
发明内容
本发明开提供了一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针，一类萘酰亚胺类荧光探针，该探针在萘酰亚胺母体的4-,5-位引入环己二胺结构，同时增加了染料的刚性和平面性；引入碱性的吗啉环作为细胞核靶向基团。研究发现这类染料有很高的亮度、优异的光稳定性，能够快速透过细胞并高选择性地标记于细胞核中，可进一步用于荧光成像。该染料还具有环境不敏感性，在不同环境中的光谱性质差异极小，有很好的成像准确性。
本发明一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针，其结构式如下所示：
Figure BDA0001910544810000021
一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针的合成方法，合成步骤如下：
Figure BDA0001910544810000022
具体合成步骤如下：
步骤一：中间体N-(2-吗啉)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(Lyso-NBr)的合成
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐溶于10-40mL乙醇中，并向其中滴加N-(2-胺乙基)吗啉，升温至50-70℃下反应1-10h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得到中间体N-(2-吗啉)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺。
步骤二：细胞核探针Nu-DAC的合成
将中间体N-(2-吗啉)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺，将反应液缓慢加热至60-90℃，并反应10-24h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物得到细胞核探针Nu-DAC。
步骤一中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与N-(2-胺乙基)吗啉的质量比为1:0.3-6，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与乙醇的质量与体积比为1:5-80g/mL。
步骤二中，N-(2-吗啉)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺与1,2-环己二胺的质量比为1:0.3-30，N-(2-吗啉)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为1:5-200g/mL。
上述细胞核荧光探针在活细胞及活体内能够对细胞核进行特异性标记并实现荧光成像。
一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针在荧光成像、分子探针及荧光传感领域的应用。
本发明具有以下特征：
该探针拥有合成原料低价、方法简单且易于衍生等优点。
该探针在萘酰亚胺母体的4-,5-位引入的环己二胺结构使分子有很强的刚性，可以有效地抑制非辐射跃迁过程，此类染料在乙醇中的摩尔消光系数达到46443M-1cm-1，量子产率达到0.73，有很高的亮度和光稳定性。
该探针结构有很强的刚性，有明显的共振型染料环境不敏感的特性。
该探针有很好的刚性和平面性，可以***细胞核中的核酸链中，且该探针有合适的脂溶性，能够快速透过细胞膜，因而可以实现对细胞核快速、精准的定位，可应用于细胞核与其他细胞器相互作用研究、细胞凋亡等研究中。
附图说明
图1为实施例1中制备的细胞核探针Nu-DAC的核磁氢谱；
图2为实施例1中制备的细胞核探针Nu-DAC的高分辨质谱；
图3为实施例1制备的细胞核探针Nu-DAC在乙醇中归一化荧光激发与发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化的荧光强度与吸收强度，荧光探针的浓度为10μM；
图4为实施例1制备的细胞核探针Nu-DAC与商业染料荧光素在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4)中，经过不同时间激光照射后后其最大荧光发射强度的变化，横坐标为激光照射时间，纵坐标为相对荧光强度，即最大荧光发射强度与初始最大荧光发射强度的比值；
图5为实施例1中制备的细胞核染料Nu-DAC在不同溶剂中的归一化紫外吸收谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化紫外吸收强度，荧光探针的浓度为10μM；
图6为实施例1中制备的细胞核染料Nu-DAC在不同溶剂中的归一化荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化荧光发射强度，荧光探针的浓度为10μM；
图7为实施例1制备的细胞核染料Nu-DAC在不同细胞系中(CHO中国仓鼠卵巢细胞、HT29人结肠癌细胞、HeLa***细胞、MCF-7乳腺癌细胞、C3A人肝癌细胞、PC3***癌细胞)荧光成像图；
图8为实施例1制备的细胞核染料Nu-DAC与商业细胞核荧光染料(Hoechst33342)在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中实时染色成像图。
具体实施方式
实施例1
细胞核染料Nu-DAC的合成方法。
中间体N-(2-吗啉)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(Lyso-NBr)的合成：
Figure BDA0001910544810000041
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于40mL乙醇中，并向其中滴加N-(2-胺乙基)吗啉(609mg，4.68mmol)，升温至70℃下反应3h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝80/1，V/V)分离得Lyso-NBr，为土黄色固体0.12g，产率55％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.8Hz,1H),8.52(d,J＝7.9Hz,1H),8.22(d,J＝7.9Hz,1H),7.93(d,J＝7.8Hz,1H),4.33(t,J＝6.6Hz,2H),3.71–3.57(m,4H),2.70(t,J＝6.5Hz,2H),2.57(s,4H).
其核磁谱图碳谱数据如下：
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ162.85,162.08,151.34,136.00,132.36,131.25,130.63,125.73,124.22,123.57,122.44,121.29,67.02,55.94,53.81,37.66.
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：434.0352，实验值：434.0386。
经检测，其结构如上式Lyso-NBr所示。
细胞核染料Nu-DAC的合成：
Figure BDA0001910544810000051
将Lyso-NBr(100mg，0.23mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺(300mg,0.69mmol)。将反应液缓慢加热至90℃反应18h后，减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)，得黄色固体48mg，产率50％。
其核磁谱图氢谱如下如图1所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.6Hz,2H),7.52(s,2H),6.83(d,J＝8.7Hz,2H),4.10(t,J＝7.0Hz,2H),3.62–3.51(m,4H),3.15(d,J＝9.2Hz,2H),2.45(s,4H),2.19(d,J＝11.9Hz,2H),1.73(d,J＝7.1Hz,2H),1.44–1.20(m,4H).
其核磁谱图碳谱数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.39,154.58,134.78,133.35,110.59,107.75,106.45,66.66,59.50,56.42,53.89,36.50,32.08,23.64.
其高分辨质谱谱图如下如图2所示，具体数据如下：
HRMS(ESI):m/z:[M+H]+:计算值：421.2240,实际值：421.2240.
经检测，其结构如上式Nu-DAC所示，在乙醇中的摩尔消光系数达到46443M-1cm-1，量子产率达到0.73，有很高的亮度和光稳定性，能够准确定位活细胞细胞核。
将待测染料分别溶解于二甲基亚砜溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，检测其荧光光谱变化及细胞内细胞核荧光成像。
Nu-DAC在乙醇中的光谱测试。取20μLNu-DAC母液，加入4mL乙醇中，配制成10μM的荧光探针测试液，并进行紫外和荧光光谱的测试。
Nu-DAC在乙醇中的吸收光谱和荧光光谱如图3所示；荧光染料浓度为10μM，经检测，Nu-DAC在乙醇中摩尔消光系数达46443M-1cm-1，量子产率达到0.73，该探针具有很高的亮度。
Nu-DAC与MitoTracker Green、荧光素和BODIPY光稳定性对比实验。将荧光素溶于0.1mmol/L的NaOH溶液中，Nu-DAC、MitoTracker Green和BODIPY溶于Hepes缓冲液中配置成浓度为10μM的测试样品。将待测溶液置于1×1×3cm的石英比色皿中，用500W钨灯作为光源进行光照。前两个h每隔半个h对样品进行紫外-可见光谱测试和荧光光谱测试，此后每隔一个h测试一次，跟踪样品荧光强度的变化情况。
Nu-DAC的光稳定性测试结果如图4所示，荧光探针浓度均为10μM，为Nu-DAC与一些商业染料在不同时间激光照射后，最大荧光发射强度与初始最大荧光发射强度的比值。在连续照射10h后，MitoTracker Green和BODIPY的荧光强度分别降至起始值得40％、60％和65％，而Nu-DAC的荧光强度基本保持不变，说明Nu-DAC相对于常见商业染料具有更好的稳定性。
Nu-DAC在不同溶剂(乙腈、二甲基亚砜、乙醇、水)中的紫外吸收光谱测试。每次取20μLNu-DAC母液，分别加入4mL待测溶剂中，配制成10μM的荧光探针测试液，并进行吸收光谱的测试。
在不同溶剂(乙腈、二甲基亚砜、乙醇、水)中归一化紫外吸收光谱谱图如图5所示，其中荧光探针浓度为10μM；在极性差异很大的溶剂中，Nu-DAC的紫外吸收波长和强度均无明显变化，证明Nu-DAC为环境不敏感染料。
Nu-DAC在不同溶剂(乙腈、二甲基亚砜、乙醇、水)中的荧光发射光谱测试。每次取20μLNu-DAC母液，分别加入4mL待测溶剂中，配制成10μM的荧光探针测试液，并进行荧光光谱的测试。
在不同溶剂(乙腈、二甲基亚砜、乙醇、水)中归一化荧光发射光谱谱图如图6所示，其中荧光探针浓度为10μM；在极性差异很大的溶剂中，Nu-DAC的发射波长和强度均无明显变化，证明Nu-DAC为环境不敏感染料。
实施例2
细胞核染料Nu-DAC的合成方法。
中间体N-(2-吗啉)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(Lyso-NBr)的合成：
Figure BDA0001910544810000071
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于40mL乙醇中，并向其中滴加N-(2-胺乙基)吗啉(0.15g，0.96mmol)，升温至50℃下反应8h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝80/1，V/V)分离得Lyso-NBr，为土黄色固体0.10g，产率85％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.8Hz,1H),8.52(d,J＝7.9Hz,1H),8.22(d,J＝7.9Hz,1H),7.93(d,J＝7.8Hz,1H),4.33(t,J＝6.6Hz,2H),3.71–3.57(m,4H),2.70(t,J＝6.5Hz,2H),2.57(s,4H).
其核磁谱图碳谱数据如下：
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ162.85,162.08,151.34,136.00,132.36,131.25,130.63,125.73,124.22,123.57,122.44,121.29,67.02,55.94,53.81,37.66.
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：434.0352，实验值：434.0386。
经检测，其结构如上式Lyso-NBr所示。
细胞核染料Nu-DAC的合成：
Figure BDA0001910544810000081
将Lyso-NBr(100mg，0.23mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺(3g,6.9mmol)。将反应液缓慢加热至90℃反应18h后，减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)，得黄色固体60mg，产率73％。
其核磁谱图氢谱如下如图1所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.6Hz,2H),7.52(s,2H),6.83(d,J＝8.7Hz,2H),4.10(t,J＝7.0Hz,2H),3.62–3.51(m,4H),3.15(d,J＝9.2Hz,2H),2.45(s,4H),2.19(d,J＝11.9Hz,2H),1.73(d,J＝7.1Hz,2H),1.44–1.20(m,4H).
其核磁谱图碳谱数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.39,154.58,134.78,133.35,110.59,107.75,106.45,66.66,59.50,56.42,53.89,36.50,32.08,23.64.
其高分辨质谱谱图如下如图2所示，具体数据如下：
HRMS(ESI):m/z:[M+H]+:计算值：421.2240,实际值：421.2240.
经检测，其结构如上式Nu-DAC所示，在乙醇中的摩尔消光系数达到46443M-1cm-1，量子产率达到0.73，有很高的亮度和光稳定性，能够准确定位活细胞细胞核。
实施例3
细胞核染料Nu-DAC的合成方法。
中间体N-(2-吗啉)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(Lyso-NBr)的合成：
Figure BDA0001910544810000091
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于40mL乙醇中，并向其中滴加N-(2-胺乙基)吗啉(3.0g，23.4mmol)，升温至70℃下反应5h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝80/1，V/V)分离得Lyso-NBr，为土黄色固体0.07g，产率72％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.8Hz,1H),8.52(d,J＝7.9Hz,1H),8.22(d,J＝7.9Hz,1H),7.93(d,J＝7.8Hz,1H),4.33(t,J＝6.6Hz,2H),3.71–3.57(m,4H),2.70(t,J＝6.5Hz,2H),2.57(s,4H).
其核磁谱图碳谱数据如下：
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ162.85,162.08,151.34,136.00,132.36,131.25,130.63,125.73,124.22,123.57,122.44,121.29,67.02,55.94,53.81,37.66.
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：434.0352，实验值：434.0386。
经检测，其结构如上式Lyso-NBr所示。
细胞核染料Nu-DAC的合成：
Figure BDA0001910544810000101
将Lyso-NBr(100mg，0.23mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺(30mg,0.08mmol)。将反应液缓慢加热至60℃反应18h后，减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)，得黄色固体26mg，产率36％。
其核磁谱图氢谱如下如图1所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.6Hz,2H),7.52(s,2H),6.83(d,J＝8.7Hz,2H),4.10(t,J＝7.0Hz,2H),3.62–3.51(m,4H),3.15(d,J＝9.2Hz,2H),2.45(s,4H),2.19(d,J＝11.9Hz,2H),1.73(d,J＝7.1Hz,2H),1.44–1.20(m,4H).
其核磁谱图碳谱数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.39,154.58,134.78,133.35,110.59,107.75,106.45,66.66,59.50,56.42,53.89,36.50,32.08,23.64.
其高分辨质谱谱图如下如图2所示，具体数据如下：
HRMS(ESI):m/z:[M+H]+:计算值：421.2240,实际值：421.2240.
经检测，其结构如上式Nu-DAC所示，在乙醇中的摩尔消光系数达到46443M-1cm-1，量子产率达到0.73，有很高的亮度和光稳定性，能够准确定位活细胞细胞核。
将该类染料分别溶解于DMSO溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，检测其荧光光谱变化及细胞、活体内细胞核荧光成像。
实施例4
Nu-DAC对不同细胞系(CHO中国仓鼠卵巢细胞、HT29人结肠癌细胞、HeLa***细胞、MCF-7乳腺癌细胞、C3A人肝癌细胞、PC3***癌细胞)染色后荧光成像检测。取1μLNu-DAC母液溶于2mL细胞培养液中，37℃，5％CO2下孵育15分钟后分别进行荧光共聚焦成像。
Nu-DAC终浓度为2μM的不同细胞系(CHO中国仓鼠卵巢细胞、HT29人结肠癌细胞、HeLa***细胞、MCF-7乳腺癌细胞、C3A人肝癌细胞、PC3***癌细胞)的细胞培养液孵育10分钟后共聚焦荧光成像如图7所示：不同细胞系细胞核均能够被Nu-DAC染色，呈现绿色荧光。即Nu-DAC在不同细胞系中均能对细胞核进行特异标记，且具有高的信噪比。
Nu-DAC与商业细胞核荧光染料(Hoechst33342)在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中实时染色成像检测。取0.5μLNu-DAC母液、1μLHoechst33342母液分别溶于2mL CHO培养基中，在孵育0、1、2、3分钟后分别进行荧光共聚焦成像。
Nu-DAC、商业染料Hoechst33342终浓度为2μM的CHO细胞孵育0、1、2、3分钟后共聚焦荧光成像如图8所示；Nu-DAC在1分钟时，细胞核内就有荧光信号产生，在3分钟内便能够对CHO细胞内细胞核进行特异性染色；而商业染料Hoechst33342在3分钟并未反映出明显荧光信号，未对细胞核进行有效染色。证明Nu-DAC具有较高的细胞渗透性，能够对细胞核进行快速染色，染色速率远高于目前常用商业细胞核荧光染料。

Claims (5)

1.一种高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针，其特征在于：其结构式如下所示，
Figure FDA0003220930180000011
2.如权利要求1所述的高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针的合成方法，其特征在于：该合成的具体方法如下：
步骤一：中间体
Figure FDA0003220930180000012
的合成
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐溶于10-40mL乙醇中，并向其中滴加N-(2-胺乙基)吗啉，升温至50-70℃下反应1-10h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得到中间体
Figure FDA0003220930180000013
步骤二：细胞核荧光 探针的合成
将中间体
Figure FDA0003220930180000014
溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺，将反应液缓慢加热至60-90℃，并反应10-24h， 减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物得到细胞核荧光 探针。
3.如权利要求2中所述的高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤一中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与N-(2-胺乙基)吗啉的质量比为1:0.3-6，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与乙醇的质量与体积比为1:5-80g/mL。
4.如权利要求2中所述高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤二中，
Figure FDA0003220930180000021
与1,2-环己二胺的质量比为1:0.3-30，
Figure FDA0003220930180000022
的质量与乙二醇甲醚的体积比为1:5-200g/mL。
5.如权利要求1所述的高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针在荧光成像、分子探针及荧光传感领域的应用。
CN201811550629.8A 2018-12-18 2018-12-18 一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针 Active CN111333643B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811550629.8A CN111333643B (zh) 2018-12-18 2018-12-18 一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811550629.8A CN111333643B (zh) 2018-12-18 2018-12-18 一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111333643A CN111333643A (zh) 2020-06-26
CN111333643B true CN111333643B (zh) 2021-11-09

Family

ID=71179456

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811550629.8A Active CN111333643B (zh) 2018-12-18 2018-12-18 一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111333643B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104804725A (zh) * 2014-01-28 2015-07-29 中国科学院大连化学物理研究所 一种检测溶酶体中h2s的荧光探针、其合成方法及应用
CN106008342A (zh) * 2016-05-20 2016-10-12 济南大学 一种检测细胞溶酶体内甲醛的荧光探针及其制备方法
CN107603269A (zh) * 2016-07-11 2018-01-19 华东理工大学 一类基于萘酰亚胺的荧光染料、其制备方法及应用
CN108610289A (zh) * 2018-04-23 2018-10-02 李新元 一种快速高选择性超灵敏次溴酸荧光探针
CN108774171A (zh) * 2018-07-24 2018-11-09 姜懿珊 一种实时灵敏检测次氯酸荧光探针的制备与应用
CN108949161A (zh) * 2018-09-28 2018-12-07 台州学院 一种用于检测次溴酸的比率型荧光探针化合物及其用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104804725A (zh) * 2014-01-28 2015-07-29 中国科学院大连化学物理研究所 一种检测溶酶体中h2s的荧光探针、其合成方法及应用
CN106008342A (zh) * 2016-05-20 2016-10-12 济南大学 一种检测细胞溶酶体内甲醛的荧光探针及其制备方法
CN107603269A (zh) * 2016-07-11 2018-01-19 华东理工大学 一类基于萘酰亚胺的荧光染料、其制备方法及应用
CN108610289A (zh) * 2018-04-23 2018-10-02 李新元 一种快速高选择性超灵敏次溴酸荧光探针
CN108774171A (zh) * 2018-07-24 2018-11-09 姜懿珊 一种实时灵敏检测次氯酸荧光探针的制备与应用
CN108949161A (zh) * 2018-09-28 2018-12-07 台州学院 一种用于检测次溴酸的比率型荧光探针化合物及其用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
萘酰亚胺类染料荧光构效关系研究及生物应用;乔庆龙;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士) 工程科技I辑》;20180915(第09期);B014-95 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111333643A (zh) 2020-06-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Li et al. An acid catalyzed reversible ring-opening/ring-closure reaction involving a cyano-rhodamine spirolactam
CN108069967B (zh) 一种用于细胞内蛋白标记的荧光探针及其合成方法和应用
CN104629754B (zh) 咔唑类比率型pH荧光探针及其制备方法和应用
Li et al. A near-infrared fluorescent probe for Cu2+ in living cells based on coordination effect
CN107286151B (zh) 一种基于咔唑的双光子荧光探针及其制备方法和用途
CN106543226A (zh) 一种定位线粒体的atp荧光探针的制备及应用
Ni et al. Convenient construction of fluorescent markers for lipid droplets with 1, 8-naphthalimide unit
CN111334081B (zh) 一类高亮度、脂滴细胞核多色成像荧光探针
CN114149441B (zh) 一种氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物及其制备和应用
CN103710021B (zh) 以硝基苯并咪唑为rna识别基团的荧光染料、其制备方法及应用
WO2020108479A1 (en) Probes for selective thiol detection
CN104650610A (zh) 一种不对称近红外bodipy荧光染料及其制备和应用
CN111333642A (zh) 一类高亮度、高稳定性、环境不敏感的细胞膜荧光探针
CN111333643B (zh) 一类高亮度、高光稳定性、环境不敏感的细胞核荧光探针
CN114276356B (zh) 一种线粒体靶向的荧光探针及其合成方法和应用
CN114702447B (zh) 一种萘酰亚胺衍生物及其制备方法与应用
CN109280017A (zh) 一种双光子荧光高尔基体定位剂及其制备方法和应用
CN102516793B (zh) 一类双苄基五甲川菁荧光染料、其制备方法及应用
CN111334076B (zh) 一类高亮度、高光稳定性的细胞核荧光探针
CN111334080B (zh) 一种高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶荧光探针
CN111333574B (zh) 一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针
Yin et al. Preparation, regulation and biological application of a Schiff base fluorescence probe
CN111334074A (zh) 一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料
CN110776458A (zh) 一种检测线粒体膜电位的荧光探针及其制备方法和应用
CN111334084B (zh) 一种高亮度、高稳定性、高渗透性线粒体荧光染料

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant