CN111298140B - 还原响应的t1/t2切换型mri造影剂、其制备方法及应用 - Google Patents

还原响应的t1/t2切换型mri造影剂、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂、其制备方法及应用。所述造影剂具有下列结构式：
Figure DDA0002422657090000011
其中，M为超小氧化铁纳米颗粒，X为H或靶向分子，n为50～150。本发明提供的MRI造影剂可以在肿瘤细胞内特异性地响应较高浓度的谷胱甘肽，实现超小氧化铁纳米颗粒的聚集，从而实现T1造影剂到T2造影剂的切换，在肿瘤诊断中具有高灵敏性与选择性、毒性低，生物相容性好等优点。

Description

还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种造影剂，特别是一种还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂、其制备方法及应用，例如在制备具有肿瘤检测功能的产品中的应用，属于药剂制备技术领域。
背景技术
随着科技的发展，磁共振成像(MRI)已成为临床检测疾病的一种有效手段。磁共振成像是一种具有无创性、高时空分辨率的成像技术，在临床医学中具有广阔的应用前景。由于MRI的敏感性十分有限，为了进一步提高成像的灵敏度和特异性，通常采用小分子钆作为造影剂来增强肿瘤部位的对比效果。然而，这类小分子造影剂存在一些缺点，如血液循环时间短、弛豫率低、无靶向性，具有一定的毒性，临床上对于肾功能不全患者存在引起肾源性***性纤维化的风险。同时，这类小分子造影剂在肿瘤部位表现出低的弛豫性能和非特异性。因此制备在肿瘤部位具有高特异、灵敏度以及具有组织或肿瘤靶向性的MRI造影剂成为发展的焦点。
近年来，基于肿瘤组织的特性，多种基于刺激响应的策略已被用来设计造影剂，从而提高其对肿瘤组织的选择性，进一步提高诊断的准确性。例如，有研究人员将在弱酸下响应的聚合物连接到钆基纳米颗粒上，使钆基纳米颗粒能响应肿瘤酸性微环境，从而在肿瘤部位选择性地提高MRI信号强度。又例如，有研究人员通过构建由谷胱甘肽(GSH)诱导聚集成团簇的氧化铁纳米颗粒，可以在肿瘤部位选择性地增强T2造影效果。虽然这类造影剂可以特异性增强肿瘤部位的对比效果，但仍会产生背景信号，影响诊断的准确性。因此，为了进一步提高造影剂的选择性和敏感性，开发只对肿瘤组织产生造影增强的T1/T2切换型造影剂尤为重要。
超小氧化铁纳米颗粒是近年来发展出的一种T1型造影剂。一些研究显示，这类纳米颗粒在聚集后可以发生T1型造影剂到T2型造影剂的转变。其中，在透明质酸修饰超小氧化铁纳米颗粒被设计用于在肿瘤微环境透明质酸酶的作用下肿瘤酸性微环境中调节T1加权MRI信号到T2加权MRI信号，通过这种肿瘤部位特异性T1/T2的切换，可以降低背景信号的干扰。同时，超小尺寸(<5nm)的氧化铁纳米颗粒与大尺寸的氧化铁纳米颗粒相比，具有肾清除快、生物相容性好等优点，具有作为MRI造影剂的巨大潜力。然而，这类透明质酸修饰的超小氧化铁纳米颗粒在制备氧化铁纳米颗粒时，合成方法不够精准，合成颗粒的尺 寸难以控制。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂、其制备方法及应用，从而克服现有技术的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂，它具有下列结构式：
Figure BDA0002422657070000021
其中，M为三氧化二铁纳米颗粒，X为H或靶向分子，n为50～150。
在一些较佳实施方案中，所述靶向分子的来源包括叶酸。
在一些较佳实施方案中，所述三氧化二铁纳米颗粒的粒径小于5nm，即，为超小氧化铁纳米颗粒。
本发明实施例还提供了一种还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂的制备方法，包括：
至少使端基为叠氮和羧基的聚乙二醇与单叔丁氧羰基保护的胱胺、二环己基碳二亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺反应，形成端基为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇；
至少使所述端基为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇与酸类脱保护试剂反应，形成两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇；
至少使将所述两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇与靶向分子的前驱体和一价铜类催化剂反应，形成两端分别修饰为靶向分子和双硫键的聚乙二醇；
至少使羧基聚乙二醇与单叔丁氧羰基保护的胱胺、二环己基碳二亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺反应，形成端基为甲氧基和叔丁氧羰基的聚乙二醇；
至少使所述端基为甲氧基和单叔丁氧羰基的聚乙二醇与三氟乙酸反应，形成一端修饰为双硫键的聚乙二醇；
将所述两端分别修饰为靶向分子和双硫键的聚乙二醇、所述一端修饰为双硫键的聚乙二醇与表面修饰羧基活化酯的超小氧化铁纳米颗粒反应，使所述超小氧化铁纳米颗粒表面通过双硫键连接带有靶向分子的聚乙二醇。
本发明实施例还提供了所述还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂的用途，例如在非医疗目的的造影方法中的用途、制备造影用组合物中的用途，或者具有造影功能的产品中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少在于：
1)本发明提供的还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂以超小氧化铁纳米颗粒为载体，可还原响应并引发集聚，生物相容性好，可特异性地在肿瘤部位进行T1造影信号到T2造影信号的切换，降低背景信号的干扰，具有肿瘤靶向性，从而具有高灵敏度和特异性的成像对比性能，能够有效降低背景信号的干扰，为肿瘤磁共振成像提供高灵敏度、肿瘤靶向特异性以及长成像窗口，同时，该还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂的尺寸小，使其在肿瘤中的渗透扩散效果显著；
2)本发明提供的还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂中引入了叶酸等作为靶向分子，通过点击修饰修饰在聚乙二醇一端并通过氨基和五氟苯酚酯等的反应修饰在超小氧化铁纳米颗粒的表面，通过叶酸受体介导的胞吞作用进入肿瘤细胞，来实现造影剂在肿瘤组织的富集，该造影剂进入肿瘤细胞后，在高浓度谷胱甘肽还原下发生集聚形成团簇，从T1类造影剂转化为T2类造影剂，这种主动靶向更利于体内肿瘤磁共振成像。
附图说明
图1是本发明实施例1中步骤一中产物单叔丁氧羰基保护的胱胺的核磁共振氢谱。
图2是本发明实施例1中步骤二中产物两端分别修饰为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇以及两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇的核磁共振氢谱。
图3是本发明实施例1中步骤三中产物炔基叶酸的核磁共振氢谱。
图4是本发明实施例1中步骤四中产物两端分别修饰为叶酸和双硫键的聚乙二醇的核磁共振氢谱。
图5是本发明实施例1中步骤五、六和七中产物羧基聚乙二醇、端基为单叔丁氧羰基的聚乙二醇和一端修饰双硫键的聚乙二醇的核磁共振氢谱。
图6是本发明实施例1中步骤八中产物1-甲基五氟苯酯-3,4-二羟基苯的核磁共振氢谱。
图7是步骤八和九中产物五氟苯酚酯修饰的超小氧化铁纳米颗粒和表面通过双硫键连接带有叶酸的聚乙二醇的超小氧化铁纳米颗粒的红外光谱图。
图8a-图8b是本发明实施例1中MRI造影剂在10mM二氯苏糖醇(DTT)孵育24小时之前和之后的纵向弛豫率(r1)弛豫率对比图以及对应的溶液成像。
图9a-图9b是本发明实施例1中MRI造影剂在10mM二氯苏糖醇(DTT)孵育24小时之前和之后的横向弛豫率(r2)弛豫率对比图以及对应的溶液成像。
图10是本发明实施例1中MRI造影剂与不含双硫键的对照组在10mM二硫苏糖醇(DTT)孵育下不同时间下的横向弛豫时间(T1)的变化图。
图11是本发明实施例1中MRI造影剂在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人口腔表皮样癌细胞(KB)中的细胞毒性测试图。
图12是本发明实施例1中MRI造影剂的无胸腺裸鼠上的组织毒理测试图。
图13是本发明实例1中MRI造影剂和无叶酸对照组与人口腔表皮样癌细胞(KB)孵育三小时后的细胞T1磁共振成像图。
图14是本发明实例1中MRI造影剂和无双硫键对照组与人口腔表皮样癌细胞(KB)孵育二十四小时后的细胞T2磁共振成像图。
图15是本发明实施例1中MRI造影剂在移植KB细胞肿瘤的无胸腺裸鼠上的体内成像图。
具体实施方式
如前所述，鉴于现有技术的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，提出了本发明的技术方案，其主要是以超小氧化铁纳米颗粒为载体，通过在其表面通过双硫键等连接带有靶向分子的聚乙二醇，形成一种还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂，其可以在肿瘤细胞内特异性地响应较高浓度的谷胱甘肽实现超小氧化铁纳米颗粒的聚集，从而实现T1造影剂到T2造影剂切换，在肿瘤诊断中具有高灵敏性与选择性，并且毒性低，生物相容性好。
如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
本发明实施例之中的一个方面提供了一种还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂，它具有下列结构式：
Figure BDA0002422657070000041
其中，M为三氧化二铁纳米颗粒，X为H或靶向分子，n为50～150。
在一些较佳实施方案中，所述靶向分子的来源包括叶酸。
在一些较佳实施方案中，所述三氧化二铁纳米颗粒的粒径小于5nm，即，为超小氧化铁纳米颗粒。
本发明实施例提供的还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂包括叶酸靶向可还原响应并引发集聚导致造影效果切换的超小氧化铁纳米颗粒，其中超小氧化铁纳米颗粒可以作为一种T1型造影剂，由于其具有超小尺寸，具有肾清除迅速以及生物相容性良好的优点，进而，通过在超小氧化铁纳米颗粒上修饰生物相容性好并且可生物降解的安全材料PEG(聚乙二醇)后，可以使超小氧化铁纳米颗粒溶于水溶液中形成单分散的水溶液，并且通过将可在还原环境下断裂的双硫键连接PEG与超小氧化铁纳米颗粒表面，使得在肿瘤组织中，该造影剂可以对在肿瘤细胞生长过程中产生的过量谷胱甘肽(GSH)等还原性物质进行响应(双硫键暴露于GSH时可以裂解为硫醇)，从而发生聚集，切换造影剂的造影效果(从T1型造影剂转化为T2型造影剂)。以及，通过将靶向分子连接在部分PEG的末端，并修饰到超小氧化铁 纳米颗粒上，能够有效增强造影剂在肿瘤部分的富集，并且通过受体介导的内吞进入肿瘤细胞。例如，通过采用叶酸或其衍生物作为靶向分子，其与叶酸受体有高度的亲和性。其中，叶酸受体是一种糖基磷脂酰肌醇偶联蛋白，除个别组织外,叶酸受体在正常组织上表达水平很低,而在许多肿瘤细胞表面过表达。基于这种特性,可将显像剂、治疗药物等与叶酸偶联,靶向给予肿瘤细胞,从而应用于肿瘤的影像诊断。
经实验发现，本发明实施例提供的还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂在响应前后的纵向弛豫率r1从6.5857mM-1s-1变为1.3471mM-1s-1，横向弛豫率r2从10.059mM-1s-1变为33.764mM-1s-1，其r2/r1比值的变化也说明了该造影剂在还原环境由T1型转变为T2型造影剂，可以在肿瘤检测时有效降低背景信号的干扰，提高造影剂的特异性与选择性。此外，该造影剂具有良好的生物相容性以及极低的生物毒性。
本发明实施例之中的另一个方面还提供了一种还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂的制备方法，其包括：将胱胺二盐酸盐和二碳酸二叔丁酯反应得到单叔丁氧羰基保护的胱胺，再与端基为叠氮和羧基的聚乙二醇反应得到两端分别修饰为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇，之后通过与三氟乙酸反应脱去单叔丁氧羰基，得到两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇，随后，通过点击化学反应与炔基叶酸反应得到两端分别修饰为叶酸和双硫键的聚乙二醇，同时将单叔丁氧羰基保护的胱胺与羧基聚乙二醇反应，再通过与三氟乙酸反应脱去单叔丁氧羰基得到一端为双硫键的聚乙二醇，然后将表面连接油酸的超小氧化铁纳米颗粒通过表面双配体交换，将五氟苯酚酯修饰在超小氧化铁纳米颗粒上，随后与两端分别修饰为叶酸和双硫键的聚乙二醇和一端为双硫键的聚乙二醇反应，以此得到还原响应型T1/T2可切换的造影剂。
进一步的，所述的制备方法具体可以包括：
至少使端基为叠氮和羧基的聚乙二醇与单叔丁氧羰基保护的胱胺、二环己基碳二亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺反应，形成端基为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇；
至少使所述端基为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇与酸类脱保护试剂反应，形成两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇；
至少使将所述两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇与靶向分子的前驱体和一价铜类催化剂反应，形成两端分别修饰为靶向分子和双硫键的聚乙二醇；
至少使羧基聚乙二醇与单叔丁氧羰基保护的胱胺、二环己基碳二亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺反应，形成端基为甲氧基和叔丁氧羰基的聚乙二醇；
至少使所述端基为甲氧基和单叔丁氧羰基的聚乙二醇与三氟乙酸反应，形成一端修饰为双硫键的聚乙二醇；
将所述两端分别修饰为靶向分子和双硫键的聚乙二醇、所述一端修饰为双硫键的聚乙二醇与表面修饰羧基活化酯的超小氧化铁纳米颗粒反应，使所述超小氧化铁纳米颗粒表面通过 双硫键连接带有靶向分子的聚乙二醇。
在一些实施方式中，所述的制备方法还可以包括：将端基为叠氮和羧基的聚乙二醇溶解在三氯甲烷中，再依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺以及单叔丁氧羰基保护的胱胺，在保护性气氛下室温反应12～24小时得到端基为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇，其中单叔丁氧羰基保护的胱胺的用量远大于端基为叠氮和羧基的聚乙二醇。
优选的，所述单叔丁氧羰基保护的胱胺与端基为叠氮和羧基的聚乙二醇的摩尔比大于10：1。
在一些实施方式中，所述的制备方法还可以包括：将端基为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇溶解在二氯甲烷中，再加入三氟乙酸，之后于室温反应2～3小时，得到两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇。
优选的，所述三氟乙酸与两端分别修饰为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇的摩尔比大于1000：1。
在一些实施方式中，所述的制备方法还可以包括：采用炔基叶酸作为靶向分子的前驱体，将所述两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇与炔基叶酸按照摩尔比为1：1.5～2溶于二甲基甲酰形成溶液，之后冷冻除氧，再在保护性气氛中快速加入抗坏血酸钠以及五水硫酸铜(通过两者的反应形成一价铜催化剂)，且室温反应48～72小时，得到两端分别修饰为叶酸和双硫键的聚乙二醇。
在一些实施方式中，所述的制备方法还可以包括：将羧基聚乙二醇溶解在二氯甲烷中，再依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺以及单叔丁氧羰基保护的胱胺，并在保护性气氛下室温反应12～24小时，得到端基为单叔丁氧羰基的聚乙二醇，其中单叔丁氧羰基保护的胱胺的用量远大于羧基聚乙二醇。
优选的，所述单叔丁氧羰基保护的胱胺与羧基聚乙二醇的摩尔比大于10：1。
在一些实施方式中，所述的制备方法还可以包括：将端基为单叔丁氧羰基的聚乙二醇溶解在二氯甲烷中，再加入三氟乙酸，之后于室温反应2～3小时，得到一端为双硫键的聚乙二醇。
优选的，所述三氟乙酸与端基为单叔丁氧羰基的聚乙二醇的摩尔比大于1000：1。
在一些实施方式中，所述的制备方法还可以包括：将表面修饰五氟苯酚酯的超小氧化铁纳米颗粒与所述两端分别为双硫键和靶向分子的聚乙二醇以及所述一端为双硫键的聚乙二醇在三氯甲烷中混合，再加入N,N-二异丙基乙胺，并在室温下反应12～24小时，获得表面通过双硫键连接带有靶向分子的聚乙二醇的超小氧化铁纳米颗粒。
优选的，所述表面修饰五氟苯酚酯的超小氧化铁纳米颗粒、所述两端分别为双硫键和靶向分子的聚乙二醇与所述一端为双硫键的聚乙二醇的质量比在1：2：8以上。
优选的，所述N,N-二异丙基乙胺与所述两端分别为双硫键和靶向分子的聚乙二醇的摩尔 比为100～200：1。
在一些实施方式中，所述的制备方法还可以包括：在获得表面通过双硫键连接带有靶向分子的聚乙二醇的超小氧化铁纳米颗粒之后对其进行纯化等处理的步骤。例如，可以将所述表面通过双硫键连接带有靶向分子的聚乙二醇的超小氧化铁纳米颗粒分散于水中，再以截留分子量为30000～50000的透析袋透析并冻干。
作为本发明一更为具体的实施实例之一，所述制备方法可以包括以下步骤：
(1)单叔丁氧羰基保护的胱胺的制备：三乙胺经邻苯二甲酸酐回流除去杂质，然后通过氢化钙干燥除水。胱胺二盐酸盐溶解于无水甲醇中，然后，将干燥的三乙胺(摩尔比1：3～5)和二碳酸二叔丁酯缓慢滴入到上述溶液中，室温下搅拌30分钟，得到单叔丁氧羰基保护的胱胺。
(2)两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇的制备：将端基为叠氮和羧基的聚乙二醇溶解在二氯甲烷中，再将N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺以及单叔丁氧羰基保护的胱胺依次加入至上述端基为叠氮和羧基的聚乙二醇溶液中，在氮气环境下室温反应12～24小时得到端基为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇，其中单叔丁氧羰基保护的胱胺的用量远大于端基为叠氮和羧基的聚乙二醇。然后将端基为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇溶解在二氯甲烷中，再加入三氟乙酸，之后于室温反应2～3小时，得到两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇。其中加入的三氟乙酸与两端分别修饰为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇的摩尔比优选大于1000：1。
(3)炔基叶酸的制备：将等摩尔的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶解于二甲基甲酰胺中，置于100mL圆底烧瓶中，在室温搅拌3～5小时。将叶酸溶于二甲基甲酰胺中，逐滴滴入上述混合溶液中。然后，将炔丙胺快速加入叶酸溶液中，避光室温搅拌24小时得到炔基叶酸。
(4)两端分别修饰为叶酸和双硫键的聚乙二醇的制备：将所述两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇与炔基叶酸按照摩尔比为1：1.5～2分别溶于二甲基亚砜形成溶液，之后冷冻除氧三次，在保护性气氛中将抗坏血酸钠以及五水硫酸铜快速加入到两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇与炔基叶酸的溶液中，保护性气氛中室温反应48～72小时，得到两端分别修饰为叶酸和双硫键的聚乙二醇。
(5)羧基聚乙二醇的制备：四氢呋喃通过钾和钠除水干燥。氩气气氛下，等摩尔量的萘和钠在干燥的四氢呋喃混合搅拌2小时。然后将甲氧基聚乙二醇溶解于干燥的四氢呋喃，加入上述萘溶液中。室温下搅拌1小时后，用注射器将溴乙酸乙酯加入反应中，并维持室温搅拌3～5小时得到乙氧基聚乙二醇。然后，将上述乙氧基聚乙二醇溶解在1～3mol/L的氢氧化钠中，搅拌2小时得到羧基聚乙二醇。
(6)一端修饰双硫键的聚乙二醇的制备：将羧基聚乙二醇溶解在二氯甲烷中，将N-羟 基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺以及单叔丁氧羰基保护的胱胺依次加入至上述溶液中，氮气环境下室温反应12～24小时得到端基为单叔丁氧羰基的聚乙二醇，其中单叔丁氧羰基保护的胱胺的用量远大于羧基聚乙二醇，所述单叔丁氧羰基保护的胱胺与羧基聚乙二醇的摩尔比大于10：1。将端基为单叔丁氧羰基的聚乙二醇溶解在二氯甲烷中，再加入三氟乙酸，之后于室温反应2～3小时，得到一端为双硫键的聚乙二醇。其中，所述三氟乙酸与端基为单叔丁氧羰基的聚乙二醇的摩尔比大于1000：1。
(7)五氟苯酚酯修饰的超小氧化铁纳米颗粒的制备：二氧六环用钾和钠回流搅拌除水。五氟苯酚和3，4-二羟基苯乙酸溶解于无水二氧六环中。二环己基碳二亚胺溶解在无水二氧六环中，在剧烈搅拌下逐滴滴加入上述五氟苯酚溶液中，氮气氛围下室温搅拌12小时得到1-甲基五氟苯酯-3,4-二羟基苯。然后将1-甲基五氟苯酯-3,4-二羟基苯和油酸修饰的超小氧化铁纳米颗粒以质量比5～10：1混合在三氯甲烷中，加入N,N-二异丙基乙胺，氮气氛围下室温反应24小时得到五氟苯酚酯修饰的超小氧化铁纳米颗粒。
(8)叶酸靶向的通过双硫键在表面修饰聚乙二醇的超小氧化铁纳米颗粒的制备：将质量比在1：2：8以上的表面修饰五氟苯酚酯的超小氧化铁纳米颗粒与所述两端分别为双硫键和叶酸的聚乙二醇以及一端为双硫键的聚乙二醇在三氯甲烷中混合，加入N,N-二异丙基乙胺，之后在室温下反应12～24小时，获得表面通过双硫键连接带有叶酸的聚乙二醇的超小氧化铁纳米颗粒。其中，所述N,N-二异丙基乙胺与两端分别为双硫键和叶酸的聚乙二醇的摩尔比为100～200：1。
其中，在所述单叔丁氧羰基保护的胱胺的制备步骤中，可以将所述单叔丁氧羰基保护的胱胺加入1～3mol/L的磷酸二氢钠溶液，用***分液反复萃取，洗涤三次或更多次，收集水相，在冰浴下缓慢滴入1mol/L的氢氧化钠水溶液，调节水溶液pH值到9左右，然后加入乙酸乙酯用分液萃取三次或更多次，收集并合并有机相，然后有机相用无水硫酸镁干燥过夜，旋蒸除去溶剂，真空干燥提纯。
其中，在所述两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇的制备步骤中，可以将所述端基为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇在大量***中沉淀，离心后用二氯甲烷溶解再用大量***沉淀，重复3次或更多次，离心收集沉淀并将沉淀溶解在去离子水中，通过用截留分子量1000的透析袋透析三天，冷冻干燥。所述端基为叠氮和双硫键的聚乙二醇是通过在三氟乙酸/二氯甲烷的混合溶剂中(体积比为1:1左右)室温搅拌2小时左右脱掉保护基团，并通过旋蒸除掉溶剂，用二氯甲烷反复洗涤，旋蒸浓缩溶液，在大量***中沉淀，离心后用二氯甲烷溶解再用大量***沉淀，重复3次或更多次，真空干燥提纯。其中三氟乙酸的量应远远大于端基为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇的量。
其中，在所述炔基叶酸的制备步骤中，可以将所述炔基叶酸在***中沉淀，离心收集沉淀，分别用去离子水、乙醇和丙酮离心洗三次或更多次，收集沉淀并真空干燥来提纯。
其中，在所述两端分别修饰为叶酸和双硫键的聚乙二醇的制备步骤中，溶剂二甲基亚砜应保持少量，所述两端分别修饰为叶酸和双硫键的聚乙二醇通过点击反应得到，并在大量***中沉淀，离心收集，然后将沉淀溶解于水中，通过二氯甲烷分液萃取三次，合并并收集有机相，用饱和氯化钠溶液反复萃取洗涤三次，旋蒸除去溶剂，真空干燥来提纯。
其中，在所述羧基聚乙二醇的制备步骤中，可以使所述乙氧基聚乙二醇在室温下搅拌反应4小时后，过滤去除残渣，减压浓缩，加入过量的***，得到白色沉淀，溶解在二氯甲烷中，再次沉淀在过量***中，反复三次或等多次，所得羧基聚乙二醇溶解于二氯甲烷中，用去离子水分液洗涤三次或更多次，之后用无水硫酸镁干燥，并经***沉淀提纯，而后真空干燥。
其中，在所述一端修饰双硫键的聚乙二醇的制备步骤中，所述端基为单叔丁氧羰基的聚乙二醇和所述一端修饰双硫键的聚乙二醇均可以在大量***中沉淀，之后离心，再用二氯甲烷溶解，其后用大量***沉淀，重复3次或更多次。
其中，在所述五氟苯酚酯修饰的超小氧化铁纳米颗粒的制备步骤中，对于所述1-甲基五氟苯酯-3,4-二羟基苯可以通过抽滤除去残渣，旋蒸浓缩溶液，粗产物通过硅胶柱提纯(正己烷：乙酸乙酯＝3：1作为洗脱剂)，减压除去溶液，而后真空干燥。所述五氟苯酚酯修饰的超小氧化铁纳米颗粒通过减压除去溶剂，加入二甲基亚砜，离心收集，并用二甲基亚砜洗涤三次，离心。
其中，所述叶酸靶向的通过双硫键在表面修饰聚乙二醇的超小氧化铁纳米颗粒的制备步骤中，所述叶酸靶向的通过双硫键在表面修饰聚乙二醇的超小氧化铁纳米颗粒通过浓缩溶液之后滴入大量***中，离心收集，溶解于去离子水中，通过用截留分子量35000左右的透析袋透析三天，冷冻干燥。
在本发明的以上实施例中所采用的二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜亦可以被替代为其它合适的有机溶剂。
本发明实施例的又一个方面还提供了所述还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂的用途。
例如，本发明实施例提供了所述的还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂于制备具有肿瘤检测功能的产品中的用途。
优选的，所述产品中Fe3+浓度为30～50mmol/L。
例如，本发明实施例提供了一种造影用组合物，包括所述的还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂；以及，药学上可接受的辅剂。
进一步的，所述药学上可接受的辅剂还可以是稀释剂等。
例如，本发明实施例提供了一种药用组合物，包括所述的还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂；以及，药学上可接受的载体。
进一步的，所述药用组合物还可以包括治疗性药物、示踪性分子等药物组分。
例如，本发明实施例提供了一种非医疗目的的造影方法，其特征在于包括：向待造影的对象施用所述的造影剂或所述的造影用组合物，并进行造影。
其中，所述待造影的对象可以是生物的活体组织，例如肿瘤组织，等等，但不限于此。
本发明以上实施例提供的还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂对肿瘤部位的特异性和选择性高，生物相容性良好，毒性低，同时可从快速体内代谢，具有肿瘤靶向性，从而具有优异的成像对比性能，能够避免背景信号的干扰，为肿瘤磁共振成像提供高灵敏度和肿瘤靶向特异性。进一步地，本发明以上实施例提供还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂的尺寸大小使其在肿瘤中的渗透扩散效果显著。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1一种还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一：单叔丁氧羰基保护的胱胺的制备：三乙胺(Et3N)经邻苯二甲酸酐回流除去杂质，然后通过氢化钙干燥除水。胱胺二盐酸盐溶解于无水甲醇中，然后，将干燥的三乙胺(摩尔比1：3)和二碳酸二叔丁酯缓慢滴入到上述溶液中，室温下搅拌30分钟，得到单叔丁氧羰基保护的胱胺以及副产物和其他杂质；
步骤一的反应结束后溶液加入1mol/L的磷酸二氢钠溶液，用***分液反复萃取，洗涤三次，收集水相，在冰浴下缓慢滴入1mol/L的氢氧化钠水溶液，调节水溶液pH到9，然后加入乙酸乙酯用分液萃取三次，收集并合并有机相，然后有机相用无水硫酸镁干燥过夜，旋蒸除去溶剂，真空干燥提纯。
步骤二：两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇的制备：将端基为叠氮和羧基的聚乙二醇溶解在二氯甲烷中，再将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳二亚胺(DCC)以及单叔丁氧羰基保护的胱胺依次加入至上述端基为叠氮和羧基的聚乙二醇溶液中，在氮气环境下室温反应12小时。反应结束后，溶液在大量***中沉淀，离心后用二氯甲烷溶解再用大量***沉淀，重复3次，离心收集沉淀并将沉淀溶解在去离子水中，通过用截留分子量1000的透析袋透析三天，冷冻干燥，得到白色固体即端基为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇。然后将所得端基为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇溶解在二氯甲烷中，再加入三氟乙酸(TFA)，之后于室温反应2小时。通过在三氟乙酸/二氯甲烷的混合溶剂中(体积比为1:1)室温搅拌2小时脱掉保护基团，并通过旋蒸除掉溶剂，用二氯甲烷反复洗涤，旋蒸浓缩溶液，在大量***中沉淀，离心后用二氯甲烷溶解再用大量***沉淀，重复3次，真空干燥提纯，得到白色粉末状固体，为两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇(N3-PEG-s-s-NH2)，合成路线可 由以下化学方程式表示：
Figure BDA0002422657070000111
步骤三：将等摩尔的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，置于100mL圆底烧瓶中，在室温搅拌3小时。将叶酸溶于二甲基甲酰胺中，逐滴滴入上述混合溶液中。然后，将炔丙胺快速加入叶酸溶液中，避光室温搅拌24小时。反应结束后，溶液浓缩并在***中沉淀，离心收集沉淀，分别用去离子水、乙醇和丙酮离心洗三次。收集沉淀并真空干燥来提纯，得到炔基叶酸。
步骤四：将所述两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇与炔基叶酸按照摩尔比为1：2分别溶于二甲基亚砜形成溶液，之后冷冻除氧三次，在保护性气氛中将抗坏血酸钠以及五水硫酸铜快速加入到两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇与炔基叶酸的溶液中，保护性气氛中室温反应48小时。反应溶液旋蒸浓缩后在大量***中沉淀，离心收集，然后将沉淀溶解于水中，通过二氯甲烷分液萃取三次，收集并合并有机相，用饱和氯化钠溶液反复萃取洗涤三次，旋蒸除去溶剂，真空干燥来提纯，得到淡黄色粉末状固体，即为两端分别修饰为叶酸和双硫键的聚乙二醇(FA-PEG-s-s-NH2)，合成路线可由以下化学方程式表示：
Figure BDA0002422657070000121
步骤五：首先四氢呋喃通过钾和钠除水干燥。氩气气氛下，等摩尔量的萘和钠在干燥的四氢呋喃混合搅拌2小时。然后将甲氧基聚乙二醇溶解于干燥的四氢呋喃，加入上述萘溶液中。室温下搅拌1小时后，用注射器将溴乙酸乙酯加入反应中，并维持室温搅拌4小时。反应结束后，过滤去除残渣，减压浓缩，加入过量的***，得到白色沉淀，溶解在二氯甲烷中，再次沉淀在过量***中，反复三次，得到白色固体即为乙氧基聚乙二醇。
步骤六：将所得乙氧基聚乙二醇溶解在1mol/L的氢氧化钠中，室温下搅拌2小时。反应结束后溶解于二氯甲烷中，用去离子水分液洗涤三次，之后用无水硫酸镁干燥，并经***沉淀提纯，而后真空干燥得到白色固体，即为羧基聚乙二醇。
步骤七：首先，将所得羧基聚乙二醇溶解在二氯甲烷中，将N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺以及单叔丁氧羰基保护的胱胺依次加入至上述溶液中，氮气环境下室温反应12小时，其中单叔丁氧羰基保护的胱胺与羧基聚乙二醇的摩尔比为20：1。反应结束后，将溶液在大量***中沉淀，离心后用二氯甲烷溶解再用大量***沉淀，重复3次，真空干燥得到白色固体，即为端基为单叔丁氧羰基的聚乙二醇。将端基为单叔丁氧羰基的聚乙二醇溶解在二氯甲 烷中，再加入三氟乙酸，之后于室温反应2小时。其中，所述三氟乙酸与端基为单叔丁氧羰基的聚乙二醇的摩尔比为1500：1。反应结束后，将溶液在大量***中沉淀，离心后用二氯甲烷溶解再用大量***沉淀，重复3次，真空干燥得到白色固体，即为一端修饰双硫键的聚乙二醇(mPEG-s-s-NH2)，合成路线可由以下化学方程式表示：
Figure BDA0002422657070000131
步骤八：首先将二氧六环用钾和钠回流搅拌除水。五氟苯酚(PFP)和3，4-二羟基苯乙酸(DOPAC)溶解于无水二氧六环中。二环己基碳二亚胺溶解在无水二氧六环中，在剧烈搅拌下逐滴滴加入上述五氟苯酚溶液中，氮气氛围下室温搅拌12小时。所得溶液通过抽滤除去残渣，旋蒸浓缩溶液，粗产物通过硅胶柱提纯(正己烷：乙酸乙酯＝3：1作为洗脱剂)，减压除去溶液，而后真空干燥得到白色固体，即为1-甲基五氟苯酯-3,4-二羟基苯。然后将1-甲基 五氟苯酯-3,4-二羟基苯和油酸修饰的超小氧化铁纳米颗粒以质量比10：1混合在三氯甲烷中，加入N,N-二异丙基乙胺，氮气氛围下室温反应24小时。反应结束后，通过减压除去溶剂，加入二甲基亚砜(DMSO)，离心收集，并用二甲基亚砜洗涤三次，离心得到五氟苯酚酯修饰的超小氧化铁纳米颗粒。
步骤九：将质量比在1：2：8以上的表面修饰五氟苯酚酯的超小氧化铁纳米颗粒与mPEG-s-s-NH2和FA-PEG-s-s-NH2在三氯甲烷中混合，加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，之后在室温下反应12小时。其中，所述N,N-二异丙基乙胺与两端分别为双硫键和叶酸的聚乙二醇的摩尔比为100：1。反应结束后，浓缩溶液之后滴入大量***中，离心收集，溶解于去离子水中，通过用截留分子量35000的透析袋透析三天，冷冻干燥，获得表面通过双硫键连接带有叶酸的聚乙二醇的超小氧化铁纳米颗粒(ESIONPs-s-s-PEG-FA)，即目标产物还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂，其合成路线可由以下化学方程式表示(其中M为超小氧化铁纳米颗粒，下同)：
Figure BDA0002422657070000141
所述表面通过双硫键连接带有叶酸的聚乙二醇的超小氧化铁纳米颗粒可作为造影剂(如下亦称本发明造影剂)在医学领域应用。
上述步骤步骤二以及步骤九可通过以下化学方程式表示：
Figure BDA0002422657070000151
对照例1：该对照例与实施例1基本相同，但步骤4中以N3-PEG-NH2替代了其中的N3-PEG-s-s-NH2与炔基叶酸进行反应得到FA-PEG-NH2，随后步骤9中以FA-PEG-NH替代了其中的mPEG-s-s-NH2、FA-PEG-s-s-NH2，最终获得不含双硫键的产品(ESIONPs-PEG-FA)。
对照例2：该对照例与实施例1基本相同，但步骤4中未使用炔基叶酸，最终获得不含叶酸的样品(ESIONPs-s-s-mPEG)。
实施例2一种还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：该步骤与实施例1中的步骤一相似，只将胱胺二盐酸盐和干燥的三乙胺的摩尔比 调整为1：4，反应结束后加入的磷酸二氢钠溶液浓度调整为2mol/L。
步骤二：该步骤与实施例1中的步骤二相似，不同之处在于：将端基为叠氮和羧基的聚乙二醇溶解在二氯甲烷中，再将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳二亚胺(DCC)以及单叔丁氧羰基保护的胱胺依次加入至上述溶液中，在氮气环境下室温反应时间调整为24小时。
步骤三：该步骤与实施例1中的步骤三完全相似，不同之处在于：将等摩尔的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶解于二甲基甲酰胺中，反应时间调整为4小时。
步骤四：该步骤与实施例1中的步骤四相似，只将两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇与炔基叶酸摩尔比调整为1：1.5。
步骤五：该步骤与实施例1中的步骤五相似，只将在加入溴乙酸乙酯后的反应时间调整为3小时。
步骤六：该步骤与实施例1中的步骤六相似，只将乙氧基聚乙二醇溶解在2mol/L的氢氧化钠
步骤七：该步骤与实施例1中的步骤七相似，只是在羧基聚乙二醇与N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺以及单叔丁氧羰基保护的胱胺反应时，反应时间调整为24小时。并且将单叔丁氧羰基保护的胱胺与羧基聚乙二醇的摩尔比调整为15：1。
步骤八：该步骤与实施例1中的步骤八相似，只是将1-甲基五氟苯酯-3,4-二羟基苯和油酸修饰的超小氧化铁纳米颗粒的质量比调整为5：1。
步骤九：该步骤与实施例1中的步骤九完全相似，之后将反应时间调整为24小时。
实施例3一种还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：该步骤与实施例1中的步骤一相似，只将胱胺二盐酸盐和干燥的三乙胺的摩尔比调整为1：5，反应结束后加入的磷酸二氢钠溶液浓度调整为3mol/L。
步骤二：该步骤与实施例1中的步骤二相似，不同之处在于：将所得端基为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇溶解在二氯甲烷中，再加入三氟乙酸(TFA)，之后的反应时间调整为3小时。
步骤三：该步骤与实施例1中的步骤三相似，不同之处在于：将等摩尔的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶解于二甲基甲酰胺中，反应时间调整为5小时。
步骤四：该步骤与实施例1中的步骤四相似，不同之处在于在点击反应的时候，反应时间调整为72小时。
步骤五：该步骤与实施例1中的步骤五相似，只将在加入溴乙酸乙酯后的反应时间调整为5小时。
步骤六：该步骤与实施例1中的步骤六相似，只将乙氧基聚乙二醇溶解在3mol/L的氢氧 化钠
步骤七：该步骤与实施例1中的步骤七相似，不同之处在于将端基为单叔丁氧羰基的聚乙二醇溶解在二氯甲烷中，再加入三氟乙酸，之后于室温反应时间调整为3小时。其中，所述三氟乙酸与端基为单叔丁氧羰基的聚乙二醇的摩尔比调整为为2000：1。
步骤八：该步骤与实施例1中的步骤八相似，只是将1-甲基五氟苯酯-3,4-二羟基苯和油酸修饰的超小氧化铁纳米颗粒的质量比调整为8：1。
步骤九：该步骤与实施例1中的步骤九完全相似，只是将N,N-二异丙基乙胺与两端分别为双硫键和叶酸的聚乙二醇的摩尔比调整为为200：1。
下面，通过几种项目性能测试展示实施例1所获表面通过双硫键连接带有叶酸的聚乙二醇的超小氧化铁纳米颗粒(ESIONPs-s-s-PEG-FA)作为造影剂的应用优势。
性能测试一
在0.5T的MRI测试仪上测试本发明实施例1所获的造影剂产品与10mM二氯苏糖醇(DTT)孵育24小时之前和之后的纵向弛豫时间T1及T1加权成像，其操作方法包括：
分别配制铁浓度为0.17～0.68mmol/L(mmol/L可简写为mM)的上述两种样品，在0.5T的MRI测试仪上测试后，以铁离子浓度为横坐标，纵向弛豫时间的倒数为纵坐标进行线性拟合得到本发明的造影剂与DTT孵育前以及孵育后的纵向弛豫率分别为6.5857mM-1·s-1和1.3471mM-1·s-1(如图8a-图8b所示)，可见本发明的造影剂与DTT孵育后其纵向弛豫率降低。
通过两者在不同浓度下的T1加权成像可以看出，本发明实施例1所获造影剂的T1造影效果在DTT孵育之前明显亮于与孵育之后。
性能测试二
在0.5T的MRI测试仪上测试本发明实施例1所获造影剂与10mM二氯苏糖醇(DTT)孵育24小时之前和之后的横向弛豫时间T2及T2加权成像，其操作方法包括：
分别配制铁浓度为0.17～0.68mM的上述两种样品，在0.5T的MRI测试仪上测试后，以铁离子浓度为横坐标，横向弛豫时间的倒数为纵坐标进行线性拟合得到本发明的造影剂与DTT孵育前以及孵育后的横向弛豫率分别为10.059mM-1·s-1和33.7864mM-1·s-1(如图9a-图9b所示)，可见本发明的造影剂与DTT孵育后其横向弛豫率明显增高。孵育前的横向弛豫率和纵向弛豫率的比值为1.53，孵育后的横向弛豫率和纵向弛豫率的比值为25.06，通过比值变化可以看出，本实施例所获造影剂可在还原环境下响应并从T1型造影剂到T2型造影剂。
通过两者在不同浓度下的T2加权成像可以看出，实施例1所获造影剂的T2造影效果在DTT孵育之后明显暗于与孵育之前。
性能测试三
在0.5T的MRI测试仪上测试本发明实施例1所获造影剂与不含双硫键的对照组在10mM二氯苏糖醇(DTT)孵育下不同时间下的横向弛豫时间(T1)的变化图，其操作方法包括：
将本实施例所获造影剂以及不含双硫键的对照组用10mM DTT的PBS溶液配置成铁浓度为0.35mM的溶液。置于37℃恒温箱中，分别在反应30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟以及180分钟的时间点用0.5T脉冲核磁共振成像仪测量横向弛豫时间T2，观察数值随时间的变化(如图10所示)。
随着DTT处理时间的延长，横向弛豫时间逐渐降低，到约120分钟后，弛豫时间逐渐从207.15s下降到58.5s左右并趋于稳定。这表明所制备的表面通过双硫键连接带有叶酸的聚乙二醇的超小氧化铁纳米颗粒在DTT的作用下横向弛豫时间可以显著增加。不含双硫键的对照组在DTT作用下没有明显变化，说明双硫键是影响其变化的因素。横向弛豫时间的变化是由于在DTT作用下本实施例1所获得造影剂的双硫键发生断裂，亲水链聚乙二醇从超小氧化铁纳米颗粒表面脱离，发生聚集，增加了磁场的不均匀性，从而导致横向弛豫时间增加。
性能测试四本发明实施例1所获造影剂所获造影剂对正常非癌细胞以及癌细胞(KB)毒性检测，其操作方法包括：
用四唑盐比色法(WST法)来测定本实施例所获造影剂在人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)和人口腔表皮样癌细胞(KB)中的细胞毒性。
在96孔板中以每孔5000～8000细胞的密度种入HUVEC细胞或KB细胞100μL，将96孔板置于CO2培养箱中，在37℃中培养24h。将本发明造影剂溶于完全培养基中，过滤除菌；再用完全培养基(没有加入造影剂的培养基)将本发明造影剂稀释成若干组浓度为0.05～2mM不等的培养基。
将96孔板中的旧培养基吸出，然后再将不同浓度的培养基加入到96孔板中，每孔加100μL，对照组加入100μL完全培养基，继续培养24h。最后移出所有培养基，每孔加入100μL新鲜完全培养基，然后每孔加入10μL WST-1(是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲臜。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。中英文全称为2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium,monosodium salt，2-(4-碘代苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2,4二硫代苯)-2H-四唑盐单钠盐)，置于培养箱中培养2h，用酶标仪测定450nm处的吸收值OD450nm。每个造影剂浓度(称为实验组)及对照组做4个平行样。根据吸光值计算细胞的相对存活率。空白组即不加细胞的完全培养基，对照组即不加培养基的细胞。
细胞相对存活率(％)＝100×(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)
如图11所示，即使钆浓度达到2mM，ESIONPs-s-s-PEG-FA组对HUVEC细胞和KB细胞的细胞存活率仍然在100％左右说明所制备的还原响应型T1/T2切换型造影剂ESIONPs-s-s-PEG-FA对正常细胞几乎没有毒性，具有良好的生物相容性。
性能测试五本发明实施例1所获造影剂的组织毒理检测，其操作方法包括：
用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，H&E染色法)来测定本实施例所获 造影剂在正常无胸腺裸鼠体内的组织毒性。
四周龄正常无胸腺裸鼠被分为两组：
第一组尾静脉注射生理盐水作为对照组；
第二组尾静脉注射含有本实施例所获造影剂的生理盐水溶液，其中铁离子浓度为0.1mM/kg；
正常条件下饲养2天后颈脱位处死，收集心、肝、脾、肺、肾进行H&E切片染色，并用显微镜拍照观察。
如图12所示，本实施例1所获造影剂对各个脏器组织的损伤较小，高浓度样本无明显提升。具体来看，肝脏切片中的肝细胞比较正常，并没有任何炎症反应的迹象。在肺部切片中也观察不到肺纤维化。所有其他的切片样本也未观察到任何的组织坏死的情况。表明，本发明所述的造影剂对重要脏器无明显的病理改变或损伤，提示这种造影剂具有非常好的生物相容性、安全性。
性能测试六本发明实施例1所获造影剂和无叶酸对照组与人口腔表皮样癌细胞(KB)孵育三小时后的细胞T1磁共振成像图，其操作方法包括：
用7ml培养基将KB细胞或HUVEC细胞接种到培养皿中。在达到80％的量后，分别加入含铁浓度为0.1mM的ESIONPs-s-s-PEG-FA和不含叶酸的样品(ESIONPs-s-s-mPEG)的新鲜培养基。孵育3小时后，取出培养基，用2ml PBS轻洗6次。利用胰蛋白酶消化KB细胞或HUVEC细胞并离心获得细胞，放在200μL埃普多夫管通过测量获得T1加权图像。如图13，本实施例1所获造影剂组对比空白组和不含叶酸的样品组其T1加权图像明显变亮，说明所获造影剂具有靶向效果。
性能测试七本发明实施例1所获造影剂和无叶酸对照组与人口腔表皮样癌细胞(KB)孵育三小时后的细胞T2磁共振成像图，其操作方法包括：
用7ml培养基将KB细胞或HUVEC细胞接种到培养皿中。在达到80％的量后，分别加入含铁浓度为0.1mM的ESIONPs-s-s-PEG-FA和不含双硫键的样品(ESIONPs-s-s-mPEG)的新鲜培养基。孵育24小时后，取出培养基，用2ml PBS轻洗6次。利用胰蛋白酶消化KB细胞或HUVEC细胞并离心获得细胞，放在200μL埃普多夫管通过测量获得T2加权图像。如图14，本实施例1所获造影剂组对比不含双硫键的样品组其T2加权图像明显变暗，说明所获造影剂可以在肿瘤细胞内还原响应，并显示出T2造影效果。
性能测试八本发明实施例1所获造影剂的体内MRI成像实验，其操作方法包括：
构建荷人口腔表皮样癌细胞(KB)裸鼠模型并分为三组：分别为实验组(ESIONPs-s-s-PEG-FA)、不含叶酸组(ESIONPs-s-s-mPEG)和不含双硫键组(ESIONPs-PEG-FA)。首先，通过腹腔注射20％的乌拉坦溶液，剂量为5mL/kg体重。待三组老鼠都进入深度麻醉后，进行未注射造影剂前的空白扫描。然后，实验组通过尾静脉注射 ESIONPs-s-s-PEG-FA，不含叶酸组通过尾静脉注射ESIONPs-s-s-mPEG，不含双硫键组通过尾静脉注射ESIONPs-PEG-FA，三组的铁离子剂量都是0.1mmol/kg体重。然后将裸鼠固定好，置于1.5T的微型磁共振成像仪器内，在注射后24小时后拍摄T2加权磁共振图像。
如图15所示，在以0.1mmol/kg的注射量由尾静脉将三组造影剂注入裸鼠体内以后，三组呈现出了明显不同的成像增强效果。为了使三组MRI扫描所得的图片有相互对比性，序列参数统一设置为TE＝60.86ms以及TR＝3000ms。在实验组中，肿瘤部位图像更暗，T2磁共振信号明显增强，肿瘤组织与周围组织的对比度更大。而无叶酸对照组以及无双硫键对照组肿瘤部位图像略亮。实验组的磁共振效果优于非靶向组和对照组的效果，表明本实施例所述的表面通过双硫键连接带有叶酸的聚乙二醇的超小氧化铁纳米颗粒具有肿瘤靶向性和还原响应性，可选择性地在肿瘤部位激活T2 MRI信号，由T1造影剂切换为T2造影剂，提高肿瘤检测的特异性和选择性。
综上所述，本发明所提供的还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂对肿瘤部位的特异性和选择性高，生物相容性良好，毒性低，同时可从快速体内代谢，具有肿瘤靶向性，可选择性地在肿瘤部位激活T2 MRI信号，由T1造影剂切换为T2造影剂，提高肿瘤检测的特异性和选择性，从而具有优异的成像对比性能，能够避免1背景信号的干扰，为肿瘤磁共振成像提供高灵敏度和肿瘤靶向特异性。
此外，本案发明人还利用前文所列出的其它原料以及其它工艺条件等替代实施例1-3中的各种原料及相应工艺条件进行了相应试验，所获磁共振成像造影剂的生物相容性、安全性、弛豫率、成像对比性能亦较为理想。
应当指出，以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (14)

1.一种还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂，其特征在于，它具有下列结构式：
Figure FDA0003515075830000011
其中，M为粒径小于5nm的三氧化二铁纳米颗粒，X为H或靶向分子，n为50～150。
2.如权利要求1所述的还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂，其特征在于：所述靶向分子的来源为叶酸。
3.一种还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂的制备方法，其特征在于，包括：
至少使端基为叠氮和羧基的聚乙二醇与单叔丁氧羰基保护的胱胺、二环己基碳二亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺反应，形成端基为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇；
至少使所述端基为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇与酸类脱保护试剂反应，形成两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇；
至少使将所述两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇与靶向分子的前驱体和一价铜类催化剂反应，形成两端分别修饰为靶向分子和双硫键的聚乙二醇；
至少使羧基聚乙二醇与单叔丁氧羰基保护的胱胺、二环己基碳二亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺反应，形成端基为甲氧基和叔丁氧羰基的聚乙二醇；
至少使所述端基为甲氧基和单叔丁氧羰基的聚乙二醇与三氟乙酸反应，形成一端修饰为双硫键的聚乙二醇；
将所述两端分别修饰为靶向分子和双硫键的聚乙二醇、所述一端修饰为双硫键的聚乙二醇与表面修饰羧基活化酯的超小氧化铁纳米颗粒反应，使所述超小氧化铁纳米颗粒表面通过双硫键连接带有靶向分子的聚乙二醇，所述超小氧化铁纳米颗粒的粒径小于5nm。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具体包括：将端基为叠氮和羧基的聚乙二醇溶解在三氯甲烷中，再依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺以及单叔丁氧羰基保护的胱胺，在保护性气氛下室温反应12～24小时得到端基为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇，其中单叔丁氧羰基保护的胱胺的用量大于端基为叠氮和羧基的聚乙二醇；所述单叔丁氧羰基保护的胱胺与端基为叠氮和羧基的聚乙二醇的摩尔比大于10∶1。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具体包括：将端基为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇溶解在二氯甲烷中，再加入三氟乙酸，之后于室温反应2～3小时，得到两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇；所述三氟乙酸与两端分别修饰为叠氮和单叔丁氧羰基的聚乙二醇的摩尔比大于1000∶1。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具体包括：采用炔基叶酸作为靶向分子的前驱体，将所述两端分别修饰为叠氮和双硫键的聚乙二醇与炔基叶酸按照摩尔比为1∶1.5～2溶于二甲基甲酰胺形成溶液，之后冷冻除氧，再在保护性气氛中快速加入抗坏血酸钠以及五水硫酸铜，且室温反应48～72小时，得到两端分别修饰为叶酸和双硫键的聚乙二醇。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具体包括：将羧基聚乙二醇溶解在二氯甲烷中，再依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺以及单叔丁氧羰基保护的胱胺，并在保护性气氛下室温反应12～24小时，得到端基为单叔丁氧羰基的聚乙二醇，其中单叔丁氧羰基保护的胱胺的用量大于羧基聚乙二醇；所述单叔丁氧羰基保护的胱胺与羧基聚乙二醇的摩尔比大于10∶1。
8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具体包括：将端基为单叔丁氧羰基的聚乙二醇溶解在二氯甲烷中，再加入三氟乙酸，之后于室温反应2～3小时，得到一端为双硫键的聚乙二醇；所述三氟乙酸与端基为单叔丁氧羰基的聚乙二醇的摩尔比大于1000∶1。
9.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具体包括：将表面修饰五氟苯酚酯的超小氧化铁纳米颗粒与所述两端分别为双硫键和靶向分子的聚乙二醇以及所述一端为双硫键的聚乙二醇在三氯甲烷中混合，再加入N，N-二异丙基乙胺，并在室温下反应12～24小时，获得表面通过双硫键连接带有靶向分子的聚乙二醇的超小氧化铁纳米颗粒；其中，所述表面修饰五氟苯酚酯的超小氧化铁纳米颗粒、所述两端分别为双硫键和靶向分子的聚乙二醇与所述一端为双硫键的聚乙二醇的质量比在1∶2∶8以上，所述N，N-二异丙基乙胺与所述两端分别为双硫键和靶向分子的聚乙二醇的摩尔比为100～200∶1。
10.如权利要求1或2所述的还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂于制备具有肿瘤检测功能的产品中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述产品中Fe3+浓度为30～50mmol/L。
12.一种造影用组合物，其特征在于，包括：权利要求1或2所述的还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂；以及，药学上可接受的辅剂。
13.根据权利要求12所述的造影用组合物，其特征在于：所述药学上可接受的辅剂包括稀释剂。
14.一种药用组合物，其特征在于，包括：权利要求1或2所述的还原响应的T1/T2切换型MRI造影剂，药物以及药学上可接受的载体。
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