CN111304113A

CN111304113A - 一种副干酪乳杆菌副干酪亚种及其应用

Info

Publication number: CN111304113A
Application number: CN201911324613.XA
Authority: CN
Inventors: 黄桂东; 孙张乐; 区锡敏; 钟先锋; 魏梓晴; 蒋木培
Original assignee: Foshan University
Current assignee: Foshan University
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2020-06-19

Abstract

本公开提供了一种副干酪乳杆菌副干酪亚种，所述副干酪乳杆菌副干酪亚种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.17893。所述副干酪乳杆菌副干酪亚种具有一定的抗氧化能力，能清除DPPH和羟基自由基，该菌株还具有较好的耐盐性、耐酸性、耐胆盐、耐胃液、耐肠液、疏水性，这样就增加了其发挥益生作用的机会，可应用于发酵饲料、发酵食品、保健食品等领域。

Description

一种副干酪乳杆菌副干酪亚种及其应用

技术领域

本公开涉及微生物技术领域，具体涉及一种副干酪乳杆菌副干酪亚种及其应用。

背景技术

生命有机体活动中生物氧化是一个至关重要的过程，氧化过程会产生自由基，但是过多的自由基会造成氧化应激反应。氧化应激是机体细胞内的促氧化成分(如超氧化物、过氧化氢等)与抗氧化成分(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽等)之间的平衡失调，体内氧自由基生成过多，无法被及时清除，引起机体过度氧化，造成机体细胞、组织功能损害的一系列适应性的反应。该反应会加速机体衰老以及引发相关疾病。

清除体内过多的氧自由基是保持机体健康的途径之一。市面上有多种多样的抗氧化剂，如叔丁基羟基茴香醚、2,6-二叔丁基对甲酚、特丁基对苯二酚和丁羟甲苯等，然而研究发现，这些合成的抗氧化剂对肝脏有一定的损害，并有致癌性。乳酸菌具有良好的体内、外抗氧化能力，并且对人体安全无害，被广泛的接受并应用。

乳酸菌在自然界中广泛存在，随着技术的发展对乳酸菌认识的不断加深，其功能价值不断被人们发掘并应用。其良好的体内、外抗氧化能力更是被人们广泛利用。然而并不是所有乳酸菌都有良好的抗氧化活性，从庞大的乳酸菌中分离筛选出具有良抗氧化活性的乳酸菌尤为重要。本公开所分离筛选的菌株来自酱油渣中。目前对酱油渣中乳酸菌相关研究很少，酱油渣作为传统发酵食品的副产物，本身含有丰富的微生物资源，如曲霉、酵母菌、乳酸菌等，是极好的筛菌样品。不同的环境中乳酸菌的种类不同，所起的作用及其菌株功能也不尽相同。因此筛选出具有抗氧化活性的乳酸菌，具有广阔的发展前景和经济价值。

发明内容

本公开的目的是提供一种副干酪乳杆菌副干酪亚种及其应用，以达到获取具有良抗氧化活性的乳酸菌的目的。

为实现上述目的，技术方案如下：

一种副干酪乳杆菌副干酪亚种，所述副干酪乳杆菌副干酪亚种 (Lactobacillusparacasei subsp.paracasei)在2019年6月3号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号中国科学院微生物研究所)，其简称为：CGMCC，保藏编号为：CGMCC NO.17893。

一种组合物，所述组合物包含权利要求书1中所述的副干酪乳杆菌副干酪亚种。

所述组合物为食品或发酵饲料。

所述发酵食品为发酵酸奶，所述发酵酸奶的制备方法为：首先将副干酪乳杆菌副干酪亚种在培养基中进行活化，然后将活化第三代的副干酪乳杆菌副干酪亚种接种到含有蔗糖的灭菌牛乳中，最后进行发酵培养。

接种的活化的副干酪乳杆菌副干酪亚种的量为5％。

所述发酵饲料的制备方法为：首先将副干酪乳杆菌副干酪亚种在培养基中进行活化，然后将活化第三代的副干酪乳杆菌副干酪亚种与饲料进行混合，然后再加入蔗糖进行密封发酵。

所述活化第三代的副干酪乳杆菌副干酪亚种的添加量为20％。

本公开的有益效果是：提供了一种副干酪乳杆菌副干酪亚种及其应用，所述副干酪乳杆菌副干酪亚种具有一定的抗氧化活性，能清除DPPH和羟基自由基，该菌株还具有较好的耐盐性、耐酸性、耐胆盐、耐胃液、耐肠液、疏水性，这样就增加了其发挥益生作用的机会，可应用于发酵饲料、发酵食品、保健食品等领域。

附图说明

图1为实施例1筛选的副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCC NO.17893菌落图。

图2为实施例1筛选的副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCC NO.17893的革兰氏染色图。

图3为为实施例1筛选的副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCC NO.17893的生长曲线图。

具体实施方式

以下各步骤仅用以说明本公开的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本公开进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本公开各步骤技术方案的范围。

实施例1副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCC NO.17893的分离鉴定

1.菌株的分离筛选

无菌条件下称取25g酱油渣样品于三角瓶中，加入225mL无菌生理盐水，稍加振荡后制得10^-1稀释液。依次配制10^-2～10^-5等浓度的稀释液。分别吸取0.1 mL不同梯度的酱油渣稀释液涂布于MRS培养基上。用封口膜密封，标上相关信息，于37℃条件恒温培养24～48h至菌落长成。

挑取疑似乳酸菌菌落于MRS培养基中三区划线纯化，操作2～3次至培养基上菌落形态一致。将纯化菌株接种于MRS液体培养基中于37℃培养箱中培养24h后与50％甘油1:1混合后置于-80℃冰箱保藏，其中筛选的副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCC NO.17893的菌落图如图1所示。

2.革兰氏染色及过氧化氢酶触试验

挑取已纯化菌株按试剂盒说明书进行染色镜检，观察菌株形态。革兰氏阳性菌株呈紫色；革兰氏阴性菌株呈红色。吸取过氧化氢溶液，滴在固体培养基菌落集中的位置，用无菌牙签将过氧化氢溶液和菌苔搅浑均匀，观察30s，期间无气泡产生的菌落为过氧化氢酶阴性菌，有气泡产生的菌落则为阳性，其中筛选的副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCCNO.17893的革兰氏染色图如图2，为革兰氏阳性菌，过氧化氢酶阴性菌。

3.16S rRNA分子生物学鉴定

3.1菌株DNA提取

A.在酒精灯火焰附近，取乳酸菌菌体于研钵，使用液氮进行研磨。

B.将研磨完毕的菌体移至离心管(1.5mL)中，标记菌株编号，加入0.6 mL TE缓冲液(pH≈8.0)，使用枪头吸打成均匀菌悬液。

C.加250μL 10％十二烷基硫酸钠溶液(Sodium dodecyl sulfate，SDS)，轻轻倒转使其混匀。

D.加3μL蛋白酶K(20ng/μL)，使其混匀。37℃条件下水浴60min。

E.加150μL盐溶液(5mol/L)，混匀。

F.加150μL 2％十六烷基三甲基溴化铵溶液(Hexadecyl trimethylammoniumBromide，CTAB)，混匀，65℃条件下水浴加热20min。

G.12000RPM常温条件下离心20min。

H.小心移取上清液至新的离心管(1.5mL)，加等体积异丙醇，混匀，室温放置0.5h，12000RPM，4℃条件下离心10min。

I.去上清液，用吸水纸吸干液体，加750μL 70％乙醇溶液，轻弹离心管壁，使其沉淀悬浮并倒转几次，12000RPM，4℃条件下离心2min。

J.离心管加30μL纯化水(纯化水加Rnase，使终浓度为10ng/μL)，轻弹离心管壁，4℃条件下过夜溶解。

3.2PCR扩增

A.PCR扩增引物采用细菌通用正向引物27F和通用反向引物1492R，其中正向引物27F的核苷酸序列为SEQ ID NO.1(AGAGTTTGATCATGGCTCAG) 或SEQ ID NO.2(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)均可以，通用反向引物1492R 的核苷酸序列为SEQ ID NO.3(TACGGCTACCTTGTTACGACTT)或SEQ ID NO.4(TACGGTTACCTTGTTACGACTT)均可以，DNA提取后进行PCR扩增，扩增体系：H₂O 17.8μL；Buffer 3μL；dNTP 2μL；Primer正3μL；Primer 反3μL；DNA模板1μL；酶0.2μL；总体积30μL。

B.反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30sec；55℃退火30sec； 72℃延伸1min；35个循环；72℃ 10min产物末端延伸；12℃ forever终止反应。

3.3凝胶电泳与测序及比对

将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，目标片段在1500bp左右，将扩增成功片段送由测序公司测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，将序列经 BLAST比对鉴定，结合***发育树判断所筛选菌株的种属，经对比发现为副干酪乳杆菌副干酪亚种菌株。

实施例2副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCC 17892的生长特性研究

(1)生长曲线的测定

将上述实施例1所筛选出来的副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCC NO. 17893菌株活化三代，于MRS液体培养基中37℃培养40h，每2小时测定菌株OD₆₀₀ nm值。

其结果如图3所示，可以看出实施例1中所筛选的副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCCNO.17893具有很好的生长活性。

(2)耐盐性研究

配制含盐的MRS培养基，盐质量分数分别为0～9％共9个梯度，灭菌待用。将上述实施例1所筛选出来的副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCC NO.17893菌株活化三代，于MRS液体培养基中37℃培养24h，测定OD₆₀₀ nm值，结果发现实施例1所筛选出来的副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCC NO.17893具有很好的耐盐性，在盐质量分数为1％-5％时，OD₆₀₀nm值范围为 0.894±0.022～1.473±0.036，生长良好，在6％浓度下，OD₆₀₀ nm为0.305±0.062。

(3)耐酸性研究

配制不同pH的MRS液体培养基，pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、 7.0、8.0、9.0，灭菌待用。将上述实施例1所筛选出来的副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCC NO.17893菌株活化三代，于MRS液体培养基中37℃培养24h，测定OD₆₀₀ nm值，结果发现实施例1所筛选出来的副干酪乳杆菌副干酪亚种 CGMCC NO.17893具有耐酸性，在pH值为4～10条件下生长良好，OD₆₀₀ nm 值范围为1.180±0.020～1.511±0.004，在pH＝3条件下，OD₆₀₀ nm值为0.203±0.005。

实施例3：副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCC17893的益生特性研究

(1)模拟胃液耐受性试验

将实施例1所筛选出来的副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCC NO.17893菌株活化三代，吸取3mL培养液，常温下4000r/min离心10min，去上清液，得菌体，将菌体悬浮于3mL灭菌生理盐水制成菌悬浮液备用。

无菌离心管中加入人工胃液与菌悬浮液(9:1)，混合均匀。37℃培养，在0h(稀释度为10^-4、10^-5、10^-6)和3h(稀释度为10^-3、10^-4、10^-5)取样0.1 mL，使用平板计数法计算菌株存活率。实验设置三个重复。

存活率＝(A₁/A₀)×100％

注：A₁是人工胃液耐受3h的乳酸菌存活数，A₀是人工胃液耐受0h的乳酸菌活菌数。

根据上述方法，其结果为：实施例1所筛选出来的副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCCNO.17893具有很好的胃液性，3小时存活率为86％。

(2)模拟肠液耐受性试验

取人工胃液消化3h的菌株培养液1mL，接种于9mL人工肠液中，37℃ 培养0h(稀释度10^-3、10^-4、10^-5)、4h(稀释度10^-2、10^-3、10^-4)和8h(稀释度10^-2、10^-3、10^-4)，使用平板计数法计算菌株存活率。实验设置三个重复。

存活率＝(A₂/A₀)×100％

注：A₂是人工肠液耐受4h、8h的乳酸菌存活数，A₀是人工肠液耐受0h 的乳酸菌活菌数。

根据上述方法，其结果为：实施例1所筛选出来的副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCCNO.17893具有很好的耐肠液性，4小时存活率为95％，8小时存活率为60％。

(3)表面疏水性试验

将实施例1所筛选出来的副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCC NO.17893活化三代，接种量为2％，37℃培养12h。菌液4000r/min离心5min，PBS溶液洗涤2～3次后，重悬。测定菌株OD₆₀₀ nm值，即为初始吸光度A₀。吸取上述菌悬浮液3mL，加入1mL二甲苯，室温培养15min，震荡使其快速混合，室温静止放置1h，弃有机层与乳化层，吸取下层水相，以PBS缓冲液为空白对照，测定OD₆₀₀ nm即为最终吸光度A，记录并计算。

乳酸菌细胞的表面疏水率的计算：

细胞表面疏水性H(％)＝((A₀-A)/A₀)×100％

注：A₀和A分别是菌液与二甲苯混匀前、后菌液的OD₆₀₀ nm值。

其结果为所述实施例1中筛选出来的副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCC NO.17893细胞表面疏水性为18.52±0.76％，证明所述实施例1中筛选出来的副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCC NO.17893具有一定的粘附能力，在人体肠道中能够很好的粘附，并发挥其益生作用。

(4)抗氧化能力测定

将实施例1所筛选出来的副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCC NO.17893活化三代，接种量为2％，37℃培养24h。4℃下4000r/min离心20min，去上清收菌体。用PBS缓冲液洗涤菌体3次，重悬。

1)清除DPPH能力测定

2mL菌体悬浮液，加2mL DPPH溶液(0.2mmol/L)，室温下避光反应 0.5h，测定OD₅₁₇nm值，空白为无水乙醇。

DPPH清除率(％)＝1-((A₃-A₄)/A₀)×100％

注：公式中：A₃为2mL DPPH+2mL样品的吸光度；A₄为2mL无水乙醇+2mL样品的吸光度；A₀为2mL DPPH+2mL无水乙醇的吸光度。

2)清除羟基自由基能力测定

试管中加入2mL邻菲啰啉(2.5mmol/L)，依次加入PBS缓冲溶液(pH＝7.4，0.02mol/L)2mL和蒸馏水2mL，混匀。加硫酸亚铁溶液2mL(2.5mmol/L)， 2mL H₂O₂(20mmol/L)溶液，混匀，37℃水浴90min。4℃下5000r/min离心6min，测定OD₅₃₆ nm值，空白为PBS缓冲溶液。

羟基自由基清除率(％)＝((A₅-A₀)/(A₆-A₀))×100％

注：A₆为2mL蒸馏水代替2mL H₂O₂的OD₅₃₆ nm值；A₅为用2mL细胞悬浮液代替2mL蒸馏水的OD₅₃₆ nm值。

根据上述方法，经检测计算后，结果为实施例1所筛选出来的副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCC NO.17893菌体细胞悬浮液对DPPH清除率为26.25％；羟基自由基的清除率为42.88％，这说明实施例1所筛选出来的副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCC NO.17893具有很好的抗氧化性。

实施例3

将实施例1筛选的副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCC NO.17893用MRS培养基在37℃温度下进行活化，将活化第三代的菌株按照5％的接种量接到添加了2％蔗糖，灭菌(95℃，5min)的牛乳中，，37℃发酵培养，发酵时间8小时，4℃后熟24h，即成酸奶。添加本公开所述的副干酪乳杆菌副干酪亚种 CGMCC NO.17893以及采用此工艺发酵制得的酸奶，风味独特，感官评价高。

实施例4

将收获的玉米秸秆用粉碎机粉碎为长短2cm左右，加入1％的蔗糖，将实施例1筛选的副干酪乳杆菌副干酪亚种CGMCC NO.17893用MRS培养基在 37℃温度下活化3代，按20％的接种量与玉米秸秆混合均匀，密封发酵5天后，即成口味适宜，营养丰富可供反刍动物食用的饲料。

SEQUENCE LISTING

<110> 佛山科学技术学院

<120> 一种副干酪乳杆菌副干酪亚种及其应用

<130> 2019.12.18

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

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<211> 1463

<212> DNA

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cccttagacg gctcgctccc taaaagggtt acgccaccgg cttcgggtgt tacaaactct 60

catggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg cgtgctgatc 120

cgcgattact agcgattccg acttcgtgta ggcgagttgc agcctacagt ccgaactgag 180

aatggcttta agagattagc ttgacctcgc ggtctcgcaa ctcgttgtac catccattgt 240

agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct 300

ccggtttgtc accggcagtc ttactagagt gcccaactaa atgctggcaa ctagtcataa 360

gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat 420

gcaccacctg tcattttgcc cccgaagggg aaacctgatc tctcaggtga tcaaaagatg 480

tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt 540

gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca accttgcggt cgtactcccc aggcggaatg 600

cttaatgcgt tagctgcggc actgaagggc ggaaaccctc caacacctag cattcatcgt 660

ttacggcatg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgcta cccatgcttt cgagcctcag 720

cgtcagttac agaccagaca gccgccttcg ccactggtgt tcttccatat atctacgcat 780

ttcaccgcta cacatggagt tccactgtcc tcttctgcac tcaagtttcc cagtttccga 840

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ctttacgccc aataaatccg gataacgctt gccacctacg tattaccgcg gctgctggca 960

cgtagttagc cgtggctttc tggttggata ccgtcacgcc gacaacagtt actctgccga 1020

ccattcttct ccaacaacag agttttacaa cccgaaagcc ttcttcactc acgcggcgtt 1080

gctccatcag acttgcgtcc attgtggaag attccctact gctgcctccc gtaggagttt 1140

gggccgtgtc tcagtcccaa tgtggccgat caacctctca gttcggctac gtatcatcgc 1200

cttggtgagc cgttacctca ccaactagct aatacgccgc gggtccatcc aaaagcgata 1260

gcttacgcca tctttcagcc aagaaccatg cggttcttgg atctatgcgg tattagcatc 1320

tgtttccaaa tgttatcccc cacttaaggg caggttaccc acgtgttact cacccgtccg 1380

ccactcgttc catgttgaat ctcggtgcaa gcaccgatca tcaacgagaa ctcgttcgac 1440

ttgcatgtat agcacccgcc ctc 1463

Claims

1.一种副干酪乳杆菌副干酪亚种，其特征在于，所述副干酪乳杆菌副干酪亚种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.17893。

2.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求书1中所述的副干酪乳杆菌副干酪亚种。

3.根据权利要求书2中所述的组合物，其特征在于，所述组合物为食品。

4.根据权利要求书3中所述的组合，其特征在于，所述食品为发酵酸奶，所述发酵酸奶的制备方法为：首先将副干酪乳杆菌副干酪亚种在培养基中进行活化，然后将活化第三代的副干酪乳杆菌副干酪亚种接种到含有蔗糖的灭菌牛乳中，最后进行发酵培养。

5.根据权利要求书4中所述的组合物，其特征在于，接种的活化的副干酪乳杆菌副干酪亚种的量为5％。

6.根据权利要求书2中所述的组合物，其特征在于，所述组合物为发酵饲料。

7.根据权利要求书6所述的组合物，其特征在于，所述发酵饲料的制备方法为：首先将副干酪乳杆菌副干酪亚种在培养基中进行活化，然后将活化第三代的副干酪乳杆菌副干酪亚种与饲料进行混合，然后再加入蔗糖进行密封发酵。

8.根据权利要求书7中所述的组合物，其特征在于，所述活化第三代的副干酪乳杆菌副干酪亚种的添加量为20％。