CN111321132B - 一种反应专一性提高的腈水解酶突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种反应专一性提高的腈水解酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。所述突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻腈水解酶的第77位、200位、224位或226位进行单位点突变或多位点突变获得。本发明通过对反应非专一性水稻腈水解酶分子改造，获得反应专一性显著提高的突变体，有利于定向生成目的产物。本发明构建的突变体Y77E/R224S/V226R催化苯乙腈，反应主产物为苯乙酰胺，占产物含量的94.8％；构建的突变体K200R/R224W催化苯乙腈，反应主产物为苯乙酸，占产物含量的95.1％。反应专一性调控后的腈水解酶突变体在羧酸和酰胺类化合物的绿色合成中具有重要工业应用潜力。

Description

一种反应专一性提高的腈水解酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及腈水解酶反应专一性改变的突变体及应用。
背景技术
腈化合物是有机化工的重要原料，易转化为酰胺、羧酸、氧肟酸和酮等高附加值化学品，广泛应用于化工、农药和医药等领域。腈的酶法水解与水合具有过程高效、环境友好以及高度化学、区域和立体选择性等显著优势，成为羧酸、酰胺工业合成的重要方法。
一般认为，腈水解酶仅会专一地催化腈化合物水解生成羧酸。但文献表明，一些腈水解酶同时具有腈水合活性，催化腈化合物生成相应的酰胺，如Bradyrhizobiumjaponicum腈水解酶催化β-氨基丙腈水解，β-氨基丙酰胺的比例高达33％(J.Mol.Catal.B:Enzym.,2015,115,113)；Pseudomonas sp.UW4腈水解酶催化吲哚-3-乙腈水解，吲哚-3-乙酰胺的含量是吲哚-3-乙酸的4.3倍(Appl.Environ.Microbiol.,2014,80,4640)。
腈水解酶同时具有腈水解和腈水合活性，即反应非专一性，使其在生物有机合成中既面临挑战，又蕴含应用潜力。一方面，腈水解酶的腈水合“副反应”存在会形成酰胺，不但降低腈水解反应产物羧酸的收率，也给后续分离工艺带来压力；另一方面，α-氨(羟)基酰胺的合成是制药工业中原子经济性和绿色化程度最低的反应类型之一。腈水合酶是催化合成酰胺的天然生物催化剂，但受氰离子(CN-)强烈抑制。当其催化α-氨(羟)基腈时，由于α-氨(羟)基腈在水溶液中存在与酮(醛)及HCN的解离平衡，强配位体CN-争夺腈水合酶活性中心的非血红素铁原子或非类可啉钴原子，形成低自旋的配合物，使酶不可逆失活。由于腈水解酶活性中心不需金属辅基，能够耐受高浓度氰离子，提高其酰胺合成能力可创制新型“腈水合酶”，开辟高效合成α-氨(羟)基酰胺的全新途径。因此，腈水解酶反应专一性调控对开发腈水解酶生物有机合成新功能具有重要意义。
国内外学者在腈水解酶反应专一性改造方面已经开展了一些研究。Kiziak等发现P.fluorescens EBC191腈水解酶165位丙氨酸被芳香族氨基酸取代后，降低了产物中扁桃酰胺的比例；而Alcaligenes faecalis腈水解酶164位色氨酸突变成丙氨酸后，扁桃酰胺的比例由0.7％上升至70％(Appl.Environ.Microbiol.,2009,75,5592)。Martínková等发现Neurospora crassa腈水解酶168位色氨酸突变成丙氨酸后，产物中酰胺的比例大幅升高(J.Mol.Catal.B Enzym.,2012,77,74-80.)。姜水琴等改造Synechocystis sp.PCC6803腈水解酶，获得了酰胺比例达到73％的突变体F193N，酰胺合成量是野生型的35倍，催化活力为野生型的50％(Catal.Sci.Technol.,2017,7,1122–1128)。以上研究为腈水解酶反应专一性调控提供了有益借鉴，但由于腈水合活力的强化或消除不彻底，突变体无法应用于工业生物催化过程。
发明内容
本发明的目的在于对水稻Oryza sativa腈水解酶(OsNIT)进行分子改造，获得腈水解酶反应专一性有效调控的突变体，从而满足工业生物催化应用的要求。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明通过分子改造对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻腈水解酶OsNIT的第77位、200位、224位或226位进行单位点突变或多位点突变，实现对该酶反应专一性的有效调控。其中第77位的酪氨酸Tyr突变为谷氨酸Glu、组氨酸His、亮氨酸Leu，第200位赖氨酸Lys突变为甲硫氨酸Met、精氨酸Arg，第224位精氨酸Arg突变为色氨酸Trp、丝氨酸Ser，第226位缬氨酸Val突变为精氨酸Arg。
本发明研究表明，第77位、200位和224位三个位点对腈水解酶反应专一性影响较大，第226位的突变能同时增加酰胺比例和提高转化率。
上述突变体可采用定点饱和突变及多轮定点突变构建获得。
具体地，本发明提供了腈水合反应活性提高的腈水解酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.11所示。
本发明获得的3个77位点突变的突变体催化苯乙腈的反应主产物为苯乙酰胺，且保留了较好活力。突变体Y77E产物中酰胺的比例达到84.1％，突变体Y77H产物中酰胺的比例达到69.5％，突变体Y77L产物中酰胺的比例达到94.1％。进一步构建的Y77E/R224S/V226R三重突变体，产物中酰胺的含量达到94.8％。
本发明提供了上述腈水合反应活性提高的腈水解酶突变体在催化苯乙腈合成苯乙酰胺中的应用。
所述的应用包括:以包含腈水解酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养后获得的湿菌体或者湿菌体破碎后提取的酶作为生物催化剂，以苯乙腈为底物，以pH为7.5～8.5的缓冲液为反应介质，30～60℃、150～500r/min条件下进行转化反应，反应结束后取反应液分离纯化，获得苯乙酰胺。
作为优选，反应体系中底物的浓度为30mM，催化剂的用量以湿菌体重量计为10g/L，其中湿菌体含水质量为88-92％。
作为优选，采用pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液，30℃下反应30min。
本发明提供了腈水解反应活性提高的腈水解酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。
本发明获得2个200位和2个224位位点突变的突变体，催化苯乙腈反应主产物为苯乙酸，且保留了高活力甚至活力有所提升。突变体K200M产物中羧酸的比例达到77.4％，突变体K200R产物中羧酸的比例达到68.3％。突变体R224W产物中羧酸的比例达到82.1％，突变体R224S产物中羧酸的比例达到61.0％。构建的双重突变体K200R/R224W产物中羧酸的比例达到95.1％。
本发明提供了上述腈水解反应活性提高的腈水解酶突变体在催化苯乙腈合成苯乙酸中的应用。
所述的应用包括：以包含腈水解酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养后获得的湿菌体或者湿菌体破碎后提取的酶作为生物催化剂，以苯乙腈为底物，以pH为7.5～8.5的缓冲液为反应介质，30～60℃、150～500r/min条件下进行转化反应，反应结束后取反应液分离纯化，获得苯乙酸。
作为优选，反应体系中底物的浓度为30mM，催化剂的用量以湿菌体重量计为10g/L，其中湿菌体含水质量为88-92％。
作为优选，采用pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液，30℃下反应30min。
所述工程菌的宿主细胞可采用大肠杆菌Escherichia coli BL21。
所述湿菌体的制备方法为：基因工程菌接种至含卡那霉素(终浓度为50mg/L)的LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下振荡培养6-8h；种子液以2％体积比接种至新鲜的含有卡那霉素(终浓度为50mg/L)的LB液体培养基中，37℃、180rpm条件下振荡培养至菌体OD600为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，28℃、180rpm诱导培养10-12h，于4℃、8000rpm离心10min收集菌体细胞。
本发明的有益效果体现在：
本发明通过对反应非专一性水稻腈水解酶OsNIT的分子改造，获得反应专一性显著提高的突变体，有利于定向生成目的产物。本发明构建的突变体Y77E/R224S/V226R催化苯乙腈，反应主产物为苯乙酰胺，占产物含量的94.8％；构建的突变体K200R/R224W催化苯乙腈，反应主产物为苯乙酸，占产物含量的95.1％。反应专一性调控后的腈水解酶突变体在羧酸和酰胺类化合物的绿色合成中具有重要工业应用潜力。
附图说明
图1为野生水稻腈水解酶OsNIT催化苯乙腈的反应进程。
图2为双重突变体K200R/R224W催化苯乙腈的反应进程。
图3为三重突变体Y77E/R224S/V226R催化苯乙腈的反应进程。
图4为野生型和突变体腈水解酶反应产物中酰胺占比测定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1
1、腈水解酶突变位点的选取
水稻腈水解酶(OsNIT，GenBank登录号：AB027054，氨基酸序列SEQ ID NO.1，核苷酸序列SEQ ID NO.2)催化苯乙腈反应时，产物中酰胺与羧酸的比例接近1:1，如图1所示。本发明通过生物信息学分析，确定其催化三联体为196Cys-71Glu-162Lys，进一步在催化口袋附近筛选出可能影响反应专一性的18个氨基酸残基：A72、A167、F175、E198、Y77、S229、T166、E169、I195、R224、S230、W197、H159、N199、K200、T220、A221和V226。
通过对上述氨基酸残基分别进行定点饱和突变，获得6个对催化反应专一性影响较大的突变位点Y77、I195、W197、N199、K200、T220、R224和V226，其中，包含Y77、K200、R224和V226位点突变的腈水解酶突变体，在反应专一性提高的同时，保留或提高了酶的催化活性。
本发明最终确定通过对第77位酪氨酸Tyr，第200位赖氨酸Lys，第224位Arg和第226位缬氨酸Val的定点饱和突变、组合突变，以获得具有高度反应专一性并且保持较高催化活力的腈水解酶突变体。
2、腈水解酶突变体重组菌的构建与表达
设计引物，通过PCR扩增在水稻腈水解酶末端加上His-tag标签，为腈水解酶纯化备用。
以含水稻腈水解酶(OsNIT)基因的质粒为模板，对第77、200、224、226位设计饱和突变引物序列如下：
表1
Figure BDA0002386185570000051
注：N＝A/G/C/T,K＝G/T,M＝A/C。
通过PCR对模板进行全质粒扩增，PCR反应体系(50μL)：Template DNA 0.5μl，Forward primer 1μl，Reverse primer 1μl，2×Phanta max buffer25μl，dNTP Max(10mMeach)1μl，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5μl，ddH2O 21μl。
PCR程序设定：96℃预变性2min；96℃变性10s，Tm+3℃退火5s，72℃延伸6.5min，30个循环；72℃终延伸10min。4℃保存。
PCR产物经过0.9％琼脂糖凝胶电泳分析为阳性后，取PCR反应液20μL，加入1μL限制性内切酶Dpn I于37℃酶切0.5-1h去除模板质粒DNA，65℃灭活15min。热击转化到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，复苏后涂布于含卡那霉素的LB平板上培养过夜，每个平板均获得约200个克隆的突变体库。挑取单菌落培养于含卡那霉素抗性(终浓度为50mg/L)的LB液体培养基中，提取质粒测序，筛选出所需的目的突变体。
将测序正确的突变体接种到含有卡那霉素(终浓度为50mg/L)的LB培养基中，37℃培养6-8h，以2％(v/v)接种量转接至新鲜的含有卡那霉素(终浓度为50mg/L)的LB液体培养基中进行扩大培养，37℃，180rpm培养至菌体OD600约为0.6-0.8时，向上述LB液体培养基中加入IPTG(终浓度为0.1mM)，28℃、180rpm诱导培养10-12h，于4℃、8000rpm离心10min收集菌体细胞。
3、腈水解酶突变体反应专一性和活力测定
对步骤2中获得的重组大肠杆菌进行活力测定。反应体系组成：10mL的Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH 8.0)，湿菌体0.1g，苯乙腈30mM(溶于甲醇)。反应液于30℃，180rpm反应30min。取样1mL，加入20μL 2M HCl终止反应，12,000rpm离心1min，取上清。经高效液相色谱HPLC分析产物中苯乙酸和苯乙酰胺的浓度和比例，并计算酶活。
液相色谱分析采用C18柱，柱温40℃，检测波长210nm，流动相为甲醇：水＝40:60(含0.1％H3PO4)，流速1ml/min。
利用上述方法对单点突变结果进行分析，发现第77位点的突变体可以改变反应专一性使其趋于生成酰胺，催化活力有较好的保留。如表2所示，突变体Y77E反应产物中酰胺比例提高至84.2％，催化活力为亲本的39.2％；突变体Y77H反应产物中酰胺比例提高至69.5％，催化活力为亲本的46.1％；突变体Y77L反应产物中酰胺比例提高至94.1％，催化活力为亲本的15.0％。
表2野生型腈水解酶与第77位突变体反应专一性和活力比较
Figure BDA0002386185570000071
第200和224位点的突变体可以改变反应专一性使反应趋于生成羧酸，同时催化活力有很好的保留甚至得到提升，如表3所示，突变体K200M反应产物中羧酸比例提高至77.4％，催化活力为亲本的95.0％；突变体K200R反应产物中羧酸比例提高至68.3％，催化活力为亲本的113.2％；突变体R224W反应产物中羧酸比例提高至82.1％，催化活力为亲本的209.4％；突变体R224S反应产物中羧酸比例提高至61.0％，催化活力为亲本的187.1％。
表3野生型腈水解酶与第200、224位突变体的反应专一性和活力比较
Figure BDA0002386185570000072
实施例2
1、腈水解酶多重突变体的构建与表达
以实施例1中获得的具有优良反应专一性或酶活性较高的突变体质粒为模板，结合其他位点的优良突变，如实施例1的PCR体系经过PCR扩增全质粒，获得多重突变体，进行热击转化将突变体导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中构建多重突变体工程菌，并对构建的多重突变体进行表达。
2、野生型菌株及含腈水解酶多重突变体菌的产物占比及活力测定
对获得的腈水解酶多重突变体菌进行活力测定。反应体系组成：10mL的Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH 8.0)，湿菌体10g/L，苯乙腈30mM(溶于甲醇)。反应液于30℃下反应30min，加入20μL 2M HCl终止反应，12,000rpm离心1min，取上清。如实例1中所述，经高效液相色谱HPLC分析产物中苯乙酸和苯乙酰胺的浓度。多重突变体腈水解酶催化苯乙腈的反应进程如图2、3所示。野生型和突变体腈水解酶反应产物中酰胺占比和活力测定结果见表4和图4。
表4野生型腈水解酶与多重突变体的反应专一性和活力比较
Figure BDA0002386185570000081
多重突变体的反应专一性较亲本明显提高，其中突变体K200R/R224W反应产物中羧酸比例由49.6％提高至95.1％，催化活力为亲本的261％；而突变体Y77E/R224S/V226R反应产物中酰胺比例由50.4％提高至94.8％，催化活力为亲本的22.4％。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种反应专一性提高的腈水解酶突变体及其应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 水稻(Oryza sativa)
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1 5 10 15
Glu Val Glu Met Asn Gly Gly Ala Thr Ser Gly Ala Ala Thr Val Arg
20 25 30
Ala Thr Val Val Gln Ala Ser Thr Val Phe Tyr Asp Thr Pro Ala Thr
35 40 45
Leu Asp Lys Ala Glu Arg Leu Ile Glu Glu Ala Ala Gly Tyr Gly Ser
50 55 60
Gln Leu Val Val Phe Pro Glu Ala Phe Val Gly Gly Tyr Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ser Thr Phe Gly Phe Gly Ala Asn Ile Ser Ile Gly Asn Pro Lys Asp
85 90 95
Lys Gly Lys Glu Glu Phe Arg Lys Tyr His Ala Ala Ala Ile Glu Val
100 105 110
Pro Gly Pro Glu Val Thr Arg Leu Ala Ala Met Ala Gly Lys Tyr Lys
115 120 125
Val Phe Leu Val Met Gly Val Ile Glu Arg Glu Gly Tyr Thr Leu Tyr
130 135 140
Cys Ser Val Leu Phe Phe Asp Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Gly Lys His
145 150 155 160
Arg Lys Leu Met Pro Thr Ala Leu Glu Arg Ile Ile Trp Gly Phe Gly
165 170 175
Asp Gly Ser Thr Ile Pro Val Tyr Asp Thr Pro Leu Gly Lys Ile Gly
180 185 190
Ala Leu Ile Cys Trp Glu Asn Lys Met Pro Leu Leu Arg Thr Ala Leu
195 200 205
Tyr Gly Lys Gly Ile Glu Ile Tyr Cys Ala Pro Thr Ala Asp Ser Arg
210 215 220
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225 230 235 240
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Pro Pro Glu Tyr Val Phe Thr Gly Leu Gly Glu Glu Pro Ser Pro Asp
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Thr Val Val Cys Pro Gly Gly Ser Val Ile Ile Ser Pro Ser Gly Glu
275 280 285
Val Leu Ala Gly Pro Asn Tyr Glu Gly Glu Ala Leu Ile Thr Ala Asp
290 295 300
Leu Asp Leu Gly Glu Ile Val Arg Ala Lys Phe Asp Phe Asp Val Val
305 310 315 320
Gly His Tyr Ala Arg Pro Glu Val Leu Ser Leu Val Val Asn Asp Gln
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Pro His Leu Pro Val Ser Phe Thr Ser Ala Ala Glu Lys Thr Thr Ala
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<213> 水稻(Oryza sativa)
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<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ala Met Val Pro Ser Gly Ser Gly Gly Gly Pro Pro Val Ile Ala
1 5 10 15
Glu Val Glu Met Asn Gly Gly Ala Thr Ser Gly Ala Ala Thr Val Arg
20 25 30
Ala Thr Val Val Gln Ala Ser Thr Val Phe Tyr Asp Thr Pro Ala Thr
35 40 45
Leu Asp Lys Ala Glu Arg Leu Ile Glu Glu Ala Ala Gly Tyr Gly Ser
50 55 60
Gln Leu Val Val Phe Pro Glu Ala Phe Val Gly Gly Glu Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ser Thr Phe Gly Phe Gly Ala Asn Ile Ser Ile Gly Asn Pro Lys Asp
85 90 95
Lys Gly Lys Glu Glu Phe Arg Lys Tyr His Ala Ala Ala Ile Glu Val
100 105 110
Pro Gly Pro Glu Val Thr Arg Leu Ala Ala Met Ala Gly Lys Tyr Lys
115 120 125
Val Phe Leu Val Met Gly Val Ile Glu Arg Glu Gly Tyr Thr Leu Tyr
130 135 140
Cys Ser Val Leu Phe Phe Asp Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Gly Lys His
145 150 155 160
Arg Lys Leu Met Pro Thr Ala Leu Glu Arg Ile Ile Trp Gly Phe Gly
165 170 175
Asp Gly Ser Thr Ile Pro Val Tyr Asp Thr Pro Leu Gly Lys Ile Gly
180 185 190
Ala Leu Ile Cys Trp Glu Asn Lys Met Pro Leu Leu Arg Thr Ala Leu
195 200 205
Tyr Gly Lys Gly Ile Glu Ile Tyr Cys Ala Pro Thr Ala Asp Ser Arg
210 215 220
Gln Val Trp Gln Ala Ser Met Thr His Ile Ala Leu Glu Gly Gly Cys
225 230 235 240
Phe Val Leu Ser Ala Asn Gln Phe Cys Arg Arg Lys Asp Tyr Pro Pro
245 250 255
Pro Pro Glu Tyr Val Phe Thr Gly Leu Gly Glu Glu Pro Ser Pro Asp
260 265 270
Thr Val Val Cys Pro Gly Gly Ser Val Ile Ile Ser Pro Ser Gly Glu
275 280 285
Val Leu Ala Gly Pro Asn Tyr Glu Gly Glu Ala Leu Ile Thr Ala Asp
290 295 300
Leu Asp Leu Gly Glu Ile Val Arg Ala Lys Phe Asp Phe Asp Val Val
305 310 315 320
Gly His Tyr Ala Arg Pro Glu Val Leu Ser Leu Val Val Asn Asp Gln
325 330 335
Pro His Leu Pro Val Ser Phe Thr Ser Ala Ala Glu Lys Thr Thr Ala
340 345 350
Ala Lys Ser Asp Ser Thr Ala Lys Pro Tyr
355 360
<210> 4
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Met Val Pro Ser Gly Ser Gly Gly Gly Pro Pro Val Ile Ala
1 5 10 15
Glu Val Glu Met Asn Gly Gly Ala Thr Ser Gly Ala Ala Thr Val Arg
20 25 30
Ala Thr Val Val Gln Ala Ser Thr Val Phe Tyr Asp Thr Pro Ala Thr
35 40 45
Leu Asp Lys Ala Glu Arg Leu Ile Glu Glu Ala Ala Gly Tyr Gly Ser
50 55 60
Gln Leu Val Val Phe Pro Glu Ala Phe Val Gly Gly His Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ser Thr Phe Gly Phe Gly Ala Asn Ile Ser Ile Gly Asn Pro Lys Asp
85 90 95
Lys Gly Lys Glu Glu Phe Arg Lys Tyr His Ala Ala Ala Ile Glu Val
100 105 110
Pro Gly Pro Glu Val Thr Arg Leu Ala Ala Met Ala Gly Lys Tyr Lys
115 120 125
Val Phe Leu Val Met Gly Val Ile Glu Arg Glu Gly Tyr Thr Leu Tyr
130 135 140
Cys Ser Val Leu Phe Phe Asp Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Gly Lys His
145 150 155 160
Arg Lys Leu Met Pro Thr Ala Leu Glu Arg Ile Ile Trp Gly Phe Gly
165 170 175
Asp Gly Ser Thr Ile Pro Val Tyr Asp Thr Pro Leu Gly Lys Ile Gly
180 185 190
Ala Leu Ile Cys Trp Glu Asn Lys Met Pro Leu Leu Arg Thr Ala Leu
195 200 205
Tyr Gly Lys Gly Ile Glu Ile Tyr Cys Ala Pro Thr Ala Asp Ser Arg
210 215 220
Gln Val Trp Gln Ala Ser Met Thr His Ile Ala Leu Glu Gly Gly Cys
225 230 235 240
Phe Val Leu Ser Ala Asn Gln Phe Cys Arg Arg Lys Asp Tyr Pro Pro
245 250 255
Pro Pro Glu Tyr Val Phe Thr Gly Leu Gly Glu Glu Pro Ser Pro Asp
260 265 270
Thr Val Val Cys Pro Gly Gly Ser Val Ile Ile Ser Pro Ser Gly Glu
275 280 285
Val Leu Ala Gly Pro Asn Tyr Glu Gly Glu Ala Leu Ile Thr Ala Asp
290 295 300
Leu Asp Leu Gly Glu Ile Val Arg Ala Lys Phe Asp Phe Asp Val Val
305 310 315 320
Gly His Tyr Ala Arg Pro Glu Val Leu Ser Leu Val Val Asn Asp Gln
325 330 335
Pro His Leu Pro Val Ser Phe Thr Ser Ala Ala Glu Lys Thr Thr Ala
340 345 350
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355 360
<210> 5
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Ala Met Val Pro Ser Gly Ser Gly Gly Gly Pro Pro Val Ile Ala
1 5 10 15
Glu Val Glu Met Asn Gly Gly Ala Thr Ser Gly Ala Ala Thr Val Arg
20 25 30
Ala Thr Val Val Gln Ala Ser Thr Val Phe Tyr Asp Thr Pro Ala Thr
35 40 45
Leu Asp Lys Ala Glu Arg Leu Ile Glu Glu Ala Ala Gly Tyr Gly Ser
50 55 60
Gln Leu Val Val Phe Pro Glu Ala Phe Val Gly Gly Leu Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ser Thr Phe Gly Phe Gly Ala Asn Ile Ser Ile Gly Asn Pro Lys Asp
85 90 95
Lys Gly Lys Glu Glu Phe Arg Lys Tyr His Ala Ala Ala Ile Glu Val
100 105 110
Pro Gly Pro Glu Val Thr Arg Leu Ala Ala Met Ala Gly Lys Tyr Lys
115 120 125
Val Phe Leu Val Met Gly Val Ile Glu Arg Glu Gly Tyr Thr Leu Tyr
130 135 140
Cys Ser Val Leu Phe Phe Asp Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Gly Lys His
145 150 155 160
Arg Lys Leu Met Pro Thr Ala Leu Glu Arg Ile Ile Trp Gly Phe Gly
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Tyr Gly Lys Gly Ile Glu Ile Tyr Cys Ala Pro Thr Ala Asp Ser Arg
210 215 220
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225 230 235 240
Phe Val Leu Ser Ala Asn Gln Phe Cys Arg Arg Lys Asp Tyr Pro Pro
245 250 255
Pro Pro Glu Tyr Val Phe Thr Gly Leu Gly Glu Glu Pro Ser Pro Asp
260 265 270
Thr Val Val Cys Pro Gly Gly Ser Val Ile Ile Ser Pro Ser Gly Glu
275 280 285
Val Leu Ala Gly Pro Asn Tyr Glu Gly Glu Ala Leu Ile Thr Ala Asp
290 295 300
Leu Asp Leu Gly Glu Ile Val Arg Ala Lys Phe Asp Phe Asp Val Val
305 310 315 320
Gly His Tyr Ala Arg Pro Glu Val Leu Ser Leu Val Val Asn Asp Gln
325 330 335
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340 345 350
Ala Lys Ser Asp Ser Thr Ala Lys Pro Tyr
355 360
<210> 6
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Leu Asp Lys Ala Glu Arg Leu Ile Glu Glu Ala Ala Gly Tyr Gly Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Pro Gly Pro Glu Val Thr Arg Leu Ala Ala Met Ala Gly Lys Tyr Lys
115 120 125
Val Phe Leu Val Met Gly Val Ile Glu Arg Glu Gly Tyr Thr Leu Tyr
130 135 140
Cys Ser Val Leu Phe Phe Asp Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Gly Lys His
145 150 155 160
Arg Lys Leu Met Pro Thr Ala Leu Glu Arg Ile Ile Trp Gly Phe Gly
165 170 175
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180 185 190
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210 215 220
Gln Val Trp Gln Ala Ser Met Thr His Ile Ala Leu Glu Gly Gly Cys
225 230 235 240
Phe Val Leu Ser Ala Asn Gln Phe Cys Arg Arg Lys Asp Tyr Pro Pro
245 250 255
Pro Pro Glu Tyr Val Phe Thr Gly Leu Gly Glu Glu Pro Ser Pro Asp
260 265 270
Thr Val Val Cys Pro Gly Gly Ser Val Ile Ile Ser Pro Ser Gly Glu
275 280 285
Val Leu Ala Gly Pro Asn Tyr Glu Gly Glu Ala Leu Ile Thr Ala Asp
290 295 300
Leu Asp Leu Gly Glu Ile Val Arg Ala Lys Phe Asp Phe Asp Val Val
305 310 315 320
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325 330 335
Pro His Leu Pro Val Ser Phe Thr Ser Ala Ala Glu Lys Thr Thr Ala
340 345 350
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355 360
<210> 7
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Ala Met Val Pro Ser Gly Ser Gly Gly Gly Pro Pro Val Ile Ala
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Leu Asp Lys Ala Glu Arg Leu Ile Glu Glu Ala Ala Gly Tyr Gly Ser
50 55 60
Gln Leu Val Val Phe Pro Glu Ala Phe Val Gly Gly Tyr Pro Arg Gly
65 70 75 80
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85 90 95
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Pro Gly Pro Glu Val Thr Arg Leu Ala Ala Met Ala Gly Lys Tyr Lys
115 120 125
Val Phe Leu Val Met Gly Val Ile Glu Arg Glu Gly Tyr Thr Leu Tyr
130 135 140
Cys Ser Val Leu Phe Phe Asp Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Gly Lys His
145 150 155 160
Arg Lys Leu Met Pro Thr Ala Leu Glu Arg Ile Ile Trp Gly Phe Gly
165 170 175
Asp Gly Ser Thr Ile Pro Val Tyr Asp Thr Pro Leu Gly Lys Ile Gly
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Gln Val Trp Gln Ala Ser Met Thr His Ile Ala Leu Glu Gly Gly Cys
225 230 235 240
Phe Val Leu Ser Ala Asn Gln Phe Cys Arg Arg Lys Asp Tyr Pro Pro
245 250 255
Pro Pro Glu Tyr Val Phe Thr Gly Leu Gly Glu Glu Pro Ser Pro Asp
260 265 270
Thr Val Val Cys Pro Gly Gly Ser Val Ile Ile Ser Pro Ser Gly Glu
275 280 285
Val Leu Ala Gly Pro Asn Tyr Glu Gly Glu Ala Leu Ile Thr Ala Asp
290 295 300
Leu Asp Leu Gly Glu Ile Val Arg Ala Lys Phe Asp Phe Asp Val Val
305 310 315 320
Gly His Tyr Ala Arg Pro Glu Val Leu Ser Leu Val Val Asn Asp Gln
325 330 335
Pro His Leu Pro Val Ser Phe Thr Ser Ala Ala Glu Lys Thr Thr Ala
340 345 350
Ala Lys Ser Asp Ser Thr Ala Lys Pro Tyr
355 360
<210> 8
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Ala Met Val Pro Ser Gly Ser Gly Gly Gly Pro Pro Val Ile Ala
1 5 10 15
Glu Val Glu Met Asn Gly Gly Ala Thr Ser Gly Ala Ala Thr Val Arg
20 25 30
Ala Thr Val Val Gln Ala Ser Thr Val Phe Tyr Asp Thr Pro Ala Thr
35 40 45
Leu Asp Lys Ala Glu Arg Leu Ile Glu Glu Ala Ala Gly Tyr Gly Ser
50 55 60
Gln Leu Val Val Phe Pro Glu Ala Phe Val Gly Gly Tyr Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ser Thr Phe Gly Phe Gly Ala Asn Ile Ser Ile Gly Asn Pro Lys Asp
85 90 95
Lys Gly Lys Glu Glu Phe Arg Lys Tyr His Ala Ala Ala Ile Glu Val
100 105 110
Pro Gly Pro Glu Val Thr Arg Leu Ala Ala Met Ala Gly Lys Tyr Lys
115 120 125
Val Phe Leu Val Met Gly Val Ile Glu Arg Glu Gly Tyr Thr Leu Tyr
130 135 140
Cys Ser Val Leu Phe Phe Asp Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Gly Lys His
145 150 155 160
Arg Lys Leu Met Pro Thr Ala Leu Glu Arg Ile Ile Trp Gly Phe Gly
165 170 175
Asp Gly Ser Thr Ile Pro Val Tyr Asp Thr Pro Leu Gly Lys Ile Gly
180 185 190
Ala Leu Ile Cys Trp Glu Asn Lys Met Pro Leu Leu Arg Thr Ala Leu
195 200 205
Tyr Gly Lys Gly Ile Glu Ile Tyr Cys Ala Pro Thr Ala Asp Ser Trp
210 215 220
Gln Val Trp Gln Ala Ser Met Thr His Ile Ala Leu Glu Gly Gly Cys
225 230 235 240
Phe Val Leu Ser Ala Asn Gln Phe Cys Arg Arg Lys Asp Tyr Pro Pro
245 250 255
Pro Pro Glu Tyr Val Phe Thr Gly Leu Gly Glu Glu Pro Ser Pro Asp
260 265 270
Thr Val Val Cys Pro Gly Gly Ser Val Ile Ile Ser Pro Ser Gly Glu
275 280 285
Val Leu Ala Gly Pro Asn Tyr Glu Gly Glu Ala Leu Ile Thr Ala Asp
290 295 300
Leu Asp Leu Gly Glu Ile Val Arg Ala Lys Phe Asp Phe Asp Val Val
305 310 315 320
Gly His Tyr Ala Arg Pro Glu Val Leu Ser Leu Val Val Asn Asp Gln
325 330 335
Pro His Leu Pro Val Ser Phe Thr Ser Ala Ala Glu Lys Thr Thr Ala
340 345 350
Ala Lys Ser Asp Ser Thr Ala Lys Pro Tyr
355 360
<210> 9
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Ala Met Val Pro Ser Gly Ser Gly Gly Gly Pro Pro Val Ile Ala
1 5 10 15
Glu Val Glu Met Asn Gly Gly Ala Thr Ser Gly Ala Ala Thr Val Arg
20 25 30
Ala Thr Val Val Gln Ala Ser Thr Val Phe Tyr Asp Thr Pro Ala Thr
35 40 45
Leu Asp Lys Ala Glu Arg Leu Ile Glu Glu Ala Ala Gly Tyr Gly Ser
50 55 60
Gln Leu Val Val Phe Pro Glu Ala Phe Val Gly Gly Tyr Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ser Thr Phe Gly Phe Gly Ala Asn Ile Ser Ile Gly Asn Pro Lys Asp
85 90 95
Lys Gly Lys Glu Glu Phe Arg Lys Tyr His Ala Ala Ala Ile Glu Val
100 105 110
Pro Gly Pro Glu Val Thr Arg Leu Ala Ala Met Ala Gly Lys Tyr Lys
115 120 125
Val Phe Leu Val Met Gly Val Ile Glu Arg Glu Gly Tyr Thr Leu Tyr
130 135 140
Cys Ser Val Leu Phe Phe Asp Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Gly Lys His
145 150 155 160
Arg Lys Leu Met Pro Thr Ala Leu Glu Arg Ile Ile Trp Gly Phe Gly
165 170 175
Asp Gly Ser Thr Ile Pro Val Tyr Asp Thr Pro Leu Gly Lys Ile Gly
180 185 190
Ala Leu Ile Cys Trp Glu Asn Lys Met Pro Leu Leu Arg Thr Ala Leu
195 200 205
Tyr Gly Lys Gly Ile Glu Ile Tyr Cys Ala Pro Thr Ala Asp Ser Ser
210 215 220
Gln Val Trp Gln Ala Ser Met Thr His Ile Ala Leu Glu Gly Gly Cys
225 230 235 240
Phe Val Leu Ser Ala Asn Gln Phe Cys Arg Arg Lys Asp Tyr Pro Pro
245 250 255
Pro Pro Glu Tyr Val Phe Thr Gly Leu Gly Glu Glu Pro Ser Pro Asp
260 265 270
Thr Val Val Cys Pro Gly Gly Ser Val Ile Ile Ser Pro Ser Gly Glu
275 280 285
Val Leu Ala Gly Pro Asn Tyr Glu Gly Glu Ala Leu Ile Thr Ala Asp
290 295 300
Leu Asp Leu Gly Glu Ile Val Arg Ala Lys Phe Asp Phe Asp Val Val
305 310 315 320
Gly His Tyr Ala Arg Pro Glu Val Leu Ser Leu Val Val Asn Asp Gln
325 330 335
Pro His Leu Pro Val Ser Phe Thr Ser Ala Ala Glu Lys Thr Thr Ala
340 345 350
Ala Lys Ser Asp Ser Thr Ala Lys Pro Tyr
355 360
<210> 10
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Ala Met Val Pro Ser Gly Ser Gly Gly Gly Pro Pro Val Ile Ala
1 5 10 15
Glu Val Glu Met Asn Gly Gly Ala Thr Ser Gly Ala Ala Thr Val Arg
20 25 30
Ala Thr Val Val Gln Ala Ser Thr Val Phe Tyr Asp Thr Pro Ala Thr
35 40 45
Leu Asp Lys Ala Glu Arg Leu Ile Glu Glu Ala Ala Gly Tyr Gly Ser
50 55 60
Gln Leu Val Val Phe Pro Glu Ala Phe Val Gly Gly Tyr Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ser Thr Phe Gly Phe Gly Ala Asn Ile Ser Ile Gly Asn Pro Lys Asp
85 90 95
Lys Gly Lys Glu Glu Phe Arg Lys Tyr His Ala Ala Ala Ile Glu Val
100 105 110
Pro Gly Pro Glu Val Thr Arg Leu Ala Ala Met Ala Gly Lys Tyr Lys
115 120 125
Val Phe Leu Val Met Gly Val Ile Glu Arg Glu Gly Tyr Thr Leu Tyr
130 135 140
Cys Ser Val Leu Phe Phe Asp Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Gly Lys His
145 150 155 160
Arg Lys Leu Met Pro Thr Ala Leu Glu Arg Ile Ile Trp Gly Phe Gly
165 170 175
Asp Gly Ser Thr Ile Pro Val Tyr Asp Thr Pro Leu Gly Lys Ile Gly
180 185 190
Ala Leu Ile Cys Trp Glu Asn Arg Met Pro Leu Leu Arg Thr Ala Leu
195 200 205
Tyr Gly Lys Gly Ile Glu Ile Tyr Cys Ala Pro Thr Ala Asp Ser Trp
210 215 220
Gln Val Trp Gln Ala Ser Met Thr His Ile Ala Leu Glu Gly Gly Cys
225 230 235 240
Phe Val Leu Ser Ala Asn Gln Phe Cys Arg Arg Lys Asp Tyr Pro Pro
245 250 255
Pro Pro Glu Tyr Val Phe Thr Gly Leu Gly Glu Glu Pro Ser Pro Asp
260 265 270
Thr Val Val Cys Pro Gly Gly Ser Val Ile Ile Ser Pro Ser Gly Glu
275 280 285
Val Leu Ala Gly Pro Asn Tyr Glu Gly Glu Ala Leu Ile Thr Ala Asp
290 295 300
Leu Asp Leu Gly Glu Ile Val Arg Ala Lys Phe Asp Phe Asp Val Val
305 310 315 320
Gly His Tyr Ala Arg Pro Glu Val Leu Ser Leu Val Val Asn Asp Gln
325 330 335
Pro His Leu Pro Val Ser Phe Thr Ser Ala Ala Glu Lys Thr Thr Ala
340 345 350
Ala Lys Ser Asp Ser Thr Ala Lys Pro Tyr
355 360
<210> 11
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Ala Met Val Pro Ser Gly Ser Gly Gly Gly Pro Pro Val Ile Ala
1 5 10 15
Glu Val Glu Met Asn Gly Gly Ala Thr Ser Gly Ala Ala Thr Val Arg
20 25 30
Ala Thr Val Val Gln Ala Ser Thr Val Phe Tyr Asp Thr Pro Ala Thr
35 40 45
Leu Asp Lys Ala Glu Arg Leu Ile Glu Glu Ala Ala Gly Tyr Gly Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Thr Phe Gly Phe Gly Ala Asn Ile Ser Ile Gly Asn Pro Lys Asp
85 90 95
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100 105 110
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130 135 140
Cys Ser Val Leu Phe Phe Asp Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Gly Lys His
145 150 155 160
Arg Lys Leu Met Pro Thr Ala Leu Glu Arg Ile Ile Trp Gly Phe Gly
165 170 175
Asp Gly Ser Thr Ile Pro Val Tyr Asp Thr Pro Leu Gly Lys Ile Gly
180 185 190
Ala Leu Ile Cys Trp Glu Asn Lys Met Pro Leu Leu Arg Thr Ala Leu
195 200 205
Tyr Gly Lys Gly Ile Glu Ile Tyr Cys Ala Pro Thr Ala Asp Ser Ser
210 215 220
Gln Arg Trp Gln Ala Ser Met Thr His Ile Ala Leu Glu Gly Gly Cys
225 230 235 240
Phe Val Leu Ser Ala Asn Gln Phe Cys Arg Arg Lys Asp Tyr Pro Pro
245 250 255
Pro Pro Glu Tyr Val Phe Thr Gly Leu Gly Glu Glu Pro Ser Pro Asp
260 265 270
Thr Val Val Cys Pro Gly Gly Ser Val Ile Ile Ser Pro Ser Gly Glu
275 280 285
Val Leu Ala Gly Pro Asn Tyr Glu Gly Glu Ala Leu Ile Thr Ala Asp
290 295 300
Leu Asp Leu Gly Glu Ile Val Arg Ala Lys Phe Asp Phe Asp Val Val
305 310 315 320
Gly His Tyr Ala Arg Pro Glu Val Leu Ser Leu Val Val Asn Asp Gln
325 330 335
Pro His Leu Pro Val Ser Phe Thr Ser Ala Ala Glu Lys Thr Thr Ala
340 345 350
Ala Lys Ser Asp Ser Thr Ala Lys Pro Tyr
355 360

Claims (7)

1.一种反应专一性提高的腈水解酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.9、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示。
2.如权利要求1所述的反应专一性提高的腈水解酶突变体在催化苯乙腈合成苯乙酰胺中的应用，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5或SEQ ID NO.11所示。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括：以包含腈水解酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养后获得的湿菌体或者湿菌体破碎后提取的酶作为生物催化剂，以苯乙腈为底物，以pH为7.5～8.5的缓冲液为反应介质，30～60℃、150～500r/min条件下进行转化反应，反应结束后取反应液分离纯化，获得苯乙酰胺。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，反应体系中底物的浓度为30mM，催化剂的用量以湿菌体重量计为10g/L，其中湿菌体含水质量为88-92％。
5.如权利要求1所述的反应专一性提高的腈水解酶突变体在催化苯乙腈合成苯乙酸中的应用，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，包括：以包含腈水解酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养后获得的湿菌体或者湿菌体破碎后提取的酶作为生物催化剂，以苯乙腈为底物，以pH为7.5～8.5的缓冲液为反应介质，30～60℃、150～500r/min条件下进行转化反应，反应结束后取反应液分离纯化，获得苯乙酸。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，反应体系中底物的浓度为30mM，催化剂的用量以湿菌体重量计为10g/L，其中湿菌体含水质量为88-92％。
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