CN111307694A - 一种活动***dna碎片流式细胞术检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种活动***DNA碎片流式细胞术检测方法，特点是包括以下步骤：(1)将5～10万个***加入500μL含有钼酸铵、曲拉通的盐酸缓冲液，混匀30秒后加入罗丹明6G和吖啶橙染色液；(2)流式细胞仪上机检测，收集绿、黄、红等三色发射荧光信号；(3)结合三种荧光情况分析，即首先在黄色荧光的基础上将活动***与不动***区分出来，再进一步分析活动***中红色荧光***占活动***总数的比例，从而可以判定样本中活动***DNA碎片化情况，优点是实现了一次性流式细胞术检测活动***DNA碎片情况，且简单、高效。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂领域，尤其是涉及一种活动***DNA碎片流式细胞术检测方法。
背景技术
受精过程中，***贡献了一半的遗传物质DNA。***DNA完整性可影响***受精能力、受精后原核的形成、胚胎着床、胚胎发育及子代的健康，***DNA碎片化指数(DNAfragmentation index，DFI)已经成为评估男性生育力的重要指标。传统方法是检测了所有***的DFI，即包括死***、不活动***和活动***的DFI混合情况。无论是自然受孕，还是辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)治疗过程中，只有活动的***才被分选出来和应用于受精，故理论上活动***DFI才是隐藏的、被忽视的重点。
***的活动与***尾部有关，***运动靠着***尾部鞭毛摆动产生动力。目前认为***运动是按照滑动模式进行的。其基本原理是：动力蛋白水解ATP(三磷酸腺苷)驱动临近微管间的相对滑动。***尾部鞭毛中动力蛋白ATPase(三磷酸腺苷酶)以ATP作为底物，通过水解ATP成为ADP(二磷酸腺苷)和pi(磷酸)而获得能量，促使鞭毛轴丝中的双联微管中A微管的两行支臂，不断脱离并重新依附于相邻双微管中B微管上连续结合的位点，从而产生双联微管间的滑动并产生一个纵向力；与双联微管有关的各种附属结构形成的滑动抗力，使由支臂产生的纵向力转化为横向弯曲动力，引起浪状波的形成和传播。换句话说，通过检测***尾部ATP降解成为ADP和pi的情况，可从根源上检测和反应活动***情况。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简便、高效地检测和区分活动***和非活动***的DNA碎片情况的活动***DNA碎片流式细胞术检测方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种活动***DNA碎片流式细胞术检测方法，包括以下步骤：
(1)将***中5～10万个***加入到500μL酸化处理缓冲液中，混匀，置冰上30秒；
(2)在步骤(1)得到的混合液中加入10μL染色液，5-30分钟内上机检测，设定流式细胞仪的参数，包括激发波长和激发波长通道，收集***的绿(530nm)色、黄(556nm)色和红(640nm)色荧光信号，每管样本至少记录样本主群5000个细胞；
(3)流式软件统计分析：结合三种荧光情况，即首先在黄色荧光的基础上将活动***与不动***区分出来，再进一步分析活动***中红色荧光***占活动***总数的比例，从而可以判定样本中活动***DNA碎片化情况。
步骤(1)所述的酸化处理缓冲液的配方为80-800mmol/L盐酸(HCl)、14-28mmol/L钼酸铵、0.15mol/L氯化钠(NaCl)、0.1％Triton-X 100(曲拉通)，溶剂为水。主要成分为曲拉通、盐酸、钼酸铵，目的是：A、促使细胞膜通透性增加，使染料容易进入***细胞；B、提供酸环境便于磷钼杂多酸与罗丹明6G形成缔合物；C、使紧密的DNA变得结构较为松散，以便于吖啶橙染色；D、酸可以固定细胞，阻抑了荧光染料与细胞其他成分如蛋白质、多糖和细胞膜等结合，降低背景信号。
步骤(1)所述的染色液的配方为20-400mmol/L罗丹明6G、1-50μg/mL吖啶橙、0.1mol/L柠檬酸、0.2mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)，1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.15mol/L氯化钠(NaCl)，溶剂为水。
优先的，步骤(1)所述的染色液的配方为60mmol/L罗丹明6G、6μg/mL吖啶橙、0.1mol/L柠檬酸、0.2mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)，1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.15mol/L氯化钠(NaCl)，溶剂为水。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了一种活动***DNA碎片流式细胞术检测方法，通过检测***动力蛋白水解ATP产生的Pi(磷酸)，以及***DNA碎片酸化处理后产生的单链DNA来实现，***中pi情况可采用流式细胞术法来检测：运动的***，其动力蛋白ATP酶水解ATP产生的Pi，Pi与加入的钼酸铵反应产生磷钼杂多酸，与加入的罗丹明6G(R6G)荧光探针结合形成缔合物，该缔合物能被激发出的荧光强度大大下降；而***细胞中未结合的R6G具有非常高的耐光性，高量子产率，低损耗，最大激发波长为530nm，激发波长范围从555nm至585nm，其最大波长为556nm，从而可通过流式细胞仪激发(激发波长Ex＝530nm)和产生荧光(发射波长Em＝556nm)来定量检测，根据荧光情况区分活动***(缔合物多荧光弱)和非活动***(未结合的R6G多荧光强)。***DNA碎片情况可采用吖啶橙染色后流式细胞仪检测：吖啶橙是一种极灵敏的荧光染料，它可以与***细胞中双链DNA和单链DNA同时染色而显示不同颜色(波长)的荧光，其激发波长峰为492nm，发射荧光波长峰为530nm(双链DNA)和640nm(单链DNA)，从而可通过流式细胞仪识别检测荧光颜色和计算DNA碎片情况。
综上所述，本发明一种活动***DNA碎片流式细胞术检测方法，通过对***样本进行处理、染色，荧光标记、流式上机检测活动***中Pi和DNA碎片情况、从而评估活动***的DNA损伤程度，为不育症检查、辅助生殖治疗方案的选择提供帮助。该方法避免了传统方法不能区分活动和非活动***DNA碎片情况，实现了一次性完成活动***DNA碎片检测的简单、高效的目的。
附图说明
图1为***细胞群图形，图中用圈中区域(方框内)即为***细胞主群；
图2为***细胞群黄色荧光表达图，图中分为二群细胞，横轴上左峰(实线杠区间内)即为活动***，横轴上的右峰(虚线杠区间内)为非活动***细胞群。
图3为***细胞群绿色和红色荧光表达图，图中分为二群细胞，靠近纵轴的群(三角框内的为绿色)为DNA完整性好的细胞群，靠近横轴的细胞群(三角框内右侧下方的为红色)为DNA碎片化的细胞群。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例
一种活动***DNA碎片流式细胞术检测方法，包括以下步骤：
(1)将20份***自然液化后，于37℃温度下，采用MAKLER***计数板检测***浓度和活动***比率(结果见下表1)；
(2)采用移液器将5-10万个***加入500μL含有钼酸铵的酸化处理缓冲液，充分混匀；其中酸化处理缓冲液的配方为80-800mmol/L盐酸(HCl)、14-28mmol/L钼酸铵、0.15mol/L氯化钠(NaCl)、0.1％Triton-X 100(曲拉通)，溶剂为水；
(3)混匀，置冰上30秒后加入10μL含有罗丹明6G和吖啶橙的染色液，5-30分钟内上机检测；其中染色液的配方为20-400mmol/L罗丹明6G、1-50μg/mL吖啶橙、0.1mol/L柠檬酸、0.2mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)，1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.15mol/L氯化钠(NaCl)，溶剂为水；
(4)清空Calibur流式细胞仪废液桶，断开废液桶管路连接，再加入漂白液(100-200mL的84消毒液或5wt％次氯酸钠溶液)入废液桶，重新连接好废液桶管路，确保连接紧密；检查鞘液桶的液面水平，如果需要，加入鞘液(0.05％Triton-X 100的ddH2O)至3L(鞘液桶容积4L)，盖紧桶盖；检查鞘液过滤器及鞘液管道，确保过滤器和鞘液管路中没有气泡；
(5)打开电源变压器；打开BD FACSCalibur电源开关，在开始检测样本前，使仪器预热30min。
(6)设定Calibur流式细胞仪的参数，包括开启激发激光，设定激发波长信号通道；上机检测，调节电压和信号放大倍数，绿荧光强度中位数处于收集范围的中部为400～600，红荧光强度中位数为50～100；检测红色、绿色荧光时，显示其为“peak signal”(或“heightsignal”)，而不是“area signal”；显示的结果图包括有：双参数散点图(X轴为FSC，Y轴为SSC)(1000channels)；双参数散点图(x轴为红光，Y轴为绿光)(1000channels)；单参数直方图(x轴为黄光)(1000channels)；
(7)在工具栏“Acquisition Control”窗口，点击“Acquire”菜单上的“counter”以观察并调整流速；调整***浓度和流速，每秒检测约200个***；每管样本至少连续测定两次，每管样本至少记录样本主群5000个细胞流式软件统计分析设定流式细胞仪的校准；
(8)染色后的***细胞悬液通过流式细胞仪收集***的红、黄、绿三种荧光信号，通过收集到的红色荧光***占收集***总数的比例，判定总体样本的DNA碎片情况(结果见下表)；
(9)通过黄色荧光信号情况计算活动***比率，并与MAKLER***计数板检测到的活动***比率相比较(结果见下表)；
(10)通过收集到的黄色荧光***占收集***总数的比例，判定样本的活动***比率；通过收集到的红色荧光***占收集***总数的比例，判定总体样本的DNA碎片化程度；结合三种荧光情况判定活动***DNA碎片情况，即首先在黄色荧光的基础上将活动***与不动***区分出来，再进一步分析活动***中红色荧光***占活动***总数的比例，从而可以判定样本中活动***DNA碎片化情况；并与总体***DNA碎片相比较(结果见下表)。
(11)结果判断依据于建立的图像收集模板，如图1所示，为***细胞群图形，图中用门圈中区域即为***细胞主群；图2为***细胞群黄色荧光表达图，图中分为二群细胞，横轴上左峰即为活动***，横轴上的右峰为非活动***细胞群。图3为***细胞群绿色和红色荧光表达图，图中分为二群细胞，靠近纵轴的群即为DNA完整性好的细胞群，靠近横轴的细胞群即为DNA完整性差的细胞群；
(12)测定后，分别用漂白剂、进样管清洁剂和除菌的双蒸水彻底清除残留于流式细胞仪进样线中的细胞碎片和荧光染料。
上表统计学结果表明，通过常规的MAKLER***计数板检测的活动***比率与流式细胞术检测的活动***比率间没有统计学差异，即通过检测***中动力蛋白水解ATP产生的Pi来检测活动***情况；大部分活动***的DNA碎片率比总体***样本的DNA碎片率要低，两者检测结果有统计学差异。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种活动***DNA碎片流式细胞术检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将***中5～10万个***加入到500μL酸化处理缓冲液中，混匀，置冰上30秒；
(2)在步骤(1)得到的混合液中加入10μL染色液，5-30分钟内上机检测，设定流式细胞仪的参数，包括激发波长和激发波长通道，收集***的绿色、黄色和红色荧光信号，每管样本至少记录样本主群5000个细胞；
(3)流式软件统计分析：结合三种荧光情况分析，即首先在黄色荧光的基础上将活动***与不动***区分出来，再进一步分析活动***中红色荧光***占活动***总数的比例，从而可以判定样本中活动***DNA碎片化情况。
2.根据权利要求1所述的一种活动***DNA碎片流式细胞术检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的酸化处理缓冲液的配方为80-800mmol/L盐酸、14-28mmol/L钼酸铵、0.15mol/L氯化钠、0.1％Triton-X 100，溶剂为水。
3.根据权利要求1所述的一种活动***DNA碎片流式细胞术检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的染色液的配方为20-400mmol/L罗丹明6G、1-50μg/mL吖啶橙、0.1mol/L柠檬酸、0.2mol/L磷酸氢二钠，1mmol/L乙二胺四乙酸，0.15mol/L氯化钠，溶剂为水。
4.根据权利要求3所述的一种活动***DNA碎片流式细胞术检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的染色液的配方为60mmol/L罗丹明6G、6μg/mL吖啶橙、0.1mol/L柠檬酸、0.2mol/L磷酸氢二钠，1mmol/L乙二胺四乙酸，0.15mol/L氯化钠，溶剂为水。
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