CN111298104A - 艾塞那肽注射液在治疗和预防***药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种艾塞那肽注射液在治疗和预防***药物中的应用，该艾塞那肽注射液的用量为10 ug/kg/d~200 mg/kg/d，用药时间为7~28 d。本发明艾塞那肽能够改善IUA小鼠***程度，减少胶原纤维沉积，并能促进腺体的恢复；另外，通过下调与粘连相关及炎症相关基因（TGF‑β1、α‑SMA及MMP‑9）的表达水平，从而抑制IUA小鼠体内粘连因子及炎症因子的表达，显著改善IUA小鼠***程度，促进内膜修复和腺体再生的功能，有望用于治疗和预防***。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及艾塞那肽注射液在治疗和预防***药物中的应用。
背景技术
***也称Asherman综合征(AS)。1894年，Fritisch进行了首次描述。1950年Asherman总结29个***病例，对***的频率、病因和症状进一步作出详细的报道。***常发生在创伤、感染后，尤以产损伤后***水平低为甚。其实质是子宫内膜基底层受损后引起的子宫内膜纤维化疾病。***的主要并发症为***、月经不规律(月经过少或闭经)、周期性盆腔痛、妊娠失败、此外，***可能会阻止胚泡植入，损害子宫和早期胎儿的血液供应，从而导致Asherman综合征患者的***或反复流产。据2018年的一项报道表明，***的患病率为4.6%，其中月经过少占46.3%，继发性***症占70.7%；人工流产史、***史、产后出血史分别占56.1%、51.2%和31.7%；根据分类，轻度***的患病率为34.1%，中度为41.5%，重度为24.4%。
***的发生、发展、预后是一个复杂而多变的过程，并不是由单一因素控制，而是由多基因多因素的综合参与，其中纤维化的形成和炎症的产生发展是***的主要病理因素。TGF-β（转化生长因子-β）是重要的促纤维化因子之一，不仅在肝脏纤维化、肺脏纤维化、心脏纤维化等器官组织纤维化中发挥着重要作用，许多实验证实TGF-β通过调节下游基因的表达，也参与***的形成。
另外有研究发现，在肺纤维化动物模型以及人类特发性肺纤维化中, 纤维化肺组织局部不仅TGF-β1水平升高, 而且还聚集了大量表达平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)的肌成纤维细胞。炎症细胞分泌高水平的TGF-β1，TGF-β1一方面抑制成纤维细胞的增殖, 使其停留在细胞间期的某一时相, 加速α-SMA m RNA和蛋白的合成, 进而分化成肌成纤维细胞；另一方面又抑制肌成纤维细胞的凋亡。
成纤维细胞产生胶原蛋白、金属蛋白酶（MMP）及其组织抑制剂（TIMP），其中促炎因子MMP-9（基质金属蛋白酶9）的缺乏可改善伤口愈合，皮肤伤口的特征是MMP-9过度增加和TIMP 1活性降低，即MMP-9 / TIMP-1比值异常升高。有研究发现，体外用exendin-4预处理的大鼠的成纤维细胞/成肌纤维细胞集落来源的培养基中，MMP-9 / TIMP-1比值显着降低（P <0.001）。
艾塞那肽(exenatide)为胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物exendin-4的人工合成品，由39个氨基酸组成。其主要用于改善2型糖尿病患者的血糖控制，适用于单用二甲双胍、磺酰脲类．以及二甲双胍合用磺酰脲类，血糖仍控制不佳的患者。同时，艾塞那肽除了在代谢疾病中有作用外，大量实验证明艾塞那肽在抗纤维化方面也有很好的疗效，但目前尚未发现艾塞那肽在治疗***方面的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种艾塞那肽注射液在治疗和预防***药物中的应用。
为解决上述问题，本发明所述的艾塞那肽注射液在治疗和预防***药物中的应用，其特征在于：该艾塞那肽注射液的用量为10 ug/kg/d~200 mg/kg/d，用药时间为7~28d。
所述艾塞那肽注射液的用量为50 ug/kg/d，用药时间为14 d。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明通过机械损伤加脂多糖（LPS）炎症双重作用刺激建立***小鼠模型。并按照分组给予不用剂量艾塞那肽进行干预。研究发现：艾塞那肽能够改善IUA小鼠***程度，减少胶原纤维沉积（P＜0.05），并能促进腺体的恢复；另外，通过下调与粘连相关及炎症相关基因（TGF-β1、α-SMA及MMP-9）的表达水平，从而抑制IUA小鼠体内粘连因子及炎症因子的表达，显著改善IUA小鼠***程度，促进内膜修复和腺体再生的功能，有望用于治疗和预防***。
下述所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
⑴实验动物的购买与饲养：
本动物实验严格遵守兰州大学动物实验中心操作规范。54只C57BL/6雌性小鼠，8W大小，16~18g/只，购于北京维通利华实验动物中心，饲养于兰州大学医学院动物实验室，温度控制在22±2℃内，湿度为70%，光周期为12h的环境下饲养，整个实验过程小鼠自由饮食、饮水。
⑵实验所需试剂及仪器，如表1、表2：
表1 实验所需试剂
表2 实验所需仪器
相关溶液的配制：
ⅰ6mg/L脂多糖溶液的配制：
称取0.6mg脂多糖，溶于10mL的生理盐水中，即配成浓度为60mg/L的脂多糖溶液，取出2mL 60mg/L的脂多糖溶液稀释10倍，即配成该实验所需6mg/L的脂多糖溶液。
ⅱ艾塞那肽溶液的配制：
艾塞那肽50ug/kg高剂量组小鼠6只，每只按照30g计算给药量，给药剂量为20ug/kg，总计每日给药量为：0.03kg×50ug/kg×6=9mg；
艾塞那肽10ug/kg中剂量组小鼠6只，每只按照30g计算给药量，给药剂量为10ug/kg，总计每日给药量为：0.03kg×10ug/kg×6= 1.8mg；
艾塞那肽2ug/kg低剂量组小鼠6只，每只按照30g计算给药量，给药剂量为5ug/kg，总计每日给药量为：0.03kg×2ug/kg×6=0.36mg；
因此，高中低剂量3组小鼠每日给药总量为：
9mg+1.8mg+0.36mg=11.16mg。
有研究证实，兔IUA建模型后7天，见子宫内膜表面完全由上皮细胞排列，再生细胞扁平化（60%~70%）、立方形或低柱状。可见少数腺体，基质突出显示更多纤维组织，胶原蛋白聚集，局灶性出血、充血、白细胞浸润，可见一些新生的毛细血管。14天内子宫基质显示有少量多形核白细胞和含铁血黄素的巨噬细胞浸润，表现出间质纤维化和胶原蛋白聚集；28天后子宫内膜的组织学重建在基本完成，可在少数间质区域观察到纤维化【YANG W, LAI X,WEIMIN D, et al. exenatide Restores Endothelium-Dependent Relaxation in RatAorta Rings Impaired by High Glucose: A Novel Insight into the PPARβ-NOSignaling Pathway [J]. Plos One, 2015, 10(5): e0126249】。因此，本实验将小鼠的给药周期定为14天，每日给药1次，总共给药14次，因此整个给药过程中总药量为：11.16mg×14=156.24mg，为了避免药物配制过程中的损耗，因此称取药物160mg。将称取的160mg药物溶解于二甲基亚砜（DMSO）中（原则上DMSO的量不超过药物总体积的1%），待药物完全溶解于DMSO中，再用灭菌后的ddH2O将溶解后的药物按照实验所需，稀释成三种给药浓度，最后将各浓度药物分装到已灭菌好的EP管中，封口、打标，并置于-20℃保存备用。
⑶动物分组及给药方案：
36只19周大的C57BL/6雌性小鼠分组如表3：
表3
低、中、高剂量组于***术后第一天始，皮下注射艾塞那肽每日一次；模型组于***术后第一天始，皮下注射ddH2O每日一次；正常组及假手术组正常饲养，不予任何特殊处理。给药过程中每日观察小鼠生命体征的变化，称量体重并记录，给药周期2周，后取材进行后续实验。
⑷小鼠造模：
选取检疫合格的C57BL/6小鼠36只，雌性，随机分为6组，经过一周环境平衡体重约17~19g，为了使每只小鼠处于同一发情期，术前36h每只小鼠腹腔注射孕马血清***20IU。各项术前准备完成后在动物实验中心进行手术，拟行机械+感染联合造模方法（文献报道【YANG W, LAI X, WEIMIN D, et al. exenatide Restores Endothelium-DependentRelaxation in Rat Aorta Rings Impaired by High Glucose: A Novel Insight intothe PPARβ-NO Signaling Pathway [J]. Plos One, 2015, 10(5): e0126249】及前期预实验已经证明该建模方法成功）。每只小鼠腹腔注射戊巴比妥钠溶液（30ug/kg），剃去小鼠腹部毛发，3~5分钟后小鼠麻醉成功，固定其四肢置手术台，逐层打开模型小鼠腹腔，在膀胱后方找出子宫，观察双侧子宫形态，排除异常子宫的小鼠（如子宫畸形、子宫水肿等）。分别于两侧子宫下方1/3处剪开约0.2cm大小的切口，将子宫刮勺伸进整个宫腔内，相同力度顺时针方向搔刮子宫壁3~4次，刮置子宫壁由平滑转为粗糙，即***完毕。后用预处理（术前48h）的脂多糖（LPS）2-0手术缝合线放置于宫腔内，两端线头打结置于腹壁外（待48h后缓慢抽出缝合线）。为了预防感染，腹腔滴注100μL双抗，3-0手术线逐层缝合腹膜、皮下组织、皮肤，术中顺利，手术完毕（如图1所示）。于术后第二天开始，对模型小鼠给于各浓度艾塞那肽的药物干预，给药周期（14d）结束后收集小鼠双侧子宫，进行下一步生物实验。
⑸小鼠子宫组织石蜡切片、苏木精-伊红染色（H&E）、Masson染色、免疫组化染色：
ⅰ.小鼠子宫组织石蜡切片制备：①子宫组织固定：剔除子宫周围脂肪及其他组织，取子宫组织约5mm，置于4%多聚甲醛溶液中室温过夜；②子宫组织脱水：将子宫组织分别置于50%酒精脱水1.5h、70%酒精脱水1.5h、85%酒精脱水1.5h、95%酒精脱水1.5h，100%酒精脱水1h，100%酒精脱水1h；③子宫组织透明：将酒精溶液与二甲苯溶液相同体积充分混匀，将子宫组织置于该混合液中1h，再置于二甲苯溶液中1h，最后再放置于新的二甲苯溶液中作用1h；④渗透：将二甲苯溶液与石蜡溶液相同体积充分混匀后，放置子宫组织于该混合液中作用1.5h，再置于62℃石蜡中2h，最后再换置新的62℃石蜡中2h；⑤包埋：在模具中盛满热的石蜡溶液，再将子宫组织横切面置入液体石蜡的中央，将组织固定好后，置于冷却台上冷却；⑥切片、捞片、烤片：先用切片机修片，修好之后，再切成厚度为5μm的石蜡切片；烤片机烤片；最后置于60℃烘箱中烘5h。
ⅱ.小鼠子宫组织H&E染色：
按表4配制H&E染色液：
表4 H&E染色液配方
染色方法：①将白片逐片***染色架中置于60℃烘箱烘1h；② 脱蜡：将此染色架按照脱蜡步骤逐步放入含有不同实验试剂的染色缸中逐步进行脱蜡，放入二甲苯I中，时长为20min→二甲苯II（与二甲苯I的浓度与体积相同）中，时长为20min→无水乙醇I，时长为15min→无水乙醇II（与无水乙醇I的浓度与体积相同），时长为15min→浓度为95%乙醇中，时长为10min→浓度为90%乙醇中，时长为5min→浓度为80%乙醇中，时长为5min→放入自来水中缓慢冲洗，时长为5min；③ 染色：首先将此染色架放入添加了苏木试剂的染色缸里面，浸泡7~8min，放入含有自来水的染色缸中数秒，后置于盐酸乙醇溶液中进行分化，时长为2s，放入自来水染色缸中并用自来水进行返蓝处理，时长为5min→置于添加了伊红试剂的染色缸中，浸泡25~30s，用水冲洗，时长为10s；④ 脱水：把上述染色架按脱水步骤依次放入含不同试剂的染色缸中逐步进行脱水，首先放入浓度为75%的乙醇中，时长2 s→放入浓度为85%的乙醇中，时长为2 s→放入浓度为95%的乙醇中，时长为2 s→放入无水乙醇中，时长为2 s→放入二甲苯I中，时长为2min→放入二甲苯II中（与二甲苯I的浓度与体积相同），时长为 2min；⑤将上述染色架置于通风橱内，进行风干处理；⑥ 封片：将染片逐片取出，平放，将适量中性树脂滴加在其上，上面缓慢覆盖上盖玻片，防止有气泡出现；⑦ 风干、照相；
ⅲ小鼠子宫组织Masson染色：
按表5配制Masson染色液：
表5 Masson染色液配方
染色步骤：① 将石蜡切片逐片放置在染色架上，置于烘箱中烘60 min，将其置于装有Bouin液的染色缸内浸泡（室温，过夜），于第二天使用自来水流水进行冲洗（避免水流过大冲走载玻片上的组织），一直到切片上不再存有黄色染液；② 把染色架放在装有天青石的染色缸里面浸泡，时长为2~3min，用水稍作冲洗；③ 然后将其置于装有Mayer苏木素溶液的染色缸里进行染色，时长为2~3min，放入自来水染色缸内稍作冲洗；④将染色架置于含酸性乙醇分化溶液的染色缸内进行分化，时长为2 s，后放入装有自来水的染色缸中并用自来水流进行缓慢冲洗（避免水流过大冲走载玻片上的组织），时长为10 min；⑤将其放在装有丽春红的染色缸里面浸泡10 min，后放入蒸馏水染色缸中进行数次冲洗；⑥再将其置于磷钼酸试剂染色缸内进行处理，时长约为10 min； ⑦ 将玻片的上液甩去后，将其置于苯胺蓝染色缸里浸泡，时长为5 min；⑧ 再放入弱酸溶液染色缸中，时长为2 min；⑨ 将其放入浓度为95%的乙醇溶液染色缸里，进行快速脱水，再分别置于无水乙醇染色缸中进行3次脱水，每次时长均为5~10s；⑩ 将其放入装有二甲苯溶液的染色缸中浸泡三次，每次时长为1~2min，将染片取出，平放晾干，将适量的中性树脂滴加在切片组织上，上面缓慢覆盖上盖玻片，防止有气泡出现；⑦ 风干、照相。
ⅳ子宫组织免疫组化染色：
①烘片、脱蜡：将石蜡切片逐片放置在染色架上，烘片、脱蜡同H&E染色；②脱蜡后取出带有切片的染色架，置于ddH2O的烧杯中浸泡5min；③修复：将切片固定于切片架上，放入柠檬酸缓冲液（0.4g柠檬酸+3.0g柠檬酸钠+ddH2O定容至1L，用4mg/L的NaOH，调至pH=6.0）烧杯中，柠檬酸缓冲液约占烧杯体积2/3，烧杯需用锡纸避光包裹，高温高压15min（可提前加热以节省时间），即刻降压后，取出烧杯晾至室温（可取掉锡纸）；④用3%H2O2常温浸泡10min（可阻断内源性过氧化物酶活性），1×PBS洗（置于摇床上）3次，每次5min；⑤封闭：将切片逐片放置在湿盒内用冰的1%BSA（每个组织滴加30ul）室温孵育1h，孵育完毕后，逐片用纸巾擦干组织周围多余液体；⑥孵育一抗：用1%BSA冰上稀释一抗（TGF-β1:1%BSA=1:500;α-SMA:1%BSA=1:200; MMP-9:1%BSA=1:500），每个组织滴加一抗30uL，置于4℃冰箱过夜；⑦复温：将湿盒从冰箱取出，室温放置1h；⑧孵育二抗：1×PBS洗切片2次，每次约3min，轻甩切片并用纸巾小心擦干子宫组织周围液体，滴加稀释好的二抗（二抗山羊抗兔：1%BSA=1:200），每个组织滴加二抗30uL，37℃湿盒孵育1h。将切片固定于切片架上，1×PBS清洗2次，每次3min；⑨DAB显色：冰上、避光配制DAB显色液（缓冲液：A液：B液=1000:50:50），每个组织滴加30ulDAB显色液，使其完全覆盖组织，显微镜下确定组织显色程度，所有组织显色时间均为10s（若左右两片组织一抗不同，在观察一个的显色程度时，对另一个组织滴加ddH2O进行保护）；显色完成后置于苏木素染缸中25s（苏木素可将细胞核和细胞内的核糖染成蓝紫色）、自来水冲洗5min、1%盐酸分化2s、自来水冲洗5min；⑩脱水、封片：操作同H&E染色所述。
⑹小鼠子宫组织总RNA的提取及Real time PCR
ⅰ.提取小鼠子宫组织总RNA：①将小鼠子宫组织从-80℃冰箱中迅速取出置于冰上，剪取约3mm长的子宫组织用PBS清洗两次，用滤纸吸干组织表面水份，锡纸称量，分装标记后立即置入无酶研磨无酶EP管中（本实验中所有用于PCR实验的EP管、离心管均用DEPC水处理过），并取1大2小研磨钢珠于管中，然后每个样品中加入1mL Trizol，预冷研磨底盘（-20℃），将组织置入Servicebio研磨仪中，盖紧盖子，研磨，70Hz，90s。用移液枪充分吹打混匀（暂时不用可保存在-80℃冰箱内）；②每管再加入200μL氯仿，震荡1min后，室温下静置孵育3分钟，4℃离心机离心（转速12000rpm×15min），离心后样品分为三层，底层粉色为有机层，上层为无色水相层及中间层，RNA主要集中在无色水相层内，移液器缓慢吸取无色水相层，该层约为Trizol体积的50%，在吸取无色水相层的同时应遵循避免吸到下面的有机层污染RNA的原则；③将吸取的水相层转移至已标记过的新的无酶EP管中，并加入与无色水相层相同体积的异丙醇后充分混匀，室温静置孵育10min，4℃离心机离心（转速12000rpm×10min）后，可在管壁或管底看到白色絮状沉淀，弃去上清，每管加入1mL 75%酒精（DEPC水：无水酒精=1:3），再用涡旋机剧烈震荡涡旋，洗涤白色沉淀，4℃离心机离心（转速12000rpm×5min）后，打开EP管盖，弃去上清，残余液体置于室温下蒸发晾干，最后加入20μL RNase-freeH2O完全溶解沉淀，用于后续制备cDNA。
ⅱ.RNA逆转录制备cDNA:①将提取的RNA用Nanodrop 2000分光光度计测量浓度及吸光度值，为确保RNA的纯度应保证A260/A280在1.80~2.00之间；②将测量后的RNA用RNase-free ddH2O调至同一浓度，用于后续使用；③使用TIANGEN公司的FastKing RT Kit(With gDNA)：50ng~2μg总RNA可建立20μL反应体系。冰上解冻模板RNA，室温下解冻5×gDNABuffer、FQ-RT Primer Mix、10×King RT Buffer、RNase-Free ddH2O解冻后迅速放置于冰上，使用前应注意将每种溶液涡旋器震荡混匀，减少实验过程中的误差，简短离心，收集贴附于管壁的液体。以下实验步骤均应该在冰上操作进行，为了准确地配制反应液，应先将各液体配制成Mix，混匀后再以相同体积分装到每个反应管中；④以下步骤及表6配比方案配制混合液的目的是为了去除基因组DNA，充分混匀、离心后置于梯度PCR仪42℃、孵育3min，然后置于冰上：
表6 gDNA去除反应体系
⑤充分混匀后置于冰上，按照表7配制反转录体系混合液2(10μL)：
表7 反转录体系
⑥将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，每管10μL，充分混匀后，在梯度PCR仪中42℃孵育15min；⑦在梯度PCR仪中95℃孵育3min后放于冰上，转录好的cDNA用于后续实验，或-40℃保存备用。
ⅲ. Real Time PCR：建立Real-Time PCR反应体系：溶解2×SuperReal PreMixPlus、50×ROX Reference Dye、模板、引物及RNase-free ddH2O，将所有试剂在室温下平衡并充分混匀；后在冰上进行Real-Time PCR反应体系的配制，注意将2×SuperReal PreMixPlus和50×ROX Reference Dye避光保存。
表8 20μl反应体系的配制
在暗室中配制好表8体系后，盖上反应管，轻柔混匀。离心机短暂离心，使所有成分均离心于反应管管底；将反应体系按照加样顺序放于Aglient Mx3000P荧光定量PCR仪中进行反应。利用三步法反应法：①预变性：95℃，15min，1个循环数（必须设定此温度及此时间，用以充分激活热启动酶）；②PCR反应：95℃，10s（变性），55℃ 20秒（退火），72℃ 20秒（延伸），共40个循环数。所用引物序列（上海生工）见表9。
表9 引物序列
⑺ 统计分析：
本实验所有数据运用Excel2010，SPSS22.0，Graphpad Prism6.0，Image-pro Plus6.0，软件进行统计分析，结果均以平均值±标准差的形式。采用t检验进行组内比较，P<0.05认为数据间具有统计学差异；P<0.01认为数据间统计学差异显著。
⑻实验结果：
①艾塞那肽对***小鼠体重及内膜腺体数影响：
ⅰ大体标本观察：
给药（14天）周期结束后，脱颈处死小鼠。解剖见正常组小鼠子宫表面红润、粗细均匀、弹性好、表面光滑、与周围组织无粘连易分离。IUA模型组小鼠子宫表面苍白、水肿明显、***、弹性较差、宫腔狭窄、甚至闭锁、子宫与周围组织粘连较重分离困难。IUA模型+给药组小鼠，子宫表面色泽略浅，部分宫腔水肿，弹性差、与周围组织轻度粘连。
ⅱ艾塞那肽对***小鼠体重增量的影响：
比较各组之间体重的增长量（见表10），即从建模的第一天到艾塞那肽治疗结束，第一天体重标记为第0天，隔日称量体重并记录至第14天治疗结束后。对照组：1.443±0.3156；假手术组：1.290±0.3968；模型组：1.300±0.2301；艾塞那肽低剂量组（2ug/kg）：1.135±0.2420；艾塞那肽中剂量组（10ug/kg）：1.868±0.2912；艾塞那肽高剂量组（50ug/kg）：1.608±0.1535；6组数据之间并未见统计学差异（P＞0.05）。
表10 艾塞那肽对各组小鼠体重的影响
ⅲ H&E染色观察子宫内膜：
H&E染色40倍和200倍，镜下观察子宫组织内膜形态（见图2）。正常组：小鼠子宫内膜层、肌层及浆膜层完整；内膜组织可见排列整齐的单层柱状上皮，间质均一无水肿，腺体分布均匀；***排列紧密成卵圆状，核深染。IUA模型组：小鼠子宫内膜厚度变薄，皱襞减少，部分管腔变小甚至消失；腺体数量明显减少，腺体分布不均；偶见白细胞浸润，间质水肿明显。艾塞那肽低剂量组（2ug/kg）：内膜组织较完整，内膜变薄；间质水肿，腺体分布不均。艾塞那肽中剂量组（10ug/kg）：子宫内膜组织完整，内膜较正常组薄，间质水肿减轻，管腔正常，可见皱襞及凹陷，腺体数目增加。艾塞那肽高剂量组（50ug/kg）：子宫内膜较正常组薄，上皮组织较完整，呈单层柱状上皮，间质水肿较轻，管腔正常，可见皱襞及凹陷，腺体数明显增多。
ⅳ艾塞那肽对***小鼠内膜腺体数的影响：
在显微镜高倍镜下观察组织切片，按照每个切片从左到右从上至下的顺序，观察子宫内膜腺体并计数，每张片子重复计数3次，求平均值。结果发现：比较各组之间子宫内膜腺体计数（见表11）。对照组：14.67±1.043；假手术组：17.33±0.7454；模型组：8.000±1.193；艾塞那肽低剂量组（2ug/kg）：15.00±5.321；艾塞那肽中剂量组（10ug/kg）：13.89±4.418；艾塞那肽高剂量组（50ug/kg）：19.78±2.278；对照组与假手术组相比（14.67±1.043 vs17.33±0.7454），无统计学差异；模型组与正常组相比（8.000±1.193 vs 14.67±1.043），该组子宫内膜腺体数量明显减少，具有统计学意义（P＜0.01）；艾塞那肽低剂量的腺体数与模型组相比（15.00±5.321 vs 8.000±1.193），该组子宫内膜腺体数量增加，但无统计学意义；艾塞那肽中剂量组腺体数量与模型组相比（13.89±4.418 vs 8.000±1.193），该组的子宫内膜腺体数量也有所增加，但也无统计学意义；艾塞那肽高剂量组腺体数量与模型组相比（19.78±2.278 vs 8.000±1.193），该组的腺体数量显著增加且具有统计学意义（P< 0.01）。
表11艾塞那肽对IUA小鼠子宫内膜腺体数量的影响
注：模型组与正常组比较：**P＜0.01，IUA模型+艾塞那肽（50ug/kg）与模型组比较，**P＜0.01。
②艾塞那肽对***小鼠纤维化的影响：
ⅰMasson染色：
Masson染色主要呈现胶原纤维和肌纤维的差异。通过染色纤维组织中的胶原纤维呈蓝色，肌纤维、角蛋白、纤维素及胞质等呈红色，胞核呈蓝褐色。因此根据胶原纤维组织着色面积可判断纤维化的程度。
Masson染色结果显示：在高倍镜下对每个组织任意选取3个不同视野进行拍照，采用Image Pro Plus对胶原纤维着色面积进行测量，将测量数据通过Excel 2010，GraphpadPrism 6.0进行统计学分析。结果如图3所示：正常组与假手术组比较，子宫内膜中蓝色面积相差较小，无统计学差异；造模组子宫壁变薄，子宫内膜被纤维瘢痕组织取代覆盖，子宫内膜中蓝色面积较大，提示胶原纤维沉积增多，且明显多于正常对照组，有显著性差异（P＜0.001）；各浓度梯度（2ug/kg、10ug/kg、50ug/kg）艾塞那肽治疗组：子宫内膜可见部分胶原纤维沉积，但是与模型组相比明显减少，并且随着药物浓度的增加，胶原纤维沉积有逐渐减少趋势，50ug/kg艾塞那肽治疗组具有统计学意义（P＜0.01）。
ⅱ对子宫组织蛋白表达的影响：
为进一步研究IUA小鼠子宫组织中TGF-β1、α-SMA、MMP-9蛋白方面的表达水平，收集各组小鼠子宫组织，将对照组、假手术组、模型组及艾塞那肽各浓度梯度治疗组石蜡切片免疫组化（图4A），分析比较子宫组织中TGF-β1、α-SMA、MMP-9蛋白含量。所有切片每张在200倍下随机选取3个视野拍片，用Image-Pro Plus 6.0软件对染色阳性区域进行分析，计算光密度值（IOD），最终进行统计学分析。免疫组化染色定量显示从六组子宫中发现IUA模型组TGF-β1的表达增加与正常组相比存在显著差异（***P＜0.001图4B），假手术组与正常组相比TGF-β1的表达无明显差异。TGF-β1主要位于细胞浆中，可在子宫内膜腺上皮和间质中发现其阳性表达，提示激活这些细胞中的TGF-β1信号传导。艾塞那肽低剂量治疗组与模型组对比TGF-β1的表达量有所下降但无差异，中剂量组与模型组对比TGF-β1有所下降出现差异（*P＜0.05图4B），高剂量组与模型组对比具有显著性差异（**P＜0.01图4B）。α-SMA表达于***，可在胞质中呈现深棕色阳性着色区，IUA模型组α-SMA的表达增加与正常组相比存在显著差异（***P＜0.001图4C）,艾塞那肽高剂量治疗组与模型组间存在显著差异（**P＜0.01图4C），但模型组与艾塞那肽低剂量治疗组间无明显差异。MMP-9作为一种炎症介质，其表达量在正常组与模型组相比存在显著差异（***P＜0.001图4D），但在艾塞那肽低、中剂量治疗组的表达量未出现下降趋势，而在艾塞那肽高剂量治疗组其表达量下降，且与模型组想不存在差异（*P＜0.05图4D）；总体来说，上面数据进一步证实了艾塞那肽在IUA小鼠治疗中的关键作用。
ⅲ对子宫组织相关基因表达的影响：
为研究正常小鼠、IUA小鼠、艾塞那肽治疗组小鼠子宫组织中TGF-β1、α-SMA及MMP-9基因水平的表达，收集各组小鼠子宫组织，提取组织总mRNA，采用qPT-PCR方法检测***小鼠子宫组织中与纤维生成及炎症因子相关基因的表达水平（如图5）。分别将TGF-β1、α-SMA及MMP-9的正常组与模型组的表达量相比较，发现模型组TGF-β1、α-SMA及MMP-9的表达量均增加，并存在统计学显著差异（***P＜0.001图5）。后将艾塞那肽低、中、高三个剂量治疗组与同模型组进行对比，发现纤维生成因子TGF-β1在艾塞那肽高剂量治疗组的表达量有所降低，与模型组相比具有统计学差异（**P＜0.01，图5A）；中、高剂量组可以抑制***小鼠体内α-SMA的表达，使该基因在小鼠组织内表达量下调，且高剂量组与模型组相比（**P＜0.01，图5B）具有显著统计学差异；MMP-9的表达量在艾塞那肽高剂量治疗组与模型组对比中，有所降低（*P＜0.05，图5C），但无显著差异。
综上所述，艾塞那肽可抑制纤维相关因子基因的表达水平。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明IUA小鼠造模步骤图（A→F）。
图2为本发明 IUA后14天的小鼠组织横切结果，H&E染色（40倍和200倍）。
图3为本发明艾塞那肽对各组小鼠子宫内膜纤维化的影响。（A）IUA后14天胶原蛋白（40x和200x）的Masson三色染色法，各组子宫的组织学结构。（B）IUA后14天各组子宫内膜纤维化区域的分析结果。
图4为本发明艾塞那肽对IUA小鼠组织蛋白表达量的影响。（A）不同剂量艾塞那肽治疗IUA小鼠14天后TGF-β1、α-SMA、MMP-9的免疫组化；（B）TGF-β1的免疫组化定量分析结果。（C）α-SMA的免疫组化定量分析结果。（D）MMP-9的免疫组化定量分析结果。
图5为本发明艾塞那肽对IUA小鼠组织内RNA表达的影响。（A）TGF-β1表达的定量分析结果。（B）α-SMA表达的定量分析结果。（C）MMP-9表达的定量分析结果。
图中：*为P＜0.05，**为P＜0.01,***为P＜0.001；IUA为***；TGF-β1为转化生长因子-β1；α-SMA为α-平滑肌肌动蛋白；exenatide为艾塞那肽。
具体实施方式
实施例1 艾塞那肽注射液在治疗和预防***药物中的应用：该艾塞那肽注射液的用量为10 ug/kg/d，用药时间为28 d。
实施例2 艾塞那肽注射液在治疗和预防***药物中的应用：该艾塞那肽注射液的用量为50 ug/kg/d，用药时间为14 d。
实施例3 艾塞那肽注射液在治疗和预防***药物中的应用：该艾塞那肽注射液的用量为200 mg/kg/d，用药时间为7 d。
上述实施例1~3中，艾塞那肽注射液为吉尔生化（上海）有限公司提供的醋酸盐艾塞那肽或Sigma公司提供。
Claims (2)
1.艾塞那肽注射液在治疗和预防***药物中的应用，其特征在于：该艾塞那肽注射液的用量为10 ug/kg/d~200 mg/kg/d，用药时间为7~28 d。
2.如权利要求1所述的艾塞那肽注射液在治疗和预防***药物中的应用，其特征在于：所述艾塞那肽注射液的用量为50 ug/kg/d，用药时间为14 d。
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