CN111323511B - 一种用于灭活新冠病毒的快速检测试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于灭活新冠病毒的快速检测试剂盒，包括以下组分：(1)灭活反应试管，内含胰蛋白酶冻干粉，(2)酶解反应液，(3)快速检测标准多肽；所述快速检测标准多肽的氨基酸序列为：ITFGGPTDSTDNNQNGGR。本发明在保证检测的灵敏度和特异性的前提下，可以对灭活后的病毒进行快速检测，获得准确检测结果，最大限度降低医护人员和检测人员的感染风险。

Description

一种用于灭活新冠病毒的快速检测试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于灭活新冠病毒的快速检测试剂盒及方法。
背景技术
病毒是一类非细胞型微生物。成熟完整的病毒颗粒成为病毒体，由核酸和蛋白质构成。病毒的特点是体积微小，可通过除菌滤器；结构简单，只含有一种类型的核酸(DNA或者RNA)；缺少编码线粒体和核糖体的基因，必须在活细胞内寄生，并以复制的方式繁殖后代。
冠状病毒在***分类上属套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具囊膜(envelope)、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒，冠状病毒直径约80～120nm，基因组5′端具有甲基化的帽状结构，3′端具有poly(A)尾，基因组全长约27-32kb，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒，冠状病毒仅感染脊椎动物，如人、鼠、猪、猫、犬、狼、鸡、牛、禽类。冠状病毒最先是1937年从鸡身上分离出来，病毒颗粒的直径60～200nm，平均直径为100nm，呈球形或椭圆形，具有多形性。病毒有包膜，包膜上存在棘突，整个病毒像日冕，不同的冠状病毒的棘突有明显的差异。在冠状病毒感染细胞内有时可以见到管状的包涵体。2019新型冠状病毒(2019-nCoV，引发新型冠状病毒肺炎COVID-19)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，感染病毒的人会出现程度不同的症状，有的只是发烧或轻微咳嗽，有的会发展为肺炎，有的则更为严重甚至死亡。新型冠状病毒主要的传播途径还是呼吸道飞沫传播和接触传播。
在病毒临床检验方法，通常采用基于基因(DNA或者RNA)的方法(例如PCR或者测序)，以及基于蛋白质指纹图谱的方法(例如飞行时间质谱)。他们都需要采集患者的新鲜样本(咽拭子、痰液、肺灌注液或者血液)进行检测，由于新型冠状病毒具有非常强的传染性，这对采集样本的医护人员和检测人员能够造成很大的感染风险。对采集的样本马上进行灭活，可以有效降低医护人员和检测人员的感染风险，但是，当样本灭活后(通常采用高压灭菌锅)，虽然病毒丧失了原有的致病性，但是其检测标记物(DNA、RNA以及具有空间结构的蛋白质)也容易破坏而无法检测。因此，如何有效降低医护人员和检测人员的感染风险，同时又不影响检测，成为急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于灭活新冠病毒的快速检测试剂盒，在保证检测的灵敏度和特异性的前提下，可以对灭活后的病毒进行快速检测，获得准确检测结果，最大限度降低医护人员和检测人员的感染风险。
本发明还提供了一种降低医护人员感染风险的新冠病毒快速检测方法，可以对采集的病毒迅速现场快速酶解灭活处理，利用样本运输过程回实验室的时间完成酶解过程，到达实验室后马上进行检测，有效降低医护人员和检测人员的感染风险。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于灭活新冠病毒的快速检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：(1)灭活反应试管，内含胰蛋白酶冻干粉，(2)酶解反应液，(3)快速检测标准多肽；所述快速检测标准多肽的氨基酸序列为：ITFGGPTDSTDNNQNGGR。
本方案抛弃传统的、易破坏检测标记物(DNA、RNA以及具有空间结构的蛋白质)，选择化学性质较为稳定的病毒蛋白质外壳酶解产物作为标记物。病毒蛋白质外壳酶解产物通常为多肽，具有氨基酸序列，能够保证的检测的特异性。配合质谱检测，能够保证较高的灵敏度和准确性的前提下，仅需1-2分钟就能完成1个样本的检测。病毒蛋白质外壳经过酶解后，会丧失其活性，因此其传染风险大大降低。氨基酸序列的化学结构较为稳定，能够承受较高的温度。因此，样本可以在孵育器开盖前进行加热处理，将潜在的感染源(主要来自于尚未完全酶解的病毒)彻底杀灭，最大可能性保护医护人员和检测工作者免受微生物感染的风险，同时也能让具有较低生物安全等级的实验室，也能够承接检测工作。
液相色谱串联质谱是一种通过被测物分子量来鉴定的设备，具有较高的灵敏度和准确度。氨基酸序列是生物体内体现遗传密码物质之一，选择特定的氨基酸序列能够保证检测的特异性。较DNA、RNA和蛋白质空间结构来说，氨基酸序列的化学性质稳定较高。与传统经典的方法相比，本发明在保证检测的灵敏度和特异性的前提下，极大地缩短了检测的时间，可以对灭活后的病毒进行检测，而不影响其检测结果。
所述酶解反应液组成为：浓度500mmol/L的碳酸氢铵，浓度为50mmol/L的巯基乙醇，浓度为100ng/mL的同位素标记长多肽。
碳酸氢铵，主要作用是控制反应体系的pH值，保证酶解速度和效率。巯基乙醇，主要作用：蛋白质的空间结构主要由半胱氨酸之间的二硫键维持。在蛋白质空间结构较为致密的情况下，胰蛋白酶不易接触到酶解位点，导致酶解效率变差、增加酶解时间。加入了巯基乙醇，可以破坏蛋白质的二硫键，一方面能够提高蛋白质酶解效率，缩短酶解时间，另一方面也能通过破坏蛋白质空间结构的方式将病毒灭活。
所述同位素标记长多肽的氨基酸序列为：PQSNQRSAPRI*TFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRP，其中I为[13C6,15N]-异亮氨酸。
胰蛋白酶为碱性胰蛋白酶。该序列以ITFGGPTDSTDNNQNGGR为模板，根据冠状病毒N蛋白的序列向C端和N端延伸10个氨基酸长度。采用同位素标记异亮氨酸人工合成了该长多肽，主要起到验证假阴性检测结果。
在实际检测过程中，可能存在种种因素(例如样本中存在胰蛋白酶抑制剂、试剂盒失效)导致酶解效率降低，造成假阴性结果。PQSNQRSAPRI*TFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRP在胰蛋白酶的作用下会生成I*TFGGPTDSTDNNQNGGR。当测得该多肽时，认为样本酶解过程正常，结果准确可靠。当无法测得该多肽时，判断为酶解过程存在问题，应排除问题后重新检测。
I*TFGGPTDSTDNNQNGGR与ITFGGPTDSTDNNQNGGR相比，具有完全相同的理化性质。但是前者具有同位素标记，在质谱检测的时候不会与后者产生交叉反应，因此可以同时检测。
灭活反应试管为2mL试管，内含100μg胰蛋白酶冻干粉。
所述快速检测标准多肽的浓度为100ng/ml。
一种非医学用途的降低医护人员感染风险的新冠病毒快速检测方法，包括如下步骤：
(1)现场采集样本直接放入已加入酶解反应液的灭活反应试管内；现场采集样本的同时，实验室内以快速检测标准多肽作为标准物质，采用液相色谱串联质谱为检测仪器，进样分析，建立标准图谱；
(2)运输回实验室途中，灭活反应试管放入便携式孵育器内，37℃孵育30～60分钟，然后将孵育器温度上升至100℃保持30分钟，以中止酶解反应；
(3)回到实验室样本经0.22微米滤膜过滤，然后上液相色谱串联质谱进行检测。
现场采集样本直接放入已加入酶解反应液的灭活反应试管内，检验人员无需二次开盖进行样本预处理操作，减少感染风险。
37℃孵育30～60分钟，一方面将病毒蛋白质外壳酶解成检测所需要的氨基酸序列，另一方面通过破坏病毒蛋白质外壳来达到降低感染风险的目的。将孵育器温度上升至100℃保持30分钟，一方面中止酶解反应，另一方面灭活可能残存的病毒，进一步降低感染风险。酶解灭活时间短，适合快速检测。
通常样本采集到送达实验室还有30分钟以上的时间，本方法有效利用样本运输时间进行酶解，从而到达实验室就能马上检测，缩短样本周转时期，酶解后的病毒被灭活从而降低检测人员感染风险。
本方案目的不是为了评判被检测对象的健康状况，本方案仅限于对于检测程序的改进，以尽可能降低医护人员和检测人员的感染风险，防止医护人员和检测人员因被检测物而受到病毒感染。
液相色谱串联质谱的液相检测条件为：
色谱柱：Waters BEH 300C18，规格100mm×2.1mm，粒径1.7μm；
柱温：40℃；样品温度：室温；
流动相：流动相A：含0.1％甲酸的水溶液；流动相B：含0.1％甲酸的乙腈溶液；
色谱分离梯度条件：在1分钟内将流动相B含量从2％提升至45％；
流速：0.3mL/min；
进样体积：10μL。
液相色谱串联质谱的质谱检测条件为：
ESI+离子源，毛细管电压：3.5kv，锥孔电压：25V，脱溶剂温度：400℃，脱溶剂气流量：650L/min，锥孔反吹气流量：20L/hr，碰撞室压力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5eV；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0eV；离子源温度：120℃，提取器电压：3.0V，监测模式采用多反应检测模式MRM，母离子：925.9，子离子：1062.4、645.3。
本发明的有益效果是：
1、快速：可以利用样本运输时间完成酶解工作，降低样本周转时间；每个样本的检测速度仅为1-2分钟，通量高。
2、低生物安全风险：通过蛋白酶解和高温两个手段灭活病毒，极大地降低了生物安全风险，最大可能性保护医务人员和检测工作者免受病毒感染的风险，同时也能让具有较低生物安全等级的实验室(例如基层医院、海关等)，也能够承接检测工作，达到分级诊疗的目的，降低三甲医院的压力。
3、在保证检测的灵敏度和特异性的前提下，可以对灭活后的病毒进行快速检测，获得准确检测结果。
附图说明
图1是不同多肽与酶解时间关系。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1：
一种用于灭活新冠病毒的快速检测试剂盒，包括以下组分：
(1)灭活反应试管(2mL试管)，内含100μg碱性胰蛋白酶冻干粉，
(2)酶解反应液：浓度500mmol/L的碳酸氢铵，浓度为50mmol/L的巯基乙醇，浓度为100ng/mL的同位素标记长多肽；同位素标记长多肽的氨基酸序列为：PQSNQRSAPRI*TFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRP(SEQ ID No.10)，其中I为[13C6,15N]-异亮氨酸。
(3)快速检测标准多肽；所述快速检测标准多肽的氨基酸序列为：ITFGGPTDSTDNNQNGGR(SEQ ID No.1)。快速检测标准多肽的浓度为100ng/ml(水溶液)。
本发明采用新型冠状病毒(SARS-CoV-2，阳性样本由本院自行采集)进行检测。
实施例2：
一种非医学用途的降低医护人员感染风险的新冠病毒快速检测方法，包括如下步骤：
(1)打开试剂盒，将1mL酶解反应液加入到内含100μg碱性胰蛋白酶冻干粉的2mL灭活反应试管内，摇匀，医务人员现场采集病人的咽拭子迅速放入灭活反应试管内；与此同时，实验室内以快速检测标准多肽作为标准物质，采用液相色谱串联质谱为检测仪器，进样分析，建立标准图谱；
(2)运输回实验室途中，灭活反应试管放入便携式孵育器(市售)内，37℃孵育30～60分钟(依据距离实验室的远近而定，距离越远孵育时间越长)，开盖操作前将孵育器温度上升至100℃保持30分钟，以中止酶解反应；
(3)回到实验室酶解产物经0.22微米滤膜过滤，然后上液相色谱串联质谱进行检测。
液相色谱串联质谱的液相检测条件为：
色谱柱：Waters BEH 300C18，规格100mm×2.1mm，粒径1.7μm；
柱温：40℃；样品温度：室温；
流动相：流动相A：含0.1％甲酸的水溶液；流动相B：含0.1％甲酸的乙腈溶液；
色谱分离梯度条件：在1分钟内将流动相B含量从2％提升至45％；
流速：0.3mL/min；
进样体积：10μL。
液相色谱串联质谱的质谱检测条件为：
ESI+离子源，毛细管电压：3.5kv，锥孔电压：25V，脱溶剂温度：400℃，脱溶剂气流量：650L/min，锥孔反吹气流量：20L/hr，碰撞室压力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5eV；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0eV；离子源温度：120℃，提取器电压：3.0V，监测模式采用多反应检测模式MRM监测模式采用多反应检测模式MRM。
MRM参数如下表
Figure GDA0002480887610000061
鉴定特异性
为了验证本发明的检测特异性，本研究选择甲型流感、乙型流感和新型冠状病毒患者的咽拭子作为样本(每个样本两个重复)，按照实施例2的方法进行检测。
样本编号 确诊疾病 采用实施例2的检测结果
1 甲型流感 阴性
2 甲型流感 阴性
3 甲型流感 阴性
4 乙型流感 阴性
5 乙型流感 阴性
6 乙型流感 阴性
7 新型冠状病毒 阳性
8 新型冠状病毒 阳性
检测结果显示，本方法具有特异性，能有效地与其他病毒区分开来。
根据酶解时间筛选特异性多肽
通常来说，一个蛋白质经过酶解可以获得若干个多肽，每个多肽的理化性质各异，包括灵敏度、稳定性、特异性等。因此，选择合适的多肽是本发明的关键，而酶解时间为本发明的主要关注因素，因此本发明首先根据酶解时间筛选多肽，以达到快速检测的目的。
以新型冠状病毒N蛋白为研究目标，其理论酶解多肽有31条。将N蛋白酶解后，鉴定获得23条多肽。由于部分多肽的灵敏性较低，不符合检测需求，因此建立了其中9个多肽的MRM检测方法。多肽序列见下表。
Figure GDA0002480887610000062
Figure GDA0002480887610000071
取一份阳性样本按照实施例2的方法酶解，酶解时间设置为0、10、20、30、40、50、60分钟，另选择一份样本过夜酶解，酶解产物采用质谱检测。以过夜酶解的样本回收率设定为100％，计算其他酶解时间下的多肽回收率，结果见图1。如图1所示，序列为ITFGGPTDSTDNNQNGGR、EGIVWVATEGALNTPK、QLQNSMSGASADSTQA的多肽在20分钟即可完全酶解，符合本发明在酶解时间方面的要求。因此，该三条多肽都可以作为候选标记物。并且在进一步考察中采用热稳定性为评判条件，进行进一步的筛选。
候选标记物的稳定性测试
不同多肽的氨基酸组成不同，其热稳定性也有所不同。因此，本发明对上述三条候选标记物多肽进行热稳定性测试。
将上述酶解产物置于便携孵育器中，将温度调节至100℃，分别保持15-90分钟后进行检测。
Figure GDA0002480887610000072
如表所示，ITFGGPTDSTDNNQNGGR、EGIVWVATEGALNTPK都能够在45分钟内保持稳定。QLQNSMSGASADSTQA的稳定性较差，在100℃环境下仅能保持15分钟的稳定性。因此，本发明选择稳定性最佳的ITFGGPTDSTDNNQNGGR作为检测标记物。
取两份阳性样本，分别采用本发明的正常试剂盒试剂，和采用加速破坏试验后的试剂盒试剂(即对试剂在70℃环境中处理72小时)进行检测，检测结果如下表：
ITFGGPTDSTDNNQNGGR I*TFGGPTDSTDNNQNGGR
正常试剂 检出 检出
加速破坏试验后的试剂 未检出 未检出
。
由结果可见，正常试剂可同时检测被测多肽以及同位素标记的被测多肽，结果准确可靠。试剂被加速破坏试验处理后，导致无法将被测多肽从病毒中酶解出来，产生假阴性检测结果。同位素标记的被测多肽同时无法测得，很好地指示了试剂状态，保证不会产生假阴性检测结果，确保结果的准确可靠。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学医学院附属第四医院（浙江省义乌医院、浙江大学医学院附属第四医院医共体）
<120> 一种用于灭活新冠病毒的快速检测试剂盒及方法
<130> 2020.03
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）
<400> 1
Ile Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly
1 5 10 15
Gly Arg
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）
<400> 2
Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr
1 5 10 15
Thr Leu Pro Lys
20
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）
<400> 3
Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr His Gly
1 5 10 15
Ala Ile Lys
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）
<400> 4
Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Met Asp Asp Phe Ser
1 5 10 15
Arg
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）
<400> 5
Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Asp Leu Ile Arg
1 5 10 15
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）
<400> 6
Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp
1 5 10 15
Arg
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）
<400> 7
Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys
1 5 10 15
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）
<400> 8
Gln Leu Gln Asn Ser Met Ser Gly Ala Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala
1 5 10 15
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）
<400> 9
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg
1 5 10
<210> 10
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile Thr Phe Gly Gly Pro
1 5 10 15
Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly Arg Asn Gly Ala Arg
20 25 30
Pro Lys Gln Arg Arg Pro
35

Claims (6)

1.一种用于灭活新冠病毒的快速检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：（1）灭活反应试管，内含胰蛋白酶冻干粉，（2）酶解反应液，（3）快速检测标准多肽；所述快速检测标准多肽的氨基酸序列为：ITFGGPTDSTDNNQNGGR；
所述酶解反应液组成为：浓度500mmol/L的碳酸氢铵，浓度为50mmol/L的巯基乙醇，浓度为100 ng/mL的同位素标记长多肽；所述同位素标记长多肽的氨基酸序列为：PQSNQRSAPRI*TFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRP，其中I为[13C6,15N]-异亮氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种用于灭活新冠病毒的快速检测试剂盒，其特征在于：胰蛋白酶为碱性胰蛋白酶。
3.根据权利要求1所述的一种用于灭活新冠病毒的快速检测试剂盒，其特征在于：所述快速检测标准多肽的浓度为100 ng/ml。
4.一种非医学用途的降低医护人员感染风险的新冠病毒快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）现场采集样本直接放入已加入酶解反应液的内含100µg碱性胰蛋白酶冻干粉的2mL灭活反应试管内；现场采集样本的同时，实验室内以快速检测标准多肽作为标准物质，采用液相色谱串联质谱为检测仪器，进样分析，建立标准图谱；
（2）运输回实验室途中，灭活反应试管放入便携式孵育器内， 37℃孵育30~60分钟，然后将孵育器温度上升至100 ℃保持30分钟，以中止酶解反应；
（3）回到实验室样本经0.22微米滤膜过滤，然后上液相色谱串联质谱进行检测；
所述酶解反应液组成为：浓度500mmol/L的碳酸氢铵，浓度为50mmol/L的巯基乙醇，浓度为100 ng/mL的同位素标记长多肽；所述同位素标记长多肽的氨基酸序列为：PQSNQRSAPRI*TFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRP，其中I为[13C6,15N]-异亮氨酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：液相色谱串联质谱的液相检测条件为：
色谱柱：Waters BEH 300 C18，规格100mm×2 .1mm，粒径1 .7μm；
柱温：40℃；样品温度：室温；
流动相：流动相A：含0 .1％甲酸的水溶液；流动相B：含0 .1％甲酸的乙腈溶液；
色谱分离梯度条件：在1分钟内将流动相B含量从2％提升至45％；
流速：0.3mL/min；
进样体积：10μL。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：液相色谱串联质谱的质谱检测条件为：
ESI+离子源，毛细管电压：3.5kv，锥孔电压：25V，脱溶剂温度：400℃，脱溶剂气流量：650L/min，锥孔反吹气流量：20L/hr，碰撞室压力：3 .0×10-3mbar；低端分辨率1：2 .5V，高端分辨率1：15 .0V，离子能量1：0 .5eV；低端分辨率2：2 .8V，高端分辨率2：15 .0V，离子能量2：1 .0eV；离子源温度：120℃，提取器电压：3.0V，监测模式采用多反应检测模式MRM，母离子：925.9，子离子：1062.4、645.3。
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