CN111329996A - 重组人生长激素的组合物和其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组人生长激素的组合物和其制备方法。本发明的组合物包括重组人生长激素、组氨酸、甘露醇、泊洛沙姆、苯酚和二糖。本发明提供的重组人生长激素的组合物明显降低了脱酰胺反应、氧化以及高分子聚集。

Description

重组人生长激素的组合物和其制备方法

技术领域

本发明涉及一种重组人生长激素的组合物及其制备方法。具体而言，本发明涉及包括重组人生长激素、组氨酸、甘露醇、泊洛沙姆、苯酚和二糖的重组人生长激素的组合物、其制备方法和用途。

背景技术

人生长激素(hGH)是一种由垂体前叶促生长细胞产生和分泌的蛋白激素。人生长激素通过对蛋白质、碳水化合物和脂肪的代谢作用，在儿童身体生长和成人的代谢中起着关键作用。

人生长激素为由191个氨基酸组成的单链多肽(Bewly等，1972)，具有两个二硫键。一个在Cys-53和Cys-165之间，在分子内形成大环。另一个在Cys-182和Cys-189 之间，在C端附近形成小环。

在溶液中，hGH主要以单体形式存在，含小部分二聚体或更高分子量的寡聚体。在某些条件下，可诱发hGH形成大量的二聚体、三聚体或更高的寡聚体。人生长激素聚体的形成会引起免疫原性增强，进而在体内导致安全问题。

在合适的条件下，蛋白质中的天冬酰胺和谷氨酰胺残基易发生脱酰胺反应。已有文献报道，hGH发生这种反应，导致Asn-152转变为天冬氨酸，Gln-137转变为谷氨酸(Lewis等，1981)。已知在某些贮存条件下，生物合成的hGH可发生降解，导致另一个天冬酰胺(Asn-149)发生脱酰胺反应。Asn-152、Gln-137以及Asn-149为发生脱酰胺反应的主要位点。尽管研究表明，hGH脱酰胺化产物没有毒性，也不改变其与受体的结合能力及生物活性，但作为药品来说，脱酰胺仍然是不希望看到，且需要得到控制(Cleland等，1993；Jenkins等，2008)。

蛋白质中的甲硫氨酸残基易于氧化，形成硫氧化物。hGH中的Met-14和Met-125 可发生磺化氧化反应(Becker等，1988)。Met-14和Met-125为hGH中主要的氧化位点。与天然hGH相比较，Met-14和Met-125氧化产生的亚砜结构降低了hGH的稳定性。

hGH的液体制剂有不稳定倾向，易发生的化学反应如：脱酰胺反应或氧化，同时由于物理上的不稳定也易形成二聚体或等高分子量的聚集体(Becker等，1988； Becker等，1989；Cleland等，1993；Ablinger等，2012)。

重组人生长激素(rhGH)具有与内源性人生长激素完全相同的氨基酸含量、序列和空间构象，且具有相同的生物活性。rhGH被批准用于治疗儿童和成人生长激素缺乏，特纳氏综合征、隐睾-侏儒-肥胖-低智综合征、儿童肾病等。

由于重组人生长激素在溶液中不稳定，rhGH药物制剂通常被冷冻干燥并且以冷冻干燥形式存储在2至8℃下，其在使用前必须重新溶解。为了改善医生与患者使用的便利性，提高rhGH的稳定性，本领域对rhGH的液体制剂也进行了很多研究。

国际专利公开号WO94/03198公开了一种稳定的液态配方，该配方包含人生长激素、缓冲液、非离子表面活性剂和中性盐、甘露醇或防腐剂。缓冲液可为组氨酸，也可优选柠檬酸。该申请公开了一种优选配方，包含作为缓冲液的柠檬酸和氯化钠和用来稳定的聚山梨酯20。这种组合防止了蛋白聚合，但也产生相当数量的脱酰胺的生长激素。

国际专利公开号WO93/19776公开了含生长激素的蛋白溶液配方，该配方包含柠檬酸作为缓冲液，相比包含磷酸缓冲液的配方更稳定。该配方包含氨基酸，比如甘氨酸和丙氨酸和/或甘露醇或其他糖乙醇和/或甘油和/或其他碳水化合物和选择性的防腐剂如苯乙醇。

国际专利公开号WO2005/105148公开了液体生长激素制剂，该制剂包含柠檬酸或磷酸盐作为缓冲液，以及聚乙二醇-聚丙二醇和碱金属盐或伪碱土金属盐。

美国专利公开号US6448225公开了rhGH的液体制剂，其包含人生长激素、甘露醇、缓冲剂和非离子型表面活性剂，其中优选柠檬酸盐缓冲剂。

国际专利公开号WO97/39768公开了一种含生长激素的稳定药物配方，该配方包含选自天冬氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或组氨酸中的一种氨基酸，或包含至少一种碱性氨基酸和至少一种酸性氨基酸的肽，以及非离子去污剂，例如聚山梨酯或泊洛沙姆。

韩国专利公开号KR1019980052483公开了药学稳定的人生长激素液体制剂，其中优选由乙酸钠和谷氨酸组成的缓冲溶液。

中国专利公开号CN20110267989.9公开的例子则优选柠檬酸盐缓冲体系、泊洛沙姆、甘氨酸、甘露醇来制备稳定的人生长激素注射液。

NovoNordiskA/S目前上市了NorditropinSimpleXx注射液，其包含重组人生长激素、组氨酸缓冲剂、非离子型表面活性剂、氯化钠和防腐剂。

在专利WO1993012812A1中，公开了使用蔗糖来改善冷冻人生长激素的填充剂，但是也未讨论人生长激素溶液的稳定性问题。

Sumitra等人的研究发现，海藻糖对rhGH的聚体无保护作用，并且不同类型的环糊精以及糖，比如葡萄糖、麦芽糖和海藻糖对4.5M GuHCl溶液中rhGH的聚集没有保护作用，并且这些糖之间无明显差别。

Mark等人的研究发现，海藻糖可能增加部分蛋白的氧化，并且蔗糖增加了FVII 蛋白的MET氧化速度(见Mark等，2010)，其中还报道了甘露醇等物质等虽然可清除氧自由基，但是并未提及可减少蛋白氧化水平。

Maya等人的研究发现，蔗糖和海藻糖能够减缓冻干hGH的脱酰胺。但是，其中并没有提及二者能够降低hGH液体制剂的脱酰胺化。

如上所述，尽管为制备生长激素的液体制剂已经进行了许多尝试，但是仍需要更加高效的能够降低rhGH的脱酰胺反应、氧化以及高分子聚集。

发明内容

鉴于上述，本发明提供一种降低rhGH的脱酰胺反应、氧化以及高分子聚集的重组人生长激素的组合物，以及其制备方法。

在一个方面中，本发明提供了一种重组人生长激素的组合物，包括重组人生长激素、组氨酸、甘露醇、泊洛沙姆、苯酚和二糖。

具体而言，本发明的组合物可包括1.0mg/ml至4.0mg/ml的重组人生长激素、8.0mM的组氨酸、9.1mg/ml至45.5mg/ml的甘露醇、3.0mg/ml的泊洛沙姆、 3.0mg/ml的苯酚和17.1mg/ml至85.5mg/ml的二糖。

根据本发明的重组人生长激素的组合物具有延长的稳定性，尤其，具有降低的脱酰胺化反应、降低的氧化以及减少的高分子聚集。

其中，所述二糖为蔗糖或海藻糖。

其中所述二糖与甘露醇的含量比例为1.93:1至9.40:1，优选4.7:1。

本发明提供的重组人生长激素的组合物明显降低了脱酰胺反应、氧化以及高分子聚集。

在另一方面中，本发明提供了一种制备本发明的重组人生长激素的组合物的方法，所述方法包括下述步骤：分别使用注射用水配制泊洛沙姆溶液、组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、蔗糖溶液、海藻糖溶液和苯酚溶液；

将配制的泊洛沙姆溶液、组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、蔗糖溶液和/或海藻糖溶液、苯酚溶液、注射用水、甘露醇以及重组人生长激素充分混匀，得到混合溶液，调整pH 为6.0至6.3，前提是对于所述泊洛沙姆溶液和所述苯酚溶液，在使其中一种溶液与其他组分充分混合之后，再添加另一溶液。

附图说明

图1显示了根据本发明实施方式的重组人生长激素的组合物中随着时间的推移，rhGH单体含量；

图2显示了根据本发明实施方式的重组人生长激素的组合物中随着时间的推移，rhGH多聚体含量；

图3A至3F分别显示了根据本发明实施方式的重组人生长激素的组合物1至5 以及诺泽放置15天之后，rhGH的粒径分布；

图4显示了根据本发明实施方式的重组人生长激素的组合物中随着时间的推移，rhGH的脱酰胺产物的含量；

图5显示了根据本发明实施方式的重组人生长激素的组合物中随着时间的推移，总相关杂质的含量。

具体实施方式

为了减缓重组人生长激素注射液中相关蛋白杂质的增长，降低重组人生长激素在溶液中的不稳定性，本发明人对重组人生长激素的稳定性进行了广泛研究。具体而言，本发明人研究了缓冲液、二糖(包括蔗糖和/或海藻糖)、甘露醇、苯酚以及泊洛沙姆等对重组人生长激素的稳定性的影响。

为了延长人重组生长激素的稳定性，减缓生长激素注射液稳定性实验中相关蛋白杂质的增长，本发明人对重组人生长激素注射液处方进行了实验设计(DOE)，具体设计方案如表1中所示：

表1.生长激素注射液的DOE设计

生长激素注射液DOE实验配制步骤如下：

溶液配制原液

1)化冻：将原液放在2-8℃冰箱中化冻过夜。

2)换液：将蛋白经G25柱进行缓冲液的置换，换液缓冲液为20mM柠檬酸缓冲液和1.34mg/ml的组氨酸缓冲液。

3)过滤：将G25峰蛋白溶液分别用0.5μm MCE一次性针筒过滤器进行一次澄清过滤，0.22μm PVDF针筒过滤器进行二次澄清过滤。蛋白溶液一次滤后和蛋白溶液二次滤后取样送检HPLC测定含量。

半成品的配制

将处方分成2部分，一部分为蛋白液和缓冲盐，共150ml，另一部分为辅料液，共150ml，首先通过预实验测试辅料液所需的pH，使得两部分溶液混合后的半成品 pH值在6.0至6.3之间。

分别按照表1的各个处方进行配液，注意，对于泊洛沙姆和苯酚，需分别配制母液后再与表1中的其他组分混合，换句话说，需使泊洛沙姆和苯酚中的一种与其他组分充分混合之后，再添加泊洛沙姆和苯酚中的另一种，否则会引起不可逆的浑浊。

过滤灌装

首先用各个批号的辅料溶液进行滤器冲洗，然后再进行半成品的过滤，并用干烤的三角瓶接料。将半成品用蠕动泵灌装至已经加好塞子的卡式瓶内，最后轧盖，放于 2-8℃的冰箱中备用。注意灌装半成品前先用相应的辅料溶液冲洗过滤管道。

DOE实验的结果如下面表2中所示：

表2.生长激素注射液处方DOE实验在15℃下相关蛋白杂质的结果

通过上述DOE实验中表2的结果，本发明人意外发现：

与含甘露醇但不含蔗糖的处方(样品3、4、5和13)相比，含蔗糖但不含甘露醇的处方(样品1、7、10和15)，在15℃下加速2.5个月时相关蛋白水平显著降低 (p<0.05)，整个加速过程中相关蛋白的增加斜率也明显降低(p<0.05)。这提示，蔗糖对相关蛋白增长有明显的抑制作用。

将同时含有蔗糖和甘露醇的处方(样品6和16)与含有相同水平蔗糖但不含甘露醇的处方(样品15和7)相比，添加有甘露醇的处方(样品6和16)，在15℃下加速2.5个月时相关蛋白以及整个加速过程中相关蛋白增加的斜率均更低一些。这说明蔗糖和甘露醇的组合与单独蔗糖相比，对于相关蛋白的增长具有更明显的抑制作用。

与含甘露醇但不含蔗糖的处方(样品3、4、5和13)相比，同时含甘露醇和蔗糖的处方(样品2、6、8、9、11、12、14和16)，在15℃下加速2.5个月时相关蛋白水平显著降低(p<0.01)。不同比例的蔗糖和甘露醇的组合对相关蛋白增长的抑制效果不同，其中蔗糖和甘露醇的组合在1.92:1至9.40:1的范围内的处方(样品6、8、11、14和 16)，在15℃下加速2.5个月时相关蛋白水平均低于10％，整个加速过程中相关蛋白增加的斜率均低于3。尤其，对于相关蛋白增长的抑制效果而言，样品16的抑制效果最佳。这说明不同的蔗糖和甘露醇的含量比例对于抑制相关蛋白的增长具有不同的效果。

在此基础上，本发明人通过对二糖，包括蔗糖和海藻糖，以及二糖与甘露醇的组合比例的探索研究，提供了具有在延长时间段内稳定的含重组人生长激素的组合物。

1、实验材料及其来源

本发明中使用的重组人生长激素原液来自上海联合赛尔生物工程有限公司，批号为GBB1201904；其中，本发明中使用的重组人生长激素原液的制备过程包括如下：将大肠杆菌摇瓶发酵、上罐发酵、融合蛋白捕获、酶切换液、精细纯化(疏水层析，离子交换层析及凝胶过滤层析)、除菌过滤，得到原液，原液中重组人生长激素的含量为 17.7mg/ml。

蔗糖购买自Pfanstiebl,Inc.；海藻糖购买自日本林原；甘露醇购买自浙江天瑞；泊洛沙姆购买自BSAF；苯酚购买自Merck；组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液购买自上海协和。

2、本发明提供的重组人生长激素的组合物

本发明人提供了在延长时间段内具有稳定性的重组人生长激素的组合物。本发明中所使用的重组人生长激素具有与内源性人生长激素完全相同的氨基酸含量、序列和空间构象，并且具有相同的生物活性。组合物中重组人生长激素的含量为1.0mg/ml 至4.0mg/ml，优选3.3mg/ml。

本发明的组合物中包括二糖，其具有防止或减缓重组人生长激素的脱酰胺反应的作用。其中二糖包括蔗糖、海藻等其他二糖。优选地，二糖为蔗糖。组合物中二糖的含量为17.1mg/ml至85.5mg/ml，优选85mg/ml。

本发明的组合物中进一步包括缓冲液，其包括组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、组氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液等。缓冲液的pH为6.0至6.3，优选6.1至6.2。组合物中组氨酸缓冲液的含量为8.0mM。

本发明的组合物中进一步包括甘露醇，其中甘露醇的含量为9.1mg/ml至 45.5mg/ml，优选18mg/ml。

本发明的组合物中进一步包括苯酚，其中苯酚的含量为3.0mg/ml。

本发明的组合物中进一步包括泊洛沙姆，其中泊洛沙姆的含量为3.0mg/ml。

本发明的组合物中，蔗糖与甘露醇的含量比例为1.93:1至9.40:1，优选4.72:1。

3、组合物的配制

分别使用注射用水配制泊洛沙姆溶液、组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、蔗糖溶液、海藻糖溶液和苯酚溶液。

将上述配制的泊洛沙姆溶液、组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、蔗糖溶液和/或海藻糖溶液、苯酚溶液、注射用水、以及甘露醇依次添加至重组人生长激素中，混匀，得到混合溶液，调整pH为6.0至6.3。

4、组合物的稳定性评估

对于本发明的人生长激素的组合物，进行了如下评估。

A、rhGH多聚体含量的测量

采用分子排阻-高相液相色谱法(SEC-HPLC)进行测量，其中流动相：0.063mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.0)(97％)：异丙醇(3％)；柱温：25℃样品室温度：5℃；检测波长：214nm；流速：0.6ml/分钟；色谱柱：TSKgelG2000SW_xl 7.8*300，5μm。

取待测试样品及对照品(中国食品药品检定研究院，货号：140635)适量，用0.025M的磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释到1mg/ml，运行30分钟，平行配制两份进行测量。

B、动态光散射(DLS)检测

采用动态光散射法进行粒径分布和单体蛋白含量的测量。取对照品及待测试样品适量，加入黑色96孔板中，设置机器参数(型号：DAWNHELEOS II)每次获取20次，重复3次，取平均值。

C、脱酰胺产物的测量

采用毛细管电泳仪，测量脱酰胺产物，将待测试溶液及对照品溶液分别加水稀释到1mg/ml，在以下分离条件下进行分离：

毛细管：非涂层-熔融石英毛线管，内径50μm；

毛细管长度100cm，有效长度90cm；

卡槽温度：30℃；

样品室温度：8℃；

检测波长：200nm；

进样量：0.7psi，5秒；

分离时间：80分钟，分离电压22KV。

D、总相关杂质含量的测量

采用高相液相色谱法进行测量，其中流动相A：0.05M Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)(71％)；流动相B：正丙醇(29％)；柱温：45℃；检测波长：220nm；色谱柱：Sepax Bio-C4 4.6*250mm，

(PN：110045-4625)。

取对照品及待测试样品适量，用流动相A稀释成2mg/ml，运行50分钟，按面积归一化法计算相关杂质含量。

根据稳定性评估的结果，发现在40℃下放置15天之后，含蔗糖和海藻糖的组合物中的rhGH单体的含量高于不含二糖的组合物及诺泽(一种上市的重组人生长激素注射液，其组分为甘露醇、组氨酸、泊洛沙姆188、苯酚和注射用水)中rhGH单体的含量。含蔗糖和海藻糖的组合物中rhGH多聚体的含量低于不含二糖的组合物及诺泽中的rhGH多聚体的含量，并且rhGH多聚体的增加速度在含蔗糖和海藻糖的组合物中也更慢。就粒径分布而言，可以看到，不含二糖的组合物和诺泽中的绝大部分在15天之后已经形成了聚合物，而含蔗糖和海藻糖的组合物中仍有30％至50％的rhGH以单体形式存在。含蔗糖和海藻糖的组合物中脱酰胺化产物的含量低于不含二糖的组合物及诺泽中脱酰胺化产物的含量；含蔗糖和海藻糖的组合物中总相关杂质的含量低于不含二糖的组合物及诺泽中总相关杂质的含量。

由此可见，本发明提供的人生长激素的组合物，降低了重组人生长激素的脱酰胺化反应、氧化以及高分子聚合，从而延长了重组人生长激素的稳定性。

本发明提供的组合物可用于治疗人生长激素缺少相关的疾病，所述疾病选自儿童和成人生长激素缺乏、特纳氏综合征、隐睾-侏儒-肥胖-低智综合征、儿童肾病等。

下面通过具体的实施例来进一步阐释本发明的方法和构思，但是本发明的范围不受实施例的限制。

实施例

实施例1

使用注射用水配制16mM的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液母液2L；配制500mg/ml 的蔗糖溶液200ml；称取100g海藻糖，使用200ml容量瓶定容配制成500mg/ml的海藻糖溶液；将6g泊洛沙姆溶于200ml的注射用水中，配制成30mg/ml的泊洛沙姆溶液；将6g苯酚溶于200ml的注射用水中，配制成30mg/ml的苯酚溶液。

将30ml的泊洛沙姆溶液、94.1ml的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、51ml的蔗糖母液、27ml的甘露醇(200mg/ml)、12ml的注射用水、30ml的苯酚，以及55.9ml的重组人生长激素原液(17.7mg/ml)充分混匀，并且将pH调整为6.0-6.3，得到300ml的液态组合物1。

实施例2

根据实施例1中相同的程序，制备实施例2的组合物2，只是用海藻糖代替蔗糖。

比较例1-3

根据实施例1中相同的程序，制备比较例1-3的组合物3至5，只是根据下面表3 中所列出的组合物3至5的具体组成。

表3.组合物1至5的组成

*表示组合物中不含有蔗糖或甘露醇时，未给出二者的含量比例。

评估例

1、rhGH单体含量的测量

将组合物1至5放置在40℃下15天，避光，并且在第0天、第5天、第10天和第15天取样，分别根据上述“B、动态光散射(DLS)检测”中的方法，进行rhGH单体含量的测量。结果见图1。图1中纵轴表示单体蛋白的含量，横轴表示放置的时间。

从图1中可见，到第15天时，含蔗糖或海藻糖的组合物(实施例1和2以及比较例2和3，组合物1、2、4、5)中，rhGH单体蛋白的含量明显高于不含蔗糖或海藻糖的组合物(比较例1，组合物3)以及诺泽中rhGH单体蛋白的含量。由此可见，经过15 天40℃的加速实验之后，含蔗糖或海藻糖的组合物中的rhGH，与不含蔗糖或海藻糖的组合物以及诺泽中的rhGH相比，更加稳定地以单体形式存在。进一步，同时包含了蔗糖或海藻糖与甘露醇的组合物(实施例1和2，组合物1和2)与仅包含蔗糖或海藻糖但未包含甘露醇的组合物(比较例2和4，组合物4和5)相比，rhGH单体蛋白的含量更高。由此可见，蔗糖或海藻糖与甘露醇的组合进一步提高了rhGH的稳定性。

2、rhGH多聚体含量的测量

将组合物1至5放置在40℃下15天，避光，并且在第0天、第5天、第10天和第15天取样，分别根据上述“A、rhGH多聚体含量的测量”方法进行rhGH多聚体含量的测量。结果见图2。图2中纵轴表示多聚体蛋白的含量，横轴表示放置的时间。

从图2中可见，到第15天时，含蔗糖和海藻糖的组合物(实施例1和2，组合物1 和2)中rhGH多聚体的含量明显低于不含蔗糖和海藻糖的组合物(比较例1至3，组合物3至5)以及诺泽中rhGH多聚体的含量。由此可见，在经过15天40℃的加速实验之后，含蔗糖和海藻糖的组合物，与不含蔗糖或海藻糖的组合物以及诺泽相比，具有更少的rhGH多聚体，更加稳定。进一步，同时包含了蔗糖或海藻糖与甘露醇的组合物(实施例1和2，组合物1和2)与仅包含蔗糖或海藻糖但未包含甘露醇的组合物(比较例2和4，组合物4和5)相比，多聚体蛋白的含量更低。由此可见，蔗糖或海藻糖与甘露醇的组合进一步提高了rhGH的稳定性。

3、粒径分布的测量

将组合物1至5放置在40℃下15天，避光，并且在第15天取样，分别根据上述“B、动态光散射(DLS)检测”方法进行粒径分布的测量。结果见图3A至3F，其中纵轴表示粒径分布的强度，横轴表示颗粒半径。

从图3A至3F中可见，不含蔗糖或海藻糖的组合物(比较例1，组合物3)以及诺泽，在40℃下放置15天之后，所测量的3.5nm附近(rhGH单体蛋白)的粒径分布仅仅为 13.1％和2.1％(见，图3C和3F)。而含蔗糖或海藻糖的组合物(实施例1和2以及比较例2和3，组合物1、2、4和5)，在40℃下放置15天之后，所测量的3.5nm附近的粒径分布为约30％至约50％(见，图3A、3B、3D和3E)。换句话说，在40℃下放置 15天之后，不含二糖的组合物和诺泽中的绝大部分形成了粒径更大的聚合物，而含蔗糖或海藻糖的组合物中仍有30％至50％的rhGH以单体形式存在。

4、脱酰胺产物的测量

将组合物1至5放置在40℃下15天，避光，并且在第0天、第5天、第10天和第15天取样，分别根据上述“C、脱酰胺产物的测量”方法进行脱酰胺产物的测量。结果见图4。图4中纵轴表示脱酰胺化的百分数，横轴表示放置的时间。

从图4中可见，在添加了蔗糖或海藻糖的组合物，比如组合物1、2、4和5中，随着时间的推移，尽管脱酰胺产物的含量也逐渐增加，但是增加的速度明显小于未添加蔗糖或海藻糖的组合物，比如组合物3，以及诺泽处方。由此可见，蔗糖或海藻糖明显降低了rhGH的脱酰胺化。

5、总相关杂质含量的测量

将组合物1至5放置在40℃下15天，避光，并且在第0天、第5天、第10天和第15天取样，分别根据上述“D、总相关杂质含量的测量”方法进行总相关杂质含量的测量。结果见图5。图5中纵轴表示相关杂质的含量，横轴表示放置的时间。

从图5中可见，就包括脱酰胺产物、氧化产物和蛋白部分降解产物在内的总相关杂质的含量而言，在40℃下放置15天之后，在添加了蔗糖或海藻糖的组合物，比如组合物1、2、4和5中，随着时间的推移，尽管总相关杂质含量逐渐增加，但是增加的速度明显小于未添加蔗糖或海藻糖的组合物，比如组合物3，以及诺泽处方。

通过上述评估例可以发现，本发明的组合物在40℃下放置15天之后，具有明显更高的rhGH单体蛋白含量、更低的多聚体含量、更多的对应rhGH单体的粒径分布、降低的脱酰胺化以及更少的相关杂质。从而，本发明的rhGH组合物具有更高的稳定性。本发明的重组人生长激素的组合物在延长的时间内具有稳定性，在工业上具有应用价值。

参考文献

唐姝等，中国医药工业杂志，45:1071-1077(2014)；

Ablinger等，Int.J.Pharm.427:209-216(2012)；

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Becker等，Biotechnol.Appl.Biochem.10:326(1988)；

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Mark等，Pharmaceutical Research,Vol.27,No.4(2010)；

Maya等，International Journal of Pharmaceutics 358,108-113(2008)。

Claims (7)

1.一种重组人生长激素的组合物，包括重组人生长激素、组氨酸、甘露醇、泊洛沙姆、苯酚和二糖。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中基于所述组合物的总体积，所述甘露醇的浓度为9.1mg/ml至45.5mg/ml。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中基于所述组合物的总体积，所述二糖的浓度为17.1mg/ml至85.5mg/ml。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述二糖为蔗糖或海藻糖。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述二糖与所述甘露醇，按重量计，含量比例为1.93:1至9.40:1，优选4.72:1。

6.一种制备根据权利要求1至5中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括下述步骤：

分别配制泊洛沙姆溶液、组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、蔗糖溶液、海藻糖溶液、苯酚溶液；

将配制的泊洛沙姆溶液、组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、蔗糖溶液和/或海藻糖溶液、苯酚溶液、注射用水、甘露醇以及重组人生长激素充分混匀，得到混合溶液，调整pH为6.0至6.3，前提是对于所述泊洛沙姆溶液和所述苯酚溶液，在使其中一种溶液与其他组分充分混合之后，再添加另一溶液。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述重组人生长激素为重组人生长激素原液。

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