CN111315357B - 含有源自绿茶的乳酸菌的用于护理由微尘引起的皮肤细胞损伤的组合物 - Google Patents
含有源自绿茶的乳酸菌的用于护理由微尘引起的皮肤细胞损伤的组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于护理由微尘引起的皮肤损伤的组合物，所述组合物含有作为有效成分的源自绿茶的乳酸菌、其裂解物、其培养物或其提取物，并且其能够将表达量受到微尘影响的皮肤细胞内的基因的表达量调节至正常水平，所述表达量受到微尘影响的皮肤细胞内的基因选自角蛋白1(KRT 1)、claudin 1(CLDN1)、claudin 4(CLDN4)和Occludin(OCL N)中的一种或多种基因。通过使用根据本发明的用于护理由微尘引起的皮肤损伤的组合物，可将因微尘而改变的基因表达量调节至正常水平，从而对受损的皮肤细胞进行护理。
Description
技术领域
本发明公开了一种用于治疗由微尘引起的皮肤细胞损伤的组合物。尤其，本发明公开了一种含有源自绿茶的乳酸菌的组合物，所述组合物可通过显著地改变相比于正常皮肤细胞、因微尘使得表达水平被改变的作为皮肤细胞基因的生物标志物等，来对皮肤细胞损伤进行护理。
背景技术
近来，由于环境因素，对微尘的关注也越来越高，且污染区域也在扩大。与普通的黄沙等相比，微尘具有尺寸更小的颗粒，因此能够更容易地渗入到人体中，并且，由于含有更多的如重金属、硝酸盐、铵、硫酸盐等的有害物质，因而对人体更具危害。当微尘进入我们的体内时，负责人体免疫的细胞就会起到去除微尘的作用。此时，会伴随炎症副作用，另外，世界卫生组织将微尘归类为与癌症直接相关的一组致癌物。
虽然，已预料到微尘不仅会渗入到呼吸道，还会渗入到皮肤或毛囊中，从而引起皮肤问题或脱发，但关于其对皮肤和头发造成负面影响的机理及目标的研究还不够完善，因此，也尚未进行有关用于解决该问题的抗污染材料的研究。
非专利文献1公开了PM2.5的微尘刺激能够使作为颗粒层屏障的紧密连接(tightjunction)的主要成分的claudin 1(CLDN 1)的表达量降低。
乳酸菌是指通过分解葡萄糖等的糖类来产生乳酸(lactic acid)的细菌，又称为乳酸细菌。通过乳酸菌的乳酸发酵产生的乳酸可以抑制病原菌和有害细菌的生长，并且，这些特性被应用在如乳制品，泡菜和酿造食品等的食品生产中。此外，由于乳酸菌通过栖息在哺乳动物的肠道内阿里防止细菌的异常发酵，因此，其也是整肠剂中所使用的重要的细菌。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是乳酸菌属中的一种菌株，已知其主要在泡菜的发酵进行到较大程度且出现酸味的时候生长。产生的乳酸的旋光异构体为D型和L型。由于植物乳杆菌被广泛地用于各种需要发酵的食品中，因此植物乳杆菌以具有优异的耐酸性，耐胆汁酸性和抗菌性而闻名，然而，还并不为人所知的是，其能够作为具有皮肤屏障增强功效和皮肤细胞损伤恢复功效等的抗污染原料。
【现有技术文献】
【非专利文献】
(非专利文献1)Kim，H.J.等人，“大气PM2.5对人角质形成细胞有害影响的转录组分析，”毒理学快报273，26-35，2017年(Kim,H.J.,et al,“Transcriptome analysis ofairborne PM2.5-induced detrimental effects on human keratinocytes”,ToxicologyLetters 273,26-35,2017.)
发明内容
技术问题
基于此，本发明人已确认，微尘会对皮肤产生有害的影响，并且皮肤细胞基因的表达也会因这些影响而受到影响，从而出现皮肤细胞损伤等的症状，而源自绿茶的乳酸菌具有恢复基因表达的作用。
因此，在一方面，本发明旨在提供一种用于护理由微尘引起的皮肤细胞损伤的组合物，所述组合物含有源自绿茶的乳酸菌、其裂解物、其培养物或其提取物。
技术方案
为实现上述目的，一方面，本发明提供一种用于护理由微尘引起的皮肤损伤的组合物，所述组合物含有作为有效成分的源自绿茶的乳酸菌、其裂解物、其培养物或其提取物，该组合物能够将表达量受微尘影响的皮肤细胞内的基因的表达量调节至正常水平，所述表达量受微尘影响的皮肤细胞内的基因为选自角蛋白1(KRT 1)、claudin 1(CLDN1)、claudin 4(C LDN4)和Occludin(OCLN)中的一种或多种基因。
有益效果
在一方面，通过使用本发明提供的用于护理由微尘引起的皮肤损伤的组合物，可将因微尘而改变的基因表达量调节至正常水平，从而对受损的皮肤细胞进行护理。
附图说明
图1a示出了，通过标准菌株(type strain)或源自绿茶的乳酸菌的处理，皮肤细胞中的cl audin 1(CLDN 1)基因的mRNA表达量增加。
图1b示出了，通过标准菌株(类型菌株)或源自绿茶的乳酸菌的处理，皮肤细胞中的cla udin 4(CLDN 4)基因的mRNA表达量增加。
图1c示出了，通过标准菌株(类型菌株)或源自绿茶的乳酸菌的处理，皮肤细胞中的Oc cludin(OCLN)基因的mRNA表达量增加。
图1d示出了，通过标准菌株(类型菌株)或源自绿茶的乳酸菌的处理，皮肤细胞中的角蛋白1(KRT 1)基因的mRNA表达量增加。
图2a示出了，在由ERM-CZ120微尘引起刺激皮肤细胞中，claudin 1(CLDN 1)基因的mR NA表达量降低，之后通过源自绿茶的乳酸菌处理恢复到正常水平。
图2b示出了，在由ERM-CZ120微尘引起刺激皮肤细胞中，claudin 4(CLDN 4)基因的mR NA表达量降低，之后通过源自绿茶的乳酸菌处理恢复到正常水平。
图2c示出了，在由ERM-CZ120微尘引起刺激皮肤细胞中，Occludin(OCLN)基因的mRNA表达量降低，之后通过源自绿茶的乳酸菌处理恢复到正常水平。
图2d的示出了，在由ERM-CZ120微尘引起刺激皮肤细胞中，角蛋白(KRT 1)基因的mRNA表达量降低，之后通过源自绿茶的乳酸菌处理恢复到正常水平。
具体实施方式
以下，将详述本发明。
在本发明的一方面，用于护理由所述微尘引起的皮肤损伤的组合物可以包含作为有效成分的源自绿茶的乳酸菌，其裂解物，其培养物或其提取物。
在本说明书中，“源自绿茶的乳酸菌”可以指从茶树叶、茶树花、茶树树干、茶树根或附近的土壤等中分离的乳酸菌。例如，它可以指从作为茶树叶的绿茶中培养并分离出的乳酸菌。
在本说明书中，“菌株裂解物”可以指通过利用化学或物理力使菌株本身裂解而获得的产物。
在本说明书中，“培养物”可以指包含培养菌株的培养基中所含有的所有物质的物质，例如，可以指包含作为菌株培养产物的代谢物或分泌物的物质，或其裂解物，菌株本身也可以被包括在培养物中。
在本说明书中，术语“提取物”可以指通过使用提取溶剂对菌株本身、菌株的裂解物，其培养物或它们的混合物进行提取而获得的产物。
根据本发明的一个实施例的绿茶乳酸菌是从上述茶树叶所含有的各种成分中分离出的乳酸菌，当将其应用于因微尘而受损的皮肤，特别是应用于皮肤屏障的紧密连接(tight junctio n)中时，其对受损皮肤的恢复功效极为优异。
在一方面，所述源自绿茶的乳酸菌可以是乳杆菌属(Lactobacillus sp.)乳酸菌。具体地，所述源自绿茶的乳酸菌可以是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。更具体地，所述源自绿茶的乳酸菌可以是植物乳杆菌APsulloc 331266(Lactobacillusplantarum APsulloc 331266)KCC M11181P。所述源自绿茶的乳酸菌可以增强皮肤屏障的紧密连接(tight junction)，尤其植物乳杆菌APsulloc 3312666(Lactobacillusplantarum APsulloc 331266)KCCM11181P可以具有恢复被微尘破坏的皮肤屏障的效果。
在一方面，所述组合物的有效成分可以是源自绿茶的乳酸菌凋亡小体。
在本发明的一方面，在组合物中，所述组合物可以包含占组合物总重量的0.000001重量％至30重量％的源自绿茶的乳酸菌、其裂解物、其培养物或其提取物。当该含量为0.000001重量％至30重量％时，源自绿茶的乳酸菌对由微尘引起的皮肤损伤的护理效果优异。
具体地，可为0.0000001重量％或以上、0.0000005重量％或以上、0.0000007重量％或以上、0.0000009重量％或以上、0.000001重量％或以上、0.000002重量％或以上、0.000004重量％或以上、0.000006重量％或以上、0.000008重量％或以上、0.00001重量％或以上、0.00003重量％或以上、0.00005重量％或以上、0.00007重量％或以上、0.00009重量％或以上、0.0001重量％或以上、0.0003重量％或以上、0.0005重量％或以上、0.0007重量％或以上、0.0009重量％或以上、0.001重量％或以上、0.01重量％或以上、0.1重量％或以上、1重量％或以上、3重量％或以上、5重量％或以上、7重量％或以上、9重量％或以上、10重量％或以上、13重量％或以上、15重量％或以上、17重量％或以上、19重量％或以上、21重量％或以上、23重量％或以上、25重量％或以上、27重量％或以上、29重量％或以上、30重量％或以上、31重量％或以上，且2重量％或以下、31重量％或以下、30重量％或以下、29重量％或以下、28重量％或以下、26重量％或以下、24重量％或以下、22重量％或以下、20重量％或以下、18重量％或以下、16重量％或以下、14重量％或以下、12重量％或以下、10重量％或以下、9重量％或以下、8重量％或以下、6重量％或以下、4重量％或以下、2重量％或以下、1重量％或以下、0.1重量％或以下、0.09重量％或以下、0.04重量％或以下、0.01重量％或以下、0.006重量％或以下、0.001重量％或以下、0.0009重量％或以下、0.0007重量％或以下、0.00005重量％或以下、0.00003重量％或以下、0.00001重量％或以下、0.000009重量％或以下、0.000007重量％或以下、0.000005重量％或以下、0.000003重量％或以下、0.000001重量％或以下、0.0000009重量％或以下、0.0000007重量％或以下、0.0000005重量％或以下、0.0000003重量％或以下、0.0000002重量％或以下、0.0000001重量％或以下、0.00000009重量％或以下，但不限于此。
在一方面，根据本发明的组合物的有效成分可作用于皮肤屏障的紧密连接。
紧密连接是细胞连接中的一种，由occluding、claudin、tricellulin、连接黏附分子(juncti onal adhesion molecule，JAM)和带状闭合蛋白(zona occludens，ZO)组成。紧密连接可分为细胞膜中含有的部分和细胞内的部分。occludin和claudin是细胞膜中含有的紧密连接组成蛋白。occludin是在紧密连接中发现的第一个跨膜蛋白，具有四个跨膜结构域。occludin不仅是紧密连接的组成成分，还具有调节紧密连接的功能。与occludin同为紧密连接组成蛋白的cl audin也具有四个跨膜结构域。紧密连接作为细胞之间的连接纽带，具有填补相邻细胞间的间隙，调节小物质的运动的功能，并且还起到调节细胞间的物质渗透和维持细胞的极性的作用。近来，根据研究结果的报道，紧密连接在皮肤屏障功能中起着重要的作用。紧密连接是细胞间结合方式中的一种。是一种主要出现在上皮细胞和内皮细胞中的细胞连接，形成具有线状结构的复杂网络。由于这种结构，紧密连接主要具有两个功能。第一个是屏障功能，其防止构成上皮细胞或内皮细胞的细胞之间的物质泄漏。它主要在血管和消化器官中治疗。第二种是封闭功能(enclosure function)，其为通过在细胞膜脂质中包裹一条线状围栏来分隔细胞膜的功能。因此，根据本发明的组合物的有效成分通过作用于皮肤屏障的紧密连接，来增强皮肤细胞的屏障功能和封闭功能，从而可以护理由微尘刺激而受损的皮肤。
在本发明的另一方面，本发明包括所述组合物对由微尘引起的皮肤损伤的护理用途。
在本发明的另一方面，本发明提供一种用于护理受试者的由微尘引起的皮肤损伤的方法，所述方法包括对有需要的受试者施用有效量的源自绿茶的乳酸菌、其裂解物、其培养物或其提取物的步骤。
在本发明的另一方面，提供一种源自绿茶的乳酸菌、其裂解物、其培养物或其提取物在制备用于护理由细微尘引起的皮肤损伤的组合物中的用途。
在本发明的另一方面，提供一种用于护理由微尘引起的皮肤损伤的源自绿茶的乳酸菌、其裂解物、其培养物或其提取物。
本说明书中所使用的“微尘”是指我们眼睛不可见的极其微小的物质，是一种长时间漂浮或飞散在大气中的颗粒状物质。具体而言，在本发明中，微尘的粒径可以为10μm或以下(PM10)，更具体地，可为2.5μm或以下(PM2.5)。尤其，将粒径为2.5μm(PM2.5)或以下的颗粒物称为“超细微尘，”在本说明书中，“微尘”也包括“超细微尘”。
在本发明的一个方面，微尘可包含砷(arsenic)、镉(cardmium)、铅(lead)和镍(nikel)中的一种或多种物质。由于微尘中包含所述砷、镉、铅和镍等的重金属成分，因此会攻击皮肤细胞来引起皮肤过敏、色素沉着、炎症等，从而导致皮肤老化。在一个实施例中，所述微尘包含砷、镉、铅和镍。
在本说明书中所使用的术语“护理”是指有效地保护皮肤细胞免受刺激，并抑制、防止和恢复(复原)由上述刺激所引起的特定基因的表达量的变化。其中，以无刺激时的基因表达量为标准，“恢复”除了包括改变表达量使其更接近上述标准之外，还包括使表达量增加至上述标准或以上的程度。
在一方面，本发明提供一种组合物，所述组合物通过将因微尘而受损的皮肤细胞中的特定基因的表达量调节至正常水平来抑制由微尘引起的皮肤细胞损伤。
具体地，在本发明中，在皮肤细胞中，表达量受微尘影响的基因选自角蛋白1(KRT1)、claudin 1(CLDN 1)、claudin 4(CLDN 4)和Occludin(OCLN中的一种或多种基因。因为角蛋白1(KRT 1)、claudin 1(CLDN 1)、claudin 4(CLDN 4)和Occludin(OCLN)是表达量会因微尘而降低的基因，因此，可以通过增加这些基因的表达量来将表达量调节至正常水平，从而抑制皮肤细胞的损伤。
在一方面，根据本发明的组合物可以具有增强皮肤屏障的功效或恢复皮肤屏障的功效。
下表[表1]中示出了本发明中使用的表达量被微尘改变的基因。[表1]示出了表达量因微尘而降低的基因，在这些表中，“基因符号(Gene Symbol)”表示官方基因符号，“基因名称(Gene title)”表示各基因的名称。这些内容可以通过非专利文献1中记载来确认。
【表1】
所述基因或蛋白质的表达量分析可使用微阵列、PCR、NGS(Nest GenerationSequencing，二代测序)、蛋白质印迹、Northern印迹杂交、ELISA、放射免疫分析、放射免疫扩散法、免疫组织化学染色法(immunohistochemistry，IHC)、免疫沉淀分析法等本领域已知的各种分析方法来进行。
微尘会对皮肤细胞造成损伤，并且会在此时引起炎症，从而进一步对皮肤细胞造成损伤。可通过使用源自绿茶的乳酸菌来护理这皮肤细胞损伤的恶性循环，从而改善皮肤状态。
在本发明的一方面，所述组合物可以是化妆品组合物、药物组合物或功能性保健食品组合物。
所述化妆品组合物包括例如各种霜、乳液(lotion)、爽肤水等的化妆品、以及清洁剂、洗面奶、肥皂和美容液等。
在一方面，添加有含有根据本发明的源自绿茶的乳酸菌的组合物的化妆品组合物可用作溶液、乳化物、粘性混合物等的形式。
即，在一方面，本发明的化妆品在其的剂型上不受特别限制，例如可为乳液、霜、化妆水、精华、面膜、凝胶、粉末、妆前乳、粉底、润肤乳、软膏、贴剂、美容液、清洁泡沫、卸妆霜、卸妆水、身体乳、身体霜、身体油、身体精华、洗发水、护发素、沐浴露、肥皂、染发剂和喷雾剂等剂型。
在各种剂型的化妆品组合物中，除了所述源自绿茶的乳酸菌之外，本领域技术人员可以毫无困难地根据其他的化妆品剂型或使用目的适当地选择其他成分来进行配制。
此外，在一方面，本发明的化妆品可以包含选自水溶性维生素、油溶性维生素、高分子肽，高分子多糖、鞘脂脂质和海藻提取物的组合物。
在一方面，在根据本发明的化妆品中，可根据需要将通常化妆品中使用的其他成分与上述必需成分一起配制。
除此之外，还可以添加的配合成分例如有有机成分、保湿剂、润肤剂、界面活性剂、有机和无机颜料、有机粉末、紫外线吸收剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、植物提取物、pH调节剂、乙醇、色素、香料、血液循环促进剂、冷却剂、止汗剂、纯净水等。
此外，可另外添加的配合成分不限于此，在不损害本发明的目的和效果的范围内可以配合上述成分中的任何成分。
在一方面，含有根据本发明的源自绿茶的乳酸菌的药物组合物可进一步包含通常用于制备药物组合物的合适的载体、赋形剂和稀释剂。
作为其的剂型，可以按照常规方法将所述含有源自绿茶的乳酸菌的药物组合物分别配制为如片剂、胶囊、散剂或糖浆等的口服剂，或如药膏，凝胶，霜剂、贴剂或喷雾剂等的外用制剂等的适用于药物制剂的任何形式来使用。
应当理解的是，当以所述药物组合物的形式进行施用时，通常应根据如症状的严重程度、选择的给药途径、受试者的年龄、性别、体重和健康状况等的多种相关因素来确定有效成分的实际剂量。通常，有效成分的剂量可为0.0001mg/kg/日至3000mg/kg/日，例如10mg/kg/日至500mg/kg/日。
在根据本发明的一方面的功能性保健食品组合物中，保健食品是使用在日常膳食中容易缺乏的营养素，或具有对人体有用的功能的原料或成分(功能性原料)所制备的保健食品，是能够通过维持人体的正常机能或激活生理机能来维持和改善健康的食物，但不限于此。所述保健食品可以被制备加工成片剂、胶囊、粉末、颗粒、液体、丸剂等的剂型，并且不限于此，可以根据法律制备、加工成任何剂型。
具体地，保健饮料组合物除了以指定比例含有作为必需成分的所述化合物外，对其他成分没有特别限制，并且如通常的饮料一样，可以包含各种调味剂或天然碳水化合物等附加成分。天然碳水化合物例如有单糖、二糖(例如葡萄糖、果糖等)、多糖(例如麦芽糖、蔗糖等)、常见的糖类(例如糊精、环糊精等)以及糖醇(例如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇等)等。除上述之外，所述调味剂可使用天然调味剂(索马甜、甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙A、甘草甜素等))和合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等)。
应该理解的是，当以所述功能性保健食品组合物的形式施用时，通常应根据例如症状的严重程度、选择的给药途径、受试者的年龄、性别、体重和健康状况等的各种相关因素来确定有效成分的实际剂量。通常，有效成分的剂量可以是0.0001mg/kg/日至1000mg/kg/日，例如，0.02mg/kg/日至6mg/kg/日。
实施例
以下，将通过具体实施例对本发明的构成和效果进行更详细地描述。但是，这些实施例仅用于举例说明本发明，本发明的范围和范畴不受这些实施例的限制。
【制备实施例1】植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)APsulloc 331266
1.植物乳杆菌APsulloc 331266的培养和分离
用一级蒸馏水清洗200克茶树叶两次，以去除杂质。将清洗后的茶树叶上水分去除，并将茶树叶与相当于茶树叶的重量的8％的食盐进行混合，然后在室温下放置3小时。将被食盐浸渍茶树叶与1％的1000mL低聚果糖溶液混合后，在32℃下，培养箱中培养3天。3天后，确认培养液的pH值是否小于5，当pH小于5时，将其取出，加入到Difco公司的乳杆菌MRS琼脂
(Difco Lactobacilli MRS
)培养基中进行培养。此时，在32℃，厌氧的条件下，在室中培养2天，然后取出呈白色菌落。
按与上述相同的方式从茶树叶中分离出植物乳杆菌APsulloc 331266。所述植物乳杆菌AP sulloc 331266于2011年3月28日保藏在韩国微生物保藏中心，保藏编号为KCCM11181P。
2.植物乳杆菌APsulloc 331266的鉴定
(1)菌株的培养
用在实施例1中分离出的APsulloc 331266在MRS琼脂平板上划线(streaking)，并在37℃下培养2天。将获得的单一菌落(single colony)接种到10mL的MRS肉汤(broth)中，并再次在37°C下培养过夜，以制备APsulloc 331266培养液。
(2)APsulloc 331266的糖发酵模式分析
将按上述(1)制备的APsulloc 331266菌株培养液在10mL MRS肉汤中接种至0.5％，并在37℃下培养过夜。将培养液以8,000rpm离心分离5分钟后，除去上清液以仅收集细胞，然后加入2mL的0.85％盐水缓冲液(saline buffer)使上述细胞悬浮。之后，使用API50CHL试剂盒(Biomerieux公司)，并根据制造商指引进行实验。其具体内容如下。
首先，在将菌株的悬浮液缓慢添加到5mL的API悬浮培养基(medium)中，同时测量达到McFarland Standard 2(Biomerieux公司)浊度所需的悬浮液量。将悬浮液以所测量的两倍添加到10mL的API 50CHL培养基中，然后振摇使其混合。将上述混合物分别加入含有不同底物的杯形器(cupule)中后，逐滴加入矿物油，并在37℃下培养2天，之后分析糖发酵模式。
下表示出了以植物乳杆菌菌株(KCTC3108)作为标准菌株，与APsulloc 331266的糖发酵模式的比较结果，及利用该结果鉴定的APsulloc 331266的结果。
【表2】
+：底物分解；-：相应的底物未分解；？：无法判定
【表3】
从以上可看出，APsulloc 331266相对于植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)显示出99％或以上的一致性(％指数)，可知属于植物乳杆菌。此外，APsulloc 331266与标准菌株(KCTC3108)对于α-甲基-甘露糖苷(mannoside)和棉子糖(raffinose)的使用特性互不相同，由此可确认两者是不同的菌株。
3.植物乳杆菌APsulloc 331266凋亡小体的制备
在37℃的环境下，将分离和鉴定后的植物乳杆菌APsulloc 33126在培养基(MRS肉汤)中培养24小时。其中，所接种的乳酸菌为以10重量％被保管在含有脱脂乳的冻存管(Cryotube)中的菌。当液体培养基中的细菌浓度达到5X108至1X109CFU/mL时，在4℃下，通过4000rpm的离心分离来收集营养细胞，并用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤菌体。然后，将洗涤后的菌体以5×108至1×109CFU/mL的浓度再分散(再悬浮)于PBS中，并在100℃下，加热10分钟以制备成植物乳杆菌凋亡小体。
【实验实施例1】通过实时qPCR定量测定基因表达量的实验
1.角质形成细胞株的培养
将购自龙沙公司(Lonza，Inc.，美国马里兰州沃克斯维尔)的角质形成细胞(人正常表皮角质形成细胞)继代培养后，在37℃，5％CO2的条件下，在CO2培养基中进行培养。在500ml的KBM-2(KBMTM-2,CC-3103)培养基中使用含有BPE(牛垂体提取物)、人表皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)、胰岛素(Insulin)、氢化可的松(Hydrocortisone)、硫酸庆大霉素(Gentamycin Suflate)、肾上腺素(Epinephrine))、转铁蛋白(Transferrin)的培养液。
培养时，将融合度(confluency)保持在最高至90％左右，然后进行继代培养(subcultivation)。
2.在角质形成细胞中处理细微尘和植物乳杆菌
微尘则使用西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)贩售的ERM-CZ120细微尘，其包含P M10标准的微尘、砷、镉、铅和镍。
使用6孔板，在“1.角质形成细胞株的培养”的细胞培养条件下，将以3×105个细胞/孔(cell s/well)的条件培养的细胞株分为六组分别进行物质处理，分别为作为对照组的未处理组(对照组1)、用50ppm微尘处理的组(对照组2)、用1μg/ml的制备实施例1的植物乳杆菌处理的组(实施例1)、用50ppm微尘和1μg/ml的制备实施例1的植物乳杆菌处理的组(实施例2)、用1μg/ml的植物乳杆菌标准菌株(type strain)处理的组(比较例1)、及用50ppm微尘和1μg/ml的植物乳杆菌标准菌株处理的组(比较例2)。
其中，植物乳杆菌标准菌株使用的是从生物资源中心获得的，保藏编号为KCTC3108的保藏菌株。
【表4】
3.实时qPCR定量
3-1.RNA提取过程
将在“2.在角质形成细胞中处理细微尘和植物乳杆菌”获得的对照组1、对照组2、实施例1和对比例1中的培养液去除，并用2ml磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，然后使用Trizol试剂(赛默飞(Invitrogen)公司，卡尔斯巴德，加利福利亚，美国)从细胞中分离RNA。
3-2.cDNA合成过程
使用QIAGEN公司的RNA试剂盒(QIAGEN RNeasy kt，QIAGEN公司，Valencia，加利福利亚)再次纯化所分离的RNA，然后再使用2100型号生物分析仪(Agilent2100BioAnalyzer，安捷伦科技有限公司(Agilent Technologies)，圣塔克拉拉，加利福尼亚州，美国)来确认RNA的质量。之后，使用逆转录试剂盒(Superscript逆转录酶(RT)试剂盒，赛默飞(Invitro gen)公司，卡尔斯巴德，加利福利亚，美国)从RNA合成cDNA。
3-3.执行qPCR
使用引物通过实时逆转录聚合酶链反应(Q-RT-PCR)进行定量分析。使用AppliedBios ystems公司的TaqMan基因表达***(TaqMan基因表达检测试剂盒(TaqMan geneexpression assay kit)，Applied Biosystems公司，福斯特城，加利福尼亚)，通过实时PCR来评估细胞的基因表达模式的变化，结果如图1a至2c所示。所用的Q-RT-PCR和实时PCR均按照Life Techno logies发布的标准协议进行，具体地，将以下过程进行40次循环，即将在95℃下处理20秒后，在95℃下处理3秒及在60℃下处理30秒。
4-1.植物乳杆菌的皮肤细胞屏障增强功效的评估
如图1a至1d所示，确认了当单独处理标准菌株和根据本发明的源自绿茶的乳酸菌时，均具有增强皮肤屏障的作用。
具体地，与对照组1相比，确认了实施例1和比较例1的claudin 1、claudin 4、ocludin和角蛋白1(Keratin 1)的mRNA表达水平均有增加。
4-2.植物乳杆菌的皮肤细胞损伤修复功效的评估
如图2a至2d所示，确认了当单独处理根据本发明的源自绿茶的乳酸菌时，具有修复被微尘损伤的皮肤屏障的作用。
具体地，与对照组2相比，确认了实施例2和比较例2的角蛋白1(Keratin 1)、claudin 1、claudin 4和ocludin的mRNA表达水平均有提高。在实验中，可确认，用微尘处理后，角蛋白1的mRNA表达量降至0.41，claudin 1的mRNA表达量降至0.57，claudin 4的mRNA表达量降至0.50，Occludin的mRNA表达量降至0.42，而在用制备实施例1中的植物乳杆菌处理后，降低的角蛋白1的mRNA表达量被恢复至1.01，降低的claudin 1的mRNA表达量被恢复至0.73，降低的claudin 4的mRNA表达量被恢复至1.18，降低Occludin的mRNA表达量被恢复至0.79。
反之，当用标准菌株处理时，角蛋白1的mRNA表达量为0.51，claudin 1的mRNA表达量为0.53，claudin 4的mRNA表达量为0.60，ocludin的mRNA表达量为0.51，RNA表达量的变化不明显。由此，证实了标准菌株不具有恢复所述标志物的被降低的mRNA表达量的作用。
剂型实施例
下面描述了根据本发明的组合物的剂型实施例，也可以应用各种于化妆品组合物、药物组合物和保健食品组合物的各种剂型，其目的在于详细描述本发明，但并不限制本发明。
【剂型实施例1】片剂
将100mg根据本发明的实施例的植物乳杆菌乳酸菌、400mg乳糖、400mg玉米淀粉和2mg硬脂酸镁进行混合后，再按照常规的片剂制备方法压片成片剂。
【表5】
| 配合成分 | 含量(mg) |
| 植物乳杆菌乳酸菌 | 100 |
| 乳糖 | 400 |
| 玉米淀粉 | 400 |
| 硬脂酸镁 | 2 |
【剂型实施例2】胶囊剂
将100mg根据本发明的实施例的植物乳杆菌乳酸菌、400mg乳糖、400mg玉米淀粉和2mg硬脂酸镁进行混合后，按照常规的胶囊剂的制备方法，将混合物填充于胶囊中，制备成胶囊。
【表6】
| 配合成分 | 含量(mg) |
| 植物乳杆菌乳酸菌 | 100 |
| 乳糖 | 400 |
| 玉米淀粉 | 400 |
| 硬脂酸镁 | 2 |
【剂型实施例3】颗粒剂
将50mg根据本发明的实施例的植物乳杆菌乳酸菌、250mg无水结晶葡萄糖和550mg淀粉进行混合，并使用流化床造粒机制备成颗粒后，填充到包衣中制备成颗粒剂。
【表7】
| 配合成分 | 含量(mg) |
| 植物乳杆菌乳酸菌 | 50 |
| 无水结晶葡萄糖 | 250 |
| 淀粉 | 550 |
【剂型实施例4】肥皂
【表8】
| 配合成分 | 含量(％) |
| 植物乳杆菌乳酸菌 | 5.00 |
| 油脂 | 适量 |
| 氢氧化钠 | 适量 |
| 氯化钠 | 适量 |
| 香料 | 适量 |
| 纯净水 | 余量 |
【剂型实施例5】乳液(lotion)
【表9】
【剂型实施例6】霜
【表10】
| 配合成分 | 含量(％) |
| 植物乳杆菌乳酸菌 | 3.00 |
| 聚乙二醇单硬脂酸酯 | 2.00 |
| 自乳化型单硬脂酸甘油酯 | 5.00 |
| 鲸蜡醇 | 4.00 |
| 角鲨烯 | 6.00 |
| 三异辛酸甘油酯 | 6.00 |
| 鞘脂糖脂 | 1.00 |
| 1,3-丁二醇 | 7.00 |
| 纯净水 | 余量 |
【剂型实施例7】软膏
【表11】
| 配合成分 | 含量(％) |
| 植物乳杆菌乳酸菌 | 5.00 |
| 聚乙烯醇 | 13.00 |
| L-抗坏血酸-2-磷酸镁 | 1.00 |
| 月桂酰羟脯氨酸 | 1.00 |
| 水溶性胶原蛋白(1％水溶液) | 2.00 |
| 1,3-丁二醇 | 3.00 |
| 乙醇 | 5.00 |
| 纯净水 | 余量 |
【剂型实施例8】美容液的制备
【表12】
| 配合成分 | 含量(％) |
| 植物乳杆菌乳酸菌 | 3.00 |
| 羟乙烯纤维素(2％水溶液) | 12.00 |
| 黄原胶(2％水溶液) | 2.00 |
| 1,3-丁二醇 | 6.00 |
| 浓甘油 | 4.00 |
| 透明质酸钠(1％水溶液) | 2.00 |
| 纯净水 | 余量 |
【剂型实施例9】保健食品
【表13】
| 配合成分 | 含量 |
| 植物乳杆菌乳酸菌 | 2mg |
| 维生素A醋酸酯 | 70μg |
| 维生素E | 1.0mg |
| 维生素B1 | 0.13mg |
| 维生素2 | 0.15mg |
| 维生素B6 | 0.5mg |
| 维生素12 | 0.2μg |
| 维生素C | 10mg |
| 生物素 | 10μg |
| 烟酰胺 | 1.7mg |
| 叶酸 | 50μg |
| 泛酸钙 | 0.5mg |
| 硫酸亚铁 | 1.75mg |
| 氧化锌 | 0.82mg |
| 碳酸镁 | 25.3mg |
| 磷酸二氢钾 | 15mg |
| 磷酸氢钙 | 55mg |
| 柠檬酸钾 | 90mg |
| 碳酸钙 | 100mg |
| 氯化镁 | 24.8mg |
【剂型实施例10】保健饮料
【表14】
| 配合成分 | 含量 |
| 植物乳杆菌乳酸菌 | 50mg |
| 柠檬酸 | 1000mg |
| 低聚果糖 | 100g |
| 牛磺酸 | 1g |
| 纯净水 | 余量 |
【保藏编号】
保藏机构名称：韩国微生物保藏中心(国外)
保藏编号：KCCM11181P
保藏日期:20110328
【微生物保藏证明】
Claims (10)
1.源自绿茶的乳酸菌、其裂解物、其培养物或其提取物在制备用于护理由微尘引起的皮肤损伤的组合物中的用途，其中，所述源自绿茶的乳酸菌为植物乳酸菌APsulloc331266KCCM11181P。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物的有效成分为源自绿茶的乳酸菌凋亡小体。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述源自绿茶的乳酸菌、其裂解物、其培养物或其提取物的含量占组合物总重量的0.000001重量％至30重量％。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物的有效成分作用于皮肤屏障的紧密连接。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物用于恢复角蛋白1、claudin 1、claudin4和Occludin中的一种或多种物质的表达。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述微尘包含砷、镉、铅和镍中的一种或多种物质。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述微尘的颗粒尺寸为PM10或以下。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物的有效成分的施用剂量为10至500mg/kg/日。
9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物为化妆品组合物。
10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物为药物组合物。
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