CN111320707A - 一种虾夷扇贝裙边多糖及其提取方法和应用 - Google Patents

一种虾夷扇贝裙边多糖及其提取方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111320707A
CN111320707A CN202010249034.XA CN202010249034A CN111320707A CN 111320707 A CN111320707 A CN 111320707A CN 202010249034 A CN202010249034 A CN 202010249034A CN 111320707 A CN111320707 A CN 111320707A
Authority
CN
China
Prior art keywords
skirt
polysaccharide
dry powder
patinopecten yessoensis
supernatant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010249034.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN111320707B (zh
Inventor
宋爽
刘正奇
温成荣
艾春青
董秀萍
付颖寰
杨静峰
祁立波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian Polytechnic University
Original Assignee
Dalian Polytechnic University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian Polytechnic University filed Critical Dalian Polytechnic University
Priority to CN202010249034.XA priority Critical patent/CN111320707B/zh
Publication of CN111320707A publication Critical patent/CN111320707A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111320707B publication Critical patent/CN111320707B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种虾夷扇贝裙边多糖，以虾夷扇贝加工产生的裙边副产物为原料，通过酶解和色谱分离等过程制备得到一种酸性多糖成分，其含有硫酸基，由多种单糖残基构成，主要由类似肝素结构(→4)β‑GlcA(1→4)α‑GlcNAc→)的糖链和类似硫酸软骨素结构(→4)β‑GlcA(1→3)‑GalNAc→)的糖链组成。所述虾夷扇贝裙边多糖具有提高细胞产生一氧化氮含量和提高细胞因子转录水平的免疫刺激作用。

Description

一种虾夷扇贝裙边多糖及其提取方法和应用
技术领域
本发明总地涉及活性多糖技术领域，具体涉及一种虾夷扇贝裙边多糖及其提取方法和应用。
背景技术
虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)，是我国最主要的养殖经济贝类之一，产自我国辽宁省和山东省。贝柱作为扇贝中最具经济价值的部位，是扇贝加工的主要产品。伴随扇贝加工业的不断发展，随之而来的问题是加工过程中产生大量的副产物。扇贝裙边是扇贝加工的副产物之一，主要是扇贝的外套膜。目前这些扇贝裙边因为其价值低，通常被丢弃，不仅造成环境的污染，也是生物资源的浪费。因此，开发利用扇贝裙边具有重要意义。
免疫***是人体抵御外来侵害的最主要防线。目前，利用天然无毒的免疫调节剂来提高人体的免疫力成为备受关注的研究课题。最常用的免疫刺激剂有左旋咪唑、脂多糖和葡聚糖等。开发效果明显、副作用小、无残留的新型免疫刺激剂成为当前尤为重要的任务。
发明内容
本发明的目的在于提供一种虾夷扇贝裙边多糖，以虾夷扇贝加工产生的裙边副产物为原料，通过酶解和色谱分离等过程制备得到一种酸性多糖成分，其含有硫酸基，由多种单糖残基构成，两条主链分别由(→4)β-GlcA(1→4)α-GlcNAc→)结构和(→4)β-GlcA(1→3)-GalNAc→)结构组成。这种酸性多糖具有提高细胞产生一氧化氮含量和提高细胞因子转录水平的免疫刺激作用。
本发明提供了一种虾夷扇贝裙边多糖(SPYP)，其所述酸性多糖的两条主链分别由(→4)β-GlcA(1→4)α-GlcNAc→)结构和(→4)β-GlcA(1→3)-GalNAc→)结构组成；其中，所述多糖的硫酸基含量为5.73％～5.95％，糖醛酸含量为11.96％～13.84％；所述多糖的重均分子量为13.58kDa；所述多糖的单糖组成包括甘露糖(Man)、氨基葡萄糖(GlcN)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、氨基半乳糖(GalN)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、岩藻糖(Fuc)；所述虾夷扇贝裙边多糖，单糖组成的摩尔比具体为甘露糖∶氨基葡萄糖∶鼠李糖∶葡萄糖醛酸∶氨基半乳糖∶葡萄糖∶半乳糖∶岩藻糖＝17.7∶11.7∶12.1∶1.0∶15.9∶8.0∶23.7∶24.7。
本发明还提供了所述虾夷扇贝裙边多糖的提取方法，包括步骤：
S1、取虾夷扇贝裙边，真空冷冻干燥，破碎成粉，得虾夷扇贝裙边干粉，所述虾夷扇贝裙边干粉为含水重量≤5％的粉末；向所述虾夷扇贝裙边干粉中加入其重量3～5倍体积的水(g/ml)，再加入所述虾夷扇贝裙边干粉重量0.5～1.5％(m/m)的胰蛋白酶干粉，所述胰蛋白酶干粉的酶活≥250USP U/mg，37～40℃水浴震荡酶解2～4h之后加入所述虾夷扇贝裙边干粉重量1.0～1.5％(m/m)的木瓜蛋白酶干粉，所述木瓜蛋白酶干粉的酶活≥2000U/mg，50～60℃水浴震荡酶解2～4h制得混合溶液；
S2、将步骤S1所述混合溶液加热灭酶，冷却至室温，调节pH＝7.0，离心取上清液；
S3、向步骤S2所述上清液中加入其体积10～20％(v/v)的D204型大孔树脂，35～39℃水浴搅拌吸附5～7h后装入色谱柱中，用去离子水洗至滤出液无颜色；
S4、用1.5mol/L NaCl溶液洗脱3～5倍柱体积，收集滤出液；
S5、向步骤S4所述滤出液中加入其体积3～4倍的无水乙醇(v/v)，放置于4℃中静置24～36h，得悬浊液A；
S6、将步骤S5所述悬浊液A一次离心取沉淀，向所述沉淀中加入其重量1～2倍体积的去离子水(g/ml)溶解沉淀，调节pH＝8.0，于50℃加热搅拌2h，静置冷却至室温后，再次离心取上清液；
S7、向步骤S6所述上清液中加入步骤S1所述虾夷扇贝裙边干粉重量0.1～0.3％(m/m)的胰蛋白酶干粉，所述胰蛋白酶干粉的酶活≥250USP U/mg，调节pH＝8.0后，于37～40℃加热搅拌4～6h，加热灭酶，再静置冷却至室温，得酶解液；
S8、向步骤S7所述酶解液中加入亚硫酸氢钠作保护剂，所述亚硫酸氢钠和所述酶解液的料液比为(0.2～2)∶100g/ml，调节pH至1.5～2.0，离心脱除蛋白，收集上清液；
S9、向步骤S8所述上清液中加入过氧化氢，所述过氧化氢和所述上清液的体积比(1～2)∶100，调节pH＝8.5，静置14～16h，调节pH＝6.5，加入相当于所述上清液体积3倍体积的无水乙醇，于4℃静置沉淀10～15h，得悬浊液B；
S10、将步骤S9所述悬浊液B离心收集沉淀，用去离子水A溶解所述沉淀，用3500Da截留分子量的透析袋在去离子水B中透析3天后，冻干透析袋内液体至含水重量≤5％，得到虾夷扇贝裙边多糖；其中，所述沉淀和所述去离子水A的重量体积比为1∶(1～100)g/ml。
优选方式下，步骤S2所述加热灭酶具体为：将步骤S1所述混合液置于沸水浴中加热10min；所述离心的参数为：转速4000r/min，时间10min，温度4℃。
优选方式下，步骤S6所述一次离心的参数为：转速4000r/min，时间10min，温度4℃；所述再次离心的参数为：转速4000r/min，时间10min，温度4℃；使用6.0mol/L NaOH调节沉淀溶解后的pH至8.0；
优选方式下，步骤S7用6.0mol/L NaOH调节pH＝8.0；所述加热灭酶的参数为100℃加热10min。
优选方式下，步骤S8用HCl调节pH至1.5～2.0；所述离心的参数为：转速8000～12000r/min，时间7～20min，温度4℃。
优选方式下，步骤S9用NaOH调节pH＝8.5；用HCl调节pH＝6.5。
优选方式下，步骤S10所述离心的参数为：转速4000r/min，时间10min，温度4℃；所述冻干的参数为：冷阱温度-45～-55℃，真空度＜10Pa。
如无特殊说明，本发明所述室温为10～38℃。
优选方式下，所述虾夷扇贝裙边多糖的提取方法，包括步骤：
S1、取虾夷扇贝裙边，在冷阱温度-50℃、真空度1Pa条件下真空冷冻干燥至含水重量为1％，打粉，得虾夷扇贝裙边干粉；向1000g所述虾夷扇贝裙边干粉中加入5L水，再加入5g的胰蛋白酶干粉，37℃水浴震荡酶解3h，加入15g木瓜蛋白酶干粉，50℃水浴震荡酶解4h，得混合溶液；其中，所述胰蛋白酶干粉的酶活≥250USP U/mg，所述木瓜蛋白酶的酶≥2000U/mg
S2、将步骤S1所述混合溶液置于沸水浴加热10min灭酶，冷却至室温，使用NaOH调节pH＝7.0，4℃、转速4000r/min离心10min，收集上清液；
S3、向步骤S2所述上清液中加入其体积1/10的D204型大孔树脂，37℃水浴搅拌吸附6h后将所述树脂装入色谱柱中，用去离子水洗至滤出液无颜色；
S4、用4倍柱体积的1.5mol/L NaCl洗脱，收集滤出液；
S5、向步骤S4所述滤出液中加入其4倍体积的无水乙醇，放置于4℃中静置24h，得悬浊液A；
S6、将步骤S5所述悬浊液A置于4℃、转速4000r/min离心10min，收集沉淀，用去离子水溶解所述沉淀，用6.0mol/LNaOH调节pH＝8.0，于50℃加热搅拌2h，静置冷却至室温，转速4000r/min离心10min，取上清液；其中，所述沉淀和所述去离子水的重量体积比为1∶1g/ml
S7、将步骤S6所述上清液加入步骤S1所述虾夷扇贝裙边干粉重量0.2％的胰蛋白酶干粉，用6.0mol/L NaOH调节pH＝8.0，于40℃加热搅拌5h，升温至100℃加热10min，再静置冷却至室温，得酶解液；其中，所述胰蛋白酶干粉的酶活为≥250USP U/mg；
S8、向步骤S7所述酶解液中加入5g亚硫酸氢钠，用HCl调节pH至2.0，在4℃、转速8000r/min离心10min，收集上清液；其中，所述亚硫酸氢钠和所述酶解液的料液比为1∶100g/ml；
S9、向步骤S8所述上清液加入过氧化氢，用NaOH调节pH＝8.5，静置15h，用HCl调节pH＝6.5，加入所述上清液体积3倍的无水乙醇，于4℃沉淀12h，得悬浊液B；其中，所述过氧化氢和所述上清液的体积比为1∶50；
S10、将步骤S9所述悬浊液B置于4℃、4000r/min离心10min，收集沉淀；用去离子水A溶解所述沉淀，用3500Da截留分子量的透析袋在10L去离子水B中透析72h，期间每24h换一次去离子水B，冻干透析袋内液体至含水重量为1％，得虾夷扇贝裙边多糖；其中，所述冻干的参数为：冷阱温度-50℃，真空度1Pa；所述沉淀和所述去离子水A的重量体积比为1∶50g/ml，所述去离子水A和所述去离子水B的体积比为1∶20。
本发明还提供了所述虾夷扇贝裙边多糖在制备免疫刺激药物中的应用。
本发明还提供了一种药物组合物，其中，包含所述虾夷扇贝裙边多糖。
通过检测一氧化氮(NO)产生量和免疫相关基因(TNF-α，IL-1β和IL-6)转录水平评估了本发明虾夷扇贝裙边多糖的免疫刺激效果。
浓度大于10μg/mL的虾夷扇贝裙边多糖会刺激免疫细胞(RAW264.7)产生一氧化氮，且产生量与剂量正相关，浓度为100μg/mL时，产生一氧化氮量为10.0～14.0μM。
虾夷扇贝裙边多糖可以上调免疫细胞(RAW264.7)基因TNF-α，IL-1β和IL-6的转录水平，在浓度为100μg/mL时，转录水平分别上升7.0～8.8，2.8～3.0和4.5～7.3倍。虾夷扇贝裙边多糖可以通过非特异性免疫调节细胞提高细胞因子转录水平。
本发明的有益效果是：开发了一种天然酸性多糖的提取方法，增加了虾夷扇贝加工副产物裙边的价值；该虾夷扇贝裙边多糖可以产生免疫刺激效果，具有实际价值。
附图说明
图1为实施例1中所述虾夷扇贝裙边多糖SPYP凝胶渗透色谱图；
图2为实施例1中基于葡聚糖标准品制作的重均分子量标准曲线；
图3为实施例2中单糖标准品的液相色谱图；
图4为实施例2中SPYP单糖组成的液相色谱图；
图5为实施例2中SPYP的结构分析策略；
图6为实施例2中肝素标准品二糖片段的二级质谱图；
图7为实施例2中SPYP二糖片段A的二级质谱图；
图8为实施例2中硫酸软骨素标准品二糖片段的二级质谱图；
图9为实施例2中SPYP二糖片段B的二级质谱图；
图10为实施例2中SPYP的1H核磁共振谱图；
图11为实施例2中SPYP的HMQC二维核磁共振谱图；
图12为实施例3中SPYP在RAW264.7细胞中的一氧化氮(NO)产生量分析，图中不同小写字母代表组间差异显著(p＜0.05)；
图13为实施例3中SPYP在RAW264.7细胞中TNF-α转录水平的分析，图中不同小写字母代表组间差异显著(p＜0.05)；
图14为实施例3中SPYP在RAW264.7细胞中IL-1β转录水平的分析，图中不同小写字母代表组间差异显著(p＜0.05)；
图15为实施例3中SPYP在RAW264.7细胞中IL-6转录水平的分析，图中不同小写字母代表组间差异显著(p＜0.05)。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明的目的在于提供一种虾夷扇贝裙边多糖，以虾夷扇贝加工产生的裙边副产物为原料，通过酶解和色谱分离等过程制备得到一种酸性多糖成分，其含有硫酸基，由多种单糖残基构成，主要由类似肝素结构(→4)β-GlcA(1→4)α-GlcNAc→)的糖链和类似硫酸软骨素结构(→4)β-GlcA(1→3)-GalNAc→)的糖链组成。这种酸性多糖具有提高细胞产生一氧化氮含量和提高细胞因子转录水平的免疫刺激作用。
本发明提供了一种虾夷扇贝裙边多糖，其所述酸性多糖的糖链为类似肝素结构(→4)β-GlcA(1→4)α-GlcNAc→)的糖链和类似硫酸软骨素结构(→4)β-GlcA(1→3)-GalNAc→)的糖链。
优选地，根据前述的多糖，其中，所述多糖的硫酸基含量为5％～8％，糖醛酸含量为10％～15％。
更优选地，根据前述的多糖，其中，所述多糖的分子量为6kDa～15kDa。
或更优选地，根据前述的多糖，其中，所述多糖的单糖组成包括甘露糖(Man)、氨基葡萄糖(GlcN)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、氨基半乳糖(GalN)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、岩藻糖(Fuc)。前述单糖组成的摩尔比具体为甘露糖∶氨基葡萄糖∶鼠李糖∶葡萄糖醛酸∶氨基半乳糖∶葡萄糖∶半乳糖∶岩藻糖＝(17.5～18.0)∶(11.5～12.0)∶(12.0～12.6)1.0∶(15.5～16.3)∶(7.5～8.5)∶(23.2～24.0)∶(24.3～25.1)。
本发明还提供了前述多糖的提取方法，其中，所述提取方法包括：
(1)向虾夷扇贝裙边干粉中加入3～5倍体积的水，再向样品中加入相当于样品重量0.5～1.5％(m/m)的胰蛋白酶干粉，所述胰蛋白酶干粉的酶活≥250USP U/mg，37℃水浴震荡酶解3h之后加入相对于样品重量1.0～1.5％(m/m)的木瓜蛋白酶干粉，所述木瓜蛋白酶干粉的酶活≥2000U/mg，50℃水浴震荡酶解2～4h制得混合溶液；
(2)步骤(1)所述混合溶液置于沸水浴中10min，冷却至室温，调节pH＝7.0，离心，转速4000r/min，时间10min，温度4℃，收集上清液；
(3)向上清液中加入相当于样品体积10～20％(v/v)的D204型大孔树脂，37℃水浴搅拌吸附6h后装入色谱柱中，用去离子水洗至滤出液无颜色；
(4)用1.5mol/LNaCl洗脱3～5倍柱体积，收集滤出液；
(5)向步骤(4)中的滤出液中加入相当于样品体积4倍的无水乙醇(v/v)，放置于4℃中24～36h；
(6)将步骤(5)中沉淀后的液体，离心，转速4000r/min，时间10min，温度4℃。收集沉淀后用样本等体积的去离子水(w/v)溶解沉淀后，用6.0mol/L NaOH调节pH＝8.0，于50℃加热搅拌2h。静置冷却至室温后，离心，转速4000r/min，时间10min，温度室温；
(7)向步骤(6)中的液体中加入0.2％(m/m)的胰蛋白酶干粉，所述胰蛋白酶干粉的酶活≥250USP U/mg，用6.0mol/L NaOH调节pH＝8.0后，于40℃加热搅拌5h，升温至100℃加热10min，再静置冷却至室温；
(8)加入0.2～2.0％(w/v)亚硫酸氢钠作保护剂，用HCl调节pH至1.5～2.0，在4℃离心7～20min，转速8000～12000r/min脱除蛋白，收集上清液；
(9)向步骤(8)中的液体中加入2％(v/v)的30％过氧化氢，用NaOH调节pH＝8.5，静置15h，氧化除去色素后，用HCl调节pH＝6.5，加入相当于样品体积3倍体积的无水乙醇，于4℃沉淀12h；
(10)将步骤(9)中的液体离心，转速4000r/min，时间10min，温度4℃，收集沉淀后用样本等体积的去离子水(w/v)溶解沉淀后，用3500Da截留分子量的透析袋透析3天后，冻干透析袋内液体得到虾夷扇贝裙边多糖。
本发明还提供了前述多糖在制备免疫刺激药物中的应用。
本发明还提供了一种药物组合物，其中，包含前述多糖。
通过检测一氧化氮(NO)产生量和免疫相关基因(TNF-α，IL-1β和IL-6)转录水平评估了本发明虾夷扇贝裙边多糖的免疫刺激效果。
浓度大于10μg/mL的虾夷扇贝裙边多糖会对刺激免疫细胞(RAW264.7)产生一氧化氮，且产生量与剂量正相关，浓度为100μg/mL时，产生量为10.0～14.0μM。
虾夷扇贝裙边多糖可以上调基因TNF-α，IL-1β和IL-6的转录水平，在浓度为100μg/mL时，转录水平分别上升7.0～8.8，2.8～3.0和4.5～7.3倍。虾夷扇贝裙边多糖可以通过非特异性免疫调节细胞提高细胞因子转录水平。
下述实施例使用的胰蛋白酶干粉产商：生工生物工程(上海)股份有限公司，商品号A100458，CAS号[9002-07-7]；下述实施例使用的木瓜蛋白酶干粉产商：生工生物工程(上海)股份有限公司，商品号A501612，CAS号[9001-73-4]。
实施例1
一种虾夷扇贝裙边多糖的提取方法，步骤是：
S1、取虾夷扇贝裙边，真空冷冻干燥，冷阱温度-50℃，真空度1Pa，使用打粉机打粉，得虾夷扇贝裙边干粉，所述虾夷扇贝裙边干粉为含水重量为1％的粉末；向1000g虾夷扇贝裙边干粉中加入5L的水，再向所述虾夷扇贝裙边干粉中加入5g的胰蛋白酶干粉(所述胰蛋白酶干粉的酶活为≥250USP U/mg)，37℃水浴震荡酶解3h之后加入15g的木瓜蛋白酶干粉(所述木瓜蛋白酶的酶为≥2000U/mg)，50℃水浴震荡酶解4h制得混合溶液；
S2、将步骤S1所述混合溶液置于沸水浴中10min灭酶，冷却至室温，使用NaOH调节pH＝7.0，离心，转速4000r/min、时间10min、温度4℃，收集上清液共5L；
S3、向5L步骤S2所述上清液中加入500mL的D204型大孔树脂，37℃水浴搅拌吸附6h后装入色谱柱中，用去离子水洗至滤出液无颜色；
S4、用1.5mol/L NaCl洗脱2.0L体积，收集滤出液，共2L；
S5、向2L步骤S4所述滤出液中加入8.0L无水乙醇，放置于4℃中静置24h，得悬浊液A；
S6、将步骤S5所述悬浊液A离心，转速4000r/min，时间10min，温度4℃，收集沉淀共500g，用500mL的去离子水溶解所述沉淀，用6.0mol/L NaOH调节pH＝8.0，于50℃加热搅拌2h，静置冷却至室温后，离心，转速4000r/min，时间10min，温度室温，取上清液；
S7、将步骤S6所述上清液加入2g的胰蛋白酶干粉(所述胰蛋白酶干粉的酶活为≥250USP U/mg)，用6.0mol/L NaOH调节pH＝8.0后，于40℃加热搅拌5h，升温至100℃加热10min，再静置冷却至室温，得酶解液，共500ml；
S8、向500ml步骤S7所述酶解液中加入5g亚硫酸氢钠作保护剂，用HCl调节pH至2.0，在4℃离心10min，转速8000r/min脱除蛋白，收集上清液，共500ml；
S9、向500ml步骤S8所述上清液加入10mL的过氧化氢，用NaOH调节pH＝8.5，静置15h，氧化除去色素后，用HCl调节pH＝6.5，加入1.5L的无水乙醇，于4℃沉淀12h，得悬浊液B；
S10、将步骤S9所述悬浊液B离心，转速4000r/min，时间10min，温度4℃，共收集沉淀10g；用500mL的去离子水溶解所述沉淀，用3500Da截留分子量的透析袋在10L去离子水中透析3天，期间每24h换一次去离子水，再冻干透析袋内液体至含水重量为1％后，得到7.5g虾夷扇贝裙边多糖SPYP；所述冻干的参数为：冷阱温度-50℃，真空度1Pa。
本实施例还可以包括虾夷扇贝清洗、取裙边、溶液的配制等前处理步骤。
采用明胶比浊法测定步骤S10中得到的虾夷扇贝裙边多糖SPYP-1的硫酸基含量为5.84±0.11％；采用间羟基联苯法测定其糖醛酸含量为12.90±0.94％。
采用凝胶渗透色谱色谱法，应用TSK-gel G2500SW(2.0mm×30cm)凝胶柱检测SPYP分子量为13.58kDa，结果如图1～2所示。
实施例2
本实施例用以确定实施例1所制备的虾夷扇贝裙边多糖SPYP的结构特性和组成。
具体方法如下：
采用高效液相色谱+1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化法分析了SPYP的单糖组成，结果如图3～4所示SPYP的单糖组成为甘露糖∶氨基葡萄糖∶鼠李糖∶葡萄糖醛酸∶氨基半乳糖∶葡萄糖∶半乳糖∶岩藻糖＝17.7∶11.7∶12.1∶1.0∶15.9∶8.0∶23.7∶24.7。
采用梯度酸水解策略如图5所示，用不同浓度的三氟乙酸对所述虾夷扇贝裙边多糖SPYP进行酸水解，在酸水解后用3000Da截留分子量的超滤管进行超滤，收集管内部分进行下一步酸水解。最终2.0M三氟乙酸120℃水解3h后1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化，液相色谱-质谱分析二糖组成。由图6～9可知SPYP主要含有的二糖片段A→4)β-GlcA(1→4)α-GlcN→和二糖片段B→4)β-GlcA(1→3)α-GalN→。
进一步根据SPYP部分酸水解产物的一维H谱核磁共振和二维核磁共振(HSQC)结果可以推断SPYP主要由两个重复二糖片段构成的糖链组成为→4)β-GlcA(1→4)α-GlcNAc→和→4)β-GlcA(1→3)-GalNAc→，结果如图10～11所示。
实施例3
本实施例用于评估实施例1制备的虾夷扇贝裙边多糖SPYP的免疫刺激作用。
具体实验方法如下：
样品SPYP和脂多糖(LPS)溶解于不含血清的1640培养基中。使用新鲜培养的RAW264.7细胞，按3×105个/孔的浓度固定于96孔细胞培养板上24h。丢弃培养上清液，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗2次后，向每个孔中加入200μL配置的不同浓度的(0.01，0.1，1.0，10和100μg/mL)SPYP溶液，LPS(1.0μg/mL)作为阳性对照组。于37℃、5％(v/v)CO2条件下培养24h。使用Griess法测定培养上清中一氧化氮的产生量，将100μL反应液加入酶标板中，检测OD492nm处的吸光度。使用不同浓度的(0，1，2，5，10，20，40，60和100μM)NaNO2作为标准曲线，通过标准曲线计算一氧化氮含量。结果如图12所示，随着SPYP浓度的升高，NO产生量随着升高。当SPYP浓度为10和100μg/mL时，NO的产生量分别为5.29±1.19和12.00±2.01μM。
样品SPYP和脂多糖(LPS)溶解于不含血清的1640培养基中。使用新鲜培养的RAW264.7细胞，按1×106个/孔的浓度固定于6孔细胞培养板上24h。丢弃培养上清液，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗2次后，向每个孔中加入1.0mL配置的不同浓度的(0.1，1.0，10和100μg/mL)SPYP溶液，LPS(1.0μg/mL)作为阳性对照组。于37℃、5％(v/v)CO2条件下培养24h。丢弃培养上清液，加入500μL Trizol后，提取细胞RNA，反转录成cDNA。使用表1中设计的引物，进行qPCR检测，PCR程序为95℃，5min；95℃，30s，35个循环；60℃，30s；72℃，30s。变化倍数＝2-ΔΔCt。结果如图13～15所示，当SPYP浓度为100μg/mL时，TNF-α，IL-1β和IL-6的转录水平分别提高了7.87±0.90，2.93±0.13和5.89±1.43。以上结果说明虾夷扇贝裙边多糖可以通过非特异性免疫调节细胞增强免疫效果，从而起到免疫刺激作用。
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Figure BDA0002433672720000111
Figure BDA0002433672720000121
Figure BDA0002433672720000131
序列表
<110> 大连工业大学
<120> 一种虾夷扇贝裙边多糖及其提取方法和应用
<130> ZR201070LQ
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
agcgagcatc cccaaagtt 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
gggcacgaag gctcatcatt 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
atggcaacta ttcctgaact caact 25
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
caggacaggt atagattctt tccttt 26
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
ttcctctctg caagagact 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
tgtatctctc tgaaggact 19
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
atgagcacag aaagcatgat c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
tacaggcttg tcactcgaat t 21

Claims (10)

1.一种虾夷扇贝裙边多糖，其特征在于，所述多糖的两条主链由(→4)β-GlcA(1→4)α-GlcNAc→)结构和(→4)β-GlcA(1→3)-GalNAc→)结构组成；所述多糖的硫酸基含量为5.73％～5.95％，糖醛酸含量为11.96％～13.84％，重均分子量为13.58kDa；单糖组成的摩尔比为甘露糖:氨基葡萄糖:鼠李糖:葡萄糖醛酸:氨基半乳糖:葡萄糖:半乳糖:岩藻糖＝17.7:11.7:12.1:1.0:15.9:8.0:23.7:24.7。
2.一种如权利要求1所述虾夷扇贝裙边多糖的提取方法，其特征在于，包括步骤：
S1、取虾夷扇贝裙边，真空冷冻干燥至含水重量≤5％，破碎成粉，得虾夷扇贝裙边干粉；向所述虾夷扇贝裙边干粉中加入水，再加入所述虾夷扇贝裙边干粉重量0.5％～1.5％的胰蛋白酶干粉，37～40℃水浴震荡酶解2～4h，加入所述虾夷扇贝裙边干粉重量1.0％～1.5％的木瓜蛋白酶干粉，50～60℃水浴震荡酶解2～4h，得混合溶液；其中，所述虾夷扇贝裙边干粉和水的重量体积比为1:(3～5)g/ml；所述胰蛋白酶干粉的酶活≥250USP U/mg，所述木瓜蛋白酶干粉的酶活≥2000U/mg；
S2、将步骤S1所述混合溶液加热灭酶，冷却至室温，调节pH＝7.0，离心取上清液；
S3、向步骤S2所述上清液中加入其体积10％～20％的D204型大孔树脂，35～39℃水浴搅拌吸附5～7h，将所述树脂装入色谱柱中，用去离子水洗至滤出液无颜色；
S4、用1.5mol/L NaCl溶液洗脱3～5倍柱体积，收集滤出液；
S5、向步骤S4所述滤出液中加入其体积3～4倍的无水乙醇，放置于4℃中静置24～36h，得悬浊液A；
S6、将步骤S5所述悬浊液A一次离心取沉淀，加入去离子水溶解所述沉淀，调节pH＝8.0，于50℃加热搅拌2h，静置冷却至室温后，再次离心取上清液；其中，所述沉淀和所述去离子水的重量体积比为1:(1～2)g/ml；
S7、向步骤S6所述上清液中加入步骤S1所述虾夷扇贝裙边干粉重量0.1％～0.3％的胰蛋白酶干粉，调节pH＝8.0，于37～40℃加热搅拌4～6h，加热灭酶，静置冷却至室温，得酶解液；其中，所述胰蛋白酶干粉的酶活≥250USP U/mg；
S8、向步骤S7所述酶解液中加入亚硫酸氢钠，所述亚硫酸氢钠和所述酶解液的料液比为(0.2～2):100g/ml，调节pH至1.5～2.0，离心收集上清液；
S9、向步骤S8所述上清液中加入过氧化氢，所述过氧化氢和所述上清液的体积比(1～2):100，调节pH＝8.5，静置14～16h，调节pH＝6.5，加入所述上清液体积3倍体积的无水乙醇，于4℃静置沉淀10～15h，得悬浊液B；
S10、将步骤S9所述悬浊液B离心收集沉淀，用去离子水A溶解所述沉淀，用3500Da截留分子量的透析袋在去离子水B中透析3天后，冻干透析袋内液体至含水重量≤5％，得到虾夷扇贝裙边多糖；其中，所述沉淀和所述去离子水A的重量体积比为1:(1～100)g/ml。
3.根据权利要求2所述虾夷扇贝裙边多糖的提取方法，其特征在于，步骤S2所述加热灭酶具体为：将步骤S1所述混合液置于沸水浴中加热10min。
4.根据权利要求2所述虾夷扇贝裙边多糖的提取方法，其特征在于，步骤S6所述一次离心的参数为：转速4000r/min，时间10min，温度4℃。
5.根据权利要求2所述虾夷扇贝裙边多糖的提取方法，其特征在于，步骤S6所述再次离心的参数为：转速4000r/min，时间10min，温度4℃。
6.根据权利要求2所述虾夷扇贝裙边多糖的提取方法，其特征在于，步骤S7所述加热灭酶的参数为：100℃加热10min。
7.根据权利要求2所述虾夷扇贝裙边多糖的提取方法，其特征在于，步骤S10所述冻干的参数为：冷阱温度-45～-55℃，真空度＜10Pa。
8.根据权利要求2所述虾夷扇贝裙边多糖的提取方法，其特征在于，包括步骤：
S1、取虾夷扇贝裙边，在冷阱温度-50℃、真空度1Pa条件下真空冷冻干燥至含水重量为1％，打粉，得虾夷扇贝裙边干粉；向1000g所述虾夷扇贝裙边干粉中加入5L水，再加入5g的胰蛋白酶干粉，37℃水浴震荡酶解3h，加入15g木瓜蛋白酶干粉，50℃水浴震荡酶解4h，得混合溶液；其中，所述胰蛋白酶干粉的酶活≥250USP U/mg，所述木瓜蛋白酶的酶≥2000U/mg；
S2、将步骤S1所述混合溶液置于沸水浴加热10min灭酶，冷却至室温，使用NaOH调节pH＝7.0，4℃、转速4000r/min离心10min，收集上清液；
S3、向步骤S2所述上清液中加入其体积1/10的D204型大孔树脂，37℃水浴搅拌吸附6h后将所述树脂装入色谱柱中，用去离子水洗至滤出液无颜色；
S4、用4倍柱体积的1.5mol/L NaCl洗脱，收集滤出液；
S5、向步骤S4所述滤出液中加入其4倍体积的无水乙醇，放置于4℃中静置24h，得悬浊液A；
S6、将步骤S5所述悬浊液A置于4℃、转速4000r/min离心10min，收集沉淀，用去离子水溶解所述沉淀，用6.0mol/L NaOH调节pH＝8.0，于50℃加热搅拌2h，静置冷却至室温，转速4000r/min离心10min，取上清液；其中，所述沉淀和所述去离子水的重量体积比为1:1g/ml
S7、将步骤S6所述上清液加入步骤S1所述虾夷扇贝裙边干粉重量0.2％的胰蛋白酶干粉，用6.0mol/L NaOH调节pH＝8.0，于40℃加热搅拌5h，升温至100℃加热10min，再静置冷却至室温，得酶解液；其中，所述胰蛋白酶干粉的酶活为≥250USP U/mg；
S8、向步骤S7所述酶解液中加入5g亚硫酸氢钠，用HCl调节pH至2.0，在4℃、转速8000r/min离心10min，收集上清液；其中，所述亚硫酸氢钠和所述酶解液的料液比为1:100g/ml；
S9、向步骤S8所述上清液加入过氧化氢，用NaOH调节pH＝8.5，静置15h，用HCl调节pH＝6.5，加入所述上清液体积3倍的无水乙醇，于4℃沉淀12h，得悬浊液B；其中，所述过氧化氢和所述上清液的体积比为1:50；
S10、将步骤S9所述悬浊液B置于4℃、4000r/min离心10min，收集沉淀；用去离子水A溶解所述沉淀，用3500Da截留分子量的透析袋在10L去离子水B中透析72h，期间每24h换一次去离子水B，冻干透析袋内液体至含水重量为1％，得虾夷扇贝裙边多糖；其中，所述冻干的参数为：冷阱温度-50℃，真空度1Pa；所述沉淀和所述去离子水A的重量体积比为1:50g/ml，所述去离子水A和所述去离子水B的体积比为1:20。
9.一种虾夷扇贝裙边多糖在制备免疫刺激药物中的应用。
10.一种药物组合物，其特征在于，包含虾夷扇贝裙边多糖。
CN202010249034.XA 2020-03-31 2020-03-31 一种虾夷扇贝裙边多糖及其提取方法和应用 Active CN111320707B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010249034.XA CN111320707B (zh) 2020-03-31 2020-03-31 一种虾夷扇贝裙边多糖及其提取方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010249034.XA CN111320707B (zh) 2020-03-31 2020-03-31 一种虾夷扇贝裙边多糖及其提取方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111320707A true CN111320707A (zh) 2020-06-23
CN111320707B CN111320707B (zh) 2021-09-24

Family

ID=71167823

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010249034.XA Active CN111320707B (zh) 2020-03-31 2020-03-31 一种虾夷扇贝裙边多糖及其提取方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111320707B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113209127A (zh) * 2021-05-13 2021-08-06 大连工业大学 一种虾夷扇贝裙边多糖的应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1746191A (zh) * 2004-09-07 2006-03-15 青岛大学 栉孔扇贝糖胺聚糖的提取制备方法
WO2007041950A1 (fr) * 2005-10-11 2007-04-19 Dalian Polytechnic University Procede d'extraction de du polysaccharide de patinopecten yessoensis
CN102532335A (zh) * 2011-10-29 2012-07-04 山东好当家海洋发展股份有限公司 一种利用扇贝废弃液提取扇贝多糖的方法
CN103130904A (zh) * 2013-01-07 2013-06-05 天津科技大学 一种虾夷扇贝下脚料高值化利用的方法
AU2008239866B2 (en) * 2007-04-11 2013-08-08 73100 - Setenta E Tres Mil E Cem, Lda Galactose-rich polysaccharide, process for the production of the polymer and its applications
CN104004109A (zh) * 2014-06-09 2014-08-27 浙江海洋学院 海洋硫酸酯化糖胺聚糖se-3及其制备方法
CN106188329A (zh) * 2016-08-05 2016-12-07 大连工业大学 一种扇贝多糖的提取方法和制品
CN109053922A (zh) * 2018-07-20 2018-12-21 大连工业大学 虾夷扇贝内脏多糖、提取方法及其应用、以及药物组合物

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1746191A (zh) * 2004-09-07 2006-03-15 青岛大学 栉孔扇贝糖胺聚糖的提取制备方法
WO2007041950A1 (fr) * 2005-10-11 2007-04-19 Dalian Polytechnic University Procede d'extraction de du polysaccharide de patinopecten yessoensis
AU2008239866B2 (en) * 2007-04-11 2013-08-08 73100 - Setenta E Tres Mil E Cem, Lda Galactose-rich polysaccharide, process for the production of the polymer and its applications
CN102532335A (zh) * 2011-10-29 2012-07-04 山东好当家海洋发展股份有限公司 一种利用扇贝废弃液提取扇贝多糖的方法
CN103130904A (zh) * 2013-01-07 2013-06-05 天津科技大学 一种虾夷扇贝下脚料高值化利用的方法
CN104004109A (zh) * 2014-06-09 2014-08-27 浙江海洋学院 海洋硫酸酯化糖胺聚糖se-3及其制备方法
CN106188329A (zh) * 2016-08-05 2016-12-07 大连工业大学 一种扇贝多糖的提取方法和制品
CN109053922A (zh) * 2018-07-20 2018-12-21 大连工业大学 虾夷扇贝内脏多糖、提取方法及其应用、以及药物组合物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
冯丁丁等: ""虾夷扇贝裙边多糖提取物细胞"", 《食品科技》 *
刘正奇等: ""虾夷扇贝裙边中天然多糖的鉴定及免疫活性研究"", 《 中国食品科学技术学会第十六届年会暨第十届中美食品业高层论坛》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113209127A (zh) * 2021-05-13 2021-08-06 大连工业大学 一种虾夷扇贝裙边多糖的应用
CN113209127B (zh) * 2021-05-13 2024-04-12 大连工业大学 一种虾夷扇贝裙边多糖的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111320707B (zh) 2021-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. Effects of in vitro digestion and fecal fermentation on the stability and metabolic behavior of polysaccharides from Craterellus cornucopioides
CN113336867B (zh) 一种黑木耳多糖及其全破壁提取方法和应用
CN115028750B (zh) 泡叶藻岩藻多糖及其制备方法和应用
CN105924544A (zh) 一种高硫酸化硫酸软骨素及其制备方法与应用
CN111320707B (zh) 一种虾夷扇贝裙边多糖及其提取方法和应用
CN113549161B (zh) 一种利用双氧水提取黑木耳多糖的方法
CN112552424A (zh) 一种蝉花子实体多糖及其制备和用途
EP0475383A2 (en) Polysaccharide composition or polysaccharide having heparinoid activity, process for producing the same, and anticoagulant containing the same as active ingredient
CN1324051C (zh) 一种羊栖菜多糖sfp－i及其分离纯化方法与应用
CN107987179B (zh) 一种低硫酸化岩藻半乳聚糖在制备免疫增强剂中的应用
CN107236054B (zh) 一种低分子量泡叶藻聚糖的制备方法及应用
CN115166089A (zh) 一种利用甲基化硫酸寡糖组鉴别蛋白核小球藻的方法
CN104004109A (zh) 海洋硫酸酯化糖胺聚糖se-3及其制备方法
Yamaguchi et al. Macromolecular structure and morphology of native glycogen particles isolated from Candida albicans
CN107827993B (zh) 贝类粗多糖中蛋白质的发酵脱除方法
US20230293574A1 (en) Fish swim bladder-derived heparin-like mucopolysaccharide and methods of making and using the same
CN112175107B (zh) 一种从海参中提取岩藻聚糖硫酸硫酸酯和硫酸软骨素的方法
CN116675784B (zh) 具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的牡蛎糖胺聚糖及制备方法
CN114316081B (zh) 一种具有抑制SARS-CoV-2活性的长茎葡萄蕨藻硫酸化多糖及其制备方法和应用
CN112457425B (zh) 一种具有抗肝癌细胞增殖活性的小球藻多糖的提纯方法
CN115073620B (zh) 两种具有抗补体活性的均一射干多糖及其制备方法和应用
CN108976313B (zh) 一种多聚葡萄糖醛酸及其制备方法和在免疫调节药物中的应用
CN115975069A (zh) 一种高纯度水溶性酵母β-葡聚糖及其制备方法
CN116284490A (zh) 一种野桑蚕蛹多糖及其制备方法和应用
CN114410708A (zh) 一种提高发状念珠藻胞外多糖体外抗氧化活性和生物絮凝性的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant