CN111330089B - 一种用作骨修复的全降解磁修复水凝胶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用作骨修复的全降解磁修复水凝胶的制备方法，包括以下步骤：步骤1：制备含铁离子、钙离子和多巴胺的混合水溶液；步骤2：在气氛保护条件下搅拌均匀，在其中滴加磷酸盐溶液，充分反应即可得到多巴胺分散的纳米磁性羟基磷灰石颗粒；步骤3：将明胶溶于磷酸缓冲液中，充分溶解后加入甲基丙烯酸酐，充分反应后，透析冻干即可得到双键化明胶；步骤4：将纳米磁性羟基磷灰石颗粒加入到双键化明胶水溶液中，加入过硫酸钠，形成水凝胶预聚液；在水凝胶预聚液两侧施加磁场，即可聚合形成所需水凝胶；本发明制备方法简单，易于操作，得到的纳米颗粒粒径可控，能在磁场作用下在水凝胶内形成定向排列。

Description

一种用作骨修复的全降解磁修复水凝胶的制备方法
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种用作骨修复的全降解磁修复水凝胶的制备方法。
背景技术
由于创伤、感染、肿瘤切除等因素造成了人体的骨缺损的比例逐年增加，骨修复材料性能要求、需求大幅增加。近年来，水凝胶由于其高含水量，仿细胞外基质等优点被开发用作组织修复材料，特别是将具有骨诱导性的纳米材料引入水凝胶能够显著促进成骨修复。在众多纳米材料中，纳米羟基磷灰石作为天然骨中主要的无机盐成分，在生理条件下能与宿主骨整合并释放离子以促进成骨相关基因表达。基于仿生原理，理想的骨修复水凝胶不仅需要与骨相似的成分，纳米羟基磷灰石的定向结构也是极为重要的。在纳米羟基磷灰石表面组装磁性四氧化三铁并利用磁场带动磁性羟基磷灰石的定向是一种有效形成各向异性羟基磷灰石的方法。然而，纳米羟基磷灰石和纳米四氧化三铁都具有较高的表面能，易发生团聚现象，而且羟基磷灰石和四氧化三铁之间低的亲和力限制了其最终磁性羟基磷灰石的生成。此外，水凝胶基体还应该具有优异的力学性能，生物相容性和可降解性以满足植入的要求。因此，开发一种具有骨诱导性的全降解磁水凝胶依然是一个挑战。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题提供一种方法简单、易于操作、纳米颗粒粒径可控，能在磁场作用下在水凝胶内形成定向排列的用作骨修复的全降解磁修复水凝胶的制备方法。
本发明采用的技术方案是：
一种用作骨修复的全降解磁修复水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：制备含铁离子、钙离子和多巴胺的混合水溶液，混合水溶液中Fe2+：Fe3+的摩尔比为0.5～1；多巴胺和Fe2+的质量比为0.01～1；Ca2+：Fe2+的摩尔比为0～4；
步骤2：在气氛保护条件下搅拌均匀，在其中滴加磷酸盐溶液，充分反应即可得到多巴胺分散的纳米磁性羟基磷灰石颗粒；其中Ca2+和PO4 3-的摩尔比为1.5～2；
步骤3：将明胶溶于磷酸缓冲液中，充分溶解后加入甲基丙烯酸酐，充分反应后，透析冻干即可得到双键化明胶；其中甲基丙烯酸酐的添加量按照每1g明胶0.4～0.8mL添加；
步骤4：将步骤2得到的纳米磁性羟基磷灰石颗粒加入到步骤3得到的双键化明胶水溶液中，加入过硫酸钠，形成水凝胶预聚液；在水凝胶预聚液两侧平行施加磁场，磁场强度为10~50mt,即可聚合形成所需水凝胶；其中纳米磁性羟基磷灰石颗粒与双键化明胶的质量比为5～20%：1。
进一步的，所述步骤2反应过程中，维持溶液的pH＞10。
进一步的，所述步骤2中反应在80℃条件下进行，反应时间为60～120min。
进一步的，所述步骤2中通过滴加氢氧化钠或氨水维持溶液的pH值。
进一步的，所述磷酸盐溶液按照每秒2滴的速度滴加。
进一步的，所述步骤3中明胶溶于磷酸缓冲液过程中，在60℃水浴条件下搅拌30min溶解；加入甲基丙烯酸酐后在50℃水浴条件下搅拌30小时反应。
进一步的，所述步骤4中过硫酸钠和双键化明胶的质量比为1:10。
本发明的有益效果是：
（1）本发明制备方法简单、易于操作，得到的纳米颗粒粒径可控，能在磁场作用下在水凝胶内形成定向排列；
（2）本发明采用改性后的天然高分子作为水凝胶基体材料，具有良好的力学性能，生物相容性、力学性能及全降解性。
附图说明
图1本发明制备得到的磁性纳米羟基磷灰石的XRD图。
图2为本发明制备得到的磁性纳米羟基磷灰石的磁滞回线示意图。
图3为本发明制备得到的磁性纳米羟基磷灰石的SEM图。
图4为本发明制备得到的载有定向排列的磁性羟基磷灰石天然高分子水凝胶的SEM图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
一种用作骨修复的全降解磁修复水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：制备含铁离子、钙离子和多巴胺的混合水溶液，混合水溶液中Fe2+：Fe3+的摩尔比为0.5～1；多巴胺和Fe2+的质量比为0.01～1；Ca2+：Fe2+的摩尔比为0～4，其中铁离子为FeCl2·4H2O和FeCl3·6H20提供，钙离子为Ca(NO3)2·4H2O提供。
步骤2：在气氛保护条件下搅拌均匀，在其中滴加磷酸盐溶液，充分反应即可得到多巴胺分散的纳米磁性羟基磷灰石颗粒；其中Ca2+和PO4 3-的摩尔比为1.5～2；其中气氛为氮气，反应过程中，维持溶液的pH＞10，通过滴加氢氧化钠或氨水维持溶液的pH值。反应在80℃条件下进行，反应时间为60～120min。
步骤3：将明胶溶于磷酸缓冲液中，充分溶解后加入甲基丙烯酸酐，充分反应后，透析冻干即可得到双键化明胶；其中甲基丙烯酸酐的添加量按照每1g明胶0.4～0.8mL添加；
步骤4：将步骤2得到的纳米磁性羟基磷灰石颗粒加入到步骤3得到的双键化明胶水溶液中，加入过硫酸钠，形成水凝胶预聚液；在水凝胶预聚液两侧平行施加磁场，磁场强度为10~50mt,即可聚合形成所需水凝胶；其中纳米磁性羟基磷灰石颗粒与双键化明胶的质量比为5～20%：1。明胶溶于磷酸缓冲液过程中，在60℃水浴条件下搅拌30min溶解；加入甲基丙烯酸酐后在50℃水浴条件下搅拌30小时反应。
实施例1
一种用作骨修复的全降解磁修复水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：室温条件下，将8 gFeCl2·4H2O，20.8 g FeCl3·6H20，0.1 g多巴胺加入500 mL三口烧瓶中，向其中加入25 mL H2O。
步骤2：在溶液中通入氮气除去烧杯内的氧气，保证整个体系处于无氧气环境中，用机械搅拌器以1000 r/min搅拌30 min，同时配制250 mL含15 gNaOH的水溶液。搅拌30min后通过水浴锅给三口烧瓶加热到80 ℃，将氢氧化钠溶液以每秒2滴的速度逐滴加入到三口烧瓶中；滴加完成后继续在80 ℃下搅拌30 min；生成多巴胺螯合的磁性纳米羟基磷灰石。反应结束后，用磁选法分离出纳米粒子，再用脱氧去离子水洗涤三次，每次用100 mL，得到多巴胺螯合的磁性纳米羟基磷灰石颗粒。
步骤3：将5 g明胶溶于50 mL磷酸缓冲液中（pH=7.4），将明胶于60 ℃水浴锅内搅拌溶解30 min，然后以0.5 mL/min缓慢加入4 mL的甲基丙烯酸酐。将混合溶液在50 ℃水浴锅内持续搅拌3 h。反应结束后将溶液装入透析袋（MW=14000）中，在40 ℃的环境下透析7天。将透析后的液体冻干得到双键化的明胶。
步骤4：将步骤3制备得到的双键化明胶1 g溶解于10 mL水中，并向溶液中加入0.1g步骤1得到的磁性纳米羟基磷灰石，加入0.1 g的过硫酸钠，在水凝胶预聚液两侧施加磁场，聚合形成所需的水凝胶。
图1a为本实施例步骤2得到的磁性纳米羟基磷灰石颗粒的XRD图。图2a为本实施例步骤2得到的磁性纳米羟基磷灰石颗粒的磁滞回线图。图3a为本实施例步骤2得到的磁性纳米羟基磷灰石颗粒的SEM图。图4a为本实施例步骤4得到的磁性纳米羟基磷灰石颗粒在水凝胶中定向排列图。
实施例2
一种用作骨修复的全降解磁修复水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：室温条件下，将6 gFeCl2·4H2O，15.6 g FeCl3·6H20，0.1 g多巴胺和2.972 g Ca(NO3)2·4H2O加入500 mL三口烧瓶中，向其中加入25 mL H2O。
步骤2：在溶液中通入氮气除去烧杯内的氧气，保证整个体系处于无氧气环境中，用机械搅拌器以1000 r/min搅拌30 min，同时配制250 mL含15 gNaOH的水溶液和含0.99 g(NH4)2HPO4的水溶液。搅拌30 min后通过水浴锅给三口烧瓶加热到80 ℃，将氢氧化钠溶液和磷酸二胺溶液以每秒2滴的速度逐滴加入到三口烧瓶中；滴加完成后继续在80 ℃下搅拌30 min；生成多巴胺螯合的磁性纳米羟基磷灰石。反应结束后，用磁选法分离出纳米粒子，再用脱氧去离子水洗涤三次，每次用100 mL，得到多巴胺螯合的磁性纳米羟基磷灰石颗粒。
步骤3：将5 g明胶溶于50 mL磷酸缓冲液中（pH=7.4），将明胶于60 ℃水浴锅内搅拌溶解30 min，然后以0.5 mL/min缓慢加入4 mL的甲基丙烯酸酐。将混合溶液在50 ℃水浴锅内持续搅拌3 h。反应结束后将溶液装入透析袋（MW=14000）中，在40 ℃的环境下透析7天。将透析后的液体冻干得到双键化的明胶。
步骤4：将步骤3制备得到的双键化明胶1 g溶解于10 mL水中，并向溶液中加入0.1g步骤1得到的磁性纳米羟基磷灰石，加入0.1 g的过硫酸钠，在水凝胶预聚液两侧施加磁场，聚合形成所需的水凝胶。
图1b为本实施例步骤2得到的磁性纳米羟基磷灰石颗粒的XRD图。图2b为本实施例步骤2得到的磁性纳米羟基磷灰石颗粒的磁滞回线图。图3b为本实施例步骤2得到的磁性纳米羟基磷灰石颗粒的SEM图。图4b为本实施例步骤4得到的磁性纳米羟基磷灰石颗粒在水凝胶中定向排列图。
实施例3
一种用作骨修复的全降解磁修复水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：室温条件下，将4 gFeCl2·4H2O，10.4 g FeCl3·6H20，0.1 g多巴胺和5.944 g Ca(NO3)2·4H2O加入500 mL三口烧瓶中，向其中加入25 mL H2O。
步骤2：在溶液中通入氮气除去烧杯内的氧气，保证整个体系处于无氧气环境中，用机械搅拌器以1000 r/min搅拌30 min，同时配制250 mL含15 gNaOH的水溶液和含1.98 g(NH4)2HPO4的水溶液。搅拌30 min后通过水浴锅给三口烧瓶加热到80 ℃，将氢氧化钠溶液和磷酸二胺溶液以每秒2滴的速度逐滴加入到三口烧瓶中；滴加完成后继续在80 ℃下搅拌30 min；生成多巴胺螯合的磁性纳米羟基磷灰石。反应结束后，用磁选法分离出纳米粒子，再用脱氧去离子水洗涤三次，每次用100 mL，得到多巴胺螯合的磁性纳米羟基磷灰石颗粒。
步骤3：将5 g明胶溶于50 mL磷酸缓冲液中（pH=7.4），将明胶于60 ℃水浴锅内搅拌溶解30 min，然后以0.5 mL/min缓慢加入4 mL的甲基丙烯酸酐。将混合溶液在50 ℃水浴锅内持续搅拌3 h。反应结束后将溶液装入透析袋（MW=14000）中，在40 ℃的环境下透析7天。将透析后的液体冻干得到双键化的明胶。
步骤4：将步骤3制备得到的双键化明胶1 g溶解于10 mL水中，并向溶液中加入0.1g步骤1得到的磁性纳米羟基磷灰石，加入0.1 g的过硫酸钠，在水凝胶预聚液两侧施加磁场，聚合形成所需的水凝胶。
图1c为本实施例步骤2得到的磁性纳米羟基磷灰石颗粒的XRD图。图2c为本实施例步骤2得到的磁性纳米羟基磷灰石颗粒的磁滞回线图。图3c为本实施例步骤2得到的磁性纳米羟基磷灰石颗粒的SEM图。图4c为本实施例步骤4得到的磁性纳米羟基磷灰石颗粒在水凝胶中定向排列图。
实施例4
一种用作骨修复的全降解磁修复水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：室温条件下，将2 gFeCl2·4H2O，5.2 g FeCl3·6H20，0.1 g多巴胺和8.916g Ca(NO3)2·4H2O加入500 mL三口烧瓶中，向其中加入25 mL H2O。
步骤2：在溶液中通入氮气除去烧杯内的氧气，保证整个体系处于无氧气环境中，用机械搅拌器以1000 r/min搅拌30 min，同时配制250 mL含15 gNaOH的水溶液和含2.97 g(NH4)2HPO4的水溶液。搅拌30 min后通过水浴锅给三口烧瓶加热到80 ℃，将氢氧化钠溶液和磷酸二胺溶液以每秒2滴的速度逐滴加入到三口烧瓶中；滴加完成后继续在80 ℃下搅拌30 min；生成多巴胺螯合的磁性纳米羟基磷灰石。反应结束后，用磁选法分离出纳米粒子，再用脱氧去离子水洗涤三次，每次用100 mL，得到多巴胺螯合的磁性纳米羟基磷灰石颗粒。
步骤3：将5 g明胶溶于50 mL磷酸缓冲液中（pH=7.4），将明胶于60 ℃水浴锅内搅拌溶解30 min，然后以0.5 mL/min缓慢加入4 mL的甲基丙烯酸酐。将混合溶液在50 ℃水浴锅内持续搅拌3 h。反应结束后将溶液装入透析袋（MW=14000）中，在40 ℃的环境下透析7天。将透析后的液体冻干得到双键化的明胶。
步骤4：将步骤3制备得到的双键化明胶1 g溶解于10 mL水中，并向溶液中加入0.1g步骤1得到的磁性纳米羟基磷灰石，加入0.1 g的过硫酸钠，在水凝胶预聚液两侧施加磁场，聚合形成所需的水凝胶。
图1d为本实施例步骤2得到的磁性纳米羟基磷灰石颗粒的XRD图。图2d为本实施例步骤2得到的磁性纳米羟基磷灰石颗粒的磁滞回线图。图3d为本实施例步骤2得到的磁性纳米羟基磷灰石颗粒的SEM图。图4d为本实施例步骤4得到的磁性纳米羟基磷灰石颗粒在水凝胶中定向排列图。
从图1中可以看出XRD图中出现了四氧化三铁与羟基磷灰石的特征峰，说明得到的纳米颗粒为磁性的羟基磷灰石。图1a的纳米颗粒制备没有钙离子与磷酸根离子只有四氧化三铁的特征峰。图1b、c和d随着钙离子与磷酸根离子投入质量增加羟基磷灰石的特征增强。
从图2的磁滞回线中可以看出，实施例1～实施例4中的纳米颗粒均具有磁性，随着钙离子和磷酸根离子投入质量增加磁性降低。
从图3中可以看出，Fe3O4的SEM图为球形，透明质酸HA的SEM图为棒状，随着钙离子和磷酸根离子投入质量增加SEM图中棒状比例增加。
从图4中可以看出，实施例1～实施例4得到的纳米颗粒均具有磁性，所以在外界磁场作用下在水凝胶中定向排列。
本发明制备的水凝胶在体内具有较高的稳定性和生物相容性，且可实现低溶胀、全降解；磁性纳米羟基磷灰石作为水凝胶内部纳米增强相可以改善水凝胶的力学性能，同时纳米颗粒中的羟基磷灰石是生物体硬组织主要的无机成分，有助于骨修复。利用外界磁场实现磁性羟基磷灰石在水凝胶中仿生骨的结构。磁性的四氧化三铁通过磁场作用影响多种细胞的黏附、增殖、迁移、分化，促进细胞成骨分化，有助于骨修复。磁性的四氧化三铁在体内的稳定性较高且可以在体内保存较长时间最后通过肾脏排出。磁场对骨修复有促进作用，HA是骨修复所需的无机成分，两者协同作用进一步提高骨修复效果。多巴胺可以实现对纳米颗粒的良好的分散性和螯合作用，相比于传统的制备方法可以使纳米颗粒的尺寸更小，有利于体内肾脏排出以及进一步的研究。

Claims (6)

1.一种用作骨修复的全降解磁修复水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：制备含铁离子、钙离子和多巴胺的混合水溶液，混合水溶液中Fe2+：Fe3+的摩尔比为0.5～1；多巴胺和Fe2+的质量比为0.01～1；Ca2+：Fe2+的摩尔比为0～4；
步骤2：在气氛保护条件下搅拌均匀，在其中滴加磷酸盐溶液，充分反应即可得到多巴胺分散的纳米磁性羟基磷灰石颗粒；其中Ca2+和PO4 3-的摩尔比为1.5～2；
步骤3：将明胶溶于磷酸缓冲液中，充分溶解后加入甲基丙烯酸酐，充分反应后，透析冻干即可得到双键化明胶；其中甲基丙烯酸酐的添加量按照每1g明胶0.4～0.8mL添加；
步骤4：将步骤2得到的纳米磁性羟基磷灰石颗粒加入到步骤3得到的双键化明胶水溶液中，加入过硫酸钠，形成水凝胶预聚液；在水凝胶预聚液两侧平行施加磁场，磁场强度为10～50mt，即可聚合形成所需水凝胶；其中纳米磁性羟基磷灰石颗粒与双键化明胶的质量比为5～20％：1；所述步骤3中明胶溶于磷酸缓冲液过程中，在60℃水浴条件下搅拌30min溶解；加入甲基丙烯酸酐后在50℃水浴条件下搅拌30小时反应。
2.根据权利要求1所述的一种用作骨修复的全降解磁修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤2反应过程中，维持溶液的pH＞10。
3.根据权利要求1所述的一种用作骨修复的全降解磁修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤2中反应在80℃条件下进行，反应时间为60～120min。
4.根据权利要求2所述的一种用作骨修复的全降解磁修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤2中通过滴加氢氧化钠或氨水维持溶液的pH值。
5.根据权利要求1所述的一种用作骨修复的全降解磁修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐溶液按照每秒2滴的速度滴加。
6.根据权利要求1所述的一种用作骨修复的全降解磁修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤4中过硫酸钠和双键化明胶的质量比为1:10。
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