CN111307556A - He切片褪色后进行免疫荧光染色的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种HE切片褪色后进行免疫荧光染色的方法，具有HE染色后的切片，所述方法包括以下步骤：使用进行过HE染色的切片二甲苯浸泡，去除盖玻片和中性树胶；梯度酒***化褪色，放入用75％酒精配制的1％盐酸乙醇分化液中浸泡1min；待晾干后，再放入1％的盐酸酒精分化液中1min，重复数次步骤S3直至切片颜色完全褪去；用自来水缓慢冲洗后进行高压修复；对高压修复后的切片进行免疫荧光染色。本发明有益效果在于，利用同一抗原修复方法下的比较显示，本发明的HE褪色后进行染色的切片与空白片直接染色的切片比较，抗原表达强度相当，这提示本发明的方法INS抗原保存得较好。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及HE切片褪色后进行免疫荧光染色的方法。
背景技术
免疫荧光检测技术具有专一性强、灵敏度高、实用性好等优点[1]，为病理检测中一项重要的辅助技术。HE染色为常规的病理学检测染色方法，一些有意义的形态学变化在HE染色中发现。有时HE染色下病变的确诊或进一步研究需要进行免疫荧光染色辅助，此时往往会选择重切蜡块，但重切的切片已经与HE观察不为同一张组织片、需要观察的位置已经或多或少的发生了改变，不利于与原HE切片进行精准的比较研究，更甚者有些组织块小、重切片也不能够切出组织切片进行免疫荧光染色。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明探讨一种HE切片褪色后进行免疫荧光的染色方法，具有重要的应用价值。通过本发明创造了一些简便有效的HE褪色后进行免疫荧光染色的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
HE切片褪色后进行免疫荧光染色的方法，具有HE染色后的切片，所述方法包括以下步骤：
S1使用进行过HE染色的切片二甲苯浸泡，去除盖玻片和中性树胶；
S2梯度酒***化褪色，放入用75％酒精配制的1％盐酸乙醇分化液中浸泡1min；
S3待晾干后，再放入1％的盐酸酒精分化液中1min，
S4重复数次步骤S3直至切片颜色完全褪去；
S5用自来水缓慢冲洗后进行高压修复；
S6对高压修复后的切片进行免疫荧光染色。
优选地，所述高压修复为把切片泡于抗原修复液中，高压锅加热，待喷气后5min停止加热，自然冷却至室温。
优选地，所述步骤S6中免疫荧光染色的步骤为S6.1高压修复后的切片用PBS冲洗3次、每次5min，
S6.2荧光封闭液封闭1h，一抗孵育4℃冰箱过夜，复温37℃，60min；
S6.3 PBS冲洗3次、每次5min，二抗孵育37℃，60min，PBS冲洗3次、每次5min，晾干，封片。
本发明有益效果在于，利用同一抗原修复方法下的比较显示，本发明的HE褪色后进行染色的切片与空白片直接染色的切片比较，抗原表达强度相当，这提示本发明的方法INS抗原保存得较好。
附图说明
图1为本发明的褪色后染色的对照实验A/B/C/D各组的图片。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
本发明为HE切片褪色后进行免疫荧光染色的方法，具有HE染色后的切片，所述方法包括以下步骤：
S1使用进行过HE染色的切片二甲苯浸泡，去除盖玻片和中性树胶；
S2梯度酒***化褪色，放入用75％酒精配制的1％盐酸乙醇分化液中浸泡1min；
S3待晾干后，再放入1％的盐酸酒精分化液中1min，
S4重复数次步骤S3直至切片颜色完全褪去；
S5用自来水缓慢冲洗后进行高压修复；
S6对高压修复后的切片进行免疫荧光染色。
优选地，所述高压修复为把切片泡于抗原修复液中，高压锅加热，待喷气后5min停止加热，自然冷却至室温。
优选地，所述步骤S6中免疫荧光染色的步骤为
S6.1高压修复后的切片用PBS冲洗3次、每次5min，
S6.2荧光封闭液封闭1h，一抗孵育4℃冰箱过夜，复温37℃，60min；
S6.3 PBS冲洗3次、每次5min，二抗孵育37℃，60min，PBS冲洗3次、每次5min，晾干，封片。
实施例
实验动物及实验环境
[普通级]食物蟹猴3只，由广东春盛生物科技发展有限公司提供并饲养于广东春盛生物科技发展有限公司普通环境动物设施，实验中所有涉及动物的实验方案均得到了动物关怀与使用伦理委员会的批准。动物饲养场所严格按照国际实验动物评估和认证管理委员会规定和要求对动物进行日常的饲养关怀和管理。
仪器与试剂
采用的仪器包括Leica TP1020自动脱水机，Leica EG1150H+C石蜡包埋机，LeicaRM2255全自动轮转切片机、Leica ST5020+SV5030全自动染色封片一体机，Leica DM3000正置荧光显微镜。
采用的试剂有褪色剂1％盐酸乙醇分化液、胰岛素抗原(Gene Tex公司)、PBS缓冲液(博士德生物工程有限公司)、胰蛋白酶(南京建成生物工程研究所)、免疫染色封闭液(碧云天生物技术有限公司)、荧光二抗(Invitrogen Life Technologies公司)、二甲苯(天津市百世化工有限公司)、无水乙醇(广州中南化学有限公司)、95％乙醇(广州凯秀贸易有限公司)、1％醇溶性伊红(广州凯秀贸易有限公司)、Harris苏木素(广州凯秀贸易有限公司)、TO透明剂(广州市中南化工仪器有限公司)。
实验方法
组别
选取3只血糖正常的食蟹猴胰腺常规脱水包埋后的蜡块标本，连续切片后用多聚赖氨酸防脱玻片捞片，分为4组，每组3个，即：空白切片高压修复免疫荧光组(A组)，空白切片胰蛋白酶修复免疫荧光组(B组)，HE切片褪色后高压修复免疫荧光组(C组)，HE切片褪色后胰蛋白酶修复免疫荧光组(D组)。
HE染色方法
使用未进行染色的空白切片烤片，然后在二甲苯I和二甲苯II分别浸泡20min进行脱蜡，梯度酒精脱水至纯水，每个步骤7min。接着进行Harris苏木素染色10min，苏木素染色结束后再放到自来水里浸洗1min，然后进行1％盐酸乙醇分化5s，再转移到自来水返蓝15min。待返蓝结束后转移到90％乙醇浸泡7min，然后进行1％醇溶性伊红染色30s，在伊红染色后转移到95％乙醇I、95％乙醇II以及95％乙醇III分别浸泡10s，然后分别转移到无水乙醇I、无水乙醇II脱水各5min，最后在TO透明剂I、TO透明剂II分别浸泡7min，封片。
免疫荧光染色方法
A组
使用未进行染色的空白切片烤片，脱蜡，梯度酒***化后PBS冲洗3次、每次5min，高压修复(高压锅喷气后5min停止加热，待自然冷却至室温)，PBS冲洗3次、每次5min，荧光封闭液封闭1h，一抗孵育(4℃冰箱过夜)，复温(37℃，60min)，PBS冲洗3次、每次5min，二抗孵育(37℃，60min)，PBS冲洗3次、每次5min，晾干，封片。
B组
与A组比较，抗原使用1.25％胰蛋白酶修复(37℃，30min)，不使用高压修复，其余与A组方法相同。
C组
使用进行过HE染色的切片二甲苯浸泡，去除盖玻片和中性树胶，梯度酒***化褪色，放入用75％酒精配制的1％盐酸乙醇分化液中浸泡1min，待晾干后，再放入1％的盐酸酒精分化液中lmin，反复数次直至颜色完全褪去，然后用自来水缓慢冲洗。接着使用PBS冲洗3次、每次5min，进行高压修复等与A组一样的步骤和方法进行免疫荧光染色。
D组
与C组比较，抗原使用1.25％胰蛋白酶修复(37℃，30min)，不使用高压修复，其余与C组方法相同。
如图1所示，HE观察，胰岛大小不一、散在分布，胰岛细胞呈团索状分布，胞浆淡染。各组胰岛中均可见INS阳性荧光表达的胰岛β细胞。通过本发明的方法处理后，A、C组切片可见部分组织破碎、脱落，B、D组切片未见破碎、脱落；进一步的，C组与其他各组的区域综合比较，C组与A组均阳性细胞明亮、清晰，抗原表达强度、染色效果佳。这说明，使用C组的方法，可以很好的保存抗原。
对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (3)
1.HE切片褪色后进行免疫荧光染色的方法，具有HE染色后的切片，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1使用进行过HE染色的切片二甲苯浸泡，去除盖玻片和中性树胶；
S2梯度酒***化褪色，放入用75％酒精配制的1％盐酸乙醇分化液中浸泡1min；
S3待晾干后，再放入1％的盐酸酒精分化液中1min，
S4重复数次步骤S3直至切片颜色完全褪去；
S5用自来水缓慢冲洗后进行高压修复；
S6对高压修复后的切片进行免疫荧光染色。
2.根据权利要求1所述的HE切片褪色后进行免疫荧光染色的方法，其特征在于，所述高压修复为把切片泡于抗原修复液中，高压锅加热，待喷气后5min停止加热，自然冷却至室温。
3.根据权利要求1所述的HE切片褪色后进行免疫荧光染色的方法，其特征在于，所述步骤S6中免疫荧光染色的步骤为
S6.1高压修复后的切片用PBS冲洗3次、每次5min，
S6.2荧光封闭液封闭1h，一抗孵育4℃冰箱过夜，复温37℃，60min；
S6.3 PBS冲洗3次、每次5min，二抗孵育37℃，60min，PBS冲洗3次、每次5min，晾干，封片。
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