CN111315402B - T细胞修饰 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及修饰的T细胞，其诱导性表达生物活性分子，例如IL‑7，并且组成性表达抗原受体，例如与肿瘤抗原结合的T细胞受体或嵌合抗原受体。修饰的T细胞可以包含核酸构建体，其包含编码生物活性分子的第一核苷酸序列，编码抗原受体的第二核苷酸序列；与第一核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子，以及与第二核苷酸可操作地连接的组成型启动子。提供了核酸构建体和载体，以及包含此类构建体和载体的T细胞及其治疗方法和用途。
Description
技术领域
本发明涉及T细胞的增加其细胞毒性活性的修饰，以及修饰的T细胞在免疫疗法中的用途，例如用于癌症的治疗。
背景技术
发现T细胞(或T淋巴细胞)广泛分布在组织和肿瘤环境中。T细胞通过细胞表面上T细胞受体(TCR)的存在与其它淋巴细胞区分开。TCR是介导T细胞的抗原特异性活化的多亚基跨膜复合物。通过经由主要组织相容性复合物(MHC)分子识别在靶细胞上呈递的抗原肽配体，TCR对T细胞赋予抗原特异性。
尽管源自肿瘤靶细胞中的改变或突变蛋白质的肽可以被表达特异性TCR的T细胞识别为外源的，但肿瘤细胞上的许多抗原仅是上调或过表达的(所谓的自身抗原)，并且不诱导功能性T细胞应答。因此，研究已集中于鉴定在恶性而非正常细胞类型中表达或高度表达的靶肿瘤抗原。此类靶的例子包括在广泛多样的人癌症中表达，但在正常组织中显示受限表达的癌/睾丸(CT)抗原NY-ESO-1(Chen Y-T等人，Proc Natl Acad Sci USA.1997；94(5):1914-1918)，以及在非常有限的健康组织中表达的MAGE-A家族的CT抗原(ScanlanM.J.等人，Immunol Rev.2002；188:22-32)。
此类抗原的鉴定已促进了基于靶向T细胞的免疫疗法的开发，所述免疫疗法具有提供特异性和有效癌症疗法的潜力(Ho,W.Y.等人，Cancer Cell2003；3:1318-1328；Morris,E.C.等人，Clin.Exp.Immunol.2003；131:1-7；Rosenberg,S.A.Nature 2001；411:380-384；Boon,T.和van der Bruggen P.J.Exp.Med.1996；183:725-729)。
已建议白介素7(IL-7)的静脉内施用，以改善基于T细胞的免疫治疗的结果。已建议白介素7(IL-7)的静脉内施用，以改善基于T细胞的免疫治疗的结果。已知IL-7增强肿瘤特异性T细胞的持久性(Melchionda,F.等人，J.Clin.Invest.2005；115:1177-87)，并且经基因修饰为分泌IL-7或过表达IL-7受体(与施用的IL-7结合)的T细胞在临床前模型中展示增强的抗肿瘤功效(Vera,J.F.等人，Mol.Ther.2009；17:880-8,Markley,J.C.和Sadelain,M.Blood 2010；115:3508-3519)。然而，向癌症患者全身性施用细胞因子已引起明显的毒性(Sportes,C.等人，Clin.Cancer Res.2010；16:727-35,Conlon,K.C.等人，J.Clin.Oncol.2015；33:74-82,Brudno,J.N.等人，Blood2016；127:3321-31)。替代方法例如T细胞的遗传修饰以分泌或转呈递(trans-present)细胞因子(Hutton L.V.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2016；113:E7788-97)携带严重不良事件的风险，包括由于分泌细胞因子的***性积累的神经毒性和细胞因子释放综合征(Zhang,L.等人，Clin.CancerRes.21；21:2278-88)，而过表达细胞因子受体的T细胞并不消除对于外源细胞因子的需要(Vera,J.F.等人，Mol.Ther.2009；17:880-8)。因此，用于将细胞因子例如IL-7及其它生物活性分子安全递送至T细胞的方法仍未确定。
发明内容
本发明人已出乎意料地认识到，在T细胞活化后，含有提供抗原受体的组成性表达和生物活性分子例如白介素7(IL-7)的诱导性表达的核酸构建体的T细胞，展示改善的抗肿瘤特性，而没有当生物活性分子在T细胞中组成性表达时观察到的高毒性。
本发明的第一个方面提供了包含以下的核酸构建体；
(i)编码生物活性分子的第一核苷酸序列；
(ii)编码抗原受体的第二核苷酸序列；
(iii)与所述第一核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子，和
(iv)与所述第二核苷酸可操作地连接的组成型启动子。
优选地，生物活性分子是细胞因子，最优选IL-7。
本发明的第二个方面提供了包含第一个方面的核酸构建体的载体，例如慢病毒载体。
本发明的第三个方面提供了包含根据第一个方面或第二个方面的核酸构建体或载体的T细胞群体。
本发明的第四个方面提供了T细胞群体，其在T细胞活化后组成性表达异源抗原受体并且诱导性表达生物活性分子，例如IL-7。
本发明的第五个方面提供了药物组合物，其包含根据第三个方面或第四个方面的T细胞群体和药学可接受的赋形剂。
本发明的第五个方面提供了根据第三个方面或第四个方面的T细胞群体，其用于治疗人体或动物体的方法，例如治疗个体中的癌症的方法中。相关方面提供了根据第三个方面或第四个方面的T细胞群体在制造用于治疗个体中的癌症的药物中的用途，以及治疗癌症的方法，其包括向患有癌症的个体施用根据第三个方面或第四个方面的T细胞群体。
本发明的第六个方面提供了产生修饰的T细胞群体的方法，其包括；
将根据第一个方面或第二个方面的核酸构建体或载体引入从供体个体获得的T细胞群体内，以产生修饰的T细胞群体。
本发明的第七个方面提供了治疗有此需要的个体中的癌症的方法，其包括；
将根据第一个方面或第二个方面的核酸构建体或载体引入从供体个体获得的T细胞群体内，以产生修饰的T细胞群体，和
向受体个体施用修饰的T细胞群体。
供体个体和受体个体可以是相同的(即自体治疗；修饰的T细胞得自随后用修饰的T细胞治疗的个体)，或者供体个体和受体个体可以是不同的(即同种异体治疗；修饰的T细胞得自一个个体，并且随后用于治疗不同的个体)。
下文描述了本发明的其它方面和实施例。
附图说明
图1显示了NFAT诱导型IL-7表达***片段的序列和注释。序列以5'至3'取向示出，其中突出显示了盒的各个组分。这些包括NFAT IL-2TREGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT(SEQ ID NO:14)的三个拷贝，最小CMV启动子，IL-7编码序列(密码子优化的)和SV40聚A。
图1显示了由GeneArt提供的NFAT-IL-7质粒的图谱。通过用AgeI和MluI消化来去除NFAT-IL-7盒。
图2显示了表达TCR1的慢病毒载体的载体图谱。突出显示的是独特的AgeI和MluI限制。
图3显示了构建体ADB967的载体图谱。NFAT-IL-7盒被克隆到AgeI和MluI限制位点之间。IL-7的转录从反义链发生，并且处于与TCR1的那种相反的取向。
图4显示了ADB1099 IL7_T2A_TCR1的载体图谱。IL7_T2A_TCR1表示为单个ORF，其中IL-7、TCRα和TCRβ链由2A样跳过序列分开。
图6显示了关于NFAT诱导型IL-7TCR2的质粒图谱。
图7显示了组成型IL-7_TCR2的载体图谱。IL-7_TCR2被克隆到载体AB1224内的NheI和SalI位点之间。
图8显示了在这个研究中使用的三种主要慢病毒构建体的设计示意图。产生了这样的构建体，其在一个方向上，在源自IL-2启动子序列的NFAT启动子的3个重复的控制下表达IL-7，或者在SPEAR TCR和SPEAR TCR的组成性表达的存在下组成性表达IL-7。注意：构建体的各个组分的大小未按比例显示。
图9显示了CD4+和CD8+ T细胞的百分比以及T细胞转导效率的评价。NTD T细胞(白色圆圈)，用TCR(黑色正方形)、组成型IL-7_TCR(黑色三角形)或NFAT_IL-7_TCR(黑色圆圈)转导的T细胞。数据显示平均值+/-SD。(A)数据显示为其为CD4+或CD8+的CD3+ T细胞的百分比。(B)数据显示为其为CD3+和CD4+或CD8+以及其为TCR Vα24+的细胞百分比。(C)数据显示为CD4+或CD8+Vα24+群体中的平均荧光强度(MFI)。
图10显示了在CD4+ T细胞上的4-1BB、CD127、CD27、CD28、CD40L、OX-40、PD-1和TIM-3表达的评价。NTD T细胞(白色圆圈)，用TCR(黑色正方形)、组成型IL-7_TCR(黑色三角形)或NFAT_IL-7_TCR(黑色圆圈)转导的T细胞。数据显示平均值+/-SD。数据显示为其为4-1BB+、CD127+、CD27+、CD28+、CD40L+、OX-40+、PD-1+或TIM-3+以及(A)CD4+(B)CD4+Vα24+或(B)CD4+Vα24的细胞百分比。
图11显示了在CD8+ T细胞上的4-1BB、CD127、CD27、CD28、CD40L、OX-40、PD-1和TIM-3表达的评价。NTD T细胞(白色圆圈)，用MAGE-A4c1032 TCR(黑色正方形)、组成型IL-7_MAGE-A4c1032TCR(黑色三角形)或NFAT_IL-7_MAGE-A4c1032TCR(黑色圆圈)转导的T细胞。数据显示平均值+/-SD。数据显示为其为41BB+、CD127+、CD27+、CD28+、CD40L+、OX-40+、PD-1+或TIM-3+以及(A)CD8+(B)CD8+Vα24+或(B)CD8+Vα24-的细胞百分比。
图12显示了幼稚和记忆CD4+ T细胞比例的评价。NTD T细胞(白色圆圈)，用TCR(黑色正方形)、组成型IL-7_TCR(黑色三角形)或NFAT_IL-7_TCR(黑色圆圈)转导的T细胞。数据显示平均值+/-SD。数据显示为其为CCR7-CD45RA-CD45RO-、CCR7-CD45RA-CD45RO+、CCR7-CD45RA+CD45RO-、CCR7-CD45RA+CD45RO+、CCR7+CD45RA-CD45RO-、CCR7+CD45RA-CD45RO+、CCR7+CD45RA+CD45RO-或CCR7+CD45RA+CD45RO+以及(A)CD4+(B)CD4+Vα24+或(B)CD4+Vα24-的细胞百分比。
图13显示了幼稚和记忆CD8+ T细胞比例的评价。NTD T细胞(白色圆圈)，用TCR(黑色正方形)、组成型IL-7_TCR(黑色三角形)或NFAT_IL-7_TCR(黑色圆圈)转导的T细胞。数据显示平均值+/-SD。数据显示为其为CCR7-CD45RA-CD45RO-、CCR7-CD45RA-CD45RO+、CCR7-CD45RA+CD45RO-、CCR7-CD45RA+CD45RO+、CCR7+CD45RA-CD45RO-、CCR7+CD45RA-CD45RO+、CCR7+CD45RA+CD45RO-或CCR7+CD45RA+CD45RO+以及(A)CD8+(B)CD8+Vα24+或(B)CD8+Vα24-的细胞百分比。
图14显示了响应抗原阳性和阴性细胞，通过T细胞的IL-7产生。NTD T细胞(白色圆圈)，用TCR(黑色正方形)、组成型IL-7_TCR(黑色三角形)或NFAT_IL-7_TCR(黑色圆圈)转导的T细胞单独温育48小时，或者与A375、Mel624或Colo205细胞一起温育48小时。包括用外源肽或CD3/CD28珠脉冲的A375细胞作为对照。数据来自6个供体。来自T细胞的上清液以1:5或1:10稀释。标准曲线上的最大浓度为1000pg/ml，并且像这样，将>2000pg/ml、5000pg/ml或10.000pg/ml的任何值分别指定为2000pg/ml、5000pg/ml或10.000pg/ml的值。数据显示一式三份孔的平均值+/-SD。
图15显示了响应用受照射的A375细胞的重复刺激，来自供体FXA-006和FFA-004的总T细胞计数(测定参考号：ACF1141)。来自与NTD T细胞(白色圆圈)，用TCR(黑色正方形)、组成型IL-7_TCR(黑色三角形)或NFAT_IL-7_TCR(黑色圆圈)转导的T细胞一起共培养的总活细胞计数(台盼蓝阴性细胞)，所述T细胞在20ng/ml IL-7的存在或不存在下，每周用受照射的A375(HLA-A2+/NY-ESO+)细胞进行再刺激。再刺激在第0、7、14和21天时执行，并且由箭头指示。T细胞来自在IL-7的不存在下的供体(A)FXA-006或(B)FFA-004，或者来自在IL-7的存在下的(C)FXA-006或(D)FFA-004。在第7、14、21和28天时评价总细胞计数。
图16显示了与表达单独的TCR或TCR连同组成型IL-7的T细胞相比，用共表达诱导型IL-7与改造的TCR的T细胞注射的小鼠的存活率。显示了小鼠的存活曲线，所述小鼠在第0天时用1x106个Mel624肿瘤细胞进行i.v.注射，随后为如所示的在第7天时2x106个总T细胞的i.v.注射。在使用NTD T细胞的注射之前，将转导的T细胞(TCR Vβ+/CD3+)的百分比标准化至～42％。根据要求的不良条件/重量减轻，将小鼠扑杀，并且曲线图指示在研究时间内每组的存活百分比。(A-E)用单独的肿瘤(实线)或如所示的各种T细胞(虚线和点线)注射的小鼠的存活百分比。
具体实施方式
本发明涉及修饰的T细胞，其诱导性表达生物活性分子，例如IL-7，并且组成性表达抗原受体。修饰的T细胞可以包含核酸构建体，其包含；
(i)编码生物活性分子的第一核苷酸序列
(ii)编码抗原受体的第二核苷酸序列；
(iii)与所述第一核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子，和
(iv)与所述第二核苷酸可操作地连接的组成型启动子。
T细胞(也称为T淋巴细胞)是白血细胞，其在细胞介导的免疫中起关键作用。T细胞可以通过细胞表面上T细胞受体(TCR)的存在与其它淋巴细胞区分开。存在T细胞的几个类型，每个类型具有不同的功能。
T辅助细胞(TH细胞)被称为CD4+ T细胞，因为它们表达CD4表面糖蛋白。CD4+ T细胞在适应性免疫***中起重要作用，并且通过释放T细胞细胞因子且帮助抑制或调节免疫应答，来帮助其它免疫细胞的活性。它们对于细胞毒性T细胞的活化和生长是必需的。
细胞毒性T细胞(TC细胞、CTL、杀伤性T细胞)被称为CD8+ T细胞，因为它们表达CD8表面糖蛋白。CD8+ T细胞作用于破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞。大多数CD8+ T细胞表达TCR，其可以识别通过I类MHC分子在受感染或受损细胞的表面上展示的特异性抗原。TCR和CD8糖蛋白与抗原和MHC分子的特异性结合导致T细胞介导的受感染或受损细胞的破坏。
用于如本文所述使用的T细胞可以是CD4+ T细胞；CD8+ T细胞；或CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。例如，T细胞可以是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的混合群体。
用于如本文所述使用的合适的T细胞可以得自供体个体。在一些实施例中，供体个体可以是与受体个体相同的个人，在如本文所述的修饰和扩增之后，将T细胞施用于所述受体个体(自体治疗)。在其它实施例中，供体个体可以是与受体个体不同的个人，在如本文所述的修饰和扩增之后，将T细胞施用于所述受体个体(同种异体治疗)。例如，供体个体可以是健康个体，其是与患有癌症的受体个体人白细胞抗原(HLA)匹配的(在捐赠之前或之后)。
本文所述的方法可以包括以下步骤：从供体个体获得T细胞和/或从得自患有癌症的供体个体的样品中分离T细胞。
可以从血液样品中分离T细胞群体。用于分离T细胞的合适方法是本领域众所周知的，并且包括例如荧光活化细胞分选(FACS：参见例如Rheinherz等人，(1979)PNAS 764061)、细胞淘选(参见例如Lum等人，(1982)Cell Immunol 72 122)、以及使用抗体包被的磁珠的分离(参见例如，Gaudernack等人，1986J Immunol Methods 90 179)。
可以从得自血液样品的外周血单核细胞(PBMC)群体中分离CD4+和CD8+ T细胞。PBMC可以使用标准技术从血液样品中提取。例如，蔗聚糖可以与梯度离心组合使用(A.Scand J Clin Lab Invest.1968；21(Suppl.97):77-89)，以将全血分离成血浆的顶层，随后为PBMC层以及多形核细胞和红细胞的底部级分。在一些实施例中，PBMC可以耗尽CD14+细胞(单核细胞)。
在分离后，可以活化T细胞。用于活化T细胞的合适方法是本领域众所周知的。例如，分离的T细胞可以暴露于T细胞受体(TCR)激动剂。合适的TCR激动剂包括配体，例如在抗原呈递细胞例如树突状细胞的表面上的I或II类MHC分子上展示的肽，以及可溶因子，例如抗TCR抗体。
抗TCR抗体可以特异性结合TCR的组分，例如εCD3、αCD3或αCD28。适合于TCR刺激的抗TCR抗体是本领域众所周知的(例如OKT3)，并且可从商业供应商(例如eBioscience COUSA)获得。在一些实施例中，可以通过暴露于抗αCD3抗体和IL2来活化T细胞。更优选地，通过暴露于抗αCD3抗体和抗αCD28抗体来活化T细胞。活化可以在CD14+单核细胞的存在或不存在下发生。优选地，可以用抗CD3和抗CD28抗体包被的珠活化T细胞。例如，使用抗体包被的珠，例如包被有抗CD3和抗CD28抗体的磁珠，例如Human T-ActivatorCD3/CD28(ThermoFisher Scientific)，可以活化PBMC或T细胞亚群(包括CD4+和/或CD8+细胞)，而无需饲养细胞(抗原呈递细胞)或抗原。
在分离和活化后，可以修饰T细胞以掺入核酸构建体。
修饰的T细胞中表达的生物活性分子和抗原受体是由异源核酸编码的重组蛋白，即，生物活性分子和抗原受体由已通过重组技术掺入T细胞内的编码核酸表达。
表达生物活性分子和抗原受体的T细胞的修饰可以包括将核酸构建体引入T细胞内。用于将异源核酸引入T细胞内且在其中表达的合适方法是本领域众所周知的，并且在下文更详细地描述。
生物活性分子可以是生长因子或细胞因子，优选白介素7(IL-7)。白介素7(IL-7)可以是人IL-7，并且可以具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
来自诱导型启动子的IL-7的表达通过T细胞活化来诱导。
诱导型启动子可以包含活化T细胞核因子(NFAT)/AP1转录应答元件(TRE)。在同源肽MHC1复合物的识别后，NFAT经历Ca2+依赖性对核的易位，在其中它促进具有NFAT TRE的基因的转录。合适的NFAT TRE是本领域众所周知的，并且包括具有SEQ ID NO:14的序列的人IL2启动子NFAT TRE(Macian等人，(2001)Oncogene.2001Apr 30；20(19):2476-89)或其变体。
诱导型启动子可以包含NFAT TRE的一个、两个、三个或更多个重复。
诱导型启动子还可以包含另外的启动子元件，例如最小病毒启动子，例如CMV。合适的启动子元件是本领域众所周知的，并且包括SEQ ID NO:15的最小CMV启动子或其变体。
与编码IL-7的核苷酸序列可操作地连接的合适的诱导型启动子序列可以包含SEQID NO:1的核苷酸序列或其变体。
来自组成型启动子的表达不响应转录因子而变，并且第二核酸序列在T细胞中连续表达。合适的组成型启动子是本领域众所周知的，并且包括哺乳动物启动子，例如人延伸因子-1α(EF1α)。
合适的抗原受体可以特异性结合靶细胞，优选癌细胞。
抗原受体可以是T细胞受体(TCR)。TCR是二硫键连接的膜锚定的异二聚体蛋白，通常包含作为具有不变CD3链分子的复合物表达的高度可变的alpha(α)和beta(β)链。表达这些类型的TCR的T细胞称为α:β(或αβ)T细胞。少数T细胞表达包含可变的gamma(γ)和delta(δ)链的替代TCR，并且被称为γδT细胞。
合适的TCR特异性结合癌细胞的表面上的主要组织相容性复合物(MHC)，所述MHC展示肿瘤抗原的肽片段。MHC是一组细胞表面蛋白，其允许获得性免疫***识别‘外来’分子。蛋白质在细胞内被降解，并且通过MHC呈递在细胞的表面上。展示‘外来’肽(例如病毒或癌症相关肽)的MHC被具有适当TCR的T细胞识别，促进了细胞破坏途径。在癌细胞的表面上的MHC可以展示肿瘤抗原的肽片段，所述肿瘤抗原即存在于癌细胞而不是相应的非癌细胞上的抗原。识别这些肽片段的T细胞可以对癌细胞发挥细胞毒性作用。
合适的TCR是本领域众所周知的，并且包括SEQ ID NO:6和11的TCR及其变体。
在一些实施例中，关于TCR的各条链(例如TCRα和TCRβ链)的编码序列可以通过切割识别序列分开。这允许TCR的链作为单个融合物表达，所述融合物随后经历细胞内切割，以生成两种分开的蛋白质。合适的切割识别序列是本领域众所周知的，并且包括2A-弗林蛋白酶序列。
优选地，TCR并非由T细胞天然表达的(即，TCR是外源的或异源的)。异源TCR可以包括αβTCR异二聚体。合适的异源TCR可以特异性结合表达肿瘤抗原的癌细胞。例如，可以修饰T细胞以表达特异性结合MHC的异源TCR，所述MHC展示由特定癌症患者中的癌细胞表达的肿瘤抗原的肽片段。可以使用标准技术鉴定由癌症患者中的癌细胞表达的肿瘤抗原。
异源TCR可以是合成或人工TCR，即自然界中不存在的TCR。例如，可以改造异源TCR，以增加其对于肿瘤抗原的亲和力或亲合力(即亲和力增强的TCR)。亲和力增强的TCR可以包含相对于天然存在的TCR的一种或多种突变，例如，TCRα和β链的可变区的高变互补决定区(CDR)中的一种或多种突变。这些突变增加了TCR对于展示由癌细胞表达的肿瘤抗原的肽片段的MHC的亲和力。生成亲和力增强的TCR的合适方法包括使用噬菌体或酵母菌展示筛选TCR突变体的文库，并且是本领域众所周知的(参见例如Robbins等人，J Immunol(2008)180(9):6116；San Miguel等人，(2015)Cancer Cell 28(3)281-283；Schmitt等人(2013)Blood 122 348-256；Jiang等人，(2015)Cancer Discovery 5 901)。
优选的亲和力增强的TCR可以结合表达肿瘤抗原NY-ESO1、PRAME、甲胎蛋白(AFP)、MAGE A4、MAGE A1、MAGE A10和MAGE B2中的一种或多种的癌细胞。
可替代地，抗原受体可以是嵌合抗原受体(CAR)。CAR是人工受体，其被改造为含有免疫球蛋白抗原结合结构域，例如单链可变片段(scFv)。CAR可以例如包含与TCR CD3跨膜区和胞内结构域融合的scFv。scFv是免疫球蛋白重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白，其可以与大约10至25个氨基酸的短接头肽连接(Huston J.S.等人，Proc Natl Acad Sci USA1988；85(16):5879-5883)。接头可以是富含甘氨酸的用于柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸的用于溶解性，并且可以将VH的N末端连接至VL的C末端，或反之亦然。scFv之前可以是信号肽，以将蛋白质导向内质网，随后导向T细胞表面。在CAR中，scFv可以与TCR跨膜结构域和胞内结构域融合。可以在scFv和TCR跨膜结构域之间包括柔性间隔物，以允许可变的取向和抗原结合。胞内结构域是受体的功能性信号传递结构域。CAR的胞内结构域可以包含例如来自CD3ζ链，或来自受体如CD28、41BB或ICOS的细胞内信号传导结构域。CAR可以包含多重信号传导结构域，例如但不限于CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40。
CAR可以特异性结合由癌细胞表达的肿瘤特异性抗原。例如，可以修饰T细胞以表达特异性结合肿瘤抗原的CAR，所述肿瘤抗原由特定癌症患者中的癌细胞表达。可以使用标准技术鉴定由癌症患者中的癌细胞表达的肿瘤抗原。
异源抗原受体(例如异源TCR或CAR)的表达可以改变T细胞的免疫原性特异性，使得它们识别或展示对于一种或多种肿瘤抗原的改善识别，所述肿瘤抗原则存在于患有癌症的个体的癌细胞的表面上。
在一些实施例中，在异源抗原受体的不存在下，T细胞可以展示与癌细胞的减少结合或无结合。例如，相对于未修饰的T细胞，异源抗原受体的表达可以增加修饰的T细胞的癌细胞结合的亲和力和/或特异性。
术语“异源的”指这样的多肽或核酸，其对特定生物***例如宿主细胞是外来的，并且并非天然存在于该***中。异源多肽或核酸可以通过人工手段，例如使用重组技术，引入生物***。例如，可以将编码多肽的异源核酸***合适的表达构建体内，所述表达构建体依次又用于转化宿主细胞，以产生多肽。异源多肽或核酸可以是合成的或人工的，或者可以存在于不同的生物***，例如不同的物种或细胞类型中。内源多肽或核酸对特定生物***例如宿主细胞是天然的，并且天然存在于该***中。重组多肽由异源核酸表达，所述异源核酸已通过人工手段，例如使用重组技术，引入细胞内。重组多肽可以与天然存在于细胞中的多肽相同，或可以与天然存在于细胞中的多肽不同。
本文列出的参考氨基酸或核苷酸序列的变体可以包含与参考序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少98％的序列同一性的序列。特定的氨基酸序列变体可以通过1个氨基酸、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或多于10个氨基酸的***、添加、取代或缺失而不同于上文所示的重复结构域。特定核苷酸序列变体可以通过1个氨基酸、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或多于10个氨基酸的***、添加、取代或缺失而不同于本文列出的参考序列。
序列相似性和同一性通常参考算法GAP(Wisconsin Package,Accelerys,SanDiego USA)来定义。GAP使用Needleman和Wunsch算法来比对两个完全序列，所述算法使匹配数目达到最大并且使缺口数目降到最低。一般地，使用缺省参数，伴随缺口产生罚分＝12和缺口延伸罚分＝4。GAP的使用可能是优选的，但也可以使用其它算法，例如BLAST(其使用Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:405-410的方法)、FASTA(其使用Pearson和Lipman(1988)PNAS USA 85:2444-2448的方法)、或Smith-Waterman算法(Smith和Waterman(1981)J.Mol Biol.147:195-197)、或Altschul等人，(1990)同上的TBLASTN程序，一般采用缺省参数。特别地，可以使用psi-Blast算法(Nucl.Acids Res.(1997)25 3389-3402)。
可以在本文描述的相关序列的全长上进行序列比较。
由第二核苷酸序列编码的异源抗原受体可以特异性结合癌症患者的癌细胞。随后可以用修饰的T细胞治疗癌症患者。关于用修饰的T细胞治疗的合适的癌症患者可以通过包括以下的方法鉴定；
从患有癌症的个体获得癌细胞的样品；和
将癌细胞鉴定为与抗原受体结合，所述抗原受体由第二核苷酸序列编码并且由修饰的T细胞表达。
通过鉴定由癌细胞表达的一种或多种肿瘤抗原，可以将癌细胞鉴定为与由第二核苷酸序列编码的抗原受体结合。鉴定得自患有癌症的个体的癌细胞表面上的抗原的方法是本领域众所周知的。
在一些实施例中，可以通过以下鉴定适合于治疗特定癌症患者的异源抗原受体；
从患有癌症的个体获得癌细胞的样品；和
鉴定与癌细胞特异性结合的抗原受体。
可以例如通过鉴定由癌细胞表达的一种或多种肿瘤抗原，来鉴定与癌细胞特异性结合的抗原受体。鉴定得自患有癌症的个体的癌细胞表面上的抗原的方法是本领域众所周知的。然后可以例如根据已知特异性的抗原受体、或通过筛选具有不同特异性的抗原受体的实验对象组或文库，来鉴定与一种或多种肿瘤抗原结合、或者与MHC展示的一种或多种抗原的肽片段结合的抗原受体。可以使用常规技术产生与具有一种或多种限定的肿瘤抗原的癌细胞特异性结合的抗原受体。
编码鉴定的抗原受体的核酸可以用作如本文所述的核酸构建体中的第二核苷酸序列。
适合于如本文所述的治疗的个体的癌细胞可以表达抗原，并且可以具有正确的HLA类型以结合抗原受体。
癌细胞可以通过一种或多种抗原(即肿瘤抗原)的表达，与个体中的正常体细胞区分开。个体中的正常体细胞可以不表达一种或多种抗原，或者可以以不同的方式表达它们，例如以较低的水平、在不同的组织中和/或在不同的发育阶段时。肿瘤抗原可以引发个体中的免疫应答。特别地，肿瘤抗原可以引发针对个体中的癌细胞的T细胞介导的免疫应答，所述癌细胞表达肿瘤抗原。可以选择由患者中的癌细胞表达的一种或多种肿瘤抗原，作为修饰的T细胞上的异源受体的靶抗原。
由癌细胞表达的肿瘤抗原可以包括例如由癌症生殖系基因编码的癌-睾丸(CT)抗原，例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、GAGE-I、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、BAGE-I、RAGE-1、LB33/MUM-1、PRAME、NAG、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1/CT7、MAGE-C2、NY-ESO-I、LAGE-I、SSX-I、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-3、SSX-4、SSX-5、SCP-I和XAGE及其免疫原性片段(Simpson等人，Nature Rev(2005)5,615-625,Gure等人，Clin Cancer Res(2005)11,8055-8062；Velazquez等人，Cancer Immun(2007)7,1 1；Andrade等人，Cancer Immun(2008)8,2；Tinguely等人，CancerScience(2008)；Napoletano等人，Am J of Obstet Gyn(2008)198,99e91-97)。
其它肿瘤抗原包括例如过表达、上调或突变的蛋白质和分化抗原，特别是黑素细胞分化抗原，例如p53、ras、CEA、MUC1、PMSA、PSA、酪氨酸酶、Melan-A、MART-1、gp100、gp75、α-辅肌动蛋白-4、Bcr-Abl融合蛋白、Casp-8、β-连环蛋白、cdc27、cdk4、cdkn2a、coa-1、dek-can融合蛋白、EF2、ETV6-AML1融合蛋白、LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白、HLA-A2、HLA-A11、hsp70-2、KIAAO205、Mart2、Mum-2和3、neo-PAP、肌球蛋白I类、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PTPRK、K-ras、N-ras、磷酸丙糖异构酶、GnTV、Herv-K-mel、NA-88、SP17和TRP2-Int2、(MART-I)、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人***状瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、甲胎蛋白、13HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB\170K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS和酪氨酸酶相关蛋白例如TRP-1、TRP-2。
其它肿瘤抗原包括通过由“应激”癌细胞采用的非AUG翻译起始机制生成的框外肽-MHC复合物(Malarkannan等人，Immunity 1999Jun；10(6):681-90)。
其它肿瘤抗原是本领域众所周知的(参见例如WO00/20581；Cancer Vaccines andImmunotherapy(2000)编辑Stern,Beverley和Carroll，Cambridge University Press,Cambridge)。这些肿瘤抗原的序列可容易地从公共数据库中获得，但也可以在WO 1992/020356 A1、WO 1994/005304A1、WO 1994/023031 A1、WO 1995/020974 A1、WO 1995/023874A1和WO 1996/026214A1中找到。
优选的肿瘤抗原包括NY-ESO1、PRAME、甲胎蛋白(AFP)、MAGE A4、MAGE A1、MAGEA10和MAGE B2，最优选NY-ESO-1和MAGE-A10。
NY-ESO-1是癌症/睾丸(CT)家族的人肿瘤抗原，并且经常在广泛多样的癌症中表达，所述癌症包括黑色素瘤、***癌、膀胱移行细胞癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌、胃癌、头与颈癌和***(van Rhee F.等人，Blood 2005；105(10):3939-3944)。另外，NY-ESO-1的表达通常限于生殖细胞，而在体细胞中不表达(Scanlan M.J.等人，Cancer Immun.2004；4(1))。与表达NY-ESO-1的癌细胞结合的合适的亲和力增强的TCR包括NY-ESO-1c2。
NY-ESO-1c259是亲和力增强的TCR，相对于野生型TCR，其在α链95:96LY的位置95和96处突变。在HLA-A2+1类等位基因的背景下，NY-ESO-1c259结合对应于人睾丸癌Ag NY-ESO-1(SLLMWITQC)的氨基酸残基157-165的肽，相对于未修饰的野生型TCR具有增加的亲和力(Robbins等人，J Immunol(2008)180(9):6116)。
MAGE-A10是CT抗原的MAGE-A家族的高度免疫原性成员，并且在生殖细胞中表达，但在健康组织中不表达。MAGE-A10在来自许多肿瘤的癌细胞中以高百分比表达(Schultz-Thater E.等人，Int J Cancer.2011；129(5):1137-1148)。
可以在体外和/或离体执行将核酸构建体引入T细胞内及其随后的扩增。
将编码生物活性分子的第一核苷酸序列和编码抗原受体的第二核苷酸序列在相同的表达载体中引入T细胞内。这增加了在转导后表达两个基因的T细胞比例。
第一核苷酸序列可以被配置用于在核酸构建体中的第一方向上表达，并且第二核苷酸序列可以被配置用于在核酸构建体中的第二方向上表达。例如，编码IL-7的第一核苷酸序列可以处于核酸构建体中的正向取向，并且编码抗原受体的第二核苷酸序列可以处于反向取向，或者编码IL-7的第一核苷酸序列可以处于反向取向，并且编码抗原受体的第二核苷酸序列可以处于正向取向。第一核苷酸序列可以从核酸构建体的有义链转录，并且第二核苷酸序列可以从核酸构建体的反义链转录，或者第一核苷酸序列可以从核酸构建体的反义链转录，并且第二核苷酸序列可以从核酸构建体的有义链转录。
核酸构建体可以包括一个或多个独特的限制位点，以促进进一步的操作。
在一些实施例中，可以使用基因编辑技术，将核酸构建体直接引入T细胞内。
在其它实施例中，可以将核酸构建体掺入表达载体内。合适的载体是本领域众所周知的，并且在本文中更详细地描述。合适载体的例子包括如下所述的AB1581和ADB967。可以选择或构建合适的载体，其含有适当的调节序列，包括启动子序列、终止子片段、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因以及适当的其它序列。优选地，载体含有适当的调节序列，以驱动核酸在哺乳动物细胞中的表达。载体还可以包含序列，例如复制起点、启动子区和可选择标记物，其允许其在细菌宿主例如大肠杆菌(E.coli)中的选择、表达和复制。
优选地，核酸构建体包含在病毒载体，最优选γ逆转录病毒载体或慢病毒载体，例如VSVg-假型慢病毒载体中。可以通过与包含核酸的病毒颗粒接触来转导T细胞。用于转导的病毒颗粒可以根据已知方法生产。例如，可以用编码病毒包装和包膜元件的质粒、以及包含编码核酸的慢病毒载体转染HEK293T细胞。VSVg-假型病毒载体可以与水泡性口炎病毒(VSVg)的病毒包膜糖蛋白G组合产生，以产生假型病毒颗粒。
病毒载体，例如慢病毒，可以包含在病毒颗粒中，所述病毒颗粒包含被一种或多种病毒蛋白封装的核酸载体。病毒颗粒可以通过包括以下方法产生：用如本文所述的病毒载体以及一种或多种病毒包装和包膜载体转导哺乳动物细胞，并且在培养基中培养转导的细胞，使得细胞产生被释放到培养基内的慢病毒颗粒。
在病毒颗粒的释放后，可以收集包含病毒颗粒的培养基，并且任选地可以浓缩病毒颗粒。
在产生和任选的浓缩之后，病毒颗粒可以例如通过在-80℃下冷冻进行贮存，以准备用于转导T细胞中。
可以通过任何方便的方法，将核酸构建体或载体引入T细胞内。当将异源核酸引入或掺入T细胞内时，必须考虑本领域技术人员众所周知的某些考虑因素。待***的核酸应该组装在含有有效调节元件的构建体或载体内，所述调节元件驱动在T细胞中的转录。用于将构建体载体转运到T细胞内的合适技术是本领域众所周知的，并且包括磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其它病毒例如牛痘病毒或慢病毒的转导。例如，固相转导可以通过在逆转录素包被的、逆转录病毒载体预装载的组织培养板上的培养，无需选择而执行。
用于核酸操作和转化，例如在核酸构建体的制备中、将DNA引入细胞内和基因表达的许多已知的技术和方案，在Protocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel等人，编辑John Wiley&Sons,1992中详细描述。
在将核酸引入T细胞内之后，可以在体外培养修饰的T细胞的初始群体，使得修饰的T细胞增殖并且扩增该群体。
修饰的T细胞群体可以例如使用包被有抗CD3和抗CD28的磁珠进行扩增。可以使用任何方便的技术培养修饰的T细胞，以产生扩增的群体。合适的培养***包括搅拌槽式发酵罐、气升式发酵罐、滚瓶、培养袋或培养皿、以及其它生物反应器，特别是中空纤维生物反应器。此类***的使用是本领域众所周知的。
适用于离体T细胞增殖的众多培养基是可获得的，特别是完全培养基，例如AIM-V、Iscoves培养基和RPMI-1640(Invitrogen-GIBCO)。培养基可以补充有其它因子，例如血清、血清蛋白和选择剂。例如，在一些实施例中，可以采用RPMI-1640培养基，其含有2mM谷氨酰胺、10％FBS、25mM HEPES pH 7.2、1％青霉素-链霉素和55μMβ-巯基乙醇，并且任选补充有20ng/ml重组IL-2。培养基可以补充有以标准浓度的上述激动剂或拮抗剂因子，其可以由技术人员通过例行实验容易地确定。
方便地，将细胞在合适的培养基中于37℃在含有5％ CO2的潮湿大气中培养。
用于培养T细胞及其它哺乳动物细胞的方法和技术是本领域众所周知的(参见例如，Basic Cell Culture Protocols,C.Helgason,Humana Press Inc.U.S.(2004年10月15日)ISBN:1588295451；Human Cell Culture Protocols(Methods in Molecular MedicineS.)Humana Press Inc.,U.S.(2004年12月9日)ISBN:1588292223；Culture of AnimalCells:A Manual of Basic Technique,R.Freshney,John Wiley&Sons Inc(2005年8月2日)ISBN:0471453293,Ho WY等人，J Immunol Methods.(2006)310:40-52)。
在一些实施例中，从群体中分离和/或纯化修饰的T细胞可能是方便的。可以使用任何方便的技术，包括FACS和抗体包被的磁性颗粒。
任选地，在使用前，如本文所述产生的修饰的T细胞群体可以例如通过冻干和/或冷冻保存进行贮存。
修饰的T细胞群体可以与其它试剂，例如缓冲剂、载体、稀释剂、防腐剂和/或药学可接受的赋形剂混合。合适的试剂在下文更详细地描述。本文所述的方法可以包括将修饰的T细胞群体与药学可接受的赋形剂混合。
适合于施用(例如通过输注)的药物组合物包括水性和非水性等渗、无热原的无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂和溶质，其致使制剂与预期受体的血液等渗；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。用于在此类制剂中使用的合适的等渗媒介物的例子包括氯化钠注射液、林格氏溶液或乳酸林格氏注射液。合适的媒介物可以在标准药学教科书中找到，所述药学教科书例如Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1990。
在一些优选实施例中，可以将修饰的T细胞配制成适合于静脉内输注到个体内的药物组合物。
如本文使用的，术语“药学可接受的”涉及化合物、材料、组合物和/或剂型，其在合理的医学判断范围内，适用于与受试者(例如，人)的组织接触，而无过度的毒性、刺激、变应性应答、或者其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。每种载体、赋形剂等也必须在与制剂的其它成分相容的意义上是“可接受的”。
本发明的其它方面提供了表达如本文所述的核酸构建体或载体的修饰的T细胞群体，以及组成性表达异源抗原受体并且在T细胞活化后诱导性表达IL-7的T细胞群体。
T细胞可以特异性结合癌细胞。可以通过上述方法产生合适的群体。
修饰的T细胞群体可以用作药物。例如，如本文所述的修饰的T细胞群体可以用于癌症免疫治疗疗法，例如过继性T细胞疗法中。
本发明的其它方面提供了如本文所述的修饰的T细胞群体用于制造用于治疗癌症的药物的用途，如本文所述的用于治疗癌症的修饰的T细胞群体，并且治疗癌症的方法可以包括将如本文所述的修饰的T细胞群体施用于有此需要的个体。
修饰的T细胞群体可以是自体的，即，修饰的T细胞最初从它们随后施用于其的相同个体获得(即，供体个体和受体个体是相同的)。可以通过包括以下的方法产生用于施用于个体的合适的修饰的T细胞群体：提供从个体获得的初始T细胞群体，修饰T细胞以诱导性表达IL-7并且组成性表达抗原受体，所述抗原受体如本文所述的特异性结合个体中的癌细胞，并且培养修饰的T细胞。
修饰的T细胞群体可以是同种异体的，即，修饰的T细胞最初从它们随后施用于其的个体不同的个体获得(即，供体个体和受体个体是不同的)。供体个体和受体个体可以进行HLA匹配，以避免GVHD及其它不期望的免疫效应。可以通过包括以下的方法产生用于施用于受体个体的合适的修饰的T细胞群体：提供从供体个体获得的初始T细胞群体，修饰T细胞以诱导性表达IL-7并且组成性表达抗原受体，所述抗原受体如本文所述的特异性结合受体个体中的癌细胞，并且培养修饰的T细胞。
在修饰的T细胞施用之后，受体个体可以显示出T细胞介导的针对受体个体中的癌细胞的免疫应答。这可能对个体中的癌症状况具有有益作用。
癌症状况的特征可以在于恶性癌细胞的异常增殖，并且可以包括白血病例如AML、CML、ALL和CLL，淋巴瘤例如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤，以及实体癌例如肉瘤、皮肤癌、黑素瘤、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、***癌、肺癌、结肠直肠癌、***、肝癌、头与颈癌、食道癌、胰腺癌、肾癌、肾上腺癌、胃癌、睾丸癌、胆囊癌和胆道癌、甲状腺癌、胸腺癌、骨癌和脑癌、以及原发灶不明癌(CUP)。
个体内的癌细胞可以在免疫学上不同于个体中的正常体细胞(即癌性肿瘤可以是免疫原性的)。例如，癌细胞可能能够在个体中引发针对由癌细胞表达的一种或多种抗原的全身性免疫应答。引发免疫应答的肿瘤抗原可以对癌细胞是特异性的，或者可以被个体中的一种或多种正常细胞共享。
适合于如上所述的治疗的个体可以是哺乳动物，例如啮齿类动物(例如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠科动物(例如小鼠)、犬科动物(例如犬)、猫科动物(例如猫)、马科动物(例如马)、灵长类动物、猿猴(例如猴或猿)、猴(例如狨猴、狒狒)、猿(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人。
在优选实施例中，个体是人。在其它优选实施例中，可以采用非人哺乳动物，尤其是照常规用作用于证实在人中的治疗功效的模型的哺乳动物(例如鼠科动物、灵长类动物、猪科动物、犬科动物或兔形目动物)。
在一些实施例中，个体在最初的癌症治疗后可以具有微小残留病(MRD)。
患有癌症的个体可以展示至少一种可鉴定的体征、症状或实验室发现，其足以根据本领域已知的临床标准作出癌症的诊断。可以在医学教科书中找到此类临床标准的例子，所述教科书例如Harrison’s Principles of Internal Medicine,，第15版，Fauci AS等人，编辑，McGraw-Hill,New York,2001。在一些情况下，个体中的癌症诊断可以包括鉴定从个体获得的体液或组织的样品中的特定细胞类型(例如癌细胞)。
治疗可以是无论是人还是动物(例如在兽医应用中)的任何治疗和疗法，其中达到一些所需疗效，例如，状况进展的抑制或延迟，并且包括进展速率中的减少，进展速率中的停止，状况的改善，状况的治愈或缓解(无论是部分还是全部)，预防、延迟、减轻或停滞状况的一种或多种症状和/或体征，或延长受试者或患者的存活超出在治疗的不存在下预期的那种。
治疗也可以是预防性的(即预防)。例如，可以如本文所述治疗易患癌症或者处于癌症的发生或再次发生的风险中的个体。此类治疗可以预防或延迟个体中癌症的发生或再次发生。
特别地，治疗可以包括抑制癌症生长，包括完全癌症缓解，和/或抑制癌症转移。癌症生长一般指许多指标中的任何一个，所述指标指示癌症内至更发展形式的改变。因此，用于测量癌症生长的抑制的指标包括癌细胞存活中的降低，肿瘤体积或形态中的降低(例如，如使用计算机断层扫描(CT)、超声检查或其它成像方法确定的)，延迟的肿瘤生长，肿瘤脉管***的破坏，迟发型超敏反应皮肤测试中的改善性能，T细胞活性中的增加、以及肿瘤特异性抗原水平中的降低。如本文所述修饰的T细胞的施用可以改善个体抵抗癌症生长的能力，特别是已经存在于受试者中的癌症的生长和/或降低个体中的癌症生长的倾向。
可以通过任何方便的施用途径，将修饰的T细胞或包含修饰的T细胞的药物组合物施用于受试者，所述施用途径无论是全身/外周还是在所需作用部位处，包括但不限于；肠胃外，例如通过输注。输注涉及通过针或导管施用在合适组合物中的T细胞。通常，静脉内或皮下输注T细胞，尽管T细胞可以经由其它非经口途径，例如肌内注射和硬膜外途径进行输注。合适的输注技术是本领域已知的和疗法中常用的(参见例如，Rosenberg等人，NewEng.J.of Med.,319:1676,1988)。
通常，施用的细胞数目为约105至约1010/Kg体重，通常为2x108至2x1010个细胞/个体，通常在30分钟的过程中，其中治疗根据需要重复，例如以几天至几周的间隔。应了解，修饰的T细胞的适当剂量以及包含修饰的T细胞的组合物可以因患者而异。确定最佳剂量一般涉及本发明治疗的治疗益处水平针对任何风险或有害副作用的平衡。选择的剂量水平取决于各种因素，包括但不限于特定细胞的活性，施用途径，施用时间，细胞丧失或失活的速率，治疗的持续时间，组合中使用的其它药物、化合物和/或材料，以及患者的年龄、性别、重量、状况、一般健康状况和先前的病史。细胞的量和施用途径最终由医师决定，尽管一般地剂量待在作用部位处达到局部浓度，其达到所需效应而不引起大量有害或有毒副作用。
尽管修饰的T细胞可以单独施用，但在一些情况下，修饰的T细胞可以将细胞与靶抗原、展示靶抗原的APC和/或IL-2组合施用，以促进修饰的T细胞群体在体内的扩增。
修饰的T细胞群体可以与一种或多种其它疗法组合施用，所述其它疗法例如细胞因子如IL-2、细胞毒性化学疗法、辐射和免疫肿瘤学试剂包括检查点抑制剂，例如抗B7-H3、抗B7-H4、抗TIM3、抗KIR、抗LAG3、抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA4抗体。
可以通过任何方便的手段施用一种或多种其它疗法，优选在与修饰的T细胞的施用部位分开的部位处。
在治疗自始至终，修饰的T细胞的施用可以在一个剂量中、连续或间歇地(例如，以适当间隔的分份剂量)实现。确定最有效的施用手段和剂量的方法是本领域技术人员众所周知的，并且随着用于疗法的制剂、疗法的目的、待治疗的靶细胞和待治疗的受试者而变。单次或多重施用可以用通过主治医师选择的剂量水平和模式进行。优选地，修饰的T细胞以至少1x 109个T细胞的单次输液施用。
适当时，以其特定形式或根据用于执行所公开功能的手段、或用于获得所公开结果的方法或过程表示的，在前述说明书、或下述权利要求或附图中公开的特征可以分开地、或以此类特征的任何组合用于以其不同形式实现本发明。
应理解，除非上下文另有要求，否则本专利申请彼此公开了上述方面和实施例中的任一个的所有组合。类似地，除非上下文另有要求，否则本专利申请单独地或连同任何其它方面一起公开了优选和/或任选特征的所有组合。
必须注意，如在说明书和所附权利要求中使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。范围可以在本文中表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一特定值。当表达此类范围时，另一个实施例包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当值通过使用先行词“约”表示为近似值时，应理解特定值形成另一个实施例。
阅读本公开内容后，上文实施例的修饰、进一步实施例及其修饰对于本领域技术人员将是显而易见的，并且像这样，这些在本发明的范围内。
本说明书中提及的所有文件和序列数据库条目都以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
当在本文中使用时，“和/或”被视为两个指定的特征或组分中的每个连同或不连同另一个的具体公开。例如，“A和/或B”被视为(i)A、(ii)B以及(iii)A和B中的每个的具体公开，就像每个在本文中个别地列出一样。
本发明的其它方面和实施例提供了其中术语“包含”替换为术语“由……组成”的上述方面和实施例，以及其中术语“包含”替换为术语“基本上由……组成”的上述方面和实施例。
现在将通过实例且参考上述附图来示出本发明的某些方面和实施例。
实验
1.方法
1.1IL-7表达构建体的设计和生产
设计了慢病毒表达载体，其在识别同源肽MHC1复合物后，允许IL-7的诱导性表达。可诱导元件基于人IL2启动子中存在的NFAT/AP1转录应答元件(TRE)(Macian等人，2001Oncogene)。IL-7的选择性诱导型表达是TCR活化和Ca2+依赖性NFAT易位至核的结果，在其中它可以促进携带NFAT TRE的基因的转录。
IL-7表达盒由如图1中所示的四个元件组成。
1.以红色突出显示的人IL2启动子NFAT TRE的3个串联重复(GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT)(SEQ ID NO:14)
2.最小CMV启动子(绿色)
3.Kozak序列(GCCGCCACCATG)(SEQ ID NO:16)和密码子优化的IL-7
编码序列(黄色)。补充图1含有野生型核苷酸序列
4.SV40聚腺苷酸信号(紫色)
EcorV限制上游的序列(图1中以绿色突出显示)对应于慢病毒载体主链序列，并且包括在合成构建体中，以便维持EF1A启动子的编码序列。另外的独特的限制位点也设计到合成构建体内，以便在需要时允许构建体的进一步改造。这些包括：
1.NFAT IL-2TRE上游的EcoRV(GATATC)和NSI-I(ATGCAT)限制位点
2.IL-7CDS紧上游的NdeI限制位点CATATG
3.紧在IL-7CDS中的TGA终止密码子之后的XhoI(CTCGAG)
4.mCMV启动子紧上游的AatII限制位点(GACGTC)。
这种构建体被设计为克隆在表达单独的TCR的构建体内的AgeI和MluI限制位点之间(图2)，并且允许IL-7从反义链以及以与SPEAR TCR相反的取向转录。设计了允许IL-7和SPEAR TCR的组成性表达的另外构建体。这些构建体将IL-7以及TCRα和TCRβ链作为单个开放读码框编码。各个多肽通过自切割的2A样肽分开，其允许核糖体跳过以及从单个转录物表达多重多肽。
1.2ADB967 NFAT IL-7_TCR1的生成
NFAT_IL-7盒(SEQ ID NO:1)由GeneArt(Thermo Fisher Scientific)合成，具有5’AgeI(ACCGGT)3’MluI(ACGCGT)限制位点，并且在标准克隆载体(pMS-RQ)中提供(图2)。用AgeI和MluI消化含有NFAT_IL-7的载体和ADB934(TCR1)，并且根据制造商的说明书，使用凝胶提取试剂盒，通过凝胶提取纯化目的片段。根据标准方案，使用T4 DNA连接酶(NEB)连接消化的片段。克隆通过限制性酶消化进行筛选，并且通过测序加以验证(参见图4的载体图谱)。
1.3ADB1099组成型IL-7_TCR1的生成
IL-7_T2A_TCR1***片段通过重叠PCR生成。用引物NHEI_IL_7F和IL7_T2AR扩增IL-7CDS。用引物T2AF和BETA_SAL_REVIII扩增TCR1CDS。从现有的内部构建体ADB951扩增TCR1 CDS。根据标准方案，用Q5 DNA聚合酶(NEB)执行PCR反应，并且根据制造商的说明书，使用凝胶提取试剂盒，通过凝胶提取纯化PCR产物。通过重叠PCR将两个片段与NHEI_IL_7F和BETA_SAL_REVIII引物融合在一起，所述引物含有NheI(GCTAGC)和SalI(GTCGAC)限制位点(加下划线的)。根据标准方案，使用T4 DNA连接酶(NEB)连接消化的片段。克隆通过限制性酶消化进行筛选，并且通过测序加以验证(参见图5的载体图谱)。/>
1.4ADB1581NFAT IL-7_TCR2的生成
将TCR2***片段从内部构建体ADB1535亚克隆到ADB1224内。用NheI和SalI限制性酶消化ABD1535和ADB1224，并且根据制造商的说明书，使用凝胶提取试剂盒，通过凝胶提取纯化目的片段。根据标准方案，使用T4 DNA连接酶(NEB)连接消化的片段。将NFAT IL-7盒从ADB967(NFAT-IL-7_TCR1)亚克隆到这种新的TCR2慢病毒表达载体内的AgeI和MluI限制位点之间。克隆通过限制性酶消化进行筛选，并且通过测序加以验证(参见图6的载体图谱)。
1.5ADB1580组成型IL-7_F2A_TCR2的生成
用下述引物从ABD1099 PCR扩增IL-7CDS：FWD-5’TAATGCTAGCGCCGCCACCATGTTCCACGTGTCC(SEQ ID NO:21)3’和Rev 5’-CTTCACGGGCGCGCCAGAGCCGCTTCTCTTGG-(SEQ ID NO:22)3’。这些包括NheI(GCTAGC)和AscI(GGCGCGCC)限制位点(加下划线的)。根据制造商的说明书，使用凝胶提取试剂盒，通过凝胶提取纯化PCR产物。用NheI和AscI消化PCR产物和(ADB1488)，并且根据制造商的方案，使用/>凝胶提取试剂盒，通过凝胶提取纯化目的片段。根据标准方案，使用T4 DNA连接酶(NEB)连接消化的片段。克隆通过限制性酶消化进行筛选，并且通过测序加以验证(参见图7的载体图谱)。
1.6T细胞生产
使用MACS分离试剂盒和相关的制造商的方案，从全血中分开来自六个供体的PBL，伴随另外的CD14耗尽(PBL)。用包括以下的不同的慢病毒构建体转导T细胞：TCR和NFAT_IL-7TCR(参见图1)。在1mg/ml F108泊洛沙姆的存在下执行T细胞转导。F108泊洛沙姆先前已溶解于水中，以制备以100mg/ml的储备溶液，然后在贮存于4℃下之前，使用0.2μm过滤器进行灭菌。在与慢病毒颗粒添加的同时，将1mg/ml F108泊洛沙姆加入每个孔的细胞(包括NTD细胞)中。
转导的细胞扩增14天。T细胞在第10天时用100U/ml Proleukin饲喂，但在第12天时用不含Proleukin的新鲜培养基饲喂，以允许细胞在用于测定特别是用于增殖测定之前有更多的时间休息。
在第14天时，将细胞冷冻。未转导(NTD)的T细胞与转导的T细胞同时产生，但将新鲜的病毒培养基(R10+Hepes)代替慢病毒颗粒加入受刺激的T细胞中。
1.7用于ELISA的细胞因子分泌测定
细胞因子产生测定通常如下进行。在测定当天，收获A375、Mel624和Colo205细胞，重悬浮于R10中且计数。在洗涤三次之前，将一些A375细胞在37C/5％ CO2下用10μM MAGE-A4肽脉冲2小时。通常将靶细胞以50,000个细胞/孔在100μl的体积中铺平板到一式三份孔的96孔平底板内。将T细胞解冻，洗涤，以不小于1x106个细胞/ml重悬浮于R10中，并且在37℃/5％ CO2下静置1-2小时。对未转导的和转导的效应细胞进行计数，并且以120,000个细胞/孔铺平板到一式三份孔中的100μl测定培养基中，以给出200μl的最终体积。注意：为了说明不同构建体之间的转导中的差异，通过添加来自相同供体的NTD T细胞将细胞标准化，以给出等价的转导效率。然后将板置于37C/5％ CO2下的培养箱中48小时。48小时后，将测定板离心，并且将上清液转移至新的96孔板中，所述板贮存于-20℃下直至通过ELISA分析，所述ELISA在以后的日期时执行。
1.8IL-7ELISA
根据制造商的方案，伴随修饰，使用Duoset Human IL-7ELISA试剂盒，在96孔一半面积的板中执行这种测定。简言之，由于使用96孔一半面积的板，对于所有试剂使用25μl/孔(或50μl阻断试剂)代替如方案中指示的100μl。在大多数情况下，样品未稀释使用。如果将它们稀释，则将它们在测定培养基中稀释。该测定使用商业TMB底物溶液显色大约10分钟，并且用1N H2SO4终止反应。使用Spectrastar Omega在450nm处读取测定，其中波长校正设为540nm。使用Spectrastar数据分析软件分析数据。大于标准曲线上的最高浓度的数据点通常分配最高浓度的值。对于大多数测定，扩展标准曲线以提供比通过制造商指示更大的范围，其中最高浓度为1000pg/ml。样品和标准曲线使用一式两份孔或一式三份孔执行，并且在可能时，使用四参数逻辑曲线拟合执行曲线拟合。
1.9T细胞表型分型
在测定当天，将T细胞解冻，在PBS中洗涤两次，计数且在PBS中调节至1x106个细胞/ml。对T细胞执行流式细胞术。所使用抗体的列表可以在表1和表2中找到。
表1.在扩增阶段结束时，用于鉴定增殖性T细胞的抗体和体积列表(实验对象组1)
表2.在扩增阶段结束时，用于鉴定增殖性T细胞的抗体和体积列表(实验对象组2)
1.10再刺激测定
再刺激测定如下进行。在测定的第一天(第0天)，将T细胞解冻，洗涤，以不小于1x106个细胞/ml重悬浮于R10中且静置。对细胞进行计数，并且为了说明不同慢病毒制剂之间的转导中的差异，通过添加来自相同供体的NTD T细胞将细胞标准化，以在供体T细胞分批内给出等价的转导效率。
将T细胞以1x106/ml在R10中铺平板，其中在24孔板中具有1ml T细胞/孔。收获A375靶细胞，然后照射(48Gy)。将A375细胞以大约1x106/ml重悬浮，并且将1ml/孔加入含有T细胞的孔中。这给出2ml/孔的最终体积，具有1:1的T细胞和受照射的A375细胞。在对照孔中，将重组人IL-7以20ng/ml的最终浓度加入细胞中。T细胞和受照射的A375细胞连同或不连同外源IL-7的共培养物然后在37℃/5％ CO2下培养7天。
在第7、14、21和28天时，收获T细胞，并且使用半自动化计数进行计数，其中排除台盼蓝阳性细胞(死细胞)。对于含有不表达TCR1的T细胞的孔，并非所有台盼蓝阴性(活)细胞都是T细胞，因为它们比T细胞大得多。这些最有可能是对于台盼蓝染色尚未呈阳性的受照射的A375靶。从计数中手动排除尽可能多的较大的明显的非T细胞(A375)，但来自这些孔(含有NTD)中的活T细胞计数可能是过高估计的，因为它们仍含有一些“显然”的活A375靶。这也由来自那些样品的细胞的平均较大尺寸反映，因为A375细胞比T细胞大。然而，在含有表达TCR1的T细胞的孔中，存在很少的或没有剩余的大的活A375细胞，因此绝对计数和细胞大小可能是更准确的。然后计算总的活T细胞计数。
一旦已计算活T细胞的总数目，T细胞就如下进行***。如果T细胞已增殖，则可以通过将新鲜的R10加入现有体积的T细胞(在“旧”R10中)至正确的最终浓度，将它们稀释至1x106/ml的浓度(至最接近的ml)。“旧”R10定义为前一周细胞已在其中进行培养的培养基。然而，如果T细胞已收缩(即，与最初铺平板的浓度相比，活T细胞的数目已减少)，则将细胞离心(1500rpm，5分钟)，然后重悬浮于适当体积的“旧”R10中。
T细胞以1ml/孔(～1x106个T细胞/ml)在24孔板中铺平板。如果可能的话，所有T细胞都在它们扩增时铺平板，使得图中呈现的T细胞总数目实际上是产生的T细胞总数目。在一些情况下，特别是在以后的时间点，随着T细胞的数目变得越来越大(通常大于8-12x106个细胞)，仅8-12x106个T细胞进行铺平板用于再刺激。然后，通过考虑在先前的时间点已最初铺平板的T细胞数目，重新计算这些样品在后续时间点的T细胞总数目。例如，如果我们在第21天时已计数20x106个T细胞，则我们在第21天时仅铺平板这些细胞中的8x106用于再刺激。如果我们已将所有20x106个细胞铺平板，则如下重新计算在第28天时已生成的总细胞数目：
1.细胞数目中的倍数变化＝在再刺激(在第28天时)后的细胞计数/铺平板用于再刺激的细胞数目(最初在第21天时铺平板的8x106)
2.在第28天时重新计算的总细胞数目＝细胞数目中的倍数变化(在第21-28天之间)x在第21天时可用于铺平板的细胞总数目(例如20x106)
收获A375靶细胞并且以48Gy照射以防止其增殖，然后以大约1x106/ml、1ml/孔(1:1的T细胞:A375)加入R10中的T细胞中。在对照孔中，将重组人IL-7以20μg/ml的最终浓度加入细胞中(假定孔中的所有IL-7已被“消耗”)。在第7、14和21天时重复这个再刺激过程。
1.11体内研究
使用先前描述的方法，将来自Leukopak的PBL耗尽CD14。如先前所述转导T细胞，并且在冷冻前扩增14天。除NTD T细胞和用表达TCR1、NFAT-IL-7_TCR1或组成型IL-7_TCR1的构建体转导的T细胞之外，还用表达NFAT-IL-7_无关TCR的构建体转导T细胞。
在第0天时，用1x106个Mel624肿瘤细胞静脉内(i.v.)注射6-8周龄的免疫缺陷的CIEA NOG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2gtm1Sug/JicTac)雌性小鼠，所述肿瘤细胞先前已用表达GFP/萤光素酶的慢病毒构建体进行转导。在肿瘤细胞植入后的第6天时，将小鼠成像，并且基于萤光素酶信号强度，随机分为每组8只小鼠的8个组，使得每组具有相等的平均总通量。在第7天时，将T细胞解冻，并且使用NTD T细胞，将不同构建体之间的转导T细胞的频率标准化至～42％ TCR Vβ+/CD3+。小鼠随后不用任何东西(仅肿瘤对照)或用2x106总T细胞(NTD、TCR1、NFAT-IL-7_TCR1、组成型IL-7_TCR1、NFAT-IL-7_对照TCR)进行i.v.注射。
在第6天时，使用Bruker In Vivo Xtreme成像***将动物成像，然后每周成像一次，以测量疾病负担并且跟踪疾病进展。在研究的以后阶段，动物每周成像两次。在成像之前，动物用150mg/kg的萤光素(5ml/kg)进行i.p.注射，并且用异氟烷麻醉。在曝光后，拍摄X射线照片，以辅助定向和器官定位。在分析时，将图像转换为光子/秒/mm2(P/s/mm2)，其允许比较使用不同曝光时间获取的图像，调整比例并且将生物发光图像叠加在X射线图像上。设置感兴趣区域，以测量来自整个动物的生物发光信号。ROI的大小对于所有图像保持相同。小鼠还每周至少3次进行称重，并且在指示体重减轻或不良状况时剔除
结果
与表达单独的TCR或连同组成型IL-7一起的TCR的细胞相比，发现用共表达诱导型IL-7与改造的TCR的T细胞注射的小鼠显示改善的存活(图16)。
序列
SEQ ID NO:1NFAT IL-7诱导盒的核苷酸序列。
关键：
红色(完全下划线)＝人IL2启动子NFAT TRE的串联重复(GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT)(SEQ ID NO:14)。
绿色(虚线下划线)＝最小CMV启动子。
黑色＝Kozak序列(GCCGCCACCATG)(SEQ ID NO:16)和密码子优化的IL-7编码序列。
蓝色(点下划线)＝SV40聚腺苷酸化信号。
密码子优化的IL-7的翻译的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)和蛋白质序列(SEQ IDNO:3)
MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH*
SEQ ID NO:3 IL-7蛋白质序列
ATGGAGACCCTGCTGGGCCTGCTGATCCTGTGGCTGCAGCTCCAGTGGGTGTCCAGCAAGCAGGAGGTGACCCAGATCCCTGCCGCCCTGAGCGTGCCCGAGGGCGAGAACCTGGTGCTGAACTGCAGCTTCACCGACTCCGCCATCTACAACCTGCAGTGGTTCCGGCAGGACCCCGGCAAGGGCCTGACCAGCCTGCTGCTGATCCAGAGCAGCCAGCGGGAGCAGACCAGCGGACGGCTGAACGCCAGCCTGGACAAGAGCAGCGGCCGGAGCACCCTGTACATCGCCGCCAGCCAGCCCGGCGACAGCGCCACCTACCTGTGCGCTGTGCGGCCTCTGTACGGCGGCAGCTACATCCCCACCTTCGGCAGAGGCACCAGCCTGATCGTGCACCCCTACATCCAGAACCCCGACCCCGCCGTGTACCAGCTGCGGGACAGCAAGAGCAGCGACAAGTCTGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACAGCCAGACCAATGTGAGCCAGAGCAAGGACAGCGACGTGTACATCACCGACAAGACCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAACAGCGCCGTGGCCTGGAGCAACAAGAGCGACTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATTATCCCCGAGGACACCTTCTTCCCCAGCCCCGAGAGCAGCTGCGACGTGAAACTGGTGGAGAAGAGCTTCGAGACCGACACCAACCTGAACTTCCAGAACCTGAGCGTGATCGGCTTCAGAATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGATTCAACCTGCTGATGACCCTGCGGCTGTGGAGCAGCGGCTCCCGGGCCAAGAGAAGCGGATCCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGAGACGTGGAAGAAAACCCTGGCCCTAGGATGAGCATCGGCCTGCTGTGCTGCGCCGCCCTGAGCCTGCTGTGGGCAGGACCCGTGAACGCCGGAGTGACCCAGACCCCCAAGTTCCAGGTGCTGAAAACCGGCCAGAGCATGACCCTGCAGTGCGCCCAGGACATGAACCACGAGTACATGAGCTGGTATCGGCAGGACCCCGGCATGGGCCTGCGGCTGATCCACTACTCTGTGGGAGCCGGAATCACCGACCAGGGCGAGGTGCCCAACGGCTACAATGTGAGCCGGAGCACCACCGAGGACTTCCCCCTGCGGCTGCTGAGCGCTGCCCCCAGCCAGACCAGCGTGTACTTCTGCGCCAGCAGCTATGTGGGCAACACCGGCGAGCTGTTCTTCGGCGAGGGCTCCAGGCTGACCGTGCTGGAGGACCTGAAGAACGTGTTCCCCCCCGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCCAGCGAGGCCGAGATCAGCCACACCCAGAAGGCCACACTGGTGTGTCTGGCCACCGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGTCCTGGTGGGTGAACGGCAAGGAGGTGCACAGCGGCGTGTCTACCGACCCCCAGCCCCTGAAGGAGCAGCCCGCCCTGAACGACAGCCGGTACTGCCTGTCCTCCAGACTGAGAGTGAGCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGGAACCACTTCCGGTGCCAGGTGC AGTTCTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGACCGGGCCAAGCCCGTGACCCAGATTGTGAGCGCCGAGGCCTGGGGCAGGGCCGACTGCGGCTTCACCAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACCCTGTACGCCGTGCTGGTGTCTGCCCTGGTGCTGATGGCTATGGTGAAGCGGAAGGACAGCCGGGGCTAAGTCGAC
SEQ ID NO:4NheI和SalI位点之间的核苷酸序列
METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPLYGGSYIPTFGRGTSLIVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSGSRAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRMSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*V
SEQ ID NO:5TCR1的蛋白质序列
METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPLYGGSYIPTFGRGTSLIVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSGSRAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRMSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
SEQ ID NO:6 TCR1 CDS
ACGCGTTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTCTCGAGTCAGTGCTCTTTGGTGCCCATCAGGATCTTGTTCCAGCAGGTCTTGATTTCCTGCAGCAGCCGCTTCAGGAAGCACAGGTCGTTCAGTTTCTTCTGCTCTTTCAGGGACTTGTTCTCTTCCAGGCTCTTGGTAGGCTGGGCTTCTCCCAGGGCGGCAGGCTTTCTGCCCTTCACTTGGCCGGTGCAATTCAGCAGGATGGTGGTGCCCTCGGACACTTTCAGCAGATGCAGGTCGAAGTCGCCGGTGCTGTTCATCTTCAGGAACTGCCGCAGCTTTCTGGCGGCTCTGAACAGGAACATGCCTTCTTTGTTGGCGTCGCAGATGTGCCGCTTGAAGAAGTTGAACTCGTTGTTCAGGCAGTTGCTGCCGATTTCCTTCATGCTGTCCAGCAGCTGGTCGATGGACACCATCAGCACGCTCTCGTACTGCTTGCCGTCCTTGCCCTCGATGTCGCAGTCGCTGCTGGCCACAGGCAGCAGCACCAGGATCAGGGGGGGCAGGCCGAAGATGTACCGGAAGGACACGTGGAACATGGTGGCGGCCATATGGATCCAACGAATGTCGAGAGGCTGGATCGGTCCCGGTGTCTTCTATGGAGGTCAAAACAGCGTGGATGGCGTCTCCAGGCGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCTGCTTATATAGGCCTCCCACCGTACACGCCTAGACGTCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCGCTAGCGAGCTCAGGTACCGGCCAGTTAGGCCGATATCATGCATCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACTGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGTGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGCTAGCCGCCACCATGGAGACCCTGCTGGGCCTGCTGATCCTGTGGCTGCAGCTCCAGTGGGTGTCCAGCAAGCAGGAGGTGACCCAGATCCCTGCCGCCCTGAGCGTGCCCGAGGGCGAGAACCTGGTGCTGAACTGCAGCTTCACCGACTCCGCCATCTACAACCTGCAGTGGTTCCGGCAGGACCCCGGCAAGGGCCTGACCAGCCTGCTGCTGATCCAGAGCAGCCAGCGGGAGCAGACCAGCGGACGGCTGAACGCCAGCCTGGACAAGAGCAGCGGCCGGAGCACCCTGTACATCGCCGCCAGCCAGCCCGGCGACAGCGCCACCTACCTGTGCGCTGTGCGGCCTCTGTACGGCGGCAGCTACATCCCCACCTTCGGCAGAGGCACCAGCCTGATCGTGCACCCCTACATCCAGAACCCCGACCCCGCCGTGTACCAGCTGCGGGACAGCAAGAGCAGCGACAAGTCTGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACAGCCAGACCAATGTGAGCCAGAGCAAGGACAGCGACGTGTACATCACCGACAAGACCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAACAGCGCCGTGGCCTGGAGCAACAAGAGCGACTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATTATCCCCGAGGACACCTTCTTCCCCAGCCCCGAGAGCAGCTGCGACGTGAAACTGGTGGAGAAGAGCTTCGAGACCGACACCAACCTGAACTTCCAGAACCTGAGCGTGATCGGCTTCAGAATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGATTCAACCTGCTGATGACCCTGCGGCTGTGGAGCAGCGGCTCCCGGGCCAAGAGAAGCGGATCCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGAGACGTGGAAGAAAACCCTGGCCCTAGGATGAGCATCGGCCTGCTGTGCTGCGCCGCCCTGAGCCTGCTGTGGGCAGGACCCGTGAACGCCGGAGTGACCCAGACCCCCAAGTTCCAGGTGCTGAAAACCGGCCAGAGCATGACCCTGCAGTGCGCCCAGGACATGAACCACGAGTACATGAGCTGGTATCGGCAGGACCCCGGCATGGGCCTGCGGCTGATCCACTACTCTGTGGGAGCCGGAATCACCGACCAGGGCGAGGTGCCCAACGGCTACAATGTGAGCCGGAGCACCACCGAGGACTTCCCCCTGCGGCTGCTGAGCGCTGCCCCCAGCCAGACCAGCGTGTACTTCTGCGCCAGCAGCTATGTGGGCAACACCGGCGAGCTGTTCTTCGGCGAGGGCTCCAGGCTGACCGTGCTGGAGGACCTGAAGAACGTGTTCCCCCCCGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCCAGCGAGGCCGAGATCAGCCACACCCAGAAGGCCACACTGGTGTGTCTGGCCACCGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGTCCTGGTGGGTGAACGGCAAGGAGGTGCACAGCGGCGTGTCTACCGACCCCCAGCCCCTGAAGGAGCAGCCCGCCCTGAACGACAGCCGGTACTGCCTGTCCTCCAGACTGAGAGTGAGCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGGAACCACTTCCGGTGCCAGGTGCAGTTCTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGACCGGGCCAAGCCCGTGACCCAGATTGTGAGCGCCGAGGCCTGGGGCAGGGCCGACTGCGGCTTCACCAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACCCTGTACGCCGTGCTGGTGTCTGCCCTGGTGCTGATGGCTATGGTGAAGCGGAAGGACAGCCGGGGCTAAGTCGAC
SEQ ID NO:7跨越MluI和SalI限制位点之间的区域的有义链5’至3’序列。
GCTAGCGCCGCCACCATGTTCCACGTGTCCTTCCGGTACATCTTCGGCCTGCCCCCCCTGATCCTGGTGCTGCTGCCTGTGGCCAGCAGCGACTGCGACATCGAGGGCAAGGACGGCAAGCAGTACGAGAGCGTGCTGATGGTGTCCATCGACCAGCTGCTGGACAGCATGAAGGAAATCGGCAGCAACTGCCTGAACAACGAGTTCAACTTCTTCAAGCGGCACATCTGCGACGCCAACAAAGAAGGCATGTTCCTGTTCAGAGCCGCCAGAAAGCTGCGGCAGTTCCTGAAGATGAACAGCACCGGCGACTTCGACCTGCATCTGCTGAAAGTGTCCGAGGGCACCACCATCCTGCTGAATTGCACCGGCCAAGTGAAGGGCAGAAAGCCTGCCGCCCTGGGAGAAGCCCAGCCTACCAAGAGCCTGGAAGAGAACAAGTCCCTGAAAGAGCAGAAGAAACTGAACGACCTGTGCTTCCTGAAGCGGCTGCTGCAGGAAATCAAGACCTGCTGGAACAAGATCCTGATGGGCACCAAAGAGCACGGAAGCAGAGCCAAGAGAAGCGGCTCTGGCGAGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACATGTGGCGACGTGGAAGAAAACCCTGGCCCTATGGAGACCCTGCTGGGCCTGCTGATCCTGTGGCTGCAGCTCCAGTGGGTGTCCAGCAAGCAGGAGGTGACCCAGATCCCTGCCGCCCTGAGCGTGCCCGAGGGCGAGAACCTGGTGCTGAACTGCAGCTTCACCGACTCCGCCATCTACAACCTGCAGTGGTTCCGGCAGGACCCCGGCAAGGGCCTGACCAGCCTGCTGCTGATCCAGAGCAGCCAGCGGGAGCAGACCAGCGGACGGCTGAACGCCAGCCTGGACAAGAGCAGCGGCCGGAGCACCCTGTACATCGCCGCCAGCCAGCCCGGCGACAGCGCCACCTACCTGTGCGCTGTGCGGCCTCTGTACGGCGGCAGCTACATCCCCACCTTCGGCAGAGGCACCAGCCTGATCGTGCACCCCTACATCCAGAACCCCGACCCCGCCGTGTACCAGCTGCGGGACAGCAAGAGCAGCGACAAGTCTGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACAGCCAGACCAATGTGAGCCAGAGCAAGGACAGCGACGTGTACATCACCGACAAGACCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAACAGCGCCGTGGCCTGGAGCAACAAGAGCGACTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATTATCCCCGAGGACACCTTCTTCCCCAGCCCCGAGAGCAGCTGCGACGTGAAACTGGTGGAGAAGAGCTTCGAGACCGACACCAACCTGAACTTCCAGAACCTGAGCGTGATCGGCTTCAGAATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGATTCAACCTGCTGATGACCCTGCGGCTGTGGAGCAGCGGCTCCCGGGCCAAGAGAAGCGGATCCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGAGACGTGGAAGAAAACCCTGGCCCTAGGATGAGCATCGGCCTGCTGTGCTGCGCCGCCCTGAGCCTGCTGTGGGCAGGACCCGTGAACGCCGGAGTGACCCAGACCCCCAAGTTCCAGGTGCTGAAAACCGGCCAGAGCATGACCCTGCAGTGCGCCCAGGACATGAACCACGAGTACATGAGCTGGTATCGGCAGGACCCCGGCATGGGCCTGCGGCTGATCCACTACTCTGTGGGAGCCGGAATCACCGACCAGGGCGAGGTGCCCAACGGCTACAATGTGAGCCGGAGCACCACCGAGGACTTCCCCCTGCGGCTGCTGAGCGCTGCCCCCAGCCAGACCAGCGTGTACTTCTGCGCCAGCAGCTATGTGGGCAACACCGGCGAGCTGTTCTTCGGCGAGGGCTCCAGGCTGACCGTGCTGGAGGACCTGAAGAACGTGTTCCCCCCCGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCCAGCGAGGCCGAGATCAGCCACACCCAGAAGGCCACACTGGTGTGTCTGGCCACCGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGTCCTGGTGGGTGAACGGCAAGGAGGTGCACAGCGGCGTGTCTACCGACCCCCAGCCCCTGAAGGAGCAGCCCGCCCTGAACGACAGCCGGTACTGCCTGTCCTCCAGACTGAGAGTGAGCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGGAACCACTTCCGGTGCCAGGTGCAGTTCTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGACCGGGCCAAGCCCGTGACCCAGATTGTGAGCGCCGAGGCCTGGGGCAGGGCCGACTGCGGCTTCACCAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACCCTGTACGCCGTGCTGGTGTCTGCCCTGGTGCTGATGGCTATGGTGAAGCGGAAGGACAGCCGGGGCTAAGTCGAC
SEQ ID NO:8组成型IL-7_T2A_TCR1的核苷酸序列。这个序列覆盖NheI和SalI限制位点之间的区域。
SEQ ID NO:9组成型IL-7_TCR1的蛋白质序列IL7是加下划线的，且TCR是斜体的。
ACGCGTTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTCTCGAGTCAGTGCTCTTTGGTGCCCATCAGGATCTTGTTCCAGCAGGTCTTGATTTCCTGCAGCAGCCGCTTCAGGAAGCACAGGTCGTTCAGTTTCTTCTGCTCTTTCAGGGACTTGTTCTCTTCCAGGCTCTTGGTAGGCTGGGCTTCTCCCAGGGCGGCAGGCTTTCTGCCCTTCACTTGGCCGGTGCAATTCAGCAGGATGGTGGTGCCCTCGGACACTTTCAGCAGATGCAGGTCGAAGTCGCCGGTGCTGTTCATCTTCAGGAACTGCCGCAGCTTTCTGGCGGCTCTGAACAGGAACATGCCTTCTTTGTTGGCGTCGCAGATGTGCCGCTTGAAGAAGTTGAACTCGTTGTTCAGGCAGTTGCTGCCGATTTCCTTCATGCTGTCCAGCAGCTGGTCGATGGACACCATCAGCACGCTCTCGTACTGCTTGCCGTCCTTGCCCTCGATGTCGCAGTCGCTGCTGGCCACAGGCAGCAGCACCAGGATCAGGGGGGGCAGGCCGAAGATGTACCGGAAGGACACGTGGAACATGGTGGCGGCCATATGGATCCAACGAATGTCGAGAGGCTGGATCGGTCCCGGTGTCTTCTATGGAGGTCAAAACAGCGTGGATGGCGTCTCCAGGCGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCTGCTTATATAGGCCTCCCACCGTACACGCCTAGACGTCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCGCTAGCGAGCTCAGGTACCGGCCAGTTAGGCCGATATCATGCATCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACTGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGTGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGCTAGCCGCCACCATGAAGAAGCACCTGACCACCTTTCTCGTGATCCTGTGGCTGTACTTCTACCGGGGCAACGGCAAGAACCAGGTGGAACAGAGCCCCCAGAGCCTGATCATCCTGGAAGGCAAGAACTGCACCCTGCAGTGCAACTACACCGTGTCCCCCTTCAGCAACCTGCGGTGGTACAAGCAGGACACCGGCAGAGGCCCTGTGTCCCTGACCATCCTGACCTTCAGCGAGAACACCAAGAGCAACGGCCGGTACACCGCCACCCTGGACGCCGATACAAAGCAGAGCAGCCTGCACATCACCGCCAGCCAGCTGAGCGATAGCGCCAGCTACATCTGCGTGGTGTCCGGCGGCACAGACAGCTGGGGCAAGCTGCAGTTTGGCGCCGGAACACAGGTGGTCGTGACCCCCGACATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGCGGGACAGCAAGAGCAGCGACAAGAGCGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACAGCCAGACCAACGTGTCCCAGAGCAAGGACAGCGACGTGTACATCACCGACAAGACCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAATAGCGCCGTGGCCTGGTCCAACAAGAGCGACTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATTATCCCCGAGGACACATTCTTCCCAAGCCCCGAGAGCAGCTGCGACGTCAAGCTGGTGGAAAAGAGCTTCGAGACAGACACCAACCTGAACTTCCAGAACCTGAGCGTGATCGGCTTCAGAATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGCTTCAACCTGCTGATGACCCTGAGACTGTGGTCCAGCGGCAGCCGGGCCAAGAGATCTGGATCCGGCGCTACCAACTTTAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGGGACGTGGAAGAAAACCCTGGCCCTAGGATGGCCAGCCTGCTGTTCTTCTGCGGCGCCTTCTACCTGCTGGGCACCGGCTCTATGGATGCCGACGTGACCCAGACCCCCCGGAACAGAATCACCAAGACCGGCAAGCGGATCATGCTGGAATGCTCCCAGACCAAGGGCCACGACCGGATGTACTGGTACAGACAGGACCCTGGCCTGGGCCTGCGGCTGATCTACTACAGCTTCGACGTGAAGGACATCAACAAGGGCGAGATCAGCGACGGCTACAGCGTGTCCAGACAGGCTCAGGCCAAGTTCAGCCTGTCCCTGGAAAGCGCCATCCCCAACCAGACCGCCCTGTACTTTTGTGCCACAAGCGGCCAGGGCGCCTACGAGGAGCAGTTCTTTGGCCCTGGCACCCGGCTGACAGTGCTGGAAGATCTGAAGAACGTGTTCCCCCCAGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCTTCTGAGGCCGAAATCAGCCACACCCAGAAAGCCACACTCGTGTGTCTGGCCACCGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAACTGTCTTGGTGGGTCAACGGCAAAGAGGTGCACAGCGGCGTGTCCACCGATCCCCAGCCTCTGAAAGAACAGCCCGCCCTGAACGACAGCCGGTACTGCCTGAGCAGCAGACTGAGAGTGTCCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCAGAAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTTTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGACAGAGCCAAGCCCGTGACACAGATCGTGTCTGCCGAAGCTTGGGGGCGCGCCGATTGTGGCTTTACCAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGAAAGGCCACACTGTACGCCGTGCTGGTGTCTGCCCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGCGGAAGGACAGCCGGGGCTAATAAGTCGAC
SEQ ID NO:10跨越MluI和SalI限制位点之间的区域的有义链5’至3’序列(参见图6)。
MKKHLTTFLVILWLYFYRGNGKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLTILTFSENTKSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVSGGTDSWGKLQFGAGTQVVVTPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSGSRAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRMASLLFFCGAFYLLGTGSMDADVTQTPRNRITKTGKRIMLECSQTKGHDRMYWYRQDPGLGLRLIYYSFDVKDINKGEISDGYSVSRQAQAKFSLSLESAIPNQTALYFCATSGQGAYEEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
SEQ ID NO:11TCR2序列
GCTAGCGCCGCCACCATGTTCCACGTGTCCTTCCGGTACATCTTCGGCCTGCCCCCCCTGATCCTGGTGCTGCTGCCTGTGGCCAGCAGCGACTGCGACATCGAGGGCAAGGACGGCAAGCAGTACGAGAGCGTGCTGATGGTGTCCATCGACCAGCTGCTGGACAGCATGAAGGAAATCGGCAGCAACTGCCTGAACAACGAGTTCAACTTCTTCAAGCGGCACATCTGCGACGCCAACAAAGAAGGCATGTTCCTGTTCAGAGCCGCCAGAAAGCTGCGGCAGTTCCTGAAGATGAACAGCACCGGCGACTTCGACCTGCATCTGCTGAAAGTGTCCGAGGGCACCACCATCCTGCTGAATTGCACCGGCCAAGTGAAGGGCAGAAAGCCTGCCGCCCTGGGAGAAGCCCAGCCTACCAAGAGCCTGGAAGAGAACAAGTCCCTGAAAGAGCAGAAGAAACTGAACGACCTGTGCTTCCTGAAGCGGCTGCTGCAGGAAATCAAGACCTGCTGGAACAAGATCCTGATGGGCACCAAAGAGCACGGAAGCAGAGCCAAGAGAAGCGGCTCTGGCGCGCCCGTGAAGCAGACCCTGAACTTCGACCTGCTGAAACTGGCCGGCGACGTGGAAAGCAACCCTGGCCCTATGAAGAAGCACCTGACCACCTTTCTCGTGATCCTGTGGCTGTACTTCTACCGGGGCAACGGCAAGAACCAGGTGGAACAGAGCCCCCAGAGCCTGATCATCCTGGAAGGCAAGAACTGCACTCTGCAGTGCAACTACACCGTGTCCCCCTTCAGCAACCTGCGCTGGTACAAGCAGGATACCGGCAGAGGCCCTGTGTCCCTGACCATCCTGACCTTCAGCGAGAACACCAAGAGCAACGGCCGGTACACCGCCACCCTGGACGCCGATACAAAGCAGAGCAGCCTGCACATCACCGCCTCCCAGCTGAGCGATAGCGCCAGCTACATCTGCGTGGTGTCCGGCGGCACAGACAGCTGGGGCAAGCTGCAGTTTGGCGCCGGAACACAGGTGGTCGTGACCCCCGACATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGCGGGACAGCAAGAGCAGCGACAAGAGCGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACTCCCAGACCAACGTGTCCCAGAGCAAGGACAGCGACGTGTACATCACCGACAAGACCGTGCTGGATATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAATAGCGCCGTGGCCTGGTCTAACAAGAGCGACTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATTATCCCCGAGGACACATTCTTCCCAAGCCCCGAGAGCAGCTGCGACGTGAAACTGGTGGAAAAGAGCTTCGAGACAGACACCAACCTGAATTTCCAGAACCTGAGCGTGATCGGCTTCCGGATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGATTCAACCTGCTGATGACCCTGCGGCTGTGGTCCTCTGGCTCTCGGGCCAAGAGAAGCGGCAGCGGCGCCACCAATTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCAGGGGATGTGGAAGAGAATCCCGGCCCTAGAATGGCCTCCCTGCTGTTTTTCTGCGGCGCCTTCTACCTGCTGGGGACCGGCAGCATGGACGCTGACGTGACCCAGACCCCCCGGAACAGAATCACCAAGACCGGCAAGCGGATCATGCTGGAATGCAGCCAGACAAAGGGCCACGACCGGATGTACTGGTACAGACAGGATCCAGGACTGGGCCTGAGGCTGATCTACTACAGCTTCGATGTGAAGGACATCAACAAGGGCGAGATCAGCGACGGCTACAGCGTGTCCAGACAGGCCCAGGCCAAGTTCTCCCTGAGCCTGGAAAGCGCCATCCCCAACCAGACCGCCCTGTACTTTTGTGCCACAAGCGGCCAGGGCGCCTACGAGGAACAGTTCTTTGGCCCTGGCACCCGGCTGACAGTGCTGGAAGATCTGAAGAACGTGTTCCCCCCAGAGGTGGCAGTGTTCGAGCCTAGCGAGGCCGAGATCTCCCACACCCAGAAAGCCACACTCGTGTGTCTGGCCACCGGATTCTACCCCGACCATGTGGAACTGTCTTGGTGGGTCAACGGCAAAGAGGTGCACAGCGGCGTGTCCACCGATCCCCAGCCTCTGAAAGAACAGCCCGCCCTGAACGACAGCCGGTACTGCCTGAGCAGCAGACTGAGAGTGTCCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCAGAAATCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTTTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAGCCCGTGACTCAGATCGTGTCTGCCGAAGCCTGGGGCAGAGCCGATTGCGGCTTTACCAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACACTGTACGCCGTGCTGGTGTCTGCCCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGCGGAAGGACAGCCGGGGCTGATGAGGTCGAC
SEQ ID NO:12覆盖NheI和SalI限制位点之间的区域的核苷酸序列。
MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEHGSRAKRSGSGAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPMKKHLTTFLVILWLYFYRGNGKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLTILTFSENTKSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVSGGTDSWGKLQFGAGTQVVVTPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSGSRAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRMASLLFFCGAFYLLGTGSMDADVTQTPRNRITKTGKRIMLECSQTKGHDRMYWYRQDPGLGLRLIYYSFDVKDINKGEISDGYSVSRQAQAKFSLSLESAIPNQTALYFCATSGQGAYEEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG**
SEQ ID NO:13组成型IL-7_TCR2的翻译的蛋白质序列
GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT
SEQ ID NO:14人IL2启动子NFAT TRE
TAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCTCGACATTCGTTGGATC
SEQ ID NO:15最小CMV启动子
Claims (27)
1.一种核酸构建体，其包含；
(i)编码白介素7(IL-7)的第一核苷酸序列，
(ii)编码抗原受体的第二核苷酸序列；其中所述抗原受体是T细胞受体(TCR)，所述TCR特异性结合癌细胞表面上的主要组织相容性复合物(MHC)，所述MHC展示肿瘤抗原的肽片段，
(iii)与所述第一核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子，其中所述诱导型启动子包含活化T细胞核因子(NFAT)转录应答元件(TRE)，和
(iv)与所述第二核苷酸可操作地连接的组成型启动子。
2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中来自所述诱导型启动子的表达通过T细胞的活化来诱导。
3.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述NFAT TRE具有SEQ ID NO:14的核酸序列或其变体。
4.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述诱导型启动子包含所述NFAT TRE的三个或更多个拷贝。
5.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含SEQ ID NO:1的序列。
6.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述组成型启动子是人延伸因子-1α启动子。
7.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述IL-7是人IL-7。
8.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述TCR是亲和力增强的TCR。
9.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述TCR包含SEQ ID NO:5、6或11中任何一个的氨基酸序列。
10.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述肿瘤抗原是NY-ESO-1或MAGE-A10。
11.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中(i)所述第一核苷酸序列处于核酸构建体中的正向方向，并且所述第二核苷酸序列处于反向方向，或者(ii)所述第一核苷酸序列处于核酸构建体中的反向方向，并且所述第二核苷酸序列处于正向方向。
12.一种载体，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的核酸构建体。
13.根据权利要求12所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。
14.一种病毒颗粒，其包含根据权利要求12所述的载体。
15.一种T细胞群体，其包含根据权利要求1-11中任一项所述的核酸构建体、如权利要求12或13所述的载体或权利要求14所述的病毒颗粒。
16.一种T细胞群体，其在T细胞活化后组成性表达异源抗原受体，并且诱导性表达白介素7(IL-7)，其中所述抗原受体是T细胞受体(TCR)，所述TCR特异性结合癌细胞表面上的主要组织相容性复合物(MHC)，所述MHC展示肿瘤抗原的肽片段，其中编码IL-7的核苷酸序列与诱导型启动子可操作地连接，并且编码异源抗原受体的核苷酸序列与组成型启动子可操作地连接，其中所述诱导型启动子包含活化T细胞核因子(NFAT)转录应答元件(TRE)。
17.根据权利要求16所述的群体，其中所述NFAT TRE具有SEQ ID NO:14的核酸序列或其变体。
18.根据权利要求16所述的群体，其中所述诱导型启动子包含所述NFAT TRE的三个或更多个拷贝。
19.根据权利要求16所述的群体，其中所述组成型启动子是人延伸因子-1α启动子。
20.根据权利要求16所述的群体，其中所述抗原受体如权利要求8至9中任一项所定义。
21.一种药物组合物，其包含根据权利要求16至20中任一项所述的T细胞群体和药学可接受的赋形剂。
22.根据权利要求16至20中任一项所述的T细胞群体在制造用于治疗个体中的癌症的药物中的用途。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述T细胞是自体的。
24.根据权利要求22所述的用途，其中所述T细胞是同种异体的。
25.一种产生修饰的T细胞群体的方法，其包括；
将根据权利要求1至13中任一项所述的核酸构建体或载体引入从供体个体获得的T细胞群体内，以产生修饰的T细胞群体。
26.根据权利要求25所述的方法，其包括扩增和/或贮存修饰的T细胞。
27.根据权利要求25所述的方法，其包括用药学可接受的赋形剂配制修饰的T细胞群体。
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