CN111295578B - 颗粒分离***和方法 - Google Patents

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Abstract

在其他方面中，本文提供了用于分析样本中的颗粒的方法和装置。在一些方面，颗粒可以是分析物、细胞、核酸或蛋白质，并且可以与标签接触，划分为等分试样，通过定级装置检测，以及被分离。本文提供的方法和设备可包括微流体芯片。在一些方面，所述方法和装置可用于定量样品中的稀有颗粒如癌细胞和其他稀有细胞，以进行疾病诊断、预后或治疗。

Description

颗粒分离***和方法
交叉参考
本申请要求2017年8月15日提交的美国临时申请第62/545,925号的权益，其通过引用全文纳入本文。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTC)从原始发性肿瘤脱落到血流中，是癌转移的重要方面。已经在许多不同类型的癌中检测到CTC，例如乳腺癌、肺癌、***癌和胰腺癌。CTC的数量与转移患者的临床结局直接相关，提供了可帮助管理临床护理的有价值的预后信息。
发明内容
本文描述了用于从流体样本(如血液)中分离和分析颗粒(如细胞)的方法、设备、***和装置。
在多个方面中，在流体样本中收集颗粒的方法包括如下操作：i)检测样本的第一等分试样中颗粒的第一存在；ii)在检测到第一等分试样中颗粒的存在后，将第一等分试样的流动引向第一体积以形成第一分离样本；iii)分散第一分离样本以形成分散的样本；以及iv)对分散的样本进行分离程序。
在多个方面中，所述分离程序是主动分离程序。在一些情况下，所述分离程序是被动分离程序。
在一些方面，检测颗粒的第一存在包括：i)用第一电磁辐射的源问询第一等分试样中的颗粒；并且ii)检测第一电磁辐射与第一等分试样中的颗粒的第一相互作用。在一些情况下，所述第一电磁辐射包括光，并且在一些情况下，光具有选自以下范围的波长：100nm至400nm、400nm至700nm、700nm至1000nm、1μm至10μm、10μm至100μm、以及100μm至1000μm。
在一些情况下，所述第一相互作用选自下组：光学反射、光学透射、弹性光学散射、非弹性光学散射、瑞利散射、拉曼散射、表面增强拉曼散射、米氏散射、布里渊散射、荧光、自发荧光、激光诱导荧光、发光、生物发光、和化学发光。
在一些情况下，在流体样本的连续流动期间进行第一等分试样中颗粒的第一存在的检测。
在多个方面中，所述颗粒是稀有颗粒。在一些情况下，所述稀有颗粒是细胞，并且在一些情况下，所述细胞是稀有细胞。在一些情况下，所述稀有细胞是癌性细胞，并且在一些情况下，所述癌性细胞是循环肿瘤细胞。在一些情况下，所述稀有细胞是免疫细胞。在一些情况下，所述稀有细胞是白细胞。
在一些情况下，分散第一分离样本包括第一分离样本的流动拉伸，并且在一些情况下，所述流动拉伸受通过流动路径的第一分离样本的抛物线流动影响。在一些情况下，所述流动拉伸受第一分离样本的人字混合影响。在一些情况下，所述流动拉伸受通过多个流动路径的第一分离样本的流动影响。
在一些方面，分散第一分离样本包括第一分离样本的细胞拉伸。在一些情况下，所述细胞拉伸受屏障影响，并且在一些情况下，所述屏障基于细胞的物理属性改变细胞的速度。在一些情况下，所述在一些情况下，所述细胞的物理属性选自下组：细胞体积、细胞形状、和细胞可变形性。在一些情况下，所述屏障包括过滤器结构、通道的收缩、或堰结构。
在一些方面，分散第一分离样本包括流动拉伸和流动分选。
在一些情况下，所述分离程序包括：i)用第二电磁辐射的源问询颗粒；以及ii)检测第二电磁辐射的第二相互作用。在一些情况下，所述第二电磁辐射包括光，并且在一些情况下，光具有选自以下范围的波长：100nm至400nm、400nm至700nm、700nm至1000nm、1μm至10μm、10μm至100μm、以及100μm至1000μm。
在多个方面中，所述第二相互作用选自下组：光学反射、光学透射、弹性光学散射、非弹性光学散射、瑞利散射、拉曼散射、表面增强拉曼散射、米氏散射、布里渊散射、荧光、自发荧光、激光诱导荧光、发光、生物发光、和化学发光。
在一些方面，在流体样本的连续流动期间进行颗粒的第二存在的检测。
在一些情况下，所述方法还包括将颗粒收集在结构中，并且在各种情况下，所述结构选自下组：小瓶、孔板、和过滤体积。
在一些方面，本文所述的方法还包括用过滤器元件捕捉颗粒。在一些情况下，所述方法还包括从过滤器元件释放颗粒，并且在一些情况下，所述释放包括释放颗粒至选自下组的体积：小瓶、孔板、和额外的过滤体积。
在一些方面，所述方法包括用一个或多个珠接触过滤器元件，并且在一些方面，所述释放包括用一个或多个珠接触过滤器元件。
在多个方面中，本文所述的方法包括操作阀以浓缩收集的颗粒或使用被动流体结构纯化颗粒。在一些情况下，所述方法包括使用一个或多个屏障、一个或多个堰拉伸器、一个或多个微狭缝或一个或多个微滤器来分散颗粒。
在多个方面中，用于在流体样本中收集颗粒的设备包括输入通道，配置为检测输入通道中的颗粒的检测器，与输入通道流体连通的定向流动通道；配置为在定向流动通道中调节流体流动的阀；与输入通道流体连通的输出通道；与输出通道流体连通的分散级；和包括处理器和在其上存储有可执行指令的非暂时性存储器的计算机，当用处理器执行时，将导致设备：操作检测器以检测样本的第一等分试样中的颗粒的第一存在；在检测第一等分试样中颗粒的存在后，操作阀以将第一等分试样的流动引向第一体积以形成第一分离样本；将第一分离样本引向分散级以形成分散的样本；并且在分散的样本上进行分离程序。
在一些情况下，通过设备进行的分离程序是主动分离程序或被动分离程序。在一些情况下，检测颗粒的第一存在包括：用第一电磁辐射的源问询第一等分试样中的颗粒；并且检测第一电磁辐射与第一等分试样中的颗粒的第一相互作用。在一些情况下，所述第一电磁辐射包括具有选自100nm至400nm、400nm至700nm、700nm至1000nm、1μm至10μm、10μm至100μm、以及100μm至1000μm的范围的波长的光。在一些情况下，所述第一相互作用选自下组：光学反射、光学透射、弹性光学散射、非弹性光学散射、瑞利散射、拉曼散射、表面增强拉曼散射、米氏散射、布里渊散射、荧光、自发荧光、激光诱导荧光、生物发光、和化学发光。在一些情况下，所述处理器导致第一等分试样中的颗粒的第一存在的检测，同时所述处理器导致***中流体样本的连续流动。
在多个方面中，使用本文所述的设备分散第一分离样本包括第一收集样本的流动拉伸。在一些方面，所述流动拉伸受通过流动路径的第一收集样本的抛物线流动影响；并且在一些情况下，所述设备还配置为使收集的样本通过流动路径呈抛物线流动。在一些方面，所述流动拉伸受通过多个流动路径的第一分离样本的流动影响。在一些方面，分散第一分离样本包括流动拉伸和细胞拉伸。
在一些情况下，本文所述的设备包括配置为使第一收集样本呈流动拉伸的人字拉伸器。在一些情况下，本文所述的设备包括配置为使第一分离样本呈细胞拉伸的屏障。在一些情况下，所述屏障被配置为基于细胞的物理属性改变细胞的速度，在一些方面，所述细胞的物理属性选自：细胞体积、细胞形状、和细胞可变形性。在一些情况下，所述屏障包括过滤器结构或通道的收缩。
在多个方面中，本文所述的设备被配置为进行分离程序，所述分离程序包括：用第二电磁辐射的源问询颗粒；以及检测第二电磁辐射与颗粒的第二相互作用。在一些情况下，所述第二电磁辐射包括具有选自以下范围的波长的光：100nm至400nm、400nm至700nm、700nm至1000nm、1μm至10μm、10μm至100μm、以及100μm至1000μm。在一些方面中，所述第二相互作用选自下组：光学反射、光学透射、弹性光学散射、非弹性光学散射、瑞利散射、拉曼散射、表面增强拉曼散射、米氏散射、布里渊散射、荧光、自发荧光、激光诱导荧光、发光、生物发光、和化学发光。在一些方面，所述分离程序包括荧光活化等分试样分选、eDAR、流式细胞术、荧光活化细胞分选(FACS)、磁性颗粒分离、或磁性活化细胞分选(MACS)。
在多个方面中，本文所述的设备的处理器被配置为在流体样本的连续流动期间导致进行颗粒的第二存在的检测。在一些方面，所述处理器进一步被配置为导致颗粒被收集在连接到出口通道的体积中，所述体积选自：小瓶、孔板、和过滤体积。在一些方面，所述处理器进一步被配置为导致颗粒被过滤器元件捕获。在一些情况下，所述处理器进一步被配置为导致颗粒从过滤器元件被释放。在一些情况下，所述处理器进一步被配置为导致颗粒被从过滤器元件释放并被收集在选自下组的体积中：小瓶、孔板、和额外的过滤体积。
在多个方面中，所述处理器被配置为引导一个或多个珠与过滤器元件接触。在一些方面，所述处理器被配置为通过使一个或多个珠与过滤器元件接触，从过滤器元件释放颗粒。在一些情况下，所述处理器进一步被配置为通过操作第二阀来浓缩收集的颗粒。
在多个方面中，所述设备被配置为浓缩颗粒，所述结构选自一个或多个屏障、一个或多个过滤器元件、一个或多个堰拉伸器、一个或多个微狭缝、和一个或多个微滤器。
在一些情况下，本文所述的设备还包括配置为纯化颗粒的被动流体结构。
通过引用纳入
本说明书中提到的所有发表物、专利和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的发表物、专利或专利申请专门和单独地通过引用纳入本文那样。
附图说明
所附权利要求书中具体说明了本公开的新特征。参考以下说明和附图更好地理解本公开的特征和优点，这些详述列出利用本公开原理的说明性实施方式：
图1A是根据本公开的一个方面的eDAR的概况。
图1B示出了根据本公开的一些实施方式的检测迹线。
图1C示出了根据本公开的一些实施方式的荧光和明场成像数据。
图2例示了根据本公开的一个方面的用于eDAR微流体芯片的微制造的工艺流程的实例。
图3A-3H例示了根据本公开的一些实施方式的示例性的流体动力学分选方案。
图4A-4D显示了根据本公开的一个方面的整体eDAR的微流体芯片和流体动力学切换方案。
图5描绘了根据本公开的一个方面的高速摄像机记录的当前的流体方案的切换时间的实例。
图6A-6G示出了根据本公开的一个方面的eDAR的表征和分析性能。
图7A-7E示出了根据本公开的一个方面的微狭缝和捕获的CTC的多色荧光成像。
图8描绘了根据本公开的一个方面的“双重捕获”eDAR的一般结构。
图9A-9C示出了根据本公开的一些实施方式的流动切换的明场图像。
图10A示出了包括第一eDAR级、分散级、和荧光活化分选的第二级的多级分选设备。
图10B示出了示例性的第二分选级。
图10C示出了示例性的第一分选级。
图10D和E示出了第一和第二分选级之间的分散级流动拉伸器的一部分。
图11A-11D示出了根据本公开的一些实施方式的示例性的第一分选级的俯视图，其用包含障碍或不同设计的多重流动路径的通道与第二分选级连接。
图12A-12C示出了示例性的第一分选级的俯视图，其用不同的几何形状的通道与第二分选级连接。
图13示出了与具有抛物线流动轮廓(profile)的直通道组合的示例性的人字拉伸器的俯视图。
图14示出了示例性的与多重直通道组合的多重人字拉伸器的俯视图。
图15示出了与直通道和堰拉伸器组合的示例性的人字拉伸器的俯视图。
图16示出了具有与人字拉伸器组合的多重流体路径的示例性的流动拉伸器的俯视图。
图17示出了具有与多重人字拉伸器和多重堰拉伸器组合的多重流体路径的示例性的流动拉伸器的俯视图。
图18A示出了包括第一eDAR级、分散级、和荧光活化分选的第二级的多级分选设备。
图18B示出了操作多级分选设备的方法。
图19示出了示例性的分散级。
图20A示出了示例性的流动拉伸器的俯视图。
图20B示出了示例性的人字流动拉伸器的俯视图。
图21A示出了示例性的堰拉伸器的俯视图。
图21B示出了示例性的长堰拉伸器的俯视图。
图22A-22C示出了示例性的二维的堰和过滤器拉伸器的俯视图。
图23A示出了通过利用人字结构的微流体装置的流动路径的示意图。
图23B示出了利用人字结构的微流体装置的流动通道的各层的侧视图。
图24A示出了分选期间来自第一分选结点的检测迹线。
图24B示出了分选期间来自第二分选结点的检测迹线。
图24C示出了来自第一分选结点和第二分选结点的APD数据的组合迹线的较短部分。
图25A-25C示出了流动拉伸器拉伸测试的结果。
图26A-26B示出了过滤器拉伸器中细胞的图像。
图27A-27B示出了描绘顺序分选流体设备中的分选的图像帧。
图28示出了示例性的数字处理装置，其被编程为或以其它方式配置为操作颗粒收集装置。
图29A示出了配置为目标颗粒的捕获和释放的示例性的流动路径。
图29B示出了使用珠并逆流通过过滤器、从过滤器释放细胞的方法。
图30A示出了具有阀以限制流动通过流动路径的示例性的流动路径的俯视图。
图30B示出了示例性的流动路径，其包括用于减少收集有颗粒的流体体积的阀。
图30C示出了用于在多级分选后收集浓缩的颗粒的设备。
图31示出了用于减少收集有分离后的颗粒的流体体积的示例性的流动路径。
发明详述
本公开提供用于通常使用微流体设备来检测、分离和分析流体样本(例如，血液)中的颗粒(例如，细胞)的方法、***和装置。所述颗粒可以是稀有颗粒(例如，稀有细胞)。本文提供的许多微流体设备和方法可被用于在流体样本上进行综合决策等分试样定级(Ensemble Decision Aliquot Ranking，eDAR)，其允许在将流体样本分为等分试样后进行流体样本的分析。本文提供的微流体设备和方法可用于通过在采用eDAR后进行分散操作和分离操作来增强流体样本中的颗粒的纯度。
所述分散操作可通过多种本文所述的微流体设备和方法来进行。例如，所述分散操作可使用流动拉伸操作来进行。如本文所述，在初始eDAR操作后，所述流动拉伸可通过微流体通道而受包含颗粒的流体体积或等分试样的抛物线流动影响。如本文所述，在初始eDAR操作后，所述流动拉伸可通过包括一个或多个人字结构的微流体通道而受包含颗粒的流体体积或等分试样的流动影响。如本文所述，在初始eDAR操作后，所述流动拉伸可通过多重流动路径而受包含颗粒的流体体积或等分试样的流动影响。在一些情况下，所述分散操作可使用细胞拉伸操作来进行。所述细胞拉伸可通过屏障或过滤器结构或堰结构或具有收缩的通道(所有这些都可以基于体积、形状、或可变形性而改变颗粒的速度)而受包含颗粒的流体体积或等分试样的流动影响。例如，用于进行细胞拉伸操作的过滤器结构可包括多个孔，其大小优先影响(例如，减弱)一个或多个细胞类型的速度。在一些情况下，用于进行细胞拉伸操作的过滤器结构的一个或多个孔可具有一定的高度、长度、宽度或截面(例如，涉及目标细胞的尺寸或特性，如目标细胞的直径或可变形性)以要求一个或多个细胞类型的细胞变形以穿过过滤器结构的孔)。在某些情况下，所述分散操作可使用流动拉伸操作和细胞拉伸操作的组合来进行。
在分散操作之后，可进行分离操作。所述分离操作可以是主动分离操作或被动分离操作。所述分离操作可以是第二eDAR操作。所述分离操作可以是流式细胞术(例如荧光活化细胞分选)操作。所述分离操作可以是磁性分离操作。
与单独使用eDAR分离目标颗粒相比，本文所述的微流体设备和方法可在流体样本中提供目标颗粒从非目标颗粒的显著增强的分离。在一些情况下，与单独eDAR可获得的纯度相比，最终收集颗粒的纯度可达到5倍、10倍、20倍、30倍、或30倍以上。
本公开所述的方法、***、设备和装置可用于分析物(例如，稀有细胞)的分离、浓缩、和/或分离()的生物学和病理学中的多种广泛应用。例如，一些应用可包括但不限于，用于疾病诊断和预后的稀有细胞(例如，癌细胞、癌干细胞、疟疾感染的红细胞、干细胞、胎儿细胞、免疫细胞、感染的细胞)从流体(例如，体液)的捕获()；用于水质量监测的单细胞寄生虫(例如，贾第虫、隐孢子虫)的分离；用于监测疾病进程(例如，HIV，AIDS，癌)的感染的细胞(例如，淋巴细胞，白细胞)的分离；用于筛选(例如，疾病，遗传异常)的母体血液中的胎儿细胞；用于治疗应用的干细胞；用于朊病毒相关(例如，疯牛病)疾病筛选的朊病毒感染的细胞；以及其它。
在一个具体方面中，所述稀有颗粒是稀有细胞。稀有细胞可以是有核或无核。稀有细胞包括但不限于，表现为恶性表型的细胞；胎儿细胞，如孕妇外周血中的胎儿细胞，肿瘤细胞，例如已经从肿瘤脱落到血液或其他体液中的肿瘤细胞；被病毒感染的细胞，如被HIV感染的细胞，用目的基因转染的细胞；和自身反应障碍患者外周血液中存在的T细胞或B细胞的异常亚型。
如本文所述，“综合决策”是指基于对整体或一组颗粒中特征存在或不存的检测而作出的决策。一个组可包括至少3个颗粒、分析物和/或细胞。在一些方面，综合决策将基于包含多个颗粒的流体样本的等分试样中单个不同颗粒的存在与否来作出。重要的是，基于单个颗粒的存在与否作出的综合决策将被应用于整个等分试样(即，等分试样中存在的所有颗粒)。
如本文所述，“等分试样”是指所要分析的流体样本的总体积的一部分。等分试样可包含至少一个颗粒、分析物或细胞。等分试样可包含一组颗粒、分析物或细胞。等分试样可能占据三维空间并且其中的颗粒可能无组织地随机分布。等分试样可能具有有限的深度，并且颗粒可以沿着该深度分布而没有可辨别的层。在本申请的上下文中，等分试样被完整地分析而没有细分。
如本文所用，短语“划分流体”是指分离或以其它方式重定向来自流体样本的总体积的流体的一部分或等分试样。
在某些方面中，等分试样可包括较大的流体样本的一小部分，例如，约流体样本的1/2，或约流体样本的1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、或更少。在某些方面中，等分试样可包括例如，约流体样本的10％，或约流体样本的9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.001％或更少。因此，可以通过本文提供的eDAR方法检查或处理的流体可分为例如至少约2个等分试样，或至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1百万、2百万、3百万、4百万、5百万、6百万、7百万、8百万、9百万、1千万、或更多的等分试样。本领域技术人员将理解，流体样本将被划分成的等分试样的数量将取决于流体中预期的稀有颗粒的数量以及流体样本的总体积。
在某些方面中，等分试样可包括较大的流体样本的一小部分，例如，流体样本的1/2，或流体样本的1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、或更少。在某些方面中，等分试样可包括例如，流体样本的10％，或流体样本的9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.001％或更少。因此，可以通过本文提供的eDAR方法检查或处理的流体可分为例如至少2个等分试样，或至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1百万、2百万、3百万、4百万、5百万、6百万、7百万、8百万、9百万、1千万、或更多的等分试样。本领域技术人员将理解，流体样本将被划分成的等分试样的数量将取决于流体中预期的稀有颗粒的数量以及流体样本的总体积。
在某些方面中，等分试样具有例如约0.1nL至约10mL、或约1nL至约1mL、或约1nL至约100μL、或约1nL至约10μL、或约1nL至约1μL、或约1nL至约100nL、或约0.1nL至约10nL的体积。
在某些方面中，等分试样具有例如0.1nL至10mL、或1nL至1mL、或1nL至100μL、或1nL至10μL、或1nL至1μL、或1nL至100nL、或0.1nL至10nL的体积。
如本文所用，术语“定级”是指通过分类来评估定量特性、定性特性或等分试样的重要性。在一个方面，等分试样可被定级为无(例如，当等分试样中未检测到稀有颗粒)或非零(例如，当等分试样中检测到至少一个稀有颗粒)。在一个方面，定级可以是二进制的。在其它方面，等分试样可根据其它分类来定级，例如这些类别与等分试样中稀有颗粒的浓度、等分试样中稀有颗粒的特性、等分试样中多个不同稀有颗粒的特性等相关。以该方式，可基于浓度范围来分配任意数量的类别，例如，约1至10、约11至20、约1至50、约51至100、约1至100、约101至201等。在一些方面，可基于浓度范围来分配任意数量的类别，例如，1至10、11至20、1至50、51至100、1至100、101至201等。这些定级可分配为与多个预定的定量或定性类别之一(例如，0，1，2，3，4，5，等)相应的任意数量，或分配为与等分试样中的数量或近似数量或稀有颗粒的实际值相应的数。
如本文所用，术语“微流体芯片”与术语芯片、流体芯片、微芯片或流体微芯片互换使用。
如本文所用，“计算机”是指至少一个数字处理器。所述数字处理器可以是但不限于现场可编程门阵列(FGPA)、专用集成电路(ASIC)或实时(RT)处理器。
eDAR设备可用于分析物(例如，稀有细胞)的鉴定和分离。eDAR可处理等分试样中的样本并可通过由流体动力学切换方案控制的主动分选步骤，在通道或腔室中收集稀有细胞。在本文中称为微流体芯片的、具有通道和腔室的“多合一微流体芯片”可用于分选稀有细胞。所述微流体芯片可以部分地由功能区域和微制造过滤器组成。eDAR可被用于以高回收率(例如，高于或等于90％)和低假阳性率(例如，接近于零)快速(例如，每1mL少于或等于12.5分钟)分析包含混合分析物群(例如，大于或等于一毫升的全血)的流体。
微流体芯片的一般结构和eDAR的示例配置描绘于图5。左下通道可用于收集分选的等分试样并可用于将它们转移到随后的纯化(例如，纯化腔室)区域(例如，20000个微狭缝)。在图5B-D中进一步描绘了标有虚线框的区域。图5B示出了当没有阳性等分试样被定级时的示例流动条件。图5C示出了血液流动可切换到收集通道，并且分选的等分试样可通过第二窗口确认。图5D示出了血液流动可在等分试样分选后切回。
所述设备可具有数个流速。流速可以指流体流过eDAR设备和连接到该设备的任何组件的速率。在一些方面，示例性的流速可低于约5μL/分钟、10μL/分钟、20μL/分钟、25μL/分钟、30μL/分钟、35μL/分钟、40μL/分钟、41μL/分钟、42μL/分钟、43L/分钟、44μL/分钟、45μL/分钟、46μL/分钟、47μL/分钟、48μL/分钟、49μL/分钟、50μL/分钟、51μL/分钟、52μL/分钟、53μL/分钟、54μL/分钟、55μL/分钟、56μL/分钟、57μL/分钟、58μL/分钟、59μL/分钟、60μL/分钟、61μL/分钟、62μL/分钟、63μL/分钟、64μL/分钟、65μL/分钟、66μL/分钟、67μL/分钟、68μL/分钟、69μL/分钟、70μL/分钟、71μL/分钟、72μL/分钟、73μL/分钟、74μL/分钟、75μL/分钟、76μL/分钟、77μL/分钟、78μL/分钟、79μL/分钟、80μL/分钟、81μL/分钟、82μL/分钟、83μL/分钟、84μL/分钟、85μL/分钟、86μL/分钟、87μL/分钟、88μL/分钟、89μL/分钟、90μL/分钟、91μL/分钟、92μL/分钟、93μL/分钟、94μL/分钟、95μL/分钟、96μL/分钟、97μL/分钟、98μL/分钟、99μL/分钟、100μL/分钟、105μL/分钟、110μL/分钟、115μL/分钟、120μL/分钟、125μL/分钟、130μL/分钟、140μL/分钟、150μL/分钟、160μL/分钟、170μL/分钟、180μL/分钟、190μL/分钟、200μL/分钟、225μL/分钟、250μL/分钟、275μL/分钟、300μL/分钟、350μL/分钟、400μL/分钟、450μL/分钟、500μL/分钟、600μL/分钟、700μL/分钟、800μL/分钟、900μL/分钟或1000μL/分钟。
在一些方面，所述流速可在约5μL/分钟-30μL/分钟、15μL/分钟-50μL/分钟、25μL/分钟-75μL/分钟、40μL/分钟-80μL/分钟、50μL/分钟-90μL/分钟、60μL/分钟-100μL/分钟、800μL/分钟-160μL/分钟、90μL/分钟-180μL/分钟、100μL/分钟-200μL/分钟、150μL/分钟-300μL/分钟、200μL/分钟-400μL/分钟、300μL/分钟-500μL/分钟、400μL/分钟-600μL/分钟、500μL/分钟-700μL/分钟、600μL/分钟-800μL/分钟、700μL/分钟-900μL/分钟或800μL/分钟-1000μL/分钟的范围内。
在一些方面，示例性的流速可低于5μL/分钟、10μL/分钟、20μL/分钟、25μL/分钟、30μL/分钟、35μL/分钟、40μL/分钟、41μL/分钟、42μL/分钟、43L/分钟、44μL/分钟、45μL/分钟、46μL/分钟、47μL/分钟、48μL/分钟、49μL/分钟、50μL/分钟、51μL/分钟、52μL/分钟、53μL/分钟、54μL/分钟、55μL/分钟、56μL/分钟、57μL/分钟、58μL/分钟、59μL/分钟、60μL/分钟、61μL/分钟、62μL/分钟、63μL/分钟、64μL/分钟、65μL/分钟、66μL/分钟、67μL/分钟、68μL/分钟、69μL/分钟、70μL/分钟、71μL/分钟、72μL/分钟、73μL/分钟、74μL/分钟、75μL/分钟、76μL/分钟、77μL/分钟、78μL/分钟、79μL/分钟、80μL/分钟、81μL/分钟、82μL/分钟、83μL/分钟、84μL/分钟、85μL/分钟、86μL/分钟、87μL/分钟、88μL/分钟、89μL/分钟、90μL/分钟、91μL/分钟、92μL/分钟、93μL/分钟、94μL/分钟、95μL/分钟、96μL/分钟、97μL/分钟、98μL/分钟、99μL/分钟、100μL/分钟、105μL/分钟、110μL/分钟、115μL/分钟、120μL/分钟、125μL/分钟、130μL/分钟、140μL/分钟、150μL/分钟、160μL/分钟、170μL/分钟、180μL/分钟、190μL/分钟、200μL/分钟、225μL/分钟、250μL/分钟、275μL/分钟、300μL/分钟、350μL/分钟、400μL/分钟、450μL/分钟、500μL/分钟、600μL/分钟、700μL/分钟、800μL/分钟、900μL/分钟或1000μL/分钟。
在一些方面，所述流速可在5μL/分钟-30μL/分钟、15μL/分钟-50μL/分钟、25μL/分钟-75μL/分钟、40μL/分钟-80μL/分钟、50μL/分钟-90μL/分钟、60μL/分钟-100μL/分钟、800μL/分钟-160μL/分钟、90μL/分钟-180μL/分钟、100μL/分钟-200μL/分钟、150μL/分钟-300μL/分钟、200μL/分钟-400μL/分钟、300μL/分钟-500μL/分钟、400μL/分钟-600μL/分钟、500μL/分钟-700μL/分钟、600μL/分钟-800μL/分钟、700μL/分钟-900μL/分钟或800μL/分钟-1000μL/分钟的范围内。
所述设备可具有数个分选效率。所述分选效率可以指感兴趣的分析物的回收。在一些方面，示例性的分选效率可高于约5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或为100％。在一些方面，所述分选效率可在约5％-30％、15％-50％、25％-75％、40％-80％、50％-90％或60％-100％的范围内。
在一些方面，示例性的分选效率可高于5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或为100％。在一些方面，所述分选效率可在5％-30％、15％-50％、25％-75％、40％-80％、50％-90％或60％-100％的范围内。
所述eDAR设备可具有数个回收率。所述回收率可以指感兴趣的分析物的回收。在一些方面，所述回收率可高于约5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或为100％。在一些方面，所述回收率可在约5％-30％、15％-50％、25％-75％、40％-80％、50％-90％或60％-100％的范围内。
在一些方面，所述回收率可高于5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或为100％。
在一些方面，所述回收率可在5％-30％、15％-50％、25％-75％、40％-80％、50％-90％或60％-100％的范围内。
在一些方面，eDAR设备或方法用于从第二细胞类型中分离第一细胞类型。在一些方面，分离的样本包含高于5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的第一细胞类型的总数。在一些方面，分离的样本包含少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45、50％、60％、70％、80％、或90％的第二细胞类型的总数。
所述eDAR设备可包含配备有用于激发的辐射源(例如，激光)和检测模式的显微镜、光源、计时器、管、废物收集装置、用于对标记的分析物(例如，细胞)进行成像的摄影机、控制流体流进和流出微流体芯片的泵、控制主动分选步骤的数字处理器和用于处理图像的数字处理器(例如，计算机***)。所述数字处理器可以是计算机。
在一些方面，eDAR平台可包括用于捕获一种以上分析物(例如，稀有细胞)的设备。“双重捕获”eDAR可分离来自混合样本的多种稀有细胞。所述混合样本(例如，流体样本)可用检测试剂标记并在主通道处进入“双重捕获”设备的顶部。两侧通道可用于控制混合样本的流动的流体动力学切换。在一些方面，所述流动可用双螺线管控制。稀有细胞的两个亚群可被分离并捕集在同一微流体芯片的两个不同过滤区域中。
在多个方面中，提供用于从来自源自流体的样本中划分表达特定生物标志物谱的细胞的设备，其中：所述设备包括一组与微流体芯片连接的管，其具有至少一个通道和腔室；并且所述设备能够在腔室中分离细胞，其中，在分离后，所述腔室包括高于80％的表达特定生物标志物谱的样本中的细胞总群，并且其中，在分离后，所述腔室包括少于5％的表达不同的生物标志物谱的样本中的细胞总群。
在一些方面，表达特定生物标志物谱的细胞的分离发生在少于20分钟内。在一些方面，所述特定生物标志物谱存在于流体样本中少于5％的细胞中。在某些方面中，所述流体是血液。在某些方面中，所述流体是分离的全血。在其它方面，所述流体是全血的有核细胞部分。
在多个方面中，提供用于检测流体样本中的颗粒的***，所述***包括：包括输入通道、第一输出通道、第二输出通道、和定向流动通道的微流体芯片；阀，其中所述阀可与微流体芯片分离，并且其中：所述阀调节定向流动通道中第一流体的流动；并且定向流动通道中第一流体的流动引导自输入通道至第一输出通道、第二输出通道、或其组合的第二流体的流动；配置为检测自输入通道的第二流体的一部分发出的信号的检测器；以及处理器，其配置为：根据信号为该部分分配一个值；并且对阀进行操作。在一些方面，所述阀是电动阀。
在多个方面中，提供用于检测流体样本中的颗粒的***，所述***包括：(a)微流体芯片，其包括至少一个样本输入通道、至少一个定向流动通道、和至少两个输出通道，其中所述至少一个定向流动通道与样本输入通道相交；(b)电动阀，其位于不属于微流体芯片的部分的装置上，其中所述电动阀通过控制与至少一个定向流动通道或至少两个输出通道中的至少一个相交的输入通道来控制流体流动；(c)至少一个检测器，其能够检测流体样本的等分试样中的一种或多种分析物；以及(d)处理器，其能够基于等分试样中分析物的存在、不存在、相同性、组成或数量对等分试样分配值，其中所述处理器与检测器和电动阀连通。
在一些方面，所述阀是电磁阀。在某些方面中，所述电动阀控制至少一个定向流动通道中流体的流动。在其它方面，所述电动阀通常是关闭的，并且其中所述电动阀在收到来自处理器的信号后打开。在其它方面，所述电动阀通常是打开的，并且其中所述电动阀在收到来自处理器的信号后关闭。
在一些方面，至少一个定向流动通道包括至少两个端口，并且其中所述电动阀通过端口之一控制流体的流动。在某些方面中，所述电动阀直接控制至少一个定向流动通道中流体的流动。在一些方面中，所述电动阀直接控制进入至少一个定向流动通道的通道中流体的流动。在某些方面中，所述电动阀仅直接控制一个定向流动通道中流体的流动。在其它方面，所述电动阀直接控制输出通道中流体的流动。在其它方面，所述电动阀直接控制进入输出通道的通道中流体的流动。在一些方面，所述电动阀是压电阀。
在一些方面，定向流动通道在结点与输出通道相交。在某些方面中，所述检测器位于至少一个通道，所述至少一个通道不是输出通道。在一些方面，所述装置包括验证激光。在某些方面中，所述验证激光位于至少一个通道，所述至少一个通道不是输入通道。在其它方面，所述***包括第二检测器。在其它方面，至少一个通道与过滤器流体连通。
在多个方面中，提供用于检测流体样本中的稀有颗粒的装置，所述装置包括：输入通道；第一输出通道；第二输出通道；检测器，其配置为检测流体样本的一部分中颗粒的存在与否；机构，用于基于颗粒的存在与否引导部分从输入通道向第一输出通道、第二输出通道或它们的组合的流动；以及过滤器，其与第一输出通道流体连通。在一些方面，所述过滤器包括孔的阵列。在某些方面中，阵列中每个孔的最小尺寸小于颗粒的最小尺寸。
在多个方面中，提供用于检测流体样本中的稀有颗粒的装置，所述装置包括：(a)至少一个样本输入通道；(b)至少两个输出通道，其中两个输出通道中的至少一个与孔的阵列流体连通；(c)至少一个检测器，其能够检测流体样本的等分试样中的一个或多个稀有颗粒；以及(d)机构，用于通过引导包含一个或多个稀有颗粒的等分试样通过第一输出通道的流动来分选一个或多个稀有颗粒。
在一些方面，所述装置包括第一输出通道和第二输出通道。在某些方面中，如果等分试样不包含稀有颗粒，则所述机构引导等分试样的流动进入第二输出通道。在某些方面中，用于分选的所述机构包括电极、磁性元件、声学元件、或电动元件。
在一些方面，所述孔的阵列置于输入通道和输出通道之间。在某些方面中，所述孔的阵列位于与输入通道和输出通道相同的平面上。在其它方面，孔的阵置于第一输出通道。在其它方面，所述孔的阵列置于与第一输出通道流体连通的腔室。在一些方面，所述孔的阵列被配置为使得稀有颗粒不能通过孔但至少一个其它颗粒能够通过孔。在某些方面中，所述孔的阵列被配置为使得稀有颗粒能够通过孔但至少一个其它颗粒不能通过孔。在其它方面，所述孔的阵列包括多于1000个孔。
在某些方面中，所述检测器选自摄影机、电子倍增器、电荷耦合器件(CCD)图像传感器、光电倍增管(PMT)、雪崩光电二极管(APD)、单光子雪崩光电二极管(SPAD)、硅光电倍增管(SiPM)、和互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器。
在多个方面中，提供用于进行测定的集成***，所述***包括：包含颗粒的流体样本，其中颗粒包括标记物；输入通道；第一输出通道；第二输出通道；第一检测器，其被配置为检测流体样本的一部分中的颗粒存在与否，该部分在输入通道中；机构，其用于基于颗粒的存在与否引导部分从输入通道至第一输出通道的流动；微腔，其与第一输出通道流体连通并被配置为捕集颗粒。
微流体芯片设计和制造
可制造微流体芯片以提供高效的主动分选方案和随后的纯化(例如，纯化腔室)方案。所述微流体芯片可由硅主板上的两个层组成，并且用一步复制模制成聚二甲基硅氧烷(PDMS)来制造。所述微流体芯片可与玻璃基板粘合来完成。
在一些方面，所述硅主板可使用两个光刻工艺来制造(图2)。特征可以使用标准软件(例如，AutoCAD、Autodesk、San Rafael、CA)进行设计，并可写在铬蒙板上。在这种情况下，可以使用正性抗蚀剂光刻和深度反应离子蚀刻(DRIE)来形成第一层(图2)。第一层可以是微过滤器特征。在一些方面，通过可包括DRIE工艺的工艺来获得正性光刻胶(例如，AZ1512)。DRIE工艺可以达到适合各种特征的深度(例如，4.5-5μm)。
在一些方面，eDAR微流体芯片特征的第二层可使用负性光刻胶(例如，SU-8-3050，来自MicroChem，马萨诸塞州牛顿镇)来制造，并且可控制特征的高度(例如，50μm)。母版可使用例如十三氟-1,1,2,2-四氢辛基-1-三氯硅烷(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，密苏里州圣路易斯)来硅烷化。硅烷化后的母版和硅晶片可用未固化的PDMS涂覆并烘烤(例如，70℃下2小时)。在一些方面，可将具有所需微特征的PDMS片从硅母板上剥离下来，然后用等离子体氧化的标准工艺来粘合盖板玻璃片以完成eDAR微流体芯片的制造。
微流体芯片可以包含专门区域，包括染色区域、成像区域和其他区域。在一些方面，所述区域可以是用于至少一个目的的相同区域。在其他情况下，所述区域可以是用于一个目的的不同区域。在其他情况下，所述区域可以是用于至少一个目的的不同区域。每个区域可以用于多个目的。在一些方面，所述eDAR微流体芯片包括一个由标准光刻方法制造的集成过滤区域。在一些方面，所述微流体芯片可以具有两个集成功能区域，即eDAR分选区域和基于狭缝结构的过滤单元。
微流体芯片中的通道
本文提供的公开描述了一种设备，其用于检测流体样本中的分析物(例如，稀有颗粒)，所述设备包括：(a)至少第一输入通道；(b)至少两个出口通道；(c)至少一个检测器，其能够检测生物流体的等分试样中的一个或多个稀有颗粒；(d)机构，其用于引导等分试样的流动；和(e)定级装置，其能够基于等分试样中稀有颗粒的存在、不存在、相同性、组成或数量对等分试样分配值，其中所述数字处理器(例如，计算机)与检测器和用于引导等分试样的流动的机构连通。
在一些方面，本文提供的设备可包括由壁包围而成和/或在基材上微制造而成的流动通道，其具有将对分析物(例如，稀有细胞)的意外损坏最小化的设计特征。减少稀有细胞的意外损坏可以减少导致错误的患者诊断或预后的假阴性的发生率。所述流动通道可还包括具有流体动力学设计的孔的通道，以排除具有最小应力或破坏的生物细胞。流动通道如美国专利公开号2007/0037172和2008/0248499中所述。在前述专利申请中被称为具有一维(“1-D”)孔的这样的通道降低了细胞在细胞排除过程期间经历的流体动力学压力，并因此降低了细胞裂解的可能性。具有1-D孔的通道可根据美国专利公开号2008/0318324中所述的“流出过滤”被策略性地排列在阵列中，以进一步重定向、划分、抑制、或分散流动，从而降低排除时细胞经历的冲击力。包围流动通道的所述壁可使用UV固化工艺根据PCT/US2009/002426中所述的方法、由医用装置级聚合物的生物相容性基材材料制造，因此所述eDAR设备可符合规定医用装置制造的法规。
用于将流体引入分选结点的分选区域中的主通道可具有特定的高度(例如，50μm)和特定宽度(例如，150μm)。在大多数情况下，其它通道(例如，四个)可具有特定高度(例如，50μm)和特定宽度(例如，200μm)。过滤单元中的基于狭缝结构的过滤器可具有特定高度(例如，5μm)和特定宽度(例如，5μm)。所述微流体芯片可在狭缝结构中包括至多50000个狭缝。
在一些方面，所述eDAR设备可还包括用基于所述定级引导所述等分试样的通道。所述通道可以用抗凝化合物，优先结合到分析物(例如，稀有生物颗粒)上的化合物，防止稀有生物颗粒结块的化合物或其组合处理。
在一些方面，本文提供的所述eDAR设备可包括多个流动通道，包括一个或多个输入流动通道(例如，将等分试样带入检测体积的通道)和一个或多个输出通道(例如，将等分试样带离检测体积的通道)。在一些方面，本文提供的所述eDAR设备可包括至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、或更多的输入通道与至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、或更多的输出通道的组合。在一些方面，本文提供的所述eDAR设备可包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、或更多的输入通道与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、或更多的输出通道的组合。在一些方面，设备可包括连接到主通道的多重流动通道，以注入额外的流体以改变局部速度。
在一些方面，流体从作为微流体芯片的一部分的通道被输送到与通道流体连通但在微流体芯片外部的腔室。在一些方面，所述腔室是小瓶。在其它方面，所述腔室是单个孔或孔板中的孔。在其它方面，所述腔室是微量离心管。在其它方面，所述腔室是微量离心管，其中所述微量离心管是Eppendorf管。可以将任何合适的结构用于小瓶，并且本领域普通技术人员可以容易地识别出适合与本公开一起使用的腔室。
在一些方面，流体通过管或用于输送流体的其它合适的结构被从通道输送到与通道流体连通的腔室。该管可以包括由生物相容性聚合物构成的材料。在其它方面，所述腔室可以通过毛细管(如熔融二氧化硅毛细管)与通道流体连通，其被用于例如进行毛细管电泳。适用于将通道与腔室流体连通的其他类型的管对于本领域普通技术人员将是显而易见的。
如本文所述，术语“流体连通”(及其变体)是指组件之间存在流体路径。流体连通既不暗示也不排除任何中间结构或组件的存在。在某些情况下，即使两个组件之间的路径被阻塞和/或流体在两个组件之间不流动，两个组件也可以处于流体连通状态。因此，在流体连通的某些方面中可考虑间歇性的流体流动。
在一些方面，本文提供的设备可包括由壁包围而成的流动通道或腔室，所述壁由包括但不限于聚合物材料(聚二甲基硅氧烷(PDMS)，聚氨酯甲基丙烯酸酯(PUMA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯、聚酯(PET)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚碳酸酯、聚对二甲苯、聚氯乙烯、氟乙基丙烯、莱克桑(lexan)、聚苯乙烯、环烯烃共聚物、环烯烃聚合物、聚氨酯、聚酯碳酸酯、聚丙烯、聚丁烯、聚丙烯酸酯、聚己内酯、聚酮、聚邻苯二甲酰胺、乙酸纤维素、聚丙烯腈、聚砜、环氧聚合物、热塑性材料、含氟聚合物、和聚偏二氟乙烯、聚酰胺、聚酰亚胺)、无机材料(玻璃、石英、硅、GaAs、氮化硅)、熔融二氧化硅、陶瓷、玻璃(有机)、金属和/或其它材料以及它们的组合的材料制造而成。
在一些方面，壁材料可用多孔膜、羊毛的织造或非织造纤维(如布或网)、金属(例如，不锈钢或蒙乃尔合金)、玻璃、纸、或合成物(例如，尼龙、聚丙烯、聚碳酸酯、聚对二甲苯、和各种聚酯)、烧结的不锈钢和其他金属、以及多孔无机材料如氧化铝、二氧化硅或碳制成。
在一些方面，本文提供的设备可以包含已用化学或生物分子预处理的流动通道或腔室。例如，通道或腔室可以用以下处理：抗凝化合物，以防止或减少流体样本中分析物(例如，稀有颗粒或细胞)的缔合，优先与分析物(例如，稀有颗粒或细胞)结合的化合物，或防止或减少流体样本中分析物(例如，稀有颗粒或细胞)的团聚或聚集的化合物。
在一些方面，所述通道或腔室的表面可以用抗凝化合物，优先结合循环肿瘤细胞的化合物，或防止细胞粘连的化合物处理。
在一些方面，通道或腔室的表面可以进行化学修饰以增强润湿性，或帮助选择细胞、颗粒或分子的吸附。表面修饰化学品可包括但不限于硅烷如三甲基氯硅烷(TMCS)、六甲基二硅氮烷(HMDS)、(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)-三氯硅烷、氯二甲基辛基硅烷、十八烷基三氯硅烷(OTS)或γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷；聚合物如丙烯酸、丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺(DMA)、2-丙烯酸羟乙酯、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚亚乙基亚胺(PEI)、聚乙二醇(PEG)、环氧聚二甲基丙烯酰胺(EPDMA)、或PEG-丙烯酸单甲氧基酯；表面活性剂如Pluronic表面活性剂、聚(乙二醇)基(PEG)表面活性剂、十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基三甲基氯化铵(DTAC)、十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)、或聚凝胺(PB)；纤维素衍生物如羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)；胺如乙胺、二乙胺、三乙胺或三乙醇胺，含氟化合物如那些包含聚四氟乙烯(PTFE)或特氟龙的材料。
过滤
本文提供的eDAR设备还包括过滤器元件。在一些方面，所述过滤器元件可以是以下形式：微支柱(micro-post)、微屏障、微撞击器、微筛、具有比生物颗粒小的孔的通道、具有孔的通道(其可防止生物颗粒进入孔，但是可以允许流体继续通过孔在生物颗粒周围流动(“1-D通道”))、微珠、多孔膜、壁上的突起、粘合剂涂层、羊毛的织造或非织造纤维(如布或网)、金属(例如，不锈钢或蒙乃尔合金)、玻璃、纸、或合成物(例如，尼龙、聚丙烯、聚碳酸酯、聚对二甲苯、和聚酯)、烧结的不锈钢和其他金属、以及多孔无机材料如氧化铝、二氧化硅。在一些情况下，可以使用2层制造技术来形成过滤器元件。
在一些方面，过滤器元件中的孔的阵列被配置为使得感兴趣的颗粒(如稀有颗粒或细胞)不能通过过滤器元件的孔，同时至少一个其它颗粒能够通过过滤器元件的孔。在一些方面，过滤器元件中的孔的阵列被配置为使得感兴趣的颗粒(如稀有颗粒或细胞)能通过过滤器元件的孔，同时至少一个其它颗粒不能够通过过滤器元件的孔。
在一些方面，所述eDAR微流体芯片可用微狭缝来制造(图7A)。微狭缝可用于捕获稀有细胞，而无需保留任何其他非特异性颗粒(例如，红细胞，RBC)。微狭缝的尺寸可改变。在一些方面，微狭缝的高度可少于或等于约0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、50μm、75μm或100μm高。在一些方面，微狭缝的高度可在约0.1-5μm、1-10μm、5-15μm、10-30μm、15-40μm、20-50μm、30-75μm和50-100μm高的范围内。在一些方面，微狭缝的宽度可少于或等于约0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、50μm、75μm或100μm长。在一些方面，微狭缝的宽度可在约0.1-5μm、1-10μm、5-15μm、10-30μm、15-40μm、20-50μm、30-75μm和50-100μm长的范围内。例如，微狭缝可具有5μm的高度和5μm的宽度(图7B)。
在一些方面，微狭缝的高度可少于或等于0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、50μm、75μm或100μm高。在一些方面，微狭缝的高度可在0.1-5μm、1-10μm、5-15μm、10-30μm、15-40μm、20-50μm、30-75μm和50-100μm高的范围内。在一些方面，微狭缝的宽度可少于或等于0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、50μm、75μm或100μm长。在一些方面，微狭缝的宽度可在0.15μm、1-10μm、5-15μm、10-30μm、15-40μm、20-50μm、30-75μm和50-100μm长的范围内。
在一些方面，微流体芯片可制备为具有100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、20000、30000、40000、或50000个孔或微狭缝。在其它方面，微流体芯片可制备为具有多于100、多于200、多于300、多于400、多于500、多于600、多于700、多于800、多于900、多于1000、多于5000、多于20000、多于30000、多于40000、或多于50000个孔或微狭缝。在一些方面，具有更多微狭缝的微流体芯片的压力可能更低。例如，具有20000个狭缝的eDAR微流体芯片需要在两侧缓冲通道上施加小于4psi的压力以平衡流体动力学切换过程。在一些方面，穿过微滤器的较低压力可最小化分离的稀有细胞的应力和变形。
微狭缝可用作过滤的来源。在一些方面，微狭缝可由任何允许分选并且在成像期间不会引起像差(例如，PDMS)的材料制造，并用一片盖玻片粘合以用于成像***(图7C和7D)。在一些方面，所述微狭缝可以是微滤器的组件。例如，微滤器可以是具有()()至少一个的尺寸(例如，宽度、高度、深度、或直径)为1微米至100微米的狭缝(例如，微狭缝)、穴(例如，微穴)、或孔的过滤器元件。
在某些方面，将微缝隙用于过滤可提高成像精度和枚举捕获的细胞。在某些方面，微狭缝可以提高对捕获的稀有细胞进行第二轮标记的速度和效率。例如，可以将标记有抗EpCAM-PE的两个癌细胞捕获在微狭缝中(图7E)。可以固定、透化并用抗细胞角蛋白-Alexa488、抗CD45-Alexa700、抗Her2-Alexa647和Hoechst标记该细胞。
流体动力学分选
影响eDAR平台特征和性能的两个关键因素是(1)高效和主动的分选方案，以及(2)随后的高效纯化(例如，纯化腔室)方案。微流体芯片和流体动力学切换机构的分析性能可针对特定的回收效率(例如，95％)、特定的假阳性(例如，0)和特定的通量(例如，每小时4.8mL全血)进行优化。
在一些方面，根据稀有颗粒的性质、组成或数量，用于引导流动的机构将包含稀有颗粒的等分试样的流动引导至多个出口通道之一。用于引导等分试样的流动的机构可在等分试样包含稀有颗粒的情况下使其进入第一出口通道，或在等分试样不包含稀有颗粒的情况下使其进入第二出口通道。
在一些方面，用于引导等分试样的流动的机构可包括电极、磁性元件、声学元件、电动元件、电场、压电阀、或磁场。在其它情况下，用于引导等分试样的流动的机构可包括一个或多个电动阀或活塞，其中，阀或活塞控制至少第一定向流动通道中的液体的流动，所述第一定向流动通道在第一结点与第一输入通道和两个出口通道相交。
在一些方面，本文提供的设备可包括一个或多个电极，其用于对颗粒、等分试样、或流体样本的轨道或流动的跟踪和/或操纵。在一些方面，本文提供的设备可包括一个或多个电极，其用于对整体或一组颗粒或等分试样的轨道或流动的跟踪和/或操纵。在这种情况下，基于介电或电润湿现象，电极可以增强等分试样的分离。
在其他情况下，本文提供的设备可以进一步包括用于分离与磁性颗粒结合或被磁性颗粒结合的稀有颗粒(例如，细胞)的磁性元件。在其他情况下，本文提供的设备可以进一步包括用于分离与至少一个磁性颗粒结合或被至少一个磁性颗粒结合的整体或一组稀有颗粒(例如，细胞)的磁性元件。在一些方面，所述磁性元件可增强基于附着在颗粒或细胞上的微磁性或纳米磁性颗粒或细胞的磁化率的等分试样、颗粒、或细胞的分离。在一些方面，所述磁性元件可增强基于附着在至少一个颗粒或细胞上的微磁性或纳米磁性颗粒或细胞的磁化率的对整体或一组颗粒或细胞的分离。
eDAR设备可以在收集侧安装一个第二线共焦检测窗口，以实时监控流体动力学切换的效率。在一些方面，可以将eDAR设备与共焦成像配对。
在一些方面，所述流体动力学切换可以通过螺线管和两侧缓冲线中的压降来控制。螺线管可位于稀有细胞收集通道。在一些方面，该螺线管在左侧处于关闭位置，而“阴性”等分试样则在右侧进入废物通道(图1A)。打开螺线管时，包含缓冲液的两侧通道之间的压降会将血液流动从废物通道切换到收集侧。此切换可以在不到10毫秒(例如，2-3ms)内发生以收集稀有颗粒(例如，细胞)。
在一些方面，可使用各种流体动力学分选方案。本公开提供八种不同的流体动力学分选方案(图3)。流体样本(例如，血液)可以从主通道中注入，显示为深黑色流。缓冲液(微流体芯片中的浅灰色)可以在两侧通道中流动，稀有细胞可以被收集到左下通道，废物可以被引导到右下通道。矩形块代表螺线管(请参阅“螺线管”)。可以将螺线管设置为常开(N.O.)或常闭(N.C.)，分别用深灰色或浅灰色块指示(图3)。
微流体芯片的通道可能在结点处相交。在一些方面，一个通道在结点处与不同的通道相交。在一些方面，一个通道在一个结点处与多个不同的通道相交。在一些方面，一个通道在结点处与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个不同的通道相交。在一些方面，多个通道在结点处与不同的通道相交。在一些方面，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个不同的通道在结点处与一个不同的通道相交。
微流体芯片的通道可能在结点处不相交。在一些方面，一个通道在微流体芯片上不是结点的位置与不同的通道相交。在一些方面，一个通道在微流体芯片上不是结点的位置与多个不同的通道相交。在一些方面，一个通道在微流体芯片上不是结点的位置与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个不同的通道相交。在一些方面，多个通道在微流体芯片上不是结点的位置与不同的通道相交。在一些方面，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个不同的通道与一个不同的通道在微流体芯片上不是结点的位置处相交。
螺线管与流动调节
eDAR设备包括控制流体的流动和流体动力学分选方案的螺线管。在一些方面，螺线管可以是活塞。例如，螺线管活塞是电动电磁阀的子组件。在一些方面，所述电动电磁阀是压电阀。在某些方面，螺线管活塞可以通过模制嵌入设备中。在一些方面，螺线管可以是阀。例如，嵌入式螺线管活塞可以被通过管流体连通的电磁阀代替。
在一些方面，所述eDAR设备可包括一个螺线管。在其它情况下，所述eDAR设备可以包含多个螺线管。例如，所述eDAR设备可包括多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个螺线管。在一些方面，至少一个螺线管可被打开。例如，可以使用打开的螺线管来从微流体装置的一部分流到微流体装置的另一部分。在一些方面，多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个螺线管可被打开。在一些方面，一部分可以是样本的入口点。在一些方面，一部分可以是废物通道。在一些方面，一部分可以是分选腔室。在一些方面，至少一个螺线管可以是常开(N.O.)。在一些方面，多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个螺线管可以是常开。
在一些方面，螺线管可被关闭。例如，可以使用关闭的螺线管来防止从微流体装置的一部分流到微流体装置的另一部分。在一些方面，至少一个螺线管可被关闭。在一些方面，多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个螺线管可被关闭。在一些方面，一部分可以是样本的入口点。在一些方面，一部分可以是废物通道。在一些方面，一部分可以是分选腔室。在一些方面，至少一个螺线管可以是常闭(N.C.)。在一些方面，多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个螺线管可以是常闭。
在一些方面，螺线管可以从打开切换为关闭。例如，可以关闭打开的螺线管来用于防止从微流体装置的一部分流到微流体装置的另一部分。在一些方面，至少一个螺线管可以从打开切换为关闭。在一些方面，多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个螺线管可从打开切换为关闭。在一些方面，一部分可以是样本的入口点。在一些方面，一部分可以是废物通道。在一些方面，一部分可以是分选腔室。
在一些方面，螺线管可以从关闭切换为打开。例如，可以打开关闭的螺线管以用于从微流体装置的一部分流到微流体装置的另一部分。在一些方面，至少一个螺线管可以从关闭切换为打开。在一些方面，多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个螺线管可从关闭切换为打开。在一些方面，一部分可以是样本的入口点。在一些方面，一部分可以是废物通道。在一些方面，一部分可以是分选腔室。
在一些方面，可用于eDAR的流体微流体芯片的结构和相应的流体动力学分选方案如图3所示。当单个通道上有出口或入口时，可以标记螺线管的位置。例如在图3F中，第二螺线管的位置可以是“中心废物”，这意味着它位于废物收集通道的中心出口。在每种方案中，除了图3所示的方案，当“阳性”事件可被检测到时，可以改变施加在螺线管上的DC电压以触发分选，并在可一段时间后恢复到正常状态。在一些方面，可使用4个单独的步骤以控制分选(例如，图3G中所示的方案)。两个螺线管都可以关闭，并且流体可以流动到废物通道。分选可被触发，这可以打开收集侧的螺线管以执行切换步骤。收集细胞后，可以打开另一个螺线管以执行切回步骤。流体流动完全切换回正常状态后，可以同时关闭两个螺线管。下表1给出了本文所述的八个不同的流体动力学分选方案的流体构造和性能的汇总。在一些方面，使用两个螺线管(例如，图3C、3E、和3G所示的方案)。
表1 8个分选方案的流体构造和性能的汇总。
在一些方面，可以使用芯片外螺线管。芯片外螺线管可针对大部分方法关闭。可采用电压(例如，5V DC电压)来打开芯片外螺线管。芯片外螺线管可以快速打开(例如，小于或等于三毫秒)。如果使用芯片外螺线管，可以修改微流体芯片的制备，并可以将螺线管与微通道连接。在一些方面，可以使用芯片上螺线管。芯片上螺线管可针对大部分方法关闭。可采用电压(例如，5V DC电压)来打开芯片上螺线管。芯片上螺线管可以快速打开(例如，小于或等于三毫秒)。如果使用芯片上螺线管，可以修改微流体芯片的制备，并可以将螺线管与微通道连接。
例如，在该方案中，使用芯片外螺线管。可以使用注射泵(图4A)将标记的流体样本注入微流体芯片的顶部通道。缓冲液流过的两个侧通道可用于控制主动分选步骤。两个端口位于右侧通道上，并且都连接到加压缓冲液源。芯片外螺线管可以连接到分选结点附近的端口，以控制流体动力学切换。使用芯片外螺线管的切换过程可以是稳定的，并可以在105个开关周期中保持稳定性。
在某些方面，可以在缓冲线上放置列式螺线管，以防止流体样本与螺线管接触。这可以消除样本腐烂和交叉污染的可能性。在使用eDAR设备和方法期间，稀有细胞收集通道中可能存在恒定的缓冲液流动。芯片上螺线管可以提高后续纯化(例如，纯化腔室)步骤的效率，并可以防止细胞聚集物的形成。
在某些方面，可以使用检测体积的上游或下游的以下之一来调节eDAR设备中流体的流动：螺线管、阀、气泡、电场、磁场、光场、气压源、固体颗粒、膜、不互溶的液滴、重力差、或改变通道的表面张力的涂层。可以使用检测体积的上游或下游的以下之一来调节eDAR设备中流体的流动：第二螺线管、第二阀、第二气泡、第二电场、第二磁场、第二光场、第二气压源、第二固体颗粒、第二膜、第二不互溶的液滴、第二重力差、或改变通道的表面张力的第二涂层。随着细胞在检测体积中的移动，流动可被停止、减速或加速。
在一些方面，可以在检测期间保持流体样本通过流动通道的连续流动。在一些方面，各个等分试样可能没有被物理性分离，而是可用光学检测步骤和/或分选步骤来定义。
例如，可以将流动引导到可用于收集废物的通道中(图4B)。分选结点之后可以有两个通道。左通道可以收集阳性等分试样，将它们递送到过滤和收集区域以进一步纯化(例如，纯化腔室)；右通道收集废物(例如，阴性等分试样)。在这种情况下，当等分试样被列为“阴性”并保持闭合时，螺线管将不被施加任何电压(图4B)。在1号和3号缓冲液源(图4A)之间进行初始压降后，可能会发生流动模式的变化。可以通过第一个检测窗口检测到阳性事件。在这种情况下，可将DC电压(例如，5V)施加到螺线管上，以打开来自缓冲液储存器(例如，No.2)的缓冲液流。右侧的缓冲通道的减小的流动阻力可以产生更高的流速。可以从右侧向左推动流体流动以收集阳性等分试样(图4C)。可通过第二检测窗口收集并确认等分试样。在一些方面，螺线管可以关闭以将流体流动切回废物收集通道(图4D)。切换和切回所需的时间可以少于20毫秒，在示例性情况下，该时间是或者在2-3毫秒之间(表1和图5；帧速＝1918帧/秒)。在一些方面，所使用的条件可以重复进行105次以上的切换周期。
在一些方面，流动可例如通过引入流体动力学流体压力的方法和装置来递送，该方法和装置包括但不限于基于机械原理(例如，外部注射泵、气动膜泵、振动膜泵、真空装置、离心力和毛细作用)；电学或磁原理(例如，电渗流，电动泵压电/超声波泵、磁流体塞、电流体泵、和磁流体泵)；热力学原理(例如，气泡产生/相变引起的体积膨胀)；表面润湿原理(例如，电润湿、化学、热力学和放射性诱导的表面张力梯度)进行操作的那些。
在另一些情况中，流体可以通过以下提供的流体驱动力进行递送或引导：重力进料、表面张力(如毛细作用)、静电力(电流动)、离心流(基材置于光盘上并旋转)、磁力(振荡离子引起流动)、磁流体动力和真空或压力差。
在一些方面，流体流动控制装置(如用于引导流体动力学流体压力或流体驱动力方法和装置所列举的那些)可以结合到本主题的输入端口或输出端口。在一些方面，多个端口设置在入口或出口中的一个或两个，并且一个或多个端口被结合到流体流动控制装置。
渡越时间
分析物(例如，稀有细胞或循环肿瘤细胞(CTC))可从第一检测窗口流动到第二检测窗口。第一窗口中记录决策APD峰与确认信号检测之间所经过的时间可以是用于分选分析物的渡越时间。在一些方面，渡越时间可以变化。在一些方面，线性流速可影响渡越时间。在一些方面，微通道的层流动可影响渡越时间。在一些方面，体积流速可设为40μL/分钟(图6B)。在一些方面，体积流速可以是约1μL/分钟、2μL/分钟、3μL/分钟、4μL/分钟、5μL/分钟、6μL/分钟、7μL/分钟、8μL/分钟、9μL/分钟、10μL/分钟、11μL/分钟、12μL/分钟、13μL/分钟、14μL/分钟、15μL/分钟、16μL/分钟、17μL/分钟、18μL/分钟、19μL/分钟、20μL/分钟、21μL/分钟、22μL/分钟、23μL/分钟、24μL/分钟、25μL/分钟、30μL/分钟、35μL/分钟、40μL/分钟、45μL/分钟、50μL/分钟、55μL/分钟、60μL/分钟、65μL/分钟、70μL/分钟、75μL/分钟、80μL/分钟、85μL/分钟、90μL/分钟、95μL/分钟、100μL/分钟、或200μL/分钟。
在一些方面，流速可以在约1μL/分钟-5μL/分钟、3μL/分钟-10μL/分钟、5μL/分钟-15μL/分钟、10μL/分钟-20μL/分钟、15μL/分钟-30μL/分钟、20μL/分钟-40μL/分钟、30μL/分钟-50μL/分钟、40μL/分钟-60μL/分钟、50μL/分钟-70μL/分钟、60μL/分钟-80μL/分钟、70μL/分钟-90μL/分钟、80μL/分钟-100μL/分钟、90μL/分钟-100μL/分钟或90μL/分钟-200μL/分钟的范围内。在其它情况下，体积流速可设为80μL/分钟(图6B)。
在一些方面，体积流速可以是1μL/分钟、2μL/分钟、3μL/分钟、4μL/分钟、5μL/分钟、6μL/分钟、7μL/分钟、8μL/分钟、9μL/分钟、10μL/分钟、11μL/分钟、12μL/分钟、13μL/分钟、14μL/分钟、15μL/分钟、16μL/分钟、17μL/分钟、18μL/分钟、19μL/分钟、20μL/分钟、21μL/分钟、22μL/分钟、23μL/分钟、24μL/分钟、25μL/分钟、30μL/分钟、35μL/分钟、40μL/分钟、45μL/分钟、50μL/分钟、55μL/分钟、60μL/分钟、65μL/分钟、70μL/分钟、75μL/分钟、80μL/分钟、85μL/分钟、90μL/分钟、95μL/分钟、100μL/分钟、或200μL/分钟。
在一些方面，流速可以在1μL/分钟-5μL/分钟、3μL/分钟-10μL/分钟、5μL/分钟-15μL/分钟、10μL/分钟-20μL/分钟、15μL/分钟-30μL/分钟、20μL/分钟-40μL/分钟、30μL/分钟-50μL/分钟、40μL/分钟-60μL/分钟、50μL/分钟-70μL/分钟、60μL/分钟-80μL/分钟、70μL/分钟-90μL/分钟、80μL/分钟-100μL/分钟、90μL/分钟-100μL/分钟或90μL/分钟-200μL/分钟的范围内。可使用更高的流速来实现更低的渡越时间(图6C)。
检测
本公开提供一种使用微流体芯片的eDAR设备，其可以配备检测***。在一些方面，所述检测***可包括线共焦检测方案。在线共焦检测方案中，两个激光源(例如，488和633nm)使用一系列二向色镜、柱面透镜和分光镜来形成检测窗口(例如，两个)。第一检测窗可以同时重叠两个激光光束，并且可以用于检测来自标记的稀有细胞(例如，CTC)的荧光信号。第二检测窗口可以用于在分选的等分试样中确认稀有细胞的识别、或稀有细胞的缺少。第二检测窗口可以进一步用于监视分选效率。
在一些方面，两个稀有颗粒可被同时检测。每个稀有颗粒可以与唯一的检测试剂接触，并且每个检测试剂可以通过两个检测装置之一进行检测。而且，当检测试剂包括荧光部分，可以使用两个问询装置(例如，两个激光)，以对应不同的荧光部分的激发波长在不同的波长产生辐射。各自的荧光辐射可以通过两个不同的检测装置进行检测。在一些方面，所述检测试剂可以通过不同波长的荧光来区分。
在一些方面，两种或更多稀有颗粒可以以串联的方式进行检测。例如，所述方法可包括在eDAR设备的第一位置检测第一稀有颗粒并在eDAR设备的第二位置检测第二稀有细胞。在该情况下，在第一检测步骤、第二检测步骤、或两个检测步骤之后，第一和第二颗粒所驻留的等分试样可被引导至新的位置。
在某些方面中，检测事件可以以常规的频率发生。所述频率可与检测体积的大小和流体样本的流速相关。特定设备的检测体积可在0.1-100μL(例如，10μL)的范围内(包括其极限)，并且流体样本可以在设备中以1-1000μL/秒(例如，100μL/秒)的范围(包括其极限)流动，不同的等分试样可在每隔0.001–1秒(例如，0.1秒)的范围内(包括其极限)、或以速率1-100Hz(例如，10Hz)的范围内(包括其极限)检测到。
在一些方面，设备的几何形状和要处理的流体的体积会影响速率。例如，等分试样可以以0.1kHz至100MHz的范围内(包括其极限)的速率穿过检测体积。在一些方面，所述等分试样可以以10Hz至10MHz的范围内(包括其极限)或约10MHz的速率穿过检测体积。在一些方面，所述等分试样可能以0.1kHz至100MHz的范围内或约100MHz、或1kHz或约1kHz至10MHz或约10MHz的范围内的频率，1kHz至5MHz的范围内或约5MHz、或1kHz或约1kHz至10MHz或约10MHz的范围内的频率，或1kHz或约1kHz至1MHz或约1MHz的范围内(包括其极限)的频率穿过检测体积。在一些方面，等分试样穿过检测体积的频率可以是至少约0.1kHz，或至少约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、或900kHz，或至少约1MHz，或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100MHz。在一些方面，等分试样穿过检测体积的频率可以是至少0.1kHz，或至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、或900kHz，或至少1MHz，或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100MHz。
在一些方面，从流体样本的等分试样中的分析物(例如，细胞)的整体检测特征可以是同时的或随时间累积的。例如，特征的检测可以同时从包含分析物整体的大型等分试样中进行。在同时模式下，颗粒可以由可变速度的流动携带。在其他情况下，当颗粒横穿检测体积时，它们可以被稳定的流动携带。
在多个方面中，eDAR设备和方法允许同时从多个分析物(例如，多个细胞)中检测信号。在一些方面，基于从等分试样中存在的多个分析物同时检测到的信号对等分试样进行定级。
在其它情况下，本文中的方法提供对来自整体细胞的特征的检测，其经时地(“累积”)从与单个细胞相似的小的检测体积中散发出来，但多个细胞通过流动穿过检测体积。eDAR的累积模式不同于单个生物颗粒散发出的连续信号或帧的延时叠加；单个生物颗粒的延时叠加并不构成生物颗粒的整体。在同时和累积中，仅在检测到来自整体细胞的特征后才做出决定。
在一些方面中，所述检测器选自摄影机、电子倍增器、电荷耦合器件(CCD)图像传感器、光电倍增管(PMT)、雪崩光电二极管(APD)、单光子雪崩光电二极管(SPAD)、硅光电倍增管(SiPM)、和互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器。在一些方面，本文提供的eDAR设备可包括光、电、声或磁性检测器，以跟踪选择的细胞的运动或枚举等分试样中存在的选择颗粒或细胞。
在一些方面，本文提供的设备或方法可以以各种结构结合荧光(单色或多色)显微镜成像，包括但不限于明场、落射(epi)、共焦、反射(trans)、DIC(微分干涉对比)、暗场、霍夫曼、或相差。
在一些方面，本文提供的设备可包括多个检测装置，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多检测装置。多个检测装置可用于进行本公开的方法，例如，其中存在于流体样本的多个稀有颗粒或细胞，多个细胞标记物被用于区分不同的细胞类型，或多个检测试剂被用于同时检测。在一些方面，所述检测装置可包括验证激光。例如，所述验证激光可被用于问询分选的等分试样。在一些方面，用验证激光检测的分选的等分试样可以是阳性等分试样并在分选后被保留。在一些方面，用验证激光检测的分选的等分试样可以是阴性等分试样并可在分选后被丢弃。例如，所述验证激光可用作第二检测方法控制eDAR分选方案的精度。
辐射源和装置
本公开提供用于eDAR的设备，其包括检测装置或成像装置以及定级装置(例如，计算机)。在一些方面，激光(或多个激光)可用作问询装置。带有光电二极管、光电倍增管或照相机的倒置显微镜可用作检测装置。可以在通道和检测装置之间的通路中放置一个遮罩。
在一些方面，所述问询装置(例如，488nm固态二极管泵浦激光和633nm HeNe激光)可被引导至倒置显微镜。两个激光光束可使用圆柱形光学器件或衍射光学器件来塑形以在进入显微镜物镜前形成长宽比10比1的准直椭圆光束。通过使用半波片和偏振分光镜的组合，可以调节每束光的强度，而反射镜则独立地控制光，以创建空间共定位激发区域。来自生物颗粒的荧光可以在通过带通过滤器之前，被两个二向色镜分成三个波长带，然后重新聚焦于三个单光子雪崩光电二极管(SPAD)。一个SPAD可以在560-610nm的波长范围内收集荧光，第二SPAD可以在645-700nm的范围内收集荧光，而第三SPAD可以在500-540nm的范围内收集荧光。SPAD输出被定向到具有计数器/计时器板的数字处理器(例如，计算机)，并通过几种算法进行分析。
在一些方面，数字处理器接受来自检测装置的信号并通过算法对等分试样进行定级。所述数字处理器可基于定级值(例如，流体样本中稀有颗粒的存在、不存在、相同性、组成或数量)将等分试样引导到合适的通道。eDAR可包括一个、两个、三个、四个、五个或六个检测装置以及一个、两个、三个、四个、五个或六个问询装置、或大量的检测装置和问询装置。
双重捕获eDAR
本公开还提供用于“双重捕获”版本的eDAR的设备。双重捕获设备可以从混合流体的同一样本中分离出两个不同的稀有细胞亚群。这可以同时在单个微流体芯片上进行。两个亚群可以进一步被分开捕获在微流体芯片上的两个不同区域上。
图8中描绘了微流体eDAR装置的双重捕获版本的一般结构。样本可以用至少两个与独特的荧光标签偶联的独特抗体标记。例如，所述样本(例如，血液)可用与和样本中分析物上的标记物(例如，上皮、抗-EpCAM-PE)结合的独特的荧光团结合的第一标签、和与和样本中分析物上的标记物(例如，间质、抗-EGFR或抗-波形蛋白)结合的独特的荧光团结合的第二标签进行标记，每个荧光团可以具有不同的发射(例如，FITC)波长。标记的血液样本可被注入到微流体芯片中。表达EpCAM的稀有细胞可使用线共焦方案(如前述)检测并且峰可在黄色通道中检测。可以触发分选事件，以将特定的等分试样收集到收集通道(例如，收集通道#1)中。在一些方面，所述等分试样可被定级为对间质标记物阳性，然后稀有细胞可被分选到不同的收集通道(例如，收集通道#2)中。稀有细胞的两个亚群可以在双重捕获eDAR微流体芯片上被分开捕获并富集。
双重捕获eDAR设备可使用流体切换方案(图8)。标记的样本可以被引入到顶部的主通道中。缓冲液可流动到两侧通道中以使用两个螺线管控制血液流动的流体动力学切换。在一些方面，双重捕获eDAR的过滤区域可使用微狭缝(前述)建立。CTC的两个亚群可被分离并捕集在同一微流体芯片的两个不同过滤区域中。
双重捕获eDAR设备可包括螺线管。在一些方面，当等分试样被定级为阴性，两个螺线管都可以关闭(图9)。如果两个通道中的压力平衡，则样本可以作为废物流动到底部中心通道以被收集。在其他情况下，当等分试样仅对于两个标记物之一(例如，上皮)被定级为阳性时，可以打开螺线管#2以使样本流到左侧的收集通道中(图9B)。收集等分样本后，螺线管#2可以再次关闭，样本的流动返回中心通道。在一些方面，等分试样可仅对于一个标记物(例如，上皮)定级为阳性，而螺线管#1可以打开以允许样本向右通道(图9C)的流动。在某些方面，双重捕获eDAR设备中两种分选事件的响应时间都很短(例如，小于或等于3毫秒)。
分散
图19示出了示例性的分散级。分散级可包括流动拉伸器，如本文所述。分散级可包括抛物线流动轮廓的使用以分散细胞。分散级可包括使细胞向下流到多重流动路径以分散细胞。分散级可包括人字拉伸器，如本文所述。分散级可包括堰拉伸器，如本文所述。
如本文所述，分散级可用于从样本(例如，未分散的样本、第一分离样本、第二分离样本等)形成分散的样本或其部分。分散的样本可以是其中样本的两种或更多种组分分隔或分散的样本。例如，分散级可用于物理分隔或分散样本的两个细胞类型或细胞群，所述样本包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10个细胞类型或细胞群。
分散的体积可包括分散的样本。例如，包括样本(或其部分)的流体体积可被传递到分散级(例如，从第一分选级)，并且样本(或样本的部分)可在通过分散级后被分散。包括分散的样本(例如，在通过分散级后)的流体体积可以是分散的体积。
在一些情况下，分离或分散在分散的样本中的两个以上样本组分可以是相同流体体积的组分，或可以是不同的流体体积的组分(例如，在样本的分散期间形成自单一流体体积的多个流体体积)。包含样本的流体体积在被分散时(例如，在分散级中)，可形成两个以上分散的流体体积。在一些情况下，通过两个以上分散的体积之间的流体中的不连续性，两个以上分散的体积被彼此分离或分隔。例如，当流体体积通过分散级，形成自单一流体体积的两个分散的体积可通过第二流体(如气体或不互溶的流体)彼此分离(例如，在通道中)。
流动拉伸
图20A示出了示例性的流动拉伸器的俯视图。流动拉伸器可以包括一个或多个直线流动部分。例如，如图20A的上部所示，流动拉伸器可包括第一直线流动部分，其中包含颗粒的等分试样或流体的部分向右流动。如图20A的中下部所示，流动拉伸器可包括第二直线流动部分，其中包含颗粒的等分试样或流体体积部分以向下的角度向左行进。流动拉伸器可包括在任何方向上行进的任何数量的直线流动部分。直线流动部分可具有小于10微米、小于20微米、小于50微米、小于100微米、小于200微米、小于500微米、或小于1000微米的宽度。直线流动部分的宽度可以在上述任意两个值定义的范围内。
直线流动部分可以通过赋予等分试样或流体体积以流动分布，来拉伸包含颗粒的等分试样或流体体积。也就是说，等分试样或流体体积的不同部分可以以不同的速率流动通过直线流动部分，从而导致包含要收集的颗粒的等分试样或流体体积整体变长。直线流动部分可以赋予等分试样或流体体积以横向流量分布，使得流速在直线流动部分的宽度上变化。直线流动部分可能会使等分试样或流体体积产生抛物线流动分布。直线流动部分可具有小于10微米、小于20微米、小于50微米、小于100微米、小于200微米、小于500微米、或小于1000微米的高度。直线流动部分的高度可以在上述任意两个值定义的范围内。直线流动部分可具有小于10微米、小于20微米、小于50微米、小于100微米、小于200微米、小于500微米、或小于1000微米的宽度。直线流动部分的宽度可以在上述任意两个值定义的范围内。
人字流动拉伸
图20B示出了示例性的、与直线流动部分组合的人字流动拉伸器的俯视图。人字流动拉伸器可以包括一个或多个直线流动部分。例如，如图20B的上部所示，人字流动拉伸器可包括第一直线流动部分，其中包含颗粒的等分试样或流体体积向右流动。直线流动部分可以类似于图20A描述的直线流动部分。人字流动拉伸器可以包括一个或多个人字流动部分。例如，如图20B的中下部所示，人字流动拉伸器可包括人字流动部分，其中包含颗粒的等分试样或流体体积以向下的角度向左行进。人字流动拉伸器可以包括沿任意方向行进的任何数量的直线流动部分和沿任意方向行进的任何数量的人字流动部分。人字直线流动部分可具有小于10微米、小于20微米、小于50微米、小于100微米、小于200微米、小于500微米、或小于1000微米的宽度。人字流动部分的宽度可以在上述任意两个值定义的范围内。
人字流动部分可能包括一个或多个人字结构(v状结构，如图20B所示)。人字流动部分可能包括1、2、5、10、20、50、100、或多于100个人字结构。人字流动部分可能包括数量在上述任意两个值定义的范围内的人字结构。每个人字流动部分可能具有相同数量的人字结构。每个人字流动部分可能具有不同数量的人字结构。人字结构可具有小于10微米、小于20微米、小于50微米、小于100微米、小于200微米、小于500微米、或小于1000微米的宽度。人字结构的宽度可以在上述任意两个值定义的范围内。每个人字结构可能与其它人字结构分隔开小于10微米、小于20微米、小于50微米、小于100微米、小于200微米、小于500微米、或小于1000微米的距离。每个人字结构可以与其它人字结构分隔开一定距离，该距离在上述任意两个值所定义的范围内。
人字流动部分可以通过赋予等分试样或流体体积以混沌混合，来拉伸包含所要收集的颗粒的等分试样或流体体积。人字流动部分可具有小于10微米、小于20微米、小于50微米、小于100微米、小于200微米、小于500微米、或小于1000微米的高度。人字流动部分的高度可以在上述任意两个值定义的范围内。
堰拉伸
图21A示出了示例性的堰拉伸器的俯视图。堰拉伸器可以包括一个或多个直线流动部分。例如，如图21A的上部所示，堰拉伸器可包括第一直线流动部分，其中包含颗粒的等分试样或流体体积向右流动。直线流动部分可以类似于图21A描述的直线流动部分。堰拉伸器可以包括一个或多个堰部分。例如，如图21A的中下部所示，堰拉伸器可包括堰部分，其中等分试样或流体体积以向下的角度包含颗粒。堰拉伸器可以包括沿任意方向行进的任何数量的直线流动部分和沿任意方向行进的任何数量的堰部分。堰部分可具有小于10微米、小于20微米、小于50微米、小于100微米、小于200微米、小于500微米、或小于1000微米的宽度。堰部分的宽度可以在上述任意两个值定义的范围内。
堰部分可包括一个或多个堰结构(包括多个用于结构支持的支柱的流动部分，如图21A所示)。堰部分可能包括1、2、5、10、20、50、100、或多于100个堰结构。堰部分可能包括数量在上述任意两个值定义的范围内的堰结构。每个堰部分可能具有相同数量的堰结构。每个堰部分可能具有不同数量的人字结构。堰结构可具有小于10微米、小于20微米、小于50微米、小于100微米、小于200微米、小于500微米、或小于1000微米的宽度。人字结构的宽度可以在上述任意两个值定义的范围内。堰结构可具有小于10微米、小于20微米、小于50微米、小于100微米、小于200微米、小于500微米、或小于1000微米的长度。堰结构的宽度可以在上述任意两个值定义的范围内。每个堰结构可能与其它堰结构分隔开小于10微米、小于20微米、小于50微米、小于100微米、小于200微米、小于500微米、或小于1000微米的距离。每个堰结构可以与其它堰结构分隔开一定距离，该距离在上述任意两个值所定义的范围内。
堰部分可以基于细胞大小、形状或可变形性，赋予细胞运动以不同程度的阻力，从而拉伸颗粒。堰部分可具有小于10微米、小于20微米、小于50微米、小于100微米、小于200微米、小于500微米、或小于1000微米的高度。堰部分的高度可以在上述任意两个值定义的范围内。
图21A示出了示例性的长堰拉伸器的俯视图。堰拉伸器可能包括单个长的堰部分。长的堰部分可以类似于参考图21A描述的任何堰部分。
图22示出了示例性的基于屏障或过滤器的细胞拉伸器的俯视图。
通过障碍或多重流动路径的流动拉伸
图11示出了示例性的通过分散级与第二分选级连接的第一分选级的俯视图，该分散级包括各种设计的障碍或多重流动路径的通道。
图11A示出了在宽流动通道中包括多个障碍的分散级。如图11A所示，所述第一分选级可进行第一分选，如本文所述。第一分选级可将等分试样或流体体积传递到在宽流动通道中包括多个障碍的分散级。所述分散级可能包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10个宽流动通道。例如，所述分散级可能包括1个宽流动通道，如图11A所示。所述障碍可以是圆形形状，如图11A所示。所述障碍可以具有椭圆形、正方形、矩形、五边形、六边形或其他任何形状。所述障碍可提高或降低等分试样或流体体积的一个或多个子体积的流体路径长度。等分试样或流体体积的不同的子体积所经历的不同的路径长度可提高各种子体积中颗粒之间的平均距离。例如，所要收集的颗粒与等分试样或流体体积的其它颗粒之间的距离可能会增加。所述障碍可以是沿着流动通道的高度延伸的支柱。支柱可以为通道提供支持，并且可以帮助防止通道在用于构造通道的材料的重量下塌陷。所述分散级可将分散的体积传递至第二分选级。所述第二分选级可进行第二分选，如本文所述。
图11B示出了包括多个分支位置的分散级。如图11B所示，所述第一分选级可进行第一分选，如本文所述。第一分选级可将等分试样或流体体积传递到在通道中包括多个分支位置的分散级。所述分散级可能包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10个分支位置。例如，所述分散级可能包括4个分支位置，如图11B所示。在每个分支位置，等分试样或流体体积的不同的子体积可采取不同的流动路径。例如，第一子体积可能采取由以下组成的流动路径(从图11B的顶部到底部)：左，右，左，右。第二子体积可能采取采取由以下组成的流动路径：右，左，右，左。第一子体积可能采取比第二子体积更长的路径。因此，与第二子体积相比，第一子体积从第一分选级到第二分选级的行进时间可能更长。等分试样或流体体积的任意子体积可能采取任意可能的路径。多个分支位置可提高或降低等分试样或流体体积的一个或多个子体积的流体路径长度。等分试样或流体体积的不同的子体积所经历的不同的路径长度可提高各种子体积中颗粒之间的平均距离。例如，所要收集的颗粒与等分试样或流体体积的其它颗粒之间的距离可能会增加。分支可能包括沿着流动通道的高度延伸的支柱(在图11B中显示为半圆)。支柱可以为通道提供支持，并且可以帮助防止通道在用于构造通道的材料的重量下塌陷。所述分散级可将分散的体积传递至第二分选级。所述第二分选级可进行第二分选，如本文所述。
图11C示出了包括随后变宽和变窄的多个流动部分的分散级。如图11C所示，所述第一分选级可进行第一分选，如本文所述。第一分选级可将等分试样或流体体积传递到包括随后变宽和变窄的多个流动部分的分散级。所述分散级可能包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10个随后变宽和变窄的流动部分。例如，所述分散级可能包括3个随后变宽和变窄的流动部分，如图11C所示。变宽和变窄的流动部分可能具有菱形形状，如图11C所示。所述流动部分可以具有圆形、椭圆形、正方形、矩形、五边形、六边形或其他任何形状。所述流动部分可提高或降低等分试样或流体体积的一个或多个子体积的流体路径长度。等分试样或流体体积的不同的子体积所经历的不同的路径长度可提高各种子体积中颗粒之间的平均距离。例如，所要收集的颗粒与等分试样或流体体积的其它颗粒之间的距离可能会增加。随后变宽和变窄的部分可能进一步包括沿着流动通道的高度延伸的支柱(在图11C中显示为圆)。支柱可以为通道提供支持，并且可以帮助防止通道在用于构造通道的材料的重量下塌陷。所述分散级可将分散的体积传递至第二分选级。所述第二分选级可进行第二分选，如本文所述。
图11D示出了包括多个多重分支通道的分散级。如图11D所示，所述第一分选级可进行第一分选，如本文所述。第一分选级可将等分试样或流体体积传递到在通道中包括多个多重分支位置的分散级。每个多重分支位置可能包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于二个分支。例如，每个多重分支可能包括4个分支，如图11D所示。所述分散级可能包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10个多重分支位置。例如，所述分散级可能包括2个多重分支位置，如图11D所示。在每个多重分支位置，等分试样或流体体积的不同的子体积可采取多重不同的流动路径。例如，第一子体积可采取由以下组成的流动路径(从图11D的顶部到底部)：最右，最右。第二子体积可能采取采取由以下组成的流动路径：最左，最左。第一子体积可能采取比第二子体积更长的路径。因此，与第二子体积相比，第一子体积从第一分选级到第二分选级的行进时间可能更长。等分试样或流体体积的任意子体积可能采取任意可能的路径。多个多重分支位置可提高或降低等分试样或流体体积的一个或多个子体积的流体路径长度。等分试样或流体体积的不同的子体积所经历的不同的路径长度可提高各种子体积中颗粒之间的平均距离。例如，所要收集的颗粒与等分试样或流体体积的其它颗粒之间的距离可能会增加。分支可能包括沿着流动通道的高度延伸的支柱(在图11D中显示为大致为肾形)。支柱可以为通道提供支持，并且可以帮助防止通道在用于构造通道的材料的重量下塌陷。所述分散级可将分散的体积传递至第二分选级。所述第二分选级可进行第二分选，如本文所述。
图12示出了示例性的第一分选级的俯视图，其用不同的几何形状的通道与第二分选级连接。
图12A示出了包括形成蛇形通道的多个弯曲流动部分的分散级。如图12A所示，所述第一分选级可进行第一分选，如本文所述。第一分选级可将等分试样或流体体积传递到包括形成总体蛇形形状的多个弯曲流动部分的分散级。所述分散级可能包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10个弯曲部分。例如，所述分散级可能包括5个弯曲部分，如图12A所示。所述弯曲部分可提高或降低等分试样或流体体积的一个或多个子体积的流体路径长度。等分试样或流体体积的不同的子体积所经历的不同的路径长度可提高各种子体积中颗粒之间的平均距离。例如，所要收集的颗粒与等分试样或流体体积的其它颗粒之间的距离可能会增加。所述分散级可将分散的体积传递至第二分选级。所述第二分选级可进行第二分选，如本文所述。
图12B示出了包括多个随后变宽和变窄、与多个直线流动部分连接的流动部分的分散级。如图12B所示，所述第一分选级可进行第一分选，如本文所述。第一分选级可将等分试样或流体体积传递到包括随后变宽和变窄、与多个直线流动部分连接的多个流动部分的分散级。所述分散级可能包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10个随后变宽和变窄的流动部分。例如，所述分散级可能包括4个随后变宽和变窄的流动部分，如图12B所示。变宽和变窄的流动部分可能具有圆形形状，如图12B所示。变宽和变窄的流动部分可以具有椭圆形、正方形、矩形、五边形、六边形或其他任何形状。变宽和变窄的流动部分可能具有随变宽和变窄的流动部分的长度而变化的宽度(例如，流动部分可以从第一纵向位置的宽度“w1”变宽到第二纵向位置的宽度“w2”，如图12B所示)。所述变宽和变窄的流动部分可提高或降低等分试样或流体体积的一个或多个子体积的流体路径长度。等分试样或流体体积的不同的子体积所经历的不同的路径长度可提高各种子体积中颗粒之间的平均距离。例如，所要收集的颗粒与等分试样或流体体积的其它颗粒之间的距离可能会增加。所述分散级可将分散的体积传递至第二分选级。所述第二分选级可进行第二分选，如本文所述。
图12C示出了包括随后变宽和变窄的多个流动部分的分散级。如图12C所示，所述第一分选级可进行第一分选，如本文所述。第一分选级可将等分试样或流体体积传递到包括随后变宽和变窄的多个流动部分的分散级。所述分散级可能包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10个随后变宽和变窄的流动部分。例如，所胡分散级可能包括3个随后变宽和变窄的流动部分，如图12C所示。变宽和变窄的流动部分可能具有通常的菱形形状，如图11C所示。流动部分可能具有随流动部分的长度而变化的宽度(“w”，如图12C所示)(例如，流动部分可从第一纵向位置的宽度“w1”变宽到第二纵向位置的宽度“w2”)。在这种菱形流动部分的情况下，菱形的两侧可以以任何角度相交(θ，如图12C所示)。该角度可以大于0度。该角度可以小于180度。所述流动部分可提高或降低等分试样或流体体积的一个或多个子体积的流体路径长度。等分试样或流体体积的不同的子体积所经历的不同的路径长度可提高各种子体积中颗粒之间的平均距离。例如，所要收集的颗粒与等分试样或流体体积的其它颗粒之间的距离可能会增加。所述分散级可将分散的体积传递至第二分选级。所述第二分选级可进行第二分选，如本文所述。
多重分散策略
所述分散级可能组合两个以上的本文所述的分散策略。例如，所述分散级可能组合2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10个分散策略。分散级可以任何可能的组合和任何可能的顺序组合分散策略。
图13示出了与具有抛物线流动轮廓(profile)的直通道组合的示例性的人字拉伸器的俯视图。人字拉伸器可以与本文所述的任意人字拉伸器相似，如本文图20B所述的人字拉伸器。直通道可以与本文所述的任意直通道相似，如本文图20A所述的直通道。人字拉伸器和直通道可以以任何可能的顺序出现。
图14示出了示例性的与多重直通道组合的多重人字拉伸器的俯视图。所述装置可能包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10个人字拉伸器。每个人字拉伸器可以与本文所述的任意人字拉伸器相似，如本文图20B所述的人字拉伸器。所述装置可能包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10个直通道。每个直通道可以与本文所述的任意直通道相似，如本文图20A所述的直通道。人字拉伸器和直通道可以以任何可能的顺序出现。
图15示出了与直通道和堰拉伸器组合的示例性的人字拉伸器的俯视图。堰拉伸还可包括结构支柱。结构支柱可防止通道塌陷，如本文所述。所述装置可能包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10个人字拉伸器。每个人字拉伸器可以与本文所述的任意人字拉伸器相似，如本文图20B所述的人字拉伸器。所述装置可能包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10个直通道。每个直通道可以与本文所述的任意直通道相似，如本文图20A所述的直通道。所述装置可能包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10个堰拉伸器。每个堰拉伸器可以与本文所述的任意堰拉伸器相似，如本文图21A所述的堰拉伸器。人字拉伸器、直通道、和堰拉伸器可以以任何可能的顺序出现。
图16示出了具有与人字拉伸器组合的多重流体路径的示例性的流动拉伸器的俯视图。所述装置可能包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10个多重流体路径部分。每个多重流体路径部分可与本文所述的任意多重流体路径相似，如本文图11D所述的多重流体路径。所述装置可能包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10个人字拉伸器。每个人字拉伸器可以与本文所述的任意人字拉伸器相似，如本文图20B所述的人字拉伸器。多重流体路径部分和人字拉伸器可以以任何可能的顺序出现。
图17示出了具有与多重人字拉伸器和多重堰拉伸器组合的多重流体路径的示例性的流动拉伸器的俯视图。所述装置可能包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10个多重流体路径部分。每个多重流体路径部分可与本文所述的任意多重流体路径相似，如本文图11D所述的多重流体路径。所述装置可能包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10个人字拉伸器。每个人字拉伸器可以与本文所述的任意人字拉伸器相似，如本文图20B所述的人字拉伸器。所述装置可能包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10个堰拉伸器。每个堰拉伸器可以与本文所述的任意堰拉伸器相似，如本文图21A所述的堰拉伸器。多重流体路径部分、人字拉伸器、和堰拉伸器可以以任何可能的顺序出现。
流动拉伸微装置
图23A示出了通过利用人字结构的微流体装置的流动路径的示意图。包含颗粒的等分试样或流体体积可从第一eDAR级沿着流动通道进入人字部分。等分试样或流体体积可能遭遇一个或多个人字流动部分。例如，所述等分试样或流体体积可能遭遇包括多个直人字结构的第一人字流动部分，如图23A的右上方所示。然后等分试样或流体体积可能遭遇包括多个v形人字结构的第二人字部分，该多个v形人字结构从流动通道的中心偏移，如图23A的右下方所示。然后等分试样或流体体积可能遭遇包括多个v形人字结构的第三人字部分，该多个v形人字结构在与第二人字部分相反的方向上偏离流动通道的中心。人字部分和结构可以是本文所述的任意人字部分和结构。
图23B示出了利用人字结构的微流体装置的流动通道的各层的侧视图。微流体装置可包括特征层和封闭层。特征层和封闭层可被流动通道分开。流动通道可具有小于10微米、小于20微米、小于50微米、小于100微米、小于200微米、小于500微米、或小于1000微米的高度。流动通道的高度可以在上述任意两个值定义的范围内。所述特征层可包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)。PDMS特征层可以使用软光刻技术来制造。所述特征层可以包括固化的光刻胶，例如SU8。所述特征层可以使用光刻技术来制造。所述特征层可包括硅。所述特征层可以使用半导体蚀刻技术制造，如湿法蚀刻、碱性蚀刻、干法蚀刻、反应离子蚀刻或深反应离子蚀刻。所述特征层可包括玻璃。所述特征层可使用玻璃蚀刻技术制造，如氢氟酸蚀刻。所述特征层可包括塑料，如环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。所述特征层可以使用印迹光刻来制造。所述特征层可以使用注塑工艺来制造。所述特征层可以使用3D打印技术来制造。所述特征层可使用本文所述的任何微流体制造方法来产生。
所述特征层可包括一个或多个人字结构。所述人字结构可以包括多个井(well)和脊(ridge)。所述人字结构可以是本文所述的任意人字结构。
可以使用一种或多种接合技术将封闭层密封到特征层。所述封闭层可包括玻璃。可使用等离子接合技术将玻璃封闭层密封到PDMS特征层。可使用熔融接合技术将玻璃封闭层密封到玻璃特征层。可使用熔融接合技术或阳极接合技术将玻璃封闭层密封到硅特征层。所述封闭层可包括塑料，如COC、COP、或PMMA。可使用熔融接合技术将塑料封闭层密封到塑料特征层。可使用溶剂接合技术将塑料封闭层密封到塑料特征层。
图10A示出了示例性的多级荧光活化分选设备的俯视图。所述多级设备可以是微流体设备，如本文所述。所述多级设备可包括本文所述的利用eDAR分选原理的第一分选级。所述多级设备还可包括eDAR级后的分散级，如本文所述。分散级可包括流动拉伸器，如本文所述。所述多级设备还可包括分散级后的第二分选级，如本文所述。所述第二分选级可以是荧光活化分选级，如本文所述。
图10C示出了示例性的第一分选级。所述第一分选级可以是eDAR级，如本文所述。例如，所述第一分选级可以与本文图18A所述的第一eDAR级相似。
图10B示出了示例性的第二分选级。所述第二分选级可以是本文所述的任意荧光活化分选级。例如，所述第二分选级可以与本文图18A所述的第二分选级相似。
图10D和E示出了在第一分选级和第二分选级之间包括流动拉伸器的分散级的部分。如图10E所示，多个颗粒(在图10E种标记为1、2、3、4、5、6、和7，尽管多个可包括8个颗粒、9个颗粒、10个颗粒、多于10个颗粒、多于20个颗粒、多于50个颗粒、多于100个颗粒、多于200个颗粒、多于500个颗粒、多于1000个颗粒、或数量在由上述任意两个值定义的范围内的颗粒)可流过分散级。流动拉伸器可作用于流体流动，以使得颗粒(如图10E中流动拉伸器的顶部标记为1到7的颗粒)在流过流动拉伸器一定的时间后到达不同的位置。因此，颗粒可以在不同的时间点到达第二分选级。在图10E所示的示例中，颗粒2可能到达第二分选级，然后是颗粒3，然后是颗粒6，然后是颗粒1，然后是颗粒4，然后是颗粒7，然后是颗粒5。流动拉伸器可以作用于流体，以使得颗粒以任何可能的顺序和任何可能的时间到达第二分选级。不同的到达时间可能会增加任何两个颗粒之间的距离。因此，由于距离的增加，颗粒可以独立分选。
细胞拉伸
分散级中的拉伸还可包括细胞拉伸。所述细胞拉伸可通过在流动通道中的屏障来施加。所述屏障可基于颗粒的物理属性改变等分试样或流体体积中包含的颗粒(如细胞)的速度。例如，所述屏障可基于其体积、形状、或可变形性改变颗粒的速度。当颗粒是细胞，所述屏障可基于细胞体积、细胞形状、或细胞可变形性改变细胞的速度。所述屏障可包括过滤器结构、堰结构或通道中的截面尺寸的收缩/减小。在一些情况下，所述分散级可利用流动拉伸和细胞拉伸。
第二分离
在分散后，所要收集的颗粒可使用分离程序(例如，分离技术)被从其它等分试样或流体体积中包含的颗粒进一步分离。在优选的实施方式中，所要收集的颗粒可经历第二eDAR过程。第二eDAR过程可进一步分离所要收集的颗粒或细胞，如本文所述。
分离程序(例如第二分离)可以是主动分离程序或被动分离程序。第二分离程序(例如，在第一分离，如eDAR之后进行的分离程序)可在分离的样本或分散的样本(例如，已经经历过第一分离、或第一分离和分散程序的样本)上进行。
所要收集的颗粒可使用被动分离程序从其它颗粒(例如，在第一分离如eDAR、和/或分散程序如通过使颗粒或细胞通过分散级进行的操作之后)分离。在一些情况下，被动分离可包括分散程序。包括分散程序的被动分离可包括使颗粒或细胞(例如，分离的样本或分散的样本)通过分散级。在一些情况下，被动分离包括人字拉伸器、堰、通道(或通道的一部分)的使用，它们包括多个具有能够在流体中以本文所述的流速产生抛物线流动的尺寸的流动路径、和/或通道。
所要收集的颗粒可使用主动分离程序进一步从其它颗粒(例如，在第一分离后)被分离。例如，分离程序(例如，第二分离程序)可包括荧光活化分选。在一些情况下，荧光活化分选可包括在流体体积中分选单个细胞或在流体体积中分选一组细胞。荧光活化分选可包括分选单个细胞，或在流体体积中分选一小组细胞，其可能不是以等分试样(例如，荧光活化分选可包括分选流体体积中非随机分散的一小组细胞，就像eDAR中的情况一样)的形式。可以是第二荧光活化分选的第二分离可以将所要收集的颗粒浓缩为比可包括eDAR分选的第一分离程序所产生的等分试样更小的体积。以该方式，与第一eDAR级产生的等分试样相比，第二级荧光活化分选可进一步提高包含所要收集的颗粒的等分试样或流体体积的纯度。可选地或可替代地或额外地，可以使用其它分离技术将所要收集的颗粒与其他颗粒进一步分离。所要收集的颗粒可在第一分离(例如，在设备的eDAR分选级中进行的第一eDAR分选)后通过使用流式细胞术操作或技术被进一步分离。流式细胞术操作可以是荧光活化细胞分选(FACS)操作，其可包括单个颗粒或单个细胞基础上分选分离的样本或分散的样本的多个颗粒或细胞。流式细胞术操作可通过使包含目标颗粒和非目标颗粒的分散的等分试样或流体体积流过流动室，来从非目标颗粒分离所要收集的目标颗粒。流动室可与等分试样或流体体积对齐，以使得颗粒以单列流过流动室。流动室可被配置以使得两个颗粒之间的距离显著地大于颗粒的直径。
当在流动室内时，等分试样或流体体积可用一个或多个光源照明。从实例看，等分试样或流体体积可用一个或多个激光照明。光源发出的光可能与目标颗粒和非目标颗粒相互作用。例如，光源发出的光可能会引起目标颗粒或非目标颗粒的荧光。颗粒可能是自发荧光的。在这种情况下，荧光可能是由光与颗粒的内源性组分之间的相互作用引起的。颗粒可以用荧光分子标记。在这种情况下，荧光可能是由光与附着在颗粒上的外源性荧光团之间的相互作用引起的。外源性荧光团可基于颗粒的物理或化学特性而被附着到颗粒上。例如，外源性荧光团可通过靶向与细胞相应表面抗原的抗体共价结合的外源性荧光团而附着到细胞上。不同的荧光团可以与不同类型的颗粒结合。这样，不同类型的颗粒可通过不同的荧光信号来区分。荧光相互作用可通过光学检测器(如光电二极管)检测，并通过处理器进行处理。
流动室可配置为从等分试样或流体体积产生液体的小液滴。例如，流通室可包括产生小液滴的振动机构振动机构可配置为产生在每个液滴中包含零或一个颗粒的液滴。振动机构可被配置为以非常低的概率产生包含多于一个颗粒的液滴。
液滴可以通过将电荷置于液滴上的装置。例如，液滴可以通过充电环。置于液滴上的电荷可以取决于由光学检测器检测到并由处理器处理的荧光信号。例如，当被特定颜色的光照射时，目标颗粒可以产生荧光信号，而当被该颜色的光照射时，非目标颗粒可以不产生荧光信号。因此，可以在包含目标颗粒的液滴上放置与在包含非目标颗粒的液滴上放置的电荷不同的电荷。带电的液滴可能会通过电场，并基于其电荷在电场中发生偏转。例如，包含目标颗粒的液滴可以基于其电荷在一个方向上偏转，而包含非目标颗粒的液滴可以基于其不同的电荷在不同方向上偏转。液滴例如可被收集在一个或多个小瓶或孔板中。
所述分离程序(例如，分离操作)可包括磁性分离操作。所述分离操作可包括磁性活化细胞分选(MACS)。所述磁性分离操作可利用磁性颗粒来从非目标颗粒分离目标颗粒。所述磁性颗粒可包括超顺磁性颗粒。所述磁性颗粒可包括超顺磁性微颗粒。所述磁性颗粒可包括超顺磁性纳米颗粒。所述磁性颗粒可被配置为标记目标颗粒或非目标颗粒。所述磁性颗粒可基于颗粒的物理或化学特性而被附着到颗粒上。例如，磁性颗粒可通过靶向与细胞相应表面抗原的抗体共价结合的磁性颗粒而附着到细胞上。所述磁性颗粒可被配置为与目标颗粒结合。或者，所述磁性颗粒可被配置为与非目标颗粒结合。颗粒可以通过色谱柱。该色谱柱可以位于磁场内。用磁性颗粒标记的颗粒可能会由于与磁场的相互作用而粘在色谱柱上。未标记的颗粒可以通过色谱柱。如果目标颗粒被标记，则可以通过将收集容器(如小瓶或孔板)置于色谱柱的末端并在允许非目标颗粒通过柱后关闭磁场来对其进行收集。如果目标颗粒未被标记，则可在磁性分离操作期间，通过在色谱柱的末端放置收集容器来收集它们。
第一级eDAR分选后的多级荧光活化分选
本公开还提供在第一级的eDAR后用于多级荧光活化分选的设备，其利用在每组荧光活化分选和第一eDAR级之间的分散分离级。与单级eDAR设备相比，所述设备可提供样本的进一步纯化。所述设备可在单个微流体芯片上进行。
所述设备可包括第一eDAR级、分散级、和荧光活化分选的第二级，如图18A所示。分散级可以在荧光活化分选的第一eDAR级和第二级之间实施。尽管图18A中示出了三级设备，但多级设备可进一步包括第二分散级和荧光活化分选的第三级。第二分散级可以在荧光活化分选的第二和第三级之间实施。所述多级设备可进一步包括第三分散级和荧光活化分选的第四级。第三分散级可以在荧光活化分选的第三和第四级之间实施。所述多级设备可进一步包括第四分散级和荧光活化分选的第五级。第三分散级可以在荧光活化分选的第四和第五级之间实施。通常，所述多级设备可在第一级eDAR后包括荧光活化分选的n级和n分散级，n为正整数。第n分散级可在荧光活化分选的第n和第n级之间以及第一级eDAR之后实施。
在第一eDAR级，流体样本进入流动通道。所述流体样本可以是血液样本。所述流体样本可以是如本文所述的任意流体样本。流体样本可包括所要收集的一个或多个颗粒。所述颗粒可以是稀有颗粒。所述颗粒可以是细胞。所述细胞可以是稀有细胞。所述稀有细胞可以是癌性细胞。所述癌性细胞可以是循环肿瘤细胞(CTC)。所述稀有细胞可以是白细胞。所述颗粒可以是如本文所述的任意所要收集的颗粒。当流体样本流过流动通道的第一部分时，流体样本通过检测设备。所述检测设备可连续检测一系列来自在一系列时间点通过检测设备的一系列流体样本的等分试样的信号。每个信号可以指示给定的等分试样中所要收集的颗粒的存在(或不存在)。所述检测设备可以是如本文所述的任意检测设备。
所述检测设备可通过用电磁辐射问询流体样本的每组细胞来检测所要收集的颗粒的存在。当所要收集的颗粒存在于通过检测设备被问询的一组细胞中，所述检测设备可以检测电磁辐射与该组细胞中颗粒的相互作用。特别是，所述检测设备可能会以光的形式发出电磁辐射。所述光可以是紫外线、可见光或红外光。所述光可具有100nm至400nm、400nm至700nm、700nm至1000nm、1μm至10μm、10μm至100μm、或100μm至1000μm的范围的波长。所述光可以由一个或多个发光二极管(LED)或激光发出。所述光可以由一个或多个气体激光、准分子激光、染料激光、固态激光、光纤激光、掺杂的光纤激光、掺杂稀土的光纤激光、半导体激光、二极管激光、二极管泵浦激光、垂直腔面发射激光器(VCSEL)、或任意其它激光发出。
光可以通过任何光学相互作用与颗粒相互作用，如光学反射、光学透射、弹性光学散射、非弹性光学散射、瑞利散射、拉曼散射、表面增强拉曼散射、米氏散射、布里渊散射、荧光、自发荧光、激光诱导荧光、生物发光、或化学发光。颗粒和光之间的光学相互作用可以通过用光学检测器检测光学信号来推断，如光电二极管、光电二极管阵列、光电倍增器、雪崩式光电倍增器、摄影机、电荷耦合装置(CCD)摄影机、互补金属氧化物半导体(CMOS)摄影机、光谱仪、色散谱仪、光栅光谱仪、傅立叶变换光谱仪、或显微镜。所述检测设备可以利用如本文所述的任意光学检测技术。
所述流动通道可分岔为两个通道。一个通道(如图18A右侧所示)可构成废物通道。在检测器无法检测到所要收集的颗粒的存在的时间段内，流体样本会流到废物通道。另一个通道(在图18A左侧所示)可流动到一个分散级，如本文所述。在检测到等分试样中的颗粒后，检测设备可以向控制器(未示出)发送信号，以激活用于切换流动方向的流动切换机构(未示出)，从而使包含所要收集的颗粒的等分试样流到分散级。所述流动切换机构可包括螺线管(未示出)。一旦所要收集的颗粒移过流动通道和通向分散级的通道之间的结点，流动切换机构就可将流动的方向切换回废物通道。例如通过在结点和分散级之间放置第二检测设备(未示出)，可以检测所要收集的颗粒经过结点的移动。以该方式，只有包含所要收集的颗粒的流体的一小个等分试样可以流向分散级。
在分散级中，包含所要收集的颗粒的等分试样或流体体积可以进行拉伸。所述拉伸可提高包含所要收集的颗粒的等分试样或流体体积中的所要收集的颗粒和其它颗粒之间的平均距离。所述拉伸可通过本文所述的任意拉伸方法来实现。例如，所述拉伸可通过等分试样或流体体积通过直通道的流动、等分试样或流体体积通过流动拉伸器的流动、等分试样或流体体积通过人字拉伸器的流动、等分试样或流体体积通过与直通道组合的人字拉伸器的流动、等分试样或流体体积通过多重流动路径的流动、等分试样或流体体积通过与多重流动路径的人字拉伸器的流动、等分试样或流体体积通过与多重流动路径组合的直通道的流动、或等分试样或流体体积通过堰拉伸器的来实现，如本文所述。所述拉伸可受等分试样或流体体积通过微通道与人字混合，或通过多重流动路径的抛物线流动的影响，如本文所述。
在分散级中的流动拉伸之后，包含所要收集的颗粒的等分试样或流体体积可流向第二级荧光活化分选。第二级荧光活化分选可以与第一eDAR级相似的方式配置。第二级荧光活化分选可以与第一eDAR级相同。第二eDAR级可以与第一eDAR级不同；例如，所述第二级可以在流体体积中分选多个颗粒或细胞，其中多个颗粒或细胞在流体体积中始终随机分布(例如，如在等分试样中的情况)或所述第二级可分选流体体积中的一组细胞，其中，多个颗粒或细胞不是在流体体积中始终随机分布的(例如，如在分离的样本或分散的样本中的情况)。所述第二级荧光活化分选可利用如本文第一eDAR级中所述的任意分离方法。所述第二级荧光活化分选可将所要收集的颗粒浓缩到比第一eDAR级产生的等分试样更小的体积中。以该方式，与第一eDAR级产生的等分试样相比，第二级荧光活化分选可进一步提高包含所要收集的颗粒的等分试样或流体体积的纯度。
尽管图18A描述了在第一eDAR级后包括荧光活化分选的第二级和一个分散级的设备，但所发展的原理可用于生产利用了在第一eDAR级后二个级的荧光活化分选和二个分散级、第一eDAR级后三个级荧光活化分选三个分散级、第一eDAR级后四个级荧光活化分选和四个分散级、或第一eDAR级后n个级的荧光活化分选和n个分散级的设备，其中n为正整数。
图18B示出了根据一些实施方式操作在第一eDAR级后具有多级的荧光活化分选和分散的设备的方法。在第一步，样本流入有第一缓冲液流(在图18B中表示为“L”)和第二缓冲液流(在图18B中表示为“R”)的结点。第一和第二缓冲液流可包括任何缓冲液。例如，第一和第二缓冲液流可包括水性缓冲液。第一和第二缓冲液流可包括有机缓冲液。第一和第二缓冲液流可包括两性离子缓冲液。第一和第二缓冲液流可包括细胞生长培养基。第一和第二缓冲液流可包括最小细胞生长培养基。第一和第二缓冲液流可包括相同的缓冲液。第一和第二缓冲液流可包括不同的缓冲液。
在检测所要收集的颗粒(例如，非目标细胞群中的目标细胞，如红细胞群和/或白细胞群中的循环肿瘤细胞或白细胞)之前，可选择第一和第二缓冲液流的流速以使得样本流向废物通道。例如，第一缓冲液流的流速可被选定为高于第二缓冲液流的流速。
在第二步，所要收集的颗粒可通过检测设备来检测。所述检测设备可以是如本文所述的任意检测设备。所述检测设备可以是如本文所述的光学检测设备。
在第三步，在检测到所要收集的颗粒时，流体切换阀可打开。流体切换阀的打开可通过改变第一或第二缓冲液流的流速来实现。第一缓冲液流的流速可被降低，以使得流体样本自废物通道流动离开并流向分散级。第二缓冲液流的流速可被提高，以使得流体样本自废物通道流动离开并流向分散通道。
在第四步，流体切换阀可被关闭(如通过改变第一或第二缓冲液流的流速以具有与它们之前打开流体切换阀时相同的流速)。这导致流体样本再次流向废物通道。以该方式，可形成(包含所要收集的颗粒的)流体样本的一个小等分试样或流体体积并流向分散级。流体切换阀可在打开后不久被关闭。所述流体切换阀可被关闭以响应位于下游的第二检测设备对所要收集的颗粒的检测。流体切换阀可在预定的时间后被关闭，如在从检测设备到废物通道的经计算的流动时间之后。流体切换阀可在小于1ms、小于2ms、小于5ms、小于10ms、小于20ms、小于50ms、小于100ms、小于200ms、小于500ms、或小于1000ms的时间后关闭。流体切换阀可在一段由前述任意两个值定义的范围内的时间后关闭。
在第五步，包含所要收集的颗粒的等分试样或流体体积可通过分散级被拉伸，如本文所述。等分试样或流体体积的拉伸可能导致等分试样或流体体积中所要收集的颗粒和非目标颗粒之间的平均间距增加。等分试样或流体体积可通过本文所述的任意拉伸设备或方法来拉伸。
在第六、第七、第八和第九步，拉伸的等分试样或流体体积可进一步通过第二级的荧光活化分选来分选。第六步可以与第一步相似。第七步可以与第二步相似。第八步可以与第三步相似。第九步可以与第四步相似。在第二级的荧光活化分选后，所要收集的颗粒可以被收集在比第一eDAR级后产生的等分试样更小的等分试样或流体体积中。等分试样或流体体积可以从第二级的荧光活化分选的下游被收集。例如，等分试样或流体体积可以流到孔板，如96孔板，以用于收集。等分试样或流体体积可以流到小瓶，以用于收集。等分试样或流体体积可以流到过滤体积，以用于收集。
图18B所述的方法可以扩展为包括第二分散级和第三级的荧光活化分选。第二分散级可以发生与本文所述的第五步骤类似的步骤。第三级的荧光活化分选可发生与本文所述的第六、第七、第八、和第九步骤类似的步骤。图18B所述的方法可以扩展为包括第三分散级和第四级的荧光活化分选。第三分散级可以发生与本文所述的第五步骤类似的步骤。第四级的荧光活化分选可发生与本文所述的第六、第七、第八、和第九步骤类似的步骤。图18B所述的方法可以扩展为包括第四分散级和第五级的荧光活化分选。第四分散级可以发生与本文所述的第五步骤类似的步骤。第五级的荧光活化分选可发生与本文所述的第六、第七、第八、和第九步骤类似的步骤。通常，图18B描述的方法可以扩展为包括第n分散级和第(n+1)级的荧光活化分选，其中n为正整数。第n分散级可以发生与本文所述的第五步骤类似的步骤。第(n+1)级的荧光活化分选可发生与本文所述的第六、第七、第八、和第九步骤类似的步骤。
基于关于图18B描述的方法的许多变化、变更和适应是可能的。例如，相对于图18B所描述的方法的步骤顺序可以更改，某些步骤可删除，某些步骤可重复，并且在适当时可添加其他步骤。某些步骤可以连续执行。某些步骤可以并行执行。某些步骤可执行一次。某些步骤可执行多于一次。某些步骤可以包括子步骤。某些步骤可以自动化，而某些步骤可以手动。本文所述的处理器可包括一个或多个指令，以执行关于图18B描述的方法的一个或多个步骤的至少一部分。
颗粒捕获与收集
在二级分选(以及任选地接受一个或多个分散操作)期间分离和/或浓缩一个或多个颗粒如细胞(例如，目标细胞)后，可使用过滤器元件捕获或收集颗粒(例如，如图7A和图29A-图31所示)。例如，可在多级分选后使用过滤器元件从一个或多个颗粒或一个或多个类型的颗粒中纯化多个颗粒(例如，目标细胞)。在一些情况下，多个颗粒被浓缩以减小其中存在多个颗粒的流体体积的最终体积。
现在参考图29A和29B，包括一个或多个颗粒(例如，目标细胞)的流体体积可被引入到过滤区域(例如，经过第二分选级后)。所述过滤区域可用于进一步从存在于流体体积中的一个或多个非目标颗粒分离或纯化一个或多个目标颗粒。
过滤区域可包括与输出通道或第二分选级的流动路径流体连通的输入流动路径。过滤区域可还包括具有一个或多个孔(例如，狭缝、微狭缝、穴、微穴、或间隙)的过滤器元件。在一些情况下，一个或多个孔(或狭缝、穴、或间隙)可具有至少一个尺寸，其设为防止目标颗粒穿过孔到达位于过滤器的相反侧(例如，过滤器的下游侧)的滤液区的尺寸。例如，一个或多个孔(或狭缝、穴、或间隙)可具有设为防止目标细胞穿过孔的宽度、高度、直径、或截面积。在一些情况下，孔的尺寸小于目标细胞的直径或半径，以防止目标颗粒穿过孔。在一些情况下，孔的尺寸设为允许一个或多个非目标颗粒穿过孔(变形时或未变形时)，同时禁止目标颗粒完整穿过孔(变形时或未变形时)。可通过向包含目标颗粒的流体体积施加流体压力来使目标颗粒(例如，目标细胞)被过滤区域的过滤器元件(例如，如图29A和29B所示)捕获(例如，从上游流动路径，如从第二分选级或与过滤器元件的上游侧的过滤区域连接的一个或多个额外的上游流动路径的输入)，以使得目标颗粒与过滤器接触(例如，关联)并防止其通过过滤器的孔(例如，由于孔的大小和/或形状)。
滤液区可连接过滤器的与来自过滤区域上游的分选级的输入流动路径相反侧上的一个或多个流动路径。在一些情况下，连接到过滤器的与输入流动路径相反侧的过滤区域可包括输出通道(例如，初级流体出口)。非目标细胞可在通过过滤器后通过这样的输出通道到达收集小瓶或到达废物容器。例如，图29A示出了通过具有小于细胞直径的宽度的孔的白细胞(WBC)(例如，通过过滤器元件上的流体压差导致的WBC变形)。图29也示出了具有小于通过孔的孔的宽度的直径的红细胞(RBC)。因为相对于CTC的直径和/或CTC的可变形性的孔的宽度，循环肿瘤细胞(CTC；例如，目标细胞)不能够通过孔。
在一些情况下，连接到过滤器的与输入流动路径相反侧的过滤区域可以是流体输入通道。例如，可通过过滤区域的过滤器元件下游的流动路径，将额外的流体注入过滤区域(例如，如图29A和图29B所示)。
在一些情况下，对过滤器元件施加下游流体压力(例如，通过由过滤器元件下游的流动路径将流体注入到过滤区域中)可导致一个或多个颗粒(例如，目标颗粒)从过滤器元件被释放(例如，变得与过滤器元件不关联)。
多个珠可以通过与过滤器元件的下游侧上的过滤区域连接的流动路径注入的额外的流体被引入到过滤区域中。如图29B所示，所述珠(其可以是刚性珠)可与过滤器元件的一个或多个孔结合，并阻止通过一个或多个孔的流动。在一些情况下，一个或多个珠与过滤区域的过滤器元件的一个或多个孔的结合可改变穿过过滤器元件的压差，导致一个或多个目标颗粒被从过滤器元件释放(例如，变得与其解除关联)。在一些情况下，一个或多个珠与过滤器元件的一个或多个孔的结合可导致穿过过滤器元件的一个或多个孔的逆行的流体流动(例如，自过滤器的下游侧到过滤器的上游侧的流体流动)的增加，其可有助于从过滤器元件的上游侧释放一个或多个目标颗粒。在一些情况下，一个或多个珠与过滤器元件的一个或多个孔的结合可导致穿过过滤器元件的压差的降低，其可有助于一个或多个目标颗粒从过滤器元件的上游侧的释放。
在颗粒或多个颗粒在过滤器元件的上游侧上从过滤器元件被释放后，颗粒或多个颗粒可通过与收集小瓶或收集区流体连通的流动路径(例如，出口流动路径)被冲洗(例如，如图29A和图31所示)。
在一些情况下，在通过分选级后、在过滤区域中捕获和释放后、和/或收集前，颗粒可被浓缩在流体体积中。颗粒可通过阀的操作(例如，通过计算机控制)被浓缩在流体体积中，以允许包含颗粒的小体积流体体积通过流动路径。例如，通过仅打开一小段时间以使得目标颗粒通过阀的位置的流动路径，阀可用于浓缩流体体积中的颗粒。在一些情况下，阀可被打开仅2-3毫秒、2至20毫秒、或20毫秒至50毫秒，并且每次阀被打开都可允许1至3纳升、3至5纳升、5至10纳升、10至20纳升、或20至30纳升通过流动路径。所述阀可以是电磁阀，其对浓缩颗粒有用，因为其可在非常短的、可重复的时间内被打开和关闭(例如，2-3毫秒，2至20毫秒、或20毫秒至50毫秒)。
阀的打开和/或关闭可通过计算机控制。例如，当连接到计算机的检测器检测到目标颗粒时，用于浓缩流体体积中的颗粒的阀可被打开。通过仅在检测到目标颗粒时才打开阀，可以允许最小量的流体与允许通过流动路径的每个目标颗粒一起通过流动路径。
如图30A-30C所示，所述阀可以是管内阀(in-line valve)、双向夹管阀、或外部阀。管内阀或双向夹管阀可被集成在微流体芯片中。外部阀可与微流体芯片连接(例如，通过紧固件)。在一些情况下，外部阀可从微流体芯片移除。外部阀可以在关闭时通过捏住流动路径(例如，一段管道)来操作。
如图30C所示，包括阀(例如，收集阀)的流动路径可与第二分选级的出口、微流体芯片(例如，微流体分选芯片)和/或一定长度的收集管流体连通。在一些情况下，当已经被分选的颗粒存在于第二分选级和收集阀之间的流动路径中(例如，在一个或多个微流体芯片的流动路径中，或者在第二分选级和收集阀之间的管中)，所述收集阀可从流动路径断开并且流动路径(例如，先前连接到收集阀的管)可放置为与收集小瓶流体连通。将流动路径连接到收集小瓶后，可以将流动路径中的分选的颗粒冲洗到收集小瓶中。
现在参考图31，过滤区域可包括用于被动减小包含一个或多个目标颗粒的流体体积的体积的结构。过滤区域可包括与来自第二分选级的出口和颗粒收集区或结构(如收集小瓶)流体连通的输入流动路径或通道。连接第二分选级的出口和颗粒收集区的流动路径可包括一个或多个过滤器元件3110，其具有使得一个或多个目标颗粒不被允许完整地通过孔、而流体和任选的一个或多个非目标颗粒能够通过孔的尺寸(例如，宽度、高度、直径、或截面)的多个孔3120(或狭缝、微狭缝、穴、微穴、或间隙)。所述过滤区域可包括一个或多个滤液区3130，其位于过滤器元件3110的与连接第二分选级和颗粒收集区或结构的流动路径的相反侧。所述滤液区可与一个或多个流体出口(例如，与出口或废物流体连通的流动路径)流体连通。
通过将流体压力施加到流动路径的上游末端(例如，在输入流动路径或过滤区域的通道的上游施加流体压力)，从第二分选级引入到过滤区域的流体体积中的一个或多个颗粒可被放置为与过滤器元件3110接触(例如，相关联)。该流体压力可使包括一个或多个颗粒的流体体积的一部分穿过过滤器元件3110的孔进入滤液区3130。在某些情况下，该一部分流体体积穿过过滤器元件3110的运动可导致包含一个或多个颗粒的流体体积减小在一些情况下，该一部分流体体积穿过过滤器元件3110的运动可导致一个或多个颗粒(例如，一个或多个非目标颗粒)通过过滤器元件3110的一个或多个孔3120达到滤液区3130。在一些情况下，滤液区3130与连接第二分选级和收集区之间的流动路径的毛细管作用力和/或体积差可足以导致流体体积的一部分和/或一个或多个颗粒(例如，非目标颗粒)穿过过滤器元件3110到达滤液区3130(例如，通过过滤器元件3110的一个或多个孔3120)。
标记物/生物标志物
所述方法提供由分析物表达、或位于分析物上、或在分析物附近的多个生物标志物(例如，被捕获的颗粒)。可以通过本公开内容检测的多个生物标志物取决于捕获的颗粒上可以进行的免疫染色和光漂白的轮数。每轮免疫染色可不包括标签、包括1个标签、2个标签、3个标签、4个标签、5个标签、6个标签、7个标签、8个标签、9个标签、或10个标签。每轮免疫染色的标签的范围可以包括1-10个标签(例如，4个)。
在某些方面，标记物(如生物标志物)的存在由标签发出的信号指示，其中，标签与标记物有亲和力。如本文所述，短语“有亲和力”广泛涵盖标签对标记物的直接分子结合亲和力以及间接亲和力，如标签和标记物通过涉及一个或多个其他结构的分子复合物相互作用的能力。例如，在某些方面，标签可以是对标记物具有直接亲和力的一抗，而在其他方面，标签可以是对标记物具有间接亲和力的二抗。
在一些方面，细胞是根据特定的标记物或生物标志物谱分离的，从而使给定的细胞表现出独特的和/或可识别的标记物或生物标志物谱。在某些方面中，所述标记物或生物标志物谱是一个以上、二个以上、三个以上、四个以上、五个以上、六个以上、七个以上、八个以上、九个以上、十个以上的标记物或生物标志物的特定组合，其可用来定义和识别细胞或细胞类型。在一些方面，所述标记物或生物标志物谱可用于将细胞识别为具有一组特定的属性的特定细胞群的一部分。
在一些方面，生物标志物是细胞外的。在其他情况下，生物标志物可以是细胞内的、细胞质的、细胞质内的、细胞表面的、细胞核外的、细胞核内的、溶酶体的、线粒体的、内质网状的等等。在其它情况下，生物标志物可以附着在颗粒上，但不能反过来。
在一些方面，生物标志物可以是氨基酸、肽、多肽、蛋白质、变性蛋白质。在这种情况下，结构可以是天然的或变性的。
在一些方面，生物标志物可以是核酸、寡聚核酸、核糖核酸、转移核糖核酸、信使核糖核酸、微核糖核酸或脱氧核糖核酸。在这些情况下，酸可以是单链或双链。
在其他情况下，稀有颗粒可以是细胞、蛋白质、蛋白质复合物、核酸、核蛋白复合物、碳水化合物、代谢物、分解物等。在一些方面中，所述稀有颗粒是细胞。在一些方面，所述细胞可以是癌细胞、循环肿瘤细胞(CTC)、癌干细胞、展示癌表面抗原的癌细胞，例如选自CD44、CD2、CD3、CD10、CD14、CD16、CD24、CD31、CD45、CD64、CD140b或其组合。
在一些方面，所述细胞是胎儿细胞。在一些方面，所述胎儿细胞可以在母体流体中。母体流体可以包括全血、分馏的血液、血清、血浆、汗液、眼泪、耳分泌物、痰、淋巴液、骨髓悬液、淋巴液、尿液、唾液、***、***分泌物、粪便、经宫颈灌洗液、脑脊液、脑液、腹水、母乳、玻璃体液、房水、皮脂、内淋巴、腹水、胸水、耳垢、心外膜液、以及呼吸、肠道和泌尿生殖道的分泌物。
在一些方面，分析物是脱落的细胞，其不与其他细胞或细胞外基质相连，或也不嵌在组织中。
在某些方面，癌干细胞可通过灌注与生物标志物选择性结合的其他试剂来区别于普通的普通癌细胞，这些生物标志物可包括但不限于CD44、CD2、CD3、CD10、CD14、CD16、CD24、CD31、CD45、CD64、CD140b或CD166。
例如，可以设计标签来检测EGFR和CD166的表达，以证明肿瘤细胞的间充质特征。其他相关的标记物，例如波形蛋白和钙黏着蛋白，也可以用于该组。
在其他情况下，可以使用表明颗粒活力的生物标志物。在这些情况下，可以使用指示细胞凋亡、坏死、有丝***、有丝***的阶段、减数***等的生物标志物。
在一些方面，每套标记物可以包括核染色剂(Hoechst)作为阳性对照生物标志物、与FITC偶联的CD45作为阴性对照生物标志物、以及与PE或Alexa 647偶联的两种蛋白质生物标志物。在一些方面，Hoechst色斑可能不会被光漂白。在该情况下，Hoechst是阳性对照。在该情况下，Hoechst可能无法被标准光源光漂白。在该情况下，紫外线可以用来漂白色斑。
样本
在本文提供的公开中，样本可包括流体样本。流体样本可以来自多种来源。在一些方面，所述来源可能是人类、哺乳动物、动物、微生物、细菌、真菌、酵母、病毒、啮齿动物、昆虫、两栖动物和鱼类。
本公开提供的流体样本可以是可能或可能不包含感兴趣的稀有颗粒的液体。在一些方面，所述样本可以是环境流体样本，例如来自湖泊、河流、海洋、池塘、溪流、泉水、沼泽、水库等。在其他情况下，所述样本可以是水样本，例如来自海水淡化厂、水处理厂、水库、泉水、溪流、冰川水流、水塔或可考虑作为饮用水水源的其他水源。
在一些方面，本公开提供分析物，包括稀有颗粒的分析物。稀有颗粒可以是以低水平存在于流体样本中的细胞或大分子。在某些方面中，稀有颗粒可以是细胞、蛋白质、蛋白质复合物、核酸、核蛋白复合物、碳水化合物、代谢物、分解物等。在某些方面中，如果在流体样本中存在的颗粒的浓度少于流体中总颗粒数的约10％，或少于流体中总颗粒数的约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、或更少，则可以认为颗粒是稀有的。在其他情况下，所述稀有颗粒可以在流体样本中少于流体中总颗粒数的约103分之1份、或少于流体中总颗粒数的约104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012分之1份或更少存在。在某些方面中，如果在流体样本中存在的颗粒的浓度少于流体中总颗粒数的10％，或少于流体中总颗粒数的9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、或更少，则可以认为颗粒是稀有的。在其他情况下，所述稀有颗粒可以在流体样本中少于流体中总颗粒数的103分之1份、或少于流体中总颗粒数的104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012分之1份或更少存在。
在一些方面，流体样本可包含一定百分比的水和/或其它元素。例如，流体样本可以是血液，其中除其他物质外还包含血浆。通常，血浆主要是水，并且可能含有蛋白质、离子、维生素、酶、激素和体内其他化学物质。
在一些方面，所述流体样本可以是体液。体液通常是液体中生物颗粒的复杂悬浮液。例如，体液可以是血液。在一些方面，血液可以包括血浆和/或细胞(例如，红细胞、白细胞、循环稀有细胞)和血小板。在一些方面，血液流体体积的55％可以是细胞。在一些方面，血液样本可被浓缩以使得至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％的血液是细胞。在一些方面，血液样本中的血液已消耗一种或多种细胞类型。在一些方面，血液样本中的血液富含一种或多种细胞类型。在一些方面，血液样本可被稀释以使得至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％的血液是细胞。在一些方面，血液样本包含异质、均质或近乎均质的细胞混合物。
体液可包括但不限于全血、分馏的血液、血清、血浆、汗液、眼泪、耳分泌物、痰、淋巴液、骨髓悬液、淋巴液、尿液、唾液、***、***分泌物、粪便、经宫颈灌洗液、脑脊液、脑液、腹水、母乳、玻璃体液、房水、皮脂、内淋巴、腹水、胸水、耳垢、心外膜液、以及呼吸、肠道和泌尿生殖道的分泌物。在一些方面，体液可以与各种含有细胞和生物颗粒混合物的器官(例如，肺)接触。
在一些方面，体液可包括稀有颗粒。在一些方面中，所述稀有颗粒是稀有细胞。稀有细胞可以是有核或无核。稀有细胞包括但不限于，表现为恶性表型的细胞；胎儿细胞，如孕妇外周血中的胎儿细胞，肿瘤细胞，例如已经从肿瘤脱落到血液或其他体液中的肿瘤细胞；被病毒感染的细胞，如被HIV感染的细胞，用目的基因转染的细胞；自身反应障碍患者外周血液中存在的T细胞或B细胞的异常亚型。
在一些方面，所述体液可以是血液且包含稀有细胞。所述稀有细胞可以是红细胞、白细胞、白血球、淋巴细胞、B细胞、T细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、干细胞、红系细胞、癌细胞、肿瘤细胞或分离自从内胚层、中胚层、外胚层或神经嵴组织起源的任意组织的细胞。稀有细胞可以来自初级来源，也可以来自次级来源(例如，细胞系)。
存在于特定体液(例如，血液)中的细胞和生物颗粒的类型和数量可以揭示有关生物体健康的信息。例如，患有癌症的对象的体液中可能含有癌性细胞。来自受感染对象的样本可以包含数量增加的指示感染的免疫细胞(例如，淋巴细胞、中性粒细胞、B细胞、T细胞、树突状细胞等)、或者可以包含如微生物细胞或核酸等的病原性物质。怀孕女性的样本可包含指示胎儿基因型或核型的胎儿细胞。
与正常量相比，一些细胞或生物颗粒可以以很少量存在于体液中。这样的稀有细胞可包括循环肿瘤细胞、癌干细胞等。这些细胞可由于在身体区域发生的事件(例如，癌)而出现在体液中。细胞可以源于包含体液的器官或体液附近的器官。例如，稀有的乳腺癌细胞可能存在于乳腺附近的血液或淋巴液中。在一些方面，细胞源于更遥远的器官。例如，源自睾丸肿瘤的细胞可以存在于获自手臂的血液样本中。
分析
本公开还提供了可进行分析的方法。在一些方面，所述分析可包括用于问询等分试样或流体体积的来源。在其它情况下，其中等分试样包含可固有地显示化学发光或生物发光的分析物(例如，稀有颗粒)，所述设备可能不需要问询等分试样的来源。
在一些方面，定级装置可选自计算机、处理器、控制器、带有集成电路的芯片、电路板、电子元件、软件、算法或其组合。在一些方面，所述处理器可以是数字处理器(例如，FGPA、ASIC、或RT)。在一些方面，计算机接受来自检测装置的信号并通过算法对等分试样进行定级。定级装置可基于定级的值(例如，流体样本中稀有颗粒的存在、不存在、相同性、组成或数量)引导等分试样进入合适的通道。
在一些方面，可对来自第一检测器的信息进行分析。可对来自第一检测器的信息进行分析，结果可显示分析物为阳性。在一些方面，可对来自检测器的信息进行分析，结果可显示分析物为阴性。在一些方面，定级装置将读取到的阳性或阴性分析物的信号发送到流体动力学切换元件(例如，电磁阀)以分选分析物。在一些方面，阳性分析物可被移送到微流体芯片的独特通道。在一些方面，阳性分析物可被移送到微流体芯片的独特腔室。在一些方面，阳性分析物可被移送到微流体芯片的废物腔室。在一些方面，阴性分析物可被移送到微流体芯片的独特通道。在一些方面，阴性分析物可被移送到微流体芯片的独特腔室。在一些方面，阴性分析物可被移送到微流体芯片的废物腔室。在一些方面，阳性分析物和阴性分析物被划分开。
在一些方面，可以使用从第二检测器中继来的信息进行分析。第二检测器可用于确认使用第一检测器获得的信息。在一些方面，第二检测器可以位于微流体芯片上。在一些方面，第二检测器可以不位于微流体芯片上。在一些方面，第二检测器从细胞中获取信号，该细胞可以是根据由第一检测器检测到的信号而被分选的。在一些方面，第二检测器从分选的细胞接收检测信号，并可以将有关该信号的信息发送给计算机。该计算机可用于确定适当的细胞是否已被分选。
应用
该公开提供了用于多种应用的方法。在某些方面，该方法可以为对象提供与流体样本中存在稀有颗粒的情况相关的疾病的诊断或预后，例如，如血液样本这样的生物流体。
本文所述的方法和设备可包括以下步骤：(a)在适于将标签转化为包括所述标签和分析物的复合体的条件下，使来自对象的生物流体与标签接触；(b)检测生物流体的等分试样中步骤(a)中产生的复合体的存在与否；(c)基于步骤(a)中产生的复合体的存在与否，对等分试样分配值；而且(d)基于分离的等分试样的分析，提供对对象的诊断或预后。在一些方面，步骤(b)可包括用辐射源问询等分试样并检测通过与分析物结合的标签发射的信号。
在多个方面中，提供用于识别多个存在于具有流体中的分析物上的标记物的方法，其中所述方法包括：(a)使用辐射源检测来自第一标签的信号，其中所述第一标签附着于第一结构，该第一结构与分析物上的第一标记结合；(b)根据第一标签的存在对分析物进行划分；(c)降低第一标签的信号强度；(d)使分析物与结合到第二标记物的第二结构接触，其中第二结构附着于第二标签；以及(e)检测第二标签。
在一些方面，步骤(b)的划分基于第一标签和第三标签的存在。在其它方面，步骤(b)的划分用微流体装置进行。在其他方面，步骤(b)的划分和步骤(b)或步骤(e)的至少一个中的检测发生在同一微流体装置中。
在多个方面中，提供用于检测多个存在于分析物上的标记物的方法，所述方法包括：使分析物与第一标签接触，其中分析物包括第一标记物并且第一标签具有与第一标记物的亲和力；检测通过第一标签发射的第一信号，其中第一信号的存在指示第一标记物的存在；基于第一信号的存在，划分包括分析物的流体；降低第一信号的强度；使分析物与第二标签接触，其中分析物包括第二标记物且第二标签具有与第二标记物的亲和力；以及检测通过第二标签发射的第二信号，其中第二信号的存在指示第二标记物的存在。
在一些方面，第一标签的信号减少了50％以上。在某些方面中，降低信号强度是通过对分析物施加辐射来实现的。在其他方面，白光用于降低信号的强度。在其他方面，激光用于降低信号的强度。在其他方面，发光二极管用于降低信号的强度。在某些方面中，降低信号强度是通过对第一标签施用化学物质来实现的。在某些方面中，所述化学物质是还原剂。在其它方面，还原剂是二硫苏糖醇。
在一些方面，划分流体基于第一信号和第三信号的存在。在其它方面，检测第一信号、检测第二信号、划分流体、或它们的组合使用微流体装置来进行。
在一些方面中，所述分析物是细胞。在某些方面中，所述细胞是癌性细胞。在其它方面，所述癌性细胞是稀有细胞。在一些方面中，所述分析物是循环肿瘤细胞。在某些方面中，所述细胞是细菌细胞、免疫细胞、胎儿细胞、指示治疗后仍有疾病的细胞、或干细胞。在其它方面，所述细胞是稀有细胞，占流体中少于总细胞群体的1％。在某些方面中，所述分析物是分离的细胞。
在一些方面中，所述流体选自下组：全血、分馏的血液、血清、血浆、汗液、眼泪、耳分泌物、痰、淋巴液、骨髓悬液、淋巴液、尿液、唾液、***、***分泌物、粪便、经宫颈灌洗液、脑脊液、脑液、腹水、母乳、玻璃体液、房水、皮脂、内淋巴、腹水、胸水、耳垢、心外膜液、以及呼吸、肠道和泌尿生殖道的分泌物。在某些方面中，所述流体是全血。在其它方面中，所述流体是分馏的全血。
在一些方面，所述第一标签是荧光团。在其它方面，所述第一标签是抗体。在其它方面，所述第一标签是包括核酸的探针。在某些方面中，该方法还包括对来自第一标签和第二标签的信号进行成像。在某些方面，分析物存在于流体中，而流体是较大体积流体的等分试样。在其他方面，检测通过第一标签发射的第一信号是同时在多个分析物上执行的。
在某些方面中，划分是半自动或自动进行的。在某些方面中，划分通过综合决策等分位数定级进行。在一些方面，不使用流式细胞仪来划分分析物。
在其它方面，所述分析物包括多个标记物。在一些方面，每个多个标记物都是生物标志物。在某些方面中，所述分析物包括表达谱，其中表达谱由多个标记物定义。
在其他方面，所述方法还包括使分析物与缓冲液接触。在其他方面，所述缓冲液包含固定剂。在某些方面中，所述缓冲液包含渗透剂。在其它方面，所述缓冲液是冲洗缓冲液。
在多个方面中，提供了用于从包含第一细胞类型和第二细胞类型的样本中分离细胞的方法，所述方法包括：(a)通过一组管将样本引入微流体芯片，其中微流体芯片包括(i)与该组管流体连通的至少一个通道；(ii)配置为检测至少一个通道中的细胞的信号的检测器；以及(iii)与至少一个通道流体连通的至少一个腔室；(b)使样本的一部分流过检测器；(c)使用检测器来检测样本的一部分中第一细胞类型的存在与否；(d)如果第一细胞类型在样本的一部分中被检测到，将样本的等分试样引导到腔室中，其中等分试样包括第一细胞类型；以及(e)重复步骤(b)、(c)、和(d)，从而在腔室中分离多个等分试样，以使得腔室包含样本中第一细胞类型总数的高于80％和样本中第二细胞类型总数的低于5％。
在多个方面中，提供了用于从样本中分离细胞的方法，所述方法包括：(a)将样本引入到微流体芯片中，其中样本包括第一细胞类型和第二细胞类型，且其中微流体芯片包括：通道；配置为检测通道内发射的信号的检测器；与通道流体连通的腔室；(b)使样本的一部分流过通道，其中该部分包括多个第一细胞类型、多个第二细胞类型、或其组合；(c)使用检测器检测该部分中第一细胞类型的存在与否；(d)如果第一细胞类型存在于该部分中，则将该部分引导到腔室中；以及(e)重复(b)、(c)、和(d)足够次数，以使得腔室包含样本中第一细胞类型总数的高于80％和样本中第二细胞类型总数的低于5％。
在一些方面，第一细胞类型和第二细胞类型的至少一种是癌性细胞。在某些方面，所述癌性细胞是稀有细胞。在其它方面，第一细胞类型和第二细胞类型的至少一种是循环肿瘤细胞。在其它方面，第一细胞类型和第二细胞类型的至少一种是细菌细胞、免疫细胞、胎儿细胞、指示治疗后仍有疾病的细胞、或干细胞。在一些方面，第一细胞类型和第二细胞类型的至少一种是稀有细胞，占样本中总细胞群的不到1％。
在一些方面中，所述样本选自下组：全血、分馏的血液、血清、血浆、汗液、眼泪、耳分泌物、痰、淋巴液、骨髓悬液、淋巴液、尿液、唾液、***、***分泌物、粪便、经宫颈灌洗液、脑脊液、脑液、腹水、母乳、玻璃体液、房水、皮脂、内淋巴、腹水、胸水、耳垢、心外膜液、以及呼吸、肠道和泌尿生殖道的分泌物。在某些方面中，所述样本是全血。在其它方面中，所述样本是分馏的全血。
在一些方面，所述腔室在微流体芯片外。在某些方面中，所述腔室是小瓶、微量离心管、或孔板中的孔。在其它方面，所述腔室通过管与通道流体连通。在其它方面，所述腔室通过毛细管与通道流体连通。
在多个方面中，提供了用于分离微流体芯片中的流体样本的等分试样或流体体积的方法，其中所述等分试样或流体体积包括稀有颗粒，所述方法包括以下步骤：(a)检测等分试样中稀有颗粒的存在与否；(b)基于稀有颗粒的存在与否，对等分试样分配值；以及(c)基于分配的值，通过打开电动阀引导等分试样的流动，其中所述电动阀位于微流体芯片外的装置上。在一些方面，所述微流体芯片包括样本输入通道、至少两个输出通道、和至少一个定向流动通道，其中电动阀控制定向流动通道中的流体流动。
在多个方面中，可通过计算机的处理器来控制或进行以下步骤：将标签、样本(例如，包括颗粒的样本，如分析物，其例如可以是细胞或分子)或样本的一部分引入到通道、微流体芯片、或分选装置，使标签、样本、或样本的一部分流过通道或流动路径，使样本或其一部分反向流动、问询标签、样本、样本的一部分(例如，通过操作辐射源)，调控流动路径或通道中样本或其一部分的流动、调控流动路径或通道中的流动轮廓。在多个方面中，可通过计算机的处理器来控制以下步骤：操作一个或多个检测器，检测稀有颗粒的存在与否，基于稀有颗粒的存在与否对等分试样(例如，样本的一部分，其可包括分析物如细胞或分子)分配值，划分等分试样或样本，使等分试样经过分离程序(例如，如基于分配的值，通过打开电动阀引导等分试样的流动)，进行分离程序，操作阀，捕获颗粒(如分析物)(例如，细胞或分子)，释放颗粒(如分析物)，过滤样本或其一部分，或收集样本或其一部分。
疾病的诊断
在一些方面，使用本方法分离的分析物(例如，细胞)可进一步进行亚群分析(例如，根据基因型或表型)以开发靶向治疗。例如，可以将分离的细胞(例如，肿瘤细胞)与结合到特定生物标志物(例如，药物靶标)的标签(例如，荧光抗体)一起孵育，以确定药物靶标的存在或表达程度。一旦确认了药物靶标的表达，就可以选择针对特定药物靶标表达而专门开发的药物。在一示例中，分离的肿瘤细胞可以与特异性结合Her2受体的荧光抗体一起孵育，以确定***肿瘤的脱落的CTC是否为Her2阳性。如果分离出的肿瘤细胞表现出高的Her2表达，则赫赛汀(Herceptin，曲妥珠单抗)可以用作疗法，因为该药物是设计靶向和阻断HER2蛋白过表达功能的药物。其它已知的药物靶标，包括BCR-ABL或PDGFR(由药物格列卫(Gleevec)靶向)，ERBB2(由赫赛汀(Herceptin)靶向)，EFGR(由易瑞沙(Iressa)、特罗凯(Tarceva)靶向)，RAR-alpha(由ATRA靶向)、***受体(由他莫昔芬(Tamoxifen)靶向)、芳香化酶(由来曲唑(Letrazole)靶向)、雄激素受体(由氟他胺(Flutamide)、比卡鲁胺(Biclutamide)靶向)、CD20(由Rituximab靶向)、VEGF受体(由Avastin靶向)可在制定适当的化疗方案之前，从分离的肿瘤细胞中类似地筛选出。
在一些方面，所述分析物可以是稀有颗粒(例如，癌细胞或循环肿瘤细胞(CTC))。在其它情况下，所述稀有颗粒可以是寄生细胞或生物体，例如，贾第虫(Giardia)或隐孢子虫(Cryptosporidium)物种、被疟原虫(Plasmodium)感染的红细胞，感染了艾滋病毒的淋巴细胞或白细胞、母体血液中的胎儿细胞、干细胞、朊病毒感染的细胞、CD4+T-细胞等。
在一些方面，所述方法可包括检测来自对象的血液样本中的循环肿瘤细胞。所述方法可包括eDAR。在某些方面中，所述对象可以是被诊断出患有癌症的患者。在一些方面，所述癌可能是I期，II期，III期或IV期。在一些方面，循环肿瘤细胞(CTC)可以从先前被诊断出患有癌症的患者的血液样本中进行检测。在这种情况下，患者可以进一步诊断为转移癌。
在一些方面，所述方法可用于诊断先前已被诊断为实体瘤的对象的转移癌，所述方法包括以下步骤：(a)从对象检测血液样本的等分试样中CTC的存在与否；(b)根据CTC的存在与否，为等分试样分配值；以及(c)基于分配的值引导等分试样的流动或收集。
在一些方面，血液样本中缺乏CTC可能与没有转移癌的对象对应。血液样本中存在至少一个CTC可能与具有转移癌的对象关联。在一些方面，血液中存在至少一定数量CTC可以与患有转移癌的对象关联。所述方法可进一步包括步骤(d)，如果在血液样本中没有检测到CTC则诊断为对象没有转移癌，如果在血液样本中检测到至少一个CTC则诊断为对象有转移癌。
本公开还提供用于监控诊断患有癌症的对象的方法。所述方法可包括使用本文提供的eDAR方法检测来自对象的血液样本的等分试样中CTC的存在与否。在一些方面，可以定期监控患者的癌症进展为转移性癌症的进展，例如至少一年一次、至少一年两次、至少一年3、4、5、6、7、8、9、10或更多次，或每年至少约3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。在某些方面，对象可被每月监控一次，或者至少每月监控2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。在某些方面，对象可被每月监控约一次，或者至少每月监控约2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。血液样本中缺乏CTC可能与没有转移癌的对象关联。血液样本中存在至少一个CTC可能与具有转移癌的对象关联。血液中存在至少一定数量的CTC可以与患有转移癌的对象关联。
在血液样本中检测到CTC的情况下，所述方法可以进一步包括对被识别为包含CTC的一个或多个等分试样进行进一步分析，以识别一个或多个CTC细胞的一个或多个特征的步骤。例如，可使包含CTC的等分试样或等分试样库与对一个或多个癌特异性表面抗原具有特异性的一个或多个检测试剂接触。可以测定的癌特异性表面抗原的非限制性实例包括但不限于BCR-ABL或PDGFR(由药物格列卫(Gleevec)靶向)，ERBB2(由赫赛汀(Herceptin)靶向)，EFGR(由易瑞沙(Iressa)、特罗凯(Tarceva)靶向)，RAR-alpha(由ATRA靶向)、***受体(由他莫昔芬(Tamoxifen)靶向)、芳香化酶(由来曲唑(Letrazole)靶向)、雄激素受体(由氟他胺(Flutamide)、比卡鲁胺(Biclutamide)靶向)、CD20(由Rituximab靶向)、VEGF受体(由Avastin靶向)等。本文提供的方法和装置可用于诊断除癌以外的其他疾病。在一些方面，可以诊断出疟疾，所述方法包括检测感染了疟原虫的红细胞。在另一种情况下，提供了一种用于诊断HIV感染的方法，所述方法包括使用本文提供的eDAR方法和/或设备检测被HIV病毒感染的淋巴细胞或白细胞。在又一种情况下，提供了一种用于诊断与朊病毒有关的疾病的方法，所述方法包括从人或其他动物的生物流体中检测先验物。
在一些方面，所述分析物是稀有细胞且所述稀有细胞是细菌细胞。在一些方面，所述细菌细胞存在于全血样本中。在其它方面，装置、方法、***或设备被用于检测全血中稀有细菌细胞的存在。在一些方面，一种装置、方法、***或设备被用于检测全血样本中稀有细菌细胞的存在，以提供与表征或管理细菌感染或脓毒症有关的诊断、预后或其他治疗参数。
疾病的预后
本公开提供用于针对与流体中存在分析物有关的疾病或病症进行预后的方法。在一些方面，所述分析物可以是生物颗粒。在一些方面，所述流体可以是生物流体。在一些方面，所述方法包括以下步骤：(a)检测来自对象的样本的等分试样中分析物的存在与否；(b)基于分析物的存在与否，对等分试样分配值；(c)基于分配的值引导等分试样的流动或收集；以及(d)如果样本中未检测到分析物，则预后良好，如果样本中检测到分析物，则预后较差。
在一些方面，可以根据等分试样中分析物的数量或性质为等分试样分配值。在一些方面，可以根据样本中分析物的数量提供好或坏的预后。例如，如果样本中分析物的数量小于预定参考值，则可以提供良好的预后；如果样本中分析物的数量等于或大于参考值，则可以提供较差的预后。在一些方面，预定的参考值可能与对特定疗法有反应的可能性、或一段时间(例如至少6个月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长时间)内总体或无疾病生存的可能性有关。
在一些方面，本文提供的方法可被用于提供与稀有颗粒相关的任意疾病的预后。在一些方面，提供了一种用于提供疟疾的预后的方法，所述方法可包括使用本文提供的eDAR方法和/或设备确定来自个体的血液样本中被疟原虫感染的红细胞的数量。在一些方面，如果血液样本中检测到的受感染红细胞总数少于预定参考值，则预后良好；如果样本中检测到的受感染的红细胞总数等于或大于参考值，则预后不良。在一些方面，提供为HIV感染提供预后的方法，所述方法可包括使用本文提供的eDAR方法和/或设备确定来自个体的血液样本中被HIV病毒感染的淋巴细胞或白细胞的数量，如果血液样本中检测到的感染的细胞总数小于预定参考值，则预后良好；如果样本中检测到的感染的细胞总数等于或大于参考值，则预后较差。在一些方面，提供为朊病毒相关疾病提供预后的方法，所述方法可包括使用本文提供的eDAR方法和/或设备确定来自对象的生物流体样本中朊病毒的数量，如果血液样本中检测到的朊病毒总数小于预定参考值，则预后良好；如果样本中检测到的朊病毒总数等于或大于参考值，则预后较差。
在一些方面，本公开提供一种用于为诊断为实体瘤的对象提供预后的方法。在一些方面，所述方法包括以下步骤：(a)从对象的血液样本的等分试样中检测CTC的存在与否；(b)根据CTC的存在与否对等分试样分配值；(c)根据分配的值引导等分试样的流动或收集；以及(d)如果未检测到CTC，则预后良好；如果检测到CTC，则预后较差。
在一些方面，提供了一种方法来为诊断为转移癌的对象提供预后。在一些方面，所述方法包括以下步骤：(a)从对象的血液样本的等分试样中检测CTC的存在与否；(b)基于等分试样中检测的CTC的数量，对等分试样分配值；(c)根据分配的值引导等分试样的流动或收集；以及(d)如果血液样本中检测到的CTC总数小于预定参考值，则预后良好；如果样本中检测到的CTC的总数等于或大于参考值，则预后不良。
在一些方面，预定的参考值可能与对特定疗法有反应的可能性、或一段时间(例如至少6个月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长时间)内总体或无疾病生存的可能性有关。
疾病对治疗的响应
本公开提供用于监控疾病的进程或对疗法的响应的方法。在一些方面，所述方法可包括检测流体样本中的分析物。在一些方面，所述方法包括以下步骤：(a)在第一时间从对象获取的多个第一生物样本的多个等分试样中检测分析物的存在与否；(b)根据稀有颗粒的存在、不存在、数量或性质，对等分试样分配值；(c)确定第一样本中所有等分试样的总值；(d)在第二时间检测从对象获取的第二生物样本的多个等分试样中分析物的存在与否；(e)根据分析物的存在、不存在、数量或性质，对等分试样分配值；(f)确定来自第二样本的所有等分试样的总值；以及(g)比较分配给第一样本的总值和分配给第二样本的总值，其中与第一样本相比，分配给第二样本的增加的值与疾病的进展和/或对疗法的不良响应相关，和/或与第一样本相比，分配给第二样本的降低的值与疾病的消退和/或对该疗法的良好响应相关。在一些方面，基于分配给收集、进一步富集或进一步分析的值，等分试样可以进一步被引导到特定的通道或(有通道的)腔室。
在一些方面，监控疾病进展或对疗法的响应的方法可以在疾病诊断或治疗方案启动后定期使用。在一些方面，样本可从对象以至少一年一次、至少一年两次、至少一年3、4、5、6、7、8、9、10或更多次，或每年至少约3、4、5、6、7、8、9、10或更多次收集。在某些方面，对象可被每月监控一次，或者至少每月监控2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。在某些方面，对象可被每月监控约一次，或者至少每月监控约2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。
在一些方面，其中发现了一种疾病的进展或对疗法的不良响应，所述方法可以进一步包括分配疗法、增加剂量方案、改变治疗方案等步骤。在一些方面，与稀有颗粒有关的疾病或病症可以是癌、疟疾、HIV/艾滋病、朊病毒相关疾病等。
数字处理装置
在一些实施方式中，本文所述的平台、***、介质、和方法包括数字处理装置，或其使用。在另一些实施方式中，所述数字处理装置包括执行装置功能的一个或多个硬件中央处理单元(CPU)、通用图形处理单元(GPGPU)、或现场可编程门阵列(FPGA)。在又一些实施方式中，所述数字处理装置还包括配置为执行可执行指令的操作***。在一些实施方式中，所述数字处理装置任选地与计算机网络连接。在另一些实施方式中，所述数字处理装置可任选地连接到因特网，从而可以访问万维网。在又一些实施方式中，所述数字处理装置任选地与云计算基础架构连接。在其它实施方式中，所述数字处理装置任选地与内联网连接。在其它实施方式中，所述数字处理装置任选地与数据存储装置连接。
根据本文的描述，作为非限制性示例，合适的数字处理装置包括服务器计算机、台式计算机、膝上型计算机、笔记本计算机、子笔记本计算机、上网本计算机、平板计算机、机顶计算机、媒体流设备、手持计算机、因特网设备、移动智能手机、平板电脑、个人数字助理、视频游戏机和车辆。本领域技术人员将认识到，许多智能手机适用于本文所述的***。本领域技术人员还将认识到，具有任选的计算机网络连接的精选电视、视频播放器和数字音乐播放器适用于本文所述的***。合适的平板电脑包括本领域技术人员已知的具有小册子、平板和可转换配置的平板电脑。
在一些实施方式中，所述数字处理装置包括配置为执行可执行指令的操作***。操作***例如是软件，包括程序和数据，用于管理装置的硬件并提供执行应用程序的服务。本领域技术人员将认识到，作为非限制性示例，合适的服务器操作***包括FreeBSD、OpenBSD、Linux、/>MacOS/>Windows和/>本领域技术人员将认识到，作为非限制性示例，合适的个人计算机操作***包括/> Mac/>和类UNIX操作***，例如GNU//>在一些实施方式中，所述操作***由云计算提供。本领域技术人员还将认识到，作为非限制性示例，合适的移动智能电话操作***包括/>OS、/>Research/> OS、/>Windows/>OS、和/>本领域技术人员还将认识到，作为非限制性示例，适当的媒体流装置操作***包括：Apple/> Google/>Google和/> 本领域技术人员还将认识到，作为非限制性示例，合适的视频游戏机操纵***包括：/>Xbox/>Microsoft Xbox One、/>Wii/>和/>
在一些实施方式中，所述装置包括存储和/或记忆装置。储存和/或记忆装置是一个或多个物理设备，用于临时或永久存储数据或程序。在一些实施方式中，所述装置是易失性存储器，需要电源来维持存储的信息。在一些实施方式中，该装置是非易失性存储器，并在数字处理装置未通电时保留存储的信息。在另一些实施方式中，非易失性存储器包括闪存。在一些实施方式中，非易失性存储器包括动态随机存取存储器(DRAM)。在一些实施方式中，非易失性存储器包括铁电随机存取存储器(FRAM)。在一些实施方式中，非易失性存储器包括相变随机存取存储器(PRAM)。在其他实施方式中，该装置是存储装置，作为非限制性示例，其包括CD-ROM、DVD、闪存装置、磁盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器以及基于云计算的存储。在另一些实施方式中，所述储存和/或记忆装置是如本文所公开的装置的组合。
在一些实施方式中，所述数字处理装置包括向用户发送视觉信息的显示器。在一些实施方式中，所述显示器是阴极射线管(CRT)。在一些实施方式中，所述显示器是液晶显示器(LCD)。在另一些实施方式中，所述显示器是薄膜晶体管液晶显示器(TFT-LCD)。在一些实施方式中，所述显示器是有机发光二极管(OLED)显示器。在各种进一步的实施方式中，OLED显示器是无源矩阵OLED(PMOLED)或有源矩阵OLED(AMOLED)显示器。在一些实施方式中，所述显示器是等离子显示器。在其他实施方式中，所述显示器是视频投影仪。在又一些实施方式中，所述显示器是如本文公开的装置的组合。
在一些实施方式中，所述数字处理装置包括用于接收来自用户的信息的输入装置。在一些实施方式中，所述输入装置是键盘。在一些实施方式中，所述输入装置是指示装置，作为非限制性示例，其包括鼠标、轨迹球、轨迹板、操纵杆、游戏控制器或手写笔。在一些实施方式中，所述输入装置是触摸屏或多点触摸屏。在其他实施方式中，所述输入装置是麦克风，用于捕获语音或其他声音输入。在其他实施方式中，所述输入装置是摄像机或其他传感器，以捕获运动或视觉输入。在另一些实施方式中，输入装置是Kinect、Leap Motion等。在又一些实施方式中，所述输入装置是如本文公开的装置的组合。
参照图28，在特定实施例中，示例性的数字处理装置2801被编程或以其他方式配置为操作颗粒收集装置。装置2801可以调节本公开的颗粒收集装置的各个方面，诸如例如执行处理步骤。在该实施方式中，数字处理装置2801包括中央处理单元(CPU，本文也称为“处理器”和“计算机处理器”)2805，其可以是单核或多核处理器，或者是用于并行处理的多个处理器。数字处理装置2801还包括存储器或存储器位置2810(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存)，电子存储单元2815(例如，硬盘)，用于与一个或多个其他***通信的通信接口2820(例如，网络适配器)和***设备2825，如缓存，其他存储器，数据存储和/或电子显示适配器。存储器2810、存储单元2815、接口2820和***装置2825通过诸如主版的通信总线(实线)与CPU 2805通信。存储单元2815可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。数字处理装置2801可借助于通信接口2820操作性地连接到计算机网络(“网络”)2830。网络2830可以是互联网，因特网和/或外联网，或与互联网沟通内联网和/或外联网。在某些情况中，网络2830是电信和/或数据网络。网络2830可以包括一个或多个计算机服务器，其可以实现分布式计算，如云计算。在一些情况中，借助于装置2801，网络2830可以实现对等网络，这使得连接到装置2801的装置可以充当客户端或服务器。
继续参考图28，CPU 2805可以执行一系列机器可读指令，其可以体现在程序或软件中。指令可以存储在存储器位置，如存储器2810。指令可以指向CPU 2805，CPU 2805随后可以编程或以其他方式配置CPU 305以实现本公开的方法。由CPU 2805执行的操作的实例可以包括提取、解码、执行和回写。CPU 2805可以是电路的一部分，如集成电路。装置2801的一个或多个其他组件可以包括在电路中。在一些情况下，所述电路是专用集成电路(ASIC)或现场可编程门阵列(FPGA)。
继续参考图28，存储单元2815可以存储文件，如驱动程序、库和保存的程序。存储单元2815可以存储用户数据，例如，用户偏好和用户程序。数字处理装置2801在一些情况下可包括一个或多个外部的其他数据存储单元，例如位于通过内部网或因特网通信的远程服务器上。
继续参考图28，数字处理装置2801可以通过网络2830与一个或多个远程计算机***进行通信。例如，装置2801可以与用户的远程计算机***通信。远程计算机***的实例包括个人计算机(例如，便携式PC)，平板或平板电脑(例如，iPad，/>GalaxyTab)，电话，智能电话(例如，/>iPhone，支持Android的设备，/>))或个人数字助理。
这里描述的方法可以通过存储在数字处理装置2801的电子存储位置上的机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实现，例如，在存储器2810或电子存储单元2815上。机器可执行或机器可读代码可以软件的形式提供。在使用过程中，代码可以由处理器2805执行。在某些情况下，可从存储单元2815获取代码并将其存储在存储器2810供处理器2805快速访问。在一些情况中，可以排除电子存储单元1315，并将机器可执行指令存储在存储器2810中。
非暂时性计算机可读存储介质
在一些实施方式中，本文公开的平台、***、介质和方法包括一个或多个用程序编码的非暂时性计算机可读存储介质，该程序包括可由任选的联网的数字处理装置的操作***执行的指令。在另一些实施方式中，计算机可读存储介质是数字处理装置的有形组件。在另一些实施方式中，计算机可读存储介质可以任选地从数字处理装置中移除。在一些实施方式中，作为非限制性示例，计算机可读存储介质包括CD-ROM、DVD、闪存设备、固态存储器、磁盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、云计算***和服务等。在一些情况下，程序和指令被永久、基本上永久、半永久或非临时编码在介质上。
计算机程序
在一些实施方式中，本文公开的平台、***、介质、和方法包括至少一个计算机程序，或其使用。一个计算机程序包含一系列在数字处理装置的CPU中可执行，编写以执行指定任务的指令。计算机可读指令可以实现为程序模块，例如功能、对象、应用程序编程接口(API)，数据结构等，用于执行特定任务或实现特定的抽象数据类型。根据本文提供的公开内容，本领域技术人员将认识到，计算机程序可以用各种语言的各种版本编写。
计算机可读指令的功能可以在各种环境中根据需要组合或分布。在一些实施方式中，计算机程序包含一个指令序列。在一些实施方式中，计算机程序包含多个指令序列。在一些实施方式中，计算机程序从一个位置提供。在其它实施方式中，计算机程序从多个位置提供。在各种实施方式中，计算机程序包括一个或多个软件模块。在各种实施方式中，计算机程序，部分或全部包括一个或多个Web应用程序、一个或多个移动应用程序、一个或多个独立应用程序、一个或多个Web浏览器插件、扩展、加载项或附加组件、或其组合。
Web应用
在一些实施方式中，计算机程序包括web应用。根据本文提供的公开内容，本领域技术人员将认识到，在各种实施方式中，Web应用程序利用一个或多个软件框架和一个或多个数据库***。在一些实施方式中，基于NET或Ruby on Rails(RoR)的软件框架创建了Web应用。在一些实施方式中，作为非限制性示例，Web应用程序利用一个或多个数据库***，包括关系、非关系、面向对象、关联和XML数据库***。在另一些实施方式中，作为非限制性示例，合适的关系数据库***包括/>SQL服务器、mySQLTM和/>本领域技术人员还将认识到，在多种实施方式中，Web应用程序用一个或多个版本的一个或多个语言编写。Web应用可以用一个或多个标记语言、表示定义语言、客户端脚本语言、服务器端编码语言、数据库查询语言或其组合编写。在一些实施方式中，Web应用在某种程度上是以一种标记语言编写的，例如超文本标记语言(HTML)、可扩展超文本标记语言(XHTML)或可扩展标记语言(XML)。在一些实施方式中，在某种程度上，Web应用是用表示定义语言如级联样式表(CSS)编写的。在一些实施方式中，某种程度上，Web应用使用客户端脚本语言如异步Javascript和XML(AJAX)、/>ActionScript、Javascript或/>编写。在一些实施方式中，在某种程度上，Web应用是以服务器端编码语言编写的，如活动服务器页面(ASP)、/>Perl、JavaTM、Java服务器页面(JSP)、超文本预处理器(PHP)、PythonTM、Ruby、Tcl、Smalltalk、/>或Groovy。在一些实施方式中，在某种程度上，Web应用是用数据库查询语言如结构化查询语言(SQL)编写的。在一些实施方式中，Web应用集成了企业服务器产品，如/>在一些实施方式中，Web应用包括媒体播放器元素。在各种进一步的实施方式中，媒体播放器元素利用一种或多种合适的多媒体技术，作为非限制性示例，包括/>HTML 5、/> JavaTM和/>
移动应用
在一些实施方式中，计算机程序包括提供给移动数字处理装置的移动应用。在一些实施方式中，移动应用在其制造时就被提供给了移动数字处理装置。在一些实施方式中，移动应用通过本文所述的计算机网络被提供给移动数字处理装置。
鉴于本文提供的公开，移动应用通过本领域技术人员已知的技术使用本领域已知的硬件、语言和开发环境来创建。本领域技术人员将认识到，移动应用是用几种语言编写的。作为非限制性示例，合适的编程语言包括C、C++、C#、Objective-C、JavaTM、Javascript、Pascal、Object Pascal、PythonTM、Ruby、VB.NET、WML和XHTML/HTML(带有或不带有CSS)、或其组合。
合适的移动应用开发环境可以从多种来源获得。作为非限制性示例，可商业获得的开发环境包括AirplaySDK、alcheMo、Celsius、Bedrock、Flash Lite、.NET Compact Framework、Rhomobile和WorkLight Mobile平台。作为非限制性示例，其他开发环境可免费获得，包括Lazarus、MobiFlex、MoSync和Phonegap。作为非限制性示例，此外，移动装置制造商还分发软件开发人员工具包，包括iPhone和iPad(iOS)SDK、AndroidTMSDK、/>SDK、BREW SDK、/>OS SDK、Symbian SDK、webOS SDK和Mobile SDK。
本领域技术人员将认识到，有几个商业论坛可用于分发移动应用程序，作为非限制性示例，包括App Store、/>Play、Chrome WebStore、/>AppWorld、适用于Palm设备的App Store、适用于webOS的App Catalog、适用于移动设备的Marketplace、适用于/>设备的Ovi Store、/>Apps和/>DSi Shop。
独立应用
在一些实施方式中，计算机程序包括独立的应用，其是作为独立的计算机进程运行的程序，而不是现有进程的附加程序，例如，不是插件。本领域技术人员将认识到，独立应用程序经常被编译。编译器是一种计算机程序，可以将以编程语言编写的源代码转换为二进制目标代码，例如汇编语言或机器代码。作为非限制性示例，合适的编译程序语言包括C、C++、Objective-C、COBOL、Delphi、Eiffel、JavaTM、Lisp、PythonTM、Visual Basic和VB.NET、或其组合。通常至少部分地执行编译以创建可执行程序。在一些实施方式中，计算机程序包括一个或多个可执行的经编译的应用程序。
Web浏览器插件
在一些实施方式中，计算机程序包括web浏览器插件(例如，扩展等)。在计算中，插件是一个或多个软件组件，可以向更大的软件应用程序添加特定功能。软件应用的制造商支持插件，以使第三方开发人员能够创建扩展应用的功能，以支持轻松添加新特征并减小应用的大小。如果支持，插件可以自定义软件应用的功能。例如，插件通常用于Web浏览器中以播放视频、产生交互性、扫描病毒以及显示特定文件类型。本领域技术人员将熟悉几种Web浏览器插件，包括Player、/>和在一些实施方式中，工具栏包含一个或多个网络浏览器扩展、内插式附件、或外接式附件。在一些实施方式中，工具栏包含一个或多个资源管理器栏、工具栏或桌面栏。
鉴于本文提供的公开内容，本领域技术人员将认识到，有几种插件框架可用，这些插件框架使得能够以各种编程语言开发插件，作为非限制性示例，包括C++、Delphi、JavaTM、PHP、PythonTM和VB.NET、或其组合。
Web浏览器(也称为因特网浏览器)是软件应用，设计用于与网络连接的数字处理装置一起使用，用于在因特网上检索、呈现和遍历信息资源。作为非限制性示例，合适的web浏览器包括Internet/>Chrome、/> 和KDE Konqueror。在一些实施方式中，web浏览器是移动web浏览器。移动web浏览器(也称为微浏览器、小型浏览器和无线浏览器)设计用于移动数字处理装置，作为非限制性示例，包括手持式计算机、平板计算机、上网本计算机、子笔记本计算机、智能手机、音乐播放器、个人数字助理(PDA)和手持式视频游戏***。作为非限制性示例，合适的移动web浏览器包括/>浏览器、浏览器、/>Blazer、/>浏览器、用于移动设备的/> Mobile、Basic Web、/>浏览器、/>Mobile和PSPTM浏览器。
软件模块
在一些实施方式中，本文公开的平台、***、介质、和方法包括软件、服务器、和/或数据库模块，或其使用。鉴于本文提供的公开，软件模块通过本领域技术人员已知的技术使用本领域已知的机器、软件和语言来创建。本文所公开的软件模块以多种方式实现。在各种实施方式中，软件模块包括文件、一部分代码、编程对象、编程结构或其组合。在进一步的各种实施方式中，软件模块包括多个文件、多个代码部分、多个编程对象、多个编程结构或其组合。在各种实施例中，作为非限制性示例，一个或多个软件模块包括web应用、移动应用和独立应用。在一些实施例中，软件模块在一个计算机程序或应用中。在其它些实施例中，软件模块在超过一个计算机程序或应用中。在一些实施例中，软件模块被托管在一台机器上。在其它实施例中，软件模块被托管在超过一台机器上。在其他实施方式中，软件模块被托管在云计算平台上。在一些实施例中，软件模块被托管在一个位置的一台或多台机器上。在其它实施例中，软件模块被托管在超过一个位置的一台或多台机器上。
数据库
在一些实施方式中，本文所公开的平台、***、介质和方法包括一个或多个数据库，或其使用。鉴于本文提供的公开，本领域技术人员将认识到许多数据库适合于信息的存储和检索。在各种实施方式中，作为非限制性示例，合适的数据库包括关系数据库、非关系数据库、面向对象的数据库、对象数据库、实体关系模型数据库、关联数据库和XML数据库。其他非限制性示例包括SQL、PostgreSQL、MySQL、Oracle、DB2和Sybase。在一些实施方式中，数据库是基于因特网的。在另一些实施方式中，数据库是基于网络的。在又一些实施方式中，数据库是基于云计算的。在其他实施方式中，数据库基于一个或多个本地计算机存储装置。
本文中，范围可以表示为从“约”一个具体值开始和/或至“约”另一个具体值终止。当表述这样的范围时，另一个实施方式包括自所述一个具体数值始和/或至所述另一具体数值止。类似地，当用先行词约摂将数值表示为近似值时，应理解具体数值构成了另一个实施方式。还应理解，每个范围的端点在与另一个端点有关及独立于另一个端点时都是重要的。如本文所用，术语“约”是指在特定用途的上下文中相对于所述数值为正负15％的范围。例如，约10将包括8.5到11.5的范围。
虽然本文显示和描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员显然了解这些实施方式仅以举例方式提供。本领域技术人员在不背离本发明的情况下可以作出多种改变、变化和替代。应理解，本文所述的本发明实施方式的各种替代形式可用于实施本发明。所附权利要求书确定了本发明范围，这些权利要求范围内的方法和结构以及其等同物均为本发明所涵盖。
本文所示的细节仅是示例性的，仅出于对本发明的优选实施方式的说明性讨论的目的，并且出于提供被认为是对本发明的各个实施方式的原理和概念方面的最有用和易于理解的描述的原因而呈现。在这方面，没有做出比对本发明的基本理解所必需的更详细地示出本发明的结构细节的尝试，结合附图和/或示例进行的描述使本领域技术人员显而易见如何在实践中体现本发明的几种形式。除非在以下示例中进行了明确和明确的修改，或者当含义的应用使任何构造变得无意义或实质上无意义时，以下定义和解释均应以任何将来的构造为准。如果该术语的构造将使其变得毫无意义或基本没有意义，则该定义应取自韦伯斯特词典第3版或本领域技术人员已知的词典，例如《牛津生物化学和分子生物学词典》(安东尼·史密斯编辑，牛津大学出版社，牛津，2004年)。
如本文所使用的，除非另外指出，否则术语“一个”和“一种”被认为是指“一个”、“至少一个”或“一个或多个”。除非另作说明，本文使用的单数术语涵盖复数，复数术语涵盖单数。
除非说明书和权利要求中另有明确说明，术语“包括”、“包含”等应被认为是包括性含义，而不是排他性或穷举性含义，也就是说，其含义是“包括但不限于”。
除非另有说明，否则可以以任何顺序执行本文描述的方法和过程。例如，描述为步骤(a)、(b)和(c)的方法可以首先执行步骤(a)，然后执行步骤(b)，然后执行步骤(c)。或者，该方法可以以不同的顺序执行，例如首先是步骤(b)，然后步骤(c)，然后是步骤(a)。此外，除非另外特别指出，否则这些步骤可以同时或分别进行。
使用单数或多数的词语也分别包括多数和单数。另外，当在本申请中使用时，术语“本文”、“上述”和“下述”以及类似含义的词语应指本申请的整体，而不是本申请的任何特定部分。
实施例
包括以下实施例以进一步描述本发明的一些方面，并且不应用于限制本发明的范围。
实施例1
用于循环肿瘤细胞的大容量捕获的基于微流组件的综合决策等分试样定级
根据本公开的一个方面，本实施例描述并验证了一种用于分离包括细胞在内的颗粒的新型eDAR平台。
决定eDAR平台特征和性能的两个因素是高效和主动的分选方案，以及随后的高效纯化(例如，纯化腔室)方案。当前的eDAR-平台优化了这两个部分。在一个实施例中，eDAR平台可包括一个由标准光刻方法制造的集成过滤区域。所述微流体芯片可由硅母板上的两个层组成，并且用一步复制模制成聚二甲基硅氧烷(PDMS)来制造。所述微流体芯片可与玻璃基板粘合来完成。整个***可以包括主动分选方案。微流体芯片和流体动力学切换机构的分析性能可针对特定的回收效率(例如，95％)、特定的假阳性(例如，0)和特定的通量(例如，每小时4.8mL全血)进行优化。
微流体芯片
本实施例中使用的微流体芯片在同一设计中集成了两个功能区域，即eDAR分选区域和基于狭缝结构的过滤单元。分选单元中的主通道将血液引入分选结点，其高度为50μm，宽度为150μm；其他4个通道分别为50μm高和200μm宽。狭缝过滤器的高度为5μm，宽度为5μm。测试的最大狭缝数量为20000。
硅母板采用两种光刻工艺制造(图5、20和21)这些功能是使用AutoCAD(加利福尼亚州圣拉斐尔市的Autodesk)设计的，并写在铬蒙版(加利福尼亚州SF的TRICR公司)上。选择正性光刻和深反应离子刻蚀(DRIE)来形成第一层，即微过滤器特征。AZ 1512用作正性光刻胶，由华盛顿大学的Micromanufacturing Facility(MMF)提供。对DRIE工艺进行了优化，以实现4.5-5μm的深度。使用SU-8-3050作为负性光刻胶(MicroChem，马萨诸塞州牛顿市)制造eDAR特征的第二层，并将特征高度控制为50μm。在使用十三氟-1,1,2,2-四氢辛基-1-三氯硅烷(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，密苏里州圣路易斯)将母版硅烷化后，将未固化的PDMS倒入硅晶片上，并在70℃下烘烤2小时。将具有所需微特性的PDMS片材从硅母版上剥离下来，然后使用等离子体氧化的标准工艺将其与一块盖板玻璃结合。
生物学和临床样本
eDAR***的表征和优化使用了三种乳腺癌细胞系，SKBr-3、MCF-7和MDA-MB-231细胞(美国典型培养物保藏中心(ATCC)，弗吉尼亚州马纳萨斯)。SKBr-3细胞在McCoy’5中培养，MCF-7在Eagle的最低必需培养基(EMEM)中培养，而MDA-MB-231在达氏改良伊氏培养基(DMEM)(美国典型培养物保藏中心，弗吉尼亚州马纳萨斯)中培养。所有细胞培养基中还含有2mM L-谷氨酰胺，10％胎牛血清(FBS)(美国典型培养物保藏中心，弗吉尼亚州马纳萨斯)和50μg/mL青霉素/链霉素(美国典型培养物保藏中心，弗吉尼亚州马纳萨斯)。在湿润的环境中，在37℃的5％的CO2中孵育。MDA-MB-231-GFP细胞系由塔夫斯大学(TuffsUniversity)的Gail Sonenshein教授提供，并在含有10％FBS和1μg/mL嘌呤霉素(生命技术公司(Life Technologies)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)的DMEM培养基中培养。健康捐献者的对照血液购自血浆国际实验室(Plasma International Lab)(华盛顿州埃弗雷特)；丢弃第一支抽血管，以防止皮肤细胞污染的任何可能性。根据弗雷德哈钦森癌症研究中心(FredHutchinson Cancer Research Center)的机构审查委员会批准的方案，从转移性胰腺癌患者中抽取全血样本。在西雅图癌症护理联盟(Seattle Cancer Care Alliance，SCCA)中收集患者样本，使用含有EDTA作为抗凝剂的真空管(BD生物科学公司(BD)，新泽西州富兰克林湖)在4℃下保存，并在4小时内进行分析。
样本制备和eDAR分析
除非另有说明，否则将Isoton(贝克曼库尔特有限公司(Beckman Coulter Inc.)，加利福尼亚州富勒敦)用作所有实验的缓冲液。对于典型的eDAR实验，在室温下在黑暗中将1mL全血样本用抗藻红蛋白(PE)(批号515776，亚诺法公司(Abnova)，加利福尼亚州核桃)标记的抗EpCAM标记30分钟。所有标记参数均已优化。将标记的样本稀释至14mL，然后离心去除游离抗体。将最终体积调整为与初始体积相同。接下来使用注射泵将制备的样本注射至微流体芯片。通过PCI数据采集卡(PCI6602，美国国家仪器(National Instruments)，得克萨斯州奥斯汀)收集了来自光纤耦合的雪崩光电二极管(APD)(埃赛力达科技公司(Excelitas Technologies)，马萨诸塞州沃尔瑟姆)的迹线。eDAR的分选过程是使用自制的LabVIEW(美国国家仪器，得克萨斯州奥斯汀)脚本和内部内置的现场可编程门阵列(FPGA)装置自动控制的。收集分选的等分试样的流体动力学切换由购自李公司(Lee Company)(康涅狄格州韦斯特布鲁克)的螺线管(INKA1226212H)控制。
将所有阳性等分试样收集到过滤区域后，用isoton在不到1分钟的时间内快速冲洗过滤区域。如果将任何细胞质标记物用于二级标记，则将4％的多聚甲醛(PFA)加载到过滤区域以固定细胞。使用465(空气产品公司(Air Products)，宾夕法尼亚州阿伦敦)渗透固定的细胞。通常使用抗EpCAM-PE和抗细胞角蛋白APC(批号MAB5131，亚诺法公司，加利福尼亚州核桃)和抗CD45-异硫氰酸荧光素(FITC)(批号B116314，BioLegend，加利福尼亚州圣迭戈)作为二级标记的抗体。Hoechst(生命技术公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)也被用作核染色剂，以验证标记的靶标实际上是有核细胞。
eDAR的方法如下：将血液样本注入微流体芯片中，分成等分试样。然后应用线共焦检测方案将等分试样的定级定为“阳性”或“阴性”，这由标记方案确定。例如，在许多应用中，血液都被抗EpCAM-PE标记，因此只有具有与该抗体偶联的特定染料发出荧光信号的等分试样被列为阳性事件。应用自动反馈方案来生成血流方向的切换，从而可以迅速收集阳性等分试样。由于CTC的浓度非常低，超过99.999％的等分试样因为缺少所需的荧光信号而被丢弃。将那些给出阳性荧光信号的等分试样转移到微流体芯片上的另一个区域以进行进一步纯化，然后计数。可以对捕获的细胞进行一系列下游分析。
重新设计的流体动力学分选方案。
以前，eDAR具有机械阀来控制主动分选步骤，与其他报道的切换机构(如电渗流动或溶胶-凝胶转化)相比，其具有快速(约2毫秒响应时间)和稳健性。尽管很有希望，但该机械阀方案的一些设计因素潜在地限制了eDAR的潜在应用。为了在微流体芯片上形成机械阀，需要3个单独的结构层-螺线管，其PDMS线和150μmPDMS膜上的微通道。这将使微流体芯片的制备复杂且耗时。另一个缺点是捕获的血液等分试样与机械阀之间直接接触，这潜在地增加了CTC损失或损坏的风险。在本示例中，将螺线管替换为芯片外样式，其通常是封闭的，但在被施加5V DC电压时可以在2到3毫秒内打开。由于该列式螺线管不是微流体芯片的一部分，因此显著简化了微流体装置的制备。螺线管可以容易地与任何微通道连接以测试流体动力学分选方案。设计并测试了八种不同的方案(图3)来驱动流体切换。由于这种螺线管的结构和PDMS的弹性，流体性能有所变化(表1)，每种方案都具有最佳性能。
在表征和优化后，为eDAR选择了平台的结构和相应的流体动力学分选方案(图4)。使用注射泵(图4A)将标记的血液样本注入微流体芯片的顶部通道。缓冲液流过的两个侧通道被用于控制主动分选步骤。两个端口位于右侧通道上，并且都连接到加压缓冲液源。常闭的螺线管被连接到分选结点附近的端口，以控制流体动力学切换。分选结点之后有两个通道。左通道用于收集阳性等分试样并将它们递送到过滤和收集区域以进一步纯化(例如，纯化腔室)；右通道是废物收集通道，所有阴性等分试样在其中流过。
当这些等分试样被定级为“阴性”时(图4B)，螺线管上没有施加电压，因此其被关闭。在1号和3号缓冲液源之间设置了一个初始压降，因此血液只能流动到收集废物的通道中，这也如图4B中的明场图像所示。当通过第一检测窗口检测到阳性事件时，立即在螺线管上施加5V DC电压，以打开2号缓冲液储存器的缓冲液流。右侧的缓冲通道的该减小的流动阻力产生了更高的流速。从右侧向左推动血液流动以收集阳性等分试样(图4C)。在第二检测窗口收集并确认了该等分试样后，螺线管被关闭以将血液流动切换回废物收集通道(图4D)。每次切换和切回所需的时间被定为2至3毫秒(图5)。即使测试了超过105个开关循环，该过程对于eDAR而言也足够稳定。将列式螺线管放置在缓冲线上，使血液不会来与螺线管接触，从而消除了血液凝结和交叉污染的可能性。此外，在此方案中，在eDAR过程中，CTC收集通道中缓冲液的流量恒定。这提高了后续纯化(例如，纯化腔室)步骤的效率，并防止了细胞聚集物的形成。
在本实施例的一些方面中，可将阳性等分试样收集在过滤区域上，并用Isoton在不到1分钟的时间内冲洗过滤区域。细胞质标记物可用于二级标记，并可将4％多聚甲醛加载到过滤区域以固定细胞。使用465(空气产品公司(Air Products)，宾夕法尼亚州阿伦敦)渗透固定的细胞。可使用抗EpCAM-PE和抗细胞角蛋白APC(亚诺法公司，加利福尼亚州核桃)和抗CD45-异硫氰酸荧光素(FITC)(BioLegend，加利福尼亚州圣迭戈)进行二级标记。Hoechst(生命技术公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)可以用作核染色剂来验证是否有核细胞。
纯化(例如，纯化腔室)机构的设计
该实施例的另一方面可以包括基于芯片上过滤的微狭缝结构的新方案，该微狭缝结构可以由PDMS制成、并且可能不需要其他层(图7A)。图7A示意了这些微缝隙的示例的基本结构，该微缝隙用于捕获CTC，而没有保留任何红细胞(RBC)。狭缝的尺寸已优化为5μm高和5μm宽(图7B)，以避免损失任何小的CTC。使用这种尺寸的过滤器无法捕获许多白细胞，其小于大多数基于过滤的CTC方法中使用的尺寸。由于微过滤器是由PDMS制成，并盖有一片盖玻片，因此与不是完全透明、会产生散射和像差的聚碳酸酯过滤器相比，其成像质量(图7C和7D)得到了显著改善。此外，由于细胞只能沿狭缝的阵列被捕获，因此它们易于查询和跟踪；在许多其他方法中，细胞随机分布在表面上。沿狭缝的这种捕获使成像过程更快，并且枚举结果更加准确。狭缝还使其更快、更高效地对捕获的CTC进行二次标记。图7E示出了将标记有抗EpCAM-PE的两个癌细胞捕获在微狭缝中。使用抗细胞角蛋白-Alexa 488，抗Her2-Alexa647和Hoechst对细胞进行固定、透化和标记。荧光图像清楚地显示了这些标记物在这两个细胞上的表达，明场图像也证实了它们的形态。还用抗CD45-Alexa700标记了两个细胞作为阴性对照标记物，并且没有来自颜色通道的信号与该标签相对应。
eDAR的表征和分析性能
主动分选步骤的效率被实时监控。图6示出了来自胰腺癌患者样本的APD数据的一小部分。“决策APD迹线”来自第一个检测窗口，其对等分试样进行定级并控制分选。978毫秒和1298毫秒处的两个峰代表两个用抗EpCAM-PE标记的CTC，它们触发了等分试样分选。“确认APD迹线”的两个峰表明两个癌细胞流过位于收集通道上的第二个检测窗口，证实了两个阳性等分试样实际上已被分选。值得指出的是，来自第二检测器的背景变化(图6A)也证实了eDAR仅收集了一小部分血液，这有助于CTC的高富集率(对于典型的临床样本，最高可达一百万倍)。
因为标记的CTC必须从第一检测窗口流到第二检测窗口，所以观察到了决策APD峰与其确认信号之间的时间差。该时间差被定义为分选的CTC的渡越时间，它可以变化，因为由于微通道中层流动的性质，CTC可以具有不同的线性流速。图6B示出了在40和80μL/分钟的流速下的渡越时间的分布直方图。通常，较高的血液体积流速导致所分选的CTC的渡越时间缩短(图6C)。当流速为90μL/分钟时，平均渡越时间降低到4毫秒，这非常接近分选方案的切换时间(2到3毫秒)，这意味着这是eDAR的设计的特定实施方式的通量极限。在其他实施方式中，本eDAR设计可以获得小于2毫秒的渡越时间。
如果分选的CTC的渡越时间短于流体动力学切换时间，则可能无法在此平台上可靠地对细胞进行分选。因此，将分选效率定义为收集事件的数量与触发分选的事件的总数之比。图6D示出了在30至100μL/分钟的流速下的分选效率的值。当流速为30μL/分钟时，分选效率几乎为100％，因为在该流速下的平均渡越时间为约10毫秒(图6D)。该渡越时间足够长，可以进行主动分选步骤来收集CTC。当流速为80μL/分钟时，分选效率降至90％，然后当流速为90μL/分钟时降至49％。图6D还示出了eDAR在不同流速下的回收效率，其与分选效率相比具有相似的趋势。但是，回收效率被定义为添加的细胞数对比在微流控芯片上使用多色荧光成像计数的回收细胞数。该性能是许多因素的组合，包括抗体标记效率、线共焦检测效率和分选效率。这解释了在相同流速下回收和分选效率之间的差异。结果，对于当前这一代的eDAR，通量的上限为80μL/分钟(1mL血液为12.5分钟)，回收率为88％。尽管此通量比用于分析全血的大多数CTC技术要高，但可以通过设计更宽的血液入口通道或将第一检测光束向上移动来进一步提高通量。
将3至975个MCF-7细胞添加到1mL健康血液中，在50μL/分钟的流速下分析回收效率。为了确保下限细胞数的准确性，当浓度低于100细胞/mL时，使用毛细管计数方法精确地掺入培养细胞。平均回收率为95％，R2值为0.998(图6E)，略高于第一代eDAR(93％)。由于CTC的浓度通常很低，因此枚举结果受泊松分布的影响。在这种情况下，能够以可接受的通量和回收率来分析更大体积的全血样本的能力非常重要。将相同数量的MCF-7细胞掺入1、5和10mL健康血液中，然后以50μL/分钟的流速分析这三个样本。它们的回收率没有显著变化(图6F)，这表明该方法能够以高效率和通量运行大量全血。
尽管在大多数CTC研究中都使用EpCAM来选择肿瘤细胞，但越来越多的研究报告了EpCAM表达低的CTC具有更多的间充质特征，并且更具侵略性。最新的eDAR平台具有足够的灵活性，可以使用任何标记方案、通过EpCAM以外的生物标记物选择稀有细胞来捕获肿瘤细胞。设计了三种方案以选择不同的培养的乳腺癌细胞系(图6G)。使用EpCAM选择MCF-7细胞，使用Her-2选择SKBr-3细胞，使用EGFR选择MDA-MB-231细胞。所有这三种方案均分离并捕获了目标细胞，回收率高于88％。eDAR的另一个独特而重要的功能是标记物位置的独立性。例如，在其他技术如表面捕获方法或免疫磁性方法中，只能捕获细胞表面上的抗原。本方法能够选择具有细胞内标记物(如GFP)的细胞(图6D)。掺入人全血的MDA-MB-231-GFP细胞的回收率为91％(图6G)。由于荧光蛋白已广泛用于动物模型中以研究转移的进展和机制，因此eDAR是在这些模型中选择CTC的理想工具。
实施例2
双重捕获eDAR
该实施例描述了根据本公开的一个方面的eDAR的“双重捕获”版本。双重捕获eDAR可以同时从同一微流体装置上的同一人类血液样本中分离出CTC的两个不同亚群。这两个亚群可以分别以较高的回收率和纯度被捕获在微流体芯片上的两个不同区域上。
图8示出了微流体装置的总体结构。血液样本预先用两种与不同的荧光标签偶联的抗体标记。例如，血液样本用上皮标记物如与PE偶联的抗EpCAM、以及间充质标记物如与和PE相比具有不同发射波长的另一种荧光团如FITC偶联的抗EGFR或抗波形蛋白进行标记。将标记的血样注射到微流体芯片中，可以使用线共焦方案检测带有EpCAM表达的CTC，其中黄色通道中有一个峰，然后触发一个主动分选事件以将该等分试样收集到收集通道#1中。同样，如果等分试样对间充质标记物呈阳性，则将其分选到收集通道#2。然后将两个亚群分别捕获并富集在微流体芯片上。过滤区域建立在第二代eDAR所使用的微狭缝设计上。
流体切换方案总结如下。当等分试样对所应用的任何标记物均为阴性时，则图8中的两个螺线管都被关闭。如果两侧通道上的压力达到平衡，血液就会流到底部中央通道，用于收集废物。当等分试样仅对上皮标记物定级为阳性时，螺线管#2立即打开，因此血流被推至左侧的收集通道(图9B)。收集等分试样后，螺线管#2再次关闭，因此血液流动切换回中心。当等分试样仅对上皮标记物定级为阳性时，螺线管#1立即打开，因此血流被推至右侧(图9C)。两种类型的eDAR分选事件的响应时间约为2到3毫秒。
图8示出了“双重捕获”eDAR的总体结构。标记的血液被引入顶部的主通道。缓冲液流动到两侧通道中以使用两个螺线管控制血液流动的流体动力学切换。CTC的两个亚群被分离并捕集在同一微流体芯片的两个不同过滤区域中。
图9描绘了血液流动的三种状态的明场图像。A)血液流入废物收集通道，因为等分试样对任一标记均定级为阴性。B)将血液切换到#1收集通道，并将CTC的第一亚群转移到该通道。C)将血液切换到#2收集通道，并将CTC的第二亚群转移到该通道。
实施例3
多级分选和分散
MCF-7细胞系获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯)。将细胞在EMEM培养基(ATCC)中于37℃和5％CO2下培养。培养基中添加了5％v/v胎牛血清(FBS)和1％v/v青霉素链霉素(均来自西格玛-奥德里奇公司，密苏里州圣路易斯)。
从血浆国际实验室(华盛顿州埃弗雷特)获得健康的全血样本。
除了藻红蛋白(PE)-抗EpCAM(阿柏堪穆公司(Abcam)，马萨诸塞州坎布里奇)以外，抗体均购自BioLegend公司(加利福尼亚州圣迭戈)。IsotonII缓冲液用作eDAR的鞘流，购自贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)(加利福尼亚州布雷亚)。牛血清白蛋白(BSA)和TWEEN 20购自西格玛-奥德里奇公司(密苏里州圣路易斯)。在isoton中制备两个溶液：一个0.1％BSA w/w的用于标记，第二种是1％BSA/0.05％TWEEN20 w/w，用于预处理材料。甘油购自EMD(马萨诸塞州比勒利卡)，并在Isoton中制备了25％w/w的溶液，以模拟血液的流体特性用于分选实验。将该溶液与绿色食用染料(COV提取公司(COV Extract Company)，俄亥俄州罗克福德)以30/70的比例混合，用于需要分选图像的实验。
硅母版是使用SU-8 2050(MicroChem，马萨诸塞州韦斯特伯鲁)进行旋涂的标准光刻技术制成的。芯片是由前体与聚合物基料的比例为1∶10的PDMS制成的，完全固化，并在暴露于O2等离子体中一分钟后立即密封到玻璃基板上。如果不立即使用，则将芯片盖好并保存直到使用，但不得超过一个月。
为了测试不同芯片设计的等分试样拉伸能力，将10μl PE-山羊抗小鼠抗体添加到离心滤管中的40μl过滤的isoton中，并以14000RPM旋转5分钟以去除聚集物。将其加入isoton的1ml 25％w/w的甘油溶液中。加入约10μm的1500个黄色荧光珠(杜克科学公司(Duke Scientific)，加利福尼亚州帕洛阿尔托)。在第一级eDAR分选芯片和分选建立之后，将样本在多级荧光活化分选上运行。收集APD迹线，使用珠来触发分选事件，并分析分选出的染料峰。
用30μl PE-抗EpCAM标记MCF7细胞3小时。洗涤后，对细胞计数，并将约100个细胞掺入0.5ml血液中。将血液分选在芯片上。建立分选后，将经过1％BSA 0.05％TWEEN20预处理的新鲜试管***收集出口，并放入15ml的经预处理的离心管中。分选后，将收集的细胞在450RCF下离心10分钟，并除去上清液。加入15μl PE-抗-CD45(离心以去除聚集物)3小时。用isoton+0.1％BSA洗涤样本并在新芯片上运行，仅在进口和出口处打孔以便于使用。收集迹线，并使用MATLAB分析对总PE标记细胞进行计数。作为对照，重复上述过程而不添加PE-抗CD45，并且计数PE峰并确认其与来自第一分选实验的PE峰的数目匹配。
用30μl PE-抗EpCAM标记MCF7细胞(离心以去除聚集物)3小时。洗涤后，对细胞进行计数，并将已知数量(～100个细胞)掺入0.5ml血液中。将血液分选在芯片上。建立分选后，将经过1％BSA 0.05％TWEEN20预处理的新鲜试管***收集出口，并放入经预处理96孔板中。将细胞收集到96孔板的孔中，当达到约250μl的体积时，将管手动移至新孔。分选完成后，将孔板在450rcf下离心10分钟。在具有20倍，0.75NA物镜的尼康TE 2000 U显微镜(尼康公司(Nikon)，日本东京)上对细胞进行成像并计数。
由于eDAR分选全血而不是分析单列细胞，因此与其他荧光分选方法相比，样本的运行时间大大减少了。然而，该方法固有的事实是血细胞将与感兴趣的标记细胞一起分选。对于前一迭代的eDAR，使用芯片上过滤器来收集细胞，其狭缝宽度为5μm。这允许所有红细胞和大多数白细胞通过，同时保留最小的CTC。然而，去除保留在过滤器上的细胞非常耗时，如果要在分选后直接收集细胞，则需要提高纯度。为了实现这一点，我们设计了一种新的芯片，该芯片在第一分选结点之后包括第二分选结点(参见图18A)。当已分选的堵(plug)向下通过将两个结点(分散区域)分离的通道时，其会被拉伸，并且一旦细胞到达第二结点，就会进行第二检测和分选。如图18A所示，有两个检测点，在每个分选结点之前有一个。
图24A和图24B显示了分选期间两个结点的检测痕迹。如图所示，两个结点都检测到了细胞。图24C示出了来自第一分选结点和第二分选结点的APD数据的组合迹线的较短部分，分别以绿色和蓝色显示。两次分选之间存在一定的延迟时间，在此期间，等分试样或流体体积被拉伸和稀释。这意味着血细胞浓度降低，细胞之间的平均距离增加，第二时间中分选的这些细胞数低得多，因而按每个样本分选的CTC数量除以收集的有核细胞总数来衡量，纯度提高。
为了量化这种改善，用PE-抗EpCAM标记MCF7细胞，洗涤，计数并掺入0.5ml健康血液中。血液以30μl/分钟的速度流到顺序分选芯片上，并通过调节流动压力来建立分选。一旦设置了稳定的分选压力后，将收集出口管被移开并***经过预处理的管(在Isoton中1％BSA和0.05％tween20)。将该管的出口放置在经过预处理的15ml离心管中，收集整个分选的体积，其中包含分选的MCF7细胞、每个等分试样中分选的血液细胞和isoton缓冲液鞘流。对于使用0.5ml血液的分选实验，其体积约为1ml。分选后，将收集的体积在450rcf下离心10分钟，然后小心地将上清液移至约300μl。加入15μlPE-抗-CD45，标记细胞3小时，洗涤，并将去除上清液至1ml。这是通过一块清洁的芯片运行的，仅在进口和出口处打孔，并且收集和分析了APD迹线。作为对照，在不添加PE-抗CD45抗体的情况下进行了上述过程，并且PE峰的数量与来自第一分选实验的PE峰的数量相关，从而确认了在标记过程中细胞没有丢失。
迹线中的峰数产生了已分选的总有核细胞，包括最初分选的PE标记的MCF7细胞和分选后标记的PE标记的白细胞。为了计算纯度，将分选的MCF7细胞数除以总有核细胞数。从第一分选实验中的分选事件数获得分选的MCF7细胞数。对于1级分选，我们计算出约1％的纯度。对于2级分选，两个结点之间被3cm的通道隔开，我们实现了约15％的纯度。
以上的两个结点分开3厘米的直通道的数据显示纯度提高了约15倍。这是由于等分试样或流体体积在两个分选结点之间移动时的拉伸和稀释所致。由于微通道中层流动的混合较少，因此需要更长的通道才能实现充分的混合。因此，提高纯度的最简单方法是延长两个结点之间的通道。设计并制造了一个5.5cm通道分隔两个结点的芯片，并按照前述方法测量纯度。发现该设计的纯度约为21％。进一步的延长应会获得更大的纯度。
延长结点之间通道的长度可以改善拉伸和纯度，同时，大幅提高纯度和接近单细胞分离所需的通道长度可能不切实际。因此，需要一种更积极的混合或分离策略。我们采用三种方法拉伸等分试样或流体体积并提高纯度。一，我们设计了“流动拉伸器”，其包括与一系列更小的通道连接的长通道(图20)，以使得等分试样的部分沿第一小通道向下并且另一部分继续沿主通道，直至等分试样被完全分离为许多更小的等分试样或流体体积。
为了对此进行测试，使PE染料在甘油溶液中流到芯片上，该甘油溶液包含荧光珠和建立的分选。分选的等分试样或流体体积中包含黄色荧光珠和一堵染料，纯度的提高可通过临第二分选结点之前的APD迹线可视化了的染料等分试样或流体体积的拉伸来估算。虽然这不能提供绝对的纯度，但却是一种在装置设计之间进行比较的有用方法。等分试样或流体体积在第二结点的时间越长，其被拉伸的程度就越大，其结果是更少的血液细胞被分选到新的等分试样或流体体积。使用分选染料等分试样或流体体积的结果似乎很有希望(参见图25A-C)，但是所需的侧面通道尺寸较小，可能会造成堵塞和潜在的细胞损失。图25示出了流动拉伸器拉伸测试的结果，直通道流动拉伸器(图25A-B)和人字特征的流动拉伸器(图25C)被用来在通道上横向分布等分试样或流体体积。
第二种策略涉及堰部分，其中通道在高度上短暂地减小到了5-30μm，并沿着分开结点的通道放置。据推测，变形较大和/或变形较小的CTC或一些稀有细胞将在堰处显著变慢，而其他血液细胞将继续。测试了另一种类似堰的结构，其中在通道上横向采用了堰过滤器，缝隙为30-35μm。
图26A示出了细胞在第一堰拉伸器的图像。图26A的左侧图像是部分通道的明场图像。狭缝横跨通道的长度，宽度为35μm。图26A中的右图是PE标记的细胞的荧光图。图26B示出了细胞在第二堰拉伸器的图像。图26B中的左图是通道部分的明场图，在该情况下有30μm宽的狭缝。图26B中的右图是PE标记的细胞的荧光图。
最后，我们在分离通道的起始采用了使用人字特征的混沌混合设计，以使等分试样或流体体积横向扩散，然后再向下穿过通道的其余部分。该设计被添加到5.5厘米的直通道设计中，沿通道的第一个0.7cm使用了人字。由于多种原因，人字作为混合策略很有吸引力。首先，它们易于制造，仅需额外一层SU-8微制造，并且不需要任何阀或复杂的特征。其次，它们已被证明可调节到各种各样的应用程序。最后，它们不添加可能会困住细胞的收缩。
我们采用了包含三个人字部分的人字设计(参见图23A)：三个初始的人字从内壁到外壁成角度，因为我们已经观察到等分试样或流体体积中的细胞主要沿内壁传播；一个12个人字的部分，其中心向外壁交错排列；以及然后以相反的方向交错的12个人字。人字高度为30μm。第一部分直人字的宽度为80μm，间距为95μm。第二部分人字的宽度为70μm，间距为180μm。混合部分的长度为0.7厘米，紧随其后为4.8厘米的直通道。这种设计允许充分混合，以使细胞是横向分开穿过通道，而不是沿着外壁以一小堵行进。直通道的长部分然后允许细胞在纵向上进一步分离，因为由于抛物线流动轮廓，靠近通道中心的细胞比外边缘的细胞移动得快。如前所述进行测试时，该设计可获得30％的纯度。这意味着，对于在第一结点中每个分选的CTC或稀有细胞，当其在第二结点中被再次分选时，大约有2.5个白细胞。如果没有第二分选，则每个CTC大约有100个白细胞被分选在平均分选的90个MCF7细胞中，第二分选后收集了约225个白细胞。由于分选的总体积约为1ml，因此白细胞消耗率为2.2×104或4.3log(全血中为5×106白细胞/ml，而分选的体积中为225个白细胞/ml)。具有更长的通道的更多的人字可能会进一步改善这一点。表2总结了通过测试的设计获得的纯度结果。
表2
设计 纯度(CTC/总有核细胞)
1级eDAR ～1％
3cm通道 ～15％
5.5cm通道 ～21％
5.5cm通道和人字 ～30％
为了使这种方法在临床上有用，需要以易于枚举的方式收集细胞，并需要进行添加回收物(spike-in recoveries)、验证CTC或稀有细胞分离技术的传统方法。eDAR平台之前已通过来自不同的细胞系以及临床样本的回收进行了验证。该方法介绍了可能发生细胞损失的两个新因素：第二分选结点和96-孔板收集。因此，进行了回收以验证这些因素不会产生细胞损失。
为简便起见，使用预先标记的MCF7细胞进行了回收。我们已经对血液中的细胞标记步骤进行了先前的测试，因此对于本报告，我们决定仅分离***中的新特征。这些中首先是新的流体方案：包括在芯片上的两个分选结点。流动的平衡方式与之前的芯片相似，现在调整了三个位置的流动压力：(1)电磁阀一和二关闭，并沿第一废物通道(图27A和图27B中的第一帧)向下流动，(2)螺线管一打开且螺线管二关闭，沿第一收集通道向下流动(示于图27A)，和(3)螺线管一关闭且螺线管二打开以收集第二收集的细胞(图27B)。由于不存在引入潜在阻碍的芯片上过滤器，因此顺序芯片上的分选更加稳定。
图27A示出了三个图像帧，其描绘了顺序分选流体装置的第一结点的分选。比例尺是200μm。溶液是30％的甘油溶液(Isoton中25％w/w的甘油)和70％的绿色食用染料。这三个帧从左到右显示：没有螺线管打开；螺线管打开，流动开始向左移动；流动完全向下沿收集通道。图27B示出了三个图像帧，其描绘了顺序分选流体设备的第二结点的分选。比例尺是200μm。溶液是30％的甘油溶液(Isoton中25％w/w的甘油)和70％的绿色食用染料。这三个帧从左到右显示：没有螺线管打开，螺线管打开且流动开始向左移动，流动完全向下沿收集通道。
在第二结点对PE-抗EpCAM标记的MCF7细胞进行分选后收集它们，建立分选后，将经过预处理的管***收集出口，并将管的出口安装在经过预处理的96孔板上方。用1％BSA+0.05％Tween20的Isoton溶液预处理用于收集的管和96孔板，以防止细胞粘连。将输出的体积收集在一个孔中，直到达到约250μl，然后将管手动移至下一个孔。0.5ml血液的分选的总输出为约4孔或约1ml。为了计数孔中的细胞，将板在平板离心机上在450rcf下离心10分钟，以将所有细胞分离到孔的底部。然后可以在具有20倍、0.75NA物镜的荧光显微镜上计数细胞。在此阶段，如果需要进一步标记，可以将上清液移至所需的标记体积，并添加抗体或固定/透化的溶液。为了验证该步骤不会引起细胞损失，我们再旋转一次细胞，除去上清液，加入200μl isoton缓冲液+0.1％BSA，再次旋转平板并重新计数。没有观察到细胞损失。三种设计(3cm通道，5.5cm通道和5.5cm通道与人字)的平均回收约为91％，表明新设计引入了最小的细胞损失。
实施例4
具有颗粒捕获和释放的多级分选和分散
该实施例描述了根据本公开的一个方面的“捕获和释放”版本的多级分选设备，以及根据本公开的一个方面的进行颗粒捕获和释放的方法。在分选过程中或之后，从过滤器或屏障中捕获或释放颗粒或细胞，可以对发现的颗粒进行大量测定。例如，可以高纯度捕获CTC，用多重荧光标记的抗体标记，进行荧光成像，然后释放到小瓶中，并使用如聚合酶链反应和/或基因测序的技术进行分析。
颗粒捕获
通过二级分选和使用两个分选级和至少一个分散级的一个或多个分散操作对颗粒如细胞进行纯化和浓缩后，使用如示于图7A和图29A的过滤器元件收集颗粒。
将预定数量的SKBr-3乳腺癌细胞系细胞添加到4mL全血(例如，在添加SKBR-3细胞之前，其中包含多个细胞，但没有SKBr-3细胞或其他CTC)中，并用与藻红蛋白偶联的抗EpCAM抗体标记。用包括分散操作的两级分选来分离掺有SKBr-3细胞(例如，样本)的全血，如本文所述，并引入到图29A所示的过滤区域中，进行颗粒捕获。
通过第二分选级中的流动路径，将细胞引入过滤区域。可以想到，除了图29A所示的配置之外，连接第二分选级和过滤区域的流动路径，通过该路径将细胞引入到过滤区域中，该流动路径可以平行于、垂直于过滤区域或与过滤区域成一定角度。将细胞引入过滤区域后，通过在阳性流体流动条件下使其与过滤器关联(例如，接触)来捕获细胞。
在将第二分选级连接到过滤区域的流动路径以外，图29A还示出了两个分离流动路径(例如，第二和第三流动路径)，其与过滤器上游的过滤区域连接。可以预期，过滤区域可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个与该过滤器上游的过滤区域连接的流动路径。在通过连接第二分选级与过滤区域的流动路径将细胞引导到过滤区域的过程中，第二和第三流动路径被关闭。可以预期，在用于将细胞引导到过滤区域的流动路径以外，还有至少一个流动路径可在细胞捕获过程中打开。
在细胞被分选并被捕获在过滤器之后，包含抗细胞角蛋白APC的缓冲液(例如，额外的流体)通过第二流动路径流入过滤区域，第二流动路径包括注入端口，并与连接第二分选级和过滤区域的流动路径分离。在一些情况下，通过与用于将细胞引入到过滤区域的流动路径相同的流动路径将包含抗体的额外的流体引入到过滤区域。
进行荧光成像以计数在过滤器中捕获的目标细胞的数量。简而言之，使用具有20倍、0.75NA物镜(尼康公司，日本东京)、检测器和电磁辐射源的Nikon TE 2000U显微镜(例如，尼康TE 2000U显微镜，MiSelect R仪器(迈卡里奥股份有限公司(MiCareo Taiwan Co.,Ltd.)，中国台湾台北)等)对过滤器中捕获的细胞进行成像和计数。回收率(例如，回收效率)通过比较捕获或收集后检测的目标细胞的数量和已知添加到血液中的目标细胞的数量来确定。平均回收率与分选级的回收率没有显著差异，表示细胞捕获过滤器100％成功地保留了离开分选级的目标细胞，或者基本上100％成功地保留了离开分选级的目标细胞。
在一些情况下，在被在被注入到第一分选级中之前，在注入到第一分选级之前存在于血液样本中、但没有在捕获或收集到的细胞群中被检测到的目标细胞被捕获到死体积或被细胞粘附。这些方式的细胞损失会影响计算的回收率；但是，注入第一分选级后，没有观察到可量化的细胞损失。取决于将细胞注入第一分选级之前的死体积和/或细胞粘附的量，观察到回收率分别为69％至100％、75％至100％、81％至100％、94％至100％或100％。如果在注入具有第一分选级、分散级和第二分选级的***中，注入第一分选级之前没有细胞损失，回收率是99.5％至100％。
颗粒释放
在颗粒或细胞(例如，目标颗粒或目标细胞)被捕获后，在过滤器元件中成像，然后可以使用分析后的不同技术释放细胞(例如，用于收集和/或进一步处理，例如在单独的芯片、孔板、载玻片或小瓶上成像或测序或PCR分析)。为了提高细胞释放效率，存在多重流体设计和样本处理选项。
当细胞经历比导致它们与过滤器关联的流体压力更高的迫使它们离开过滤器的流体压力时，实现细胞自过滤器元件的高效释放。实现此目的的一种方法是使流体流过过滤器的方向逆转，以将细胞推离过滤器。通过相对于过滤器的上游流体压力增加过滤器下游流体压力，流体流动方向被逆转。过滤器下游的压力增加通过对与过滤器下游的过滤区域连接的一个或多个流动路径(如流体出口或额外流体的入口)施加压力来实现，，如图29A所示。在一些情况下，通过在过滤器的上游位置施加负压(例如，真空)，相对于过滤器下游的流体压力降低过滤器上游的流体压力，流体流动方向被逆转。可以预期，当流体压力在过滤器下游增加且流体压力在过滤器上游减少，实现细胞自过滤器的高效释放。在流体流动方向被逆转之前，被配置为防止或控制位于过滤器上游和上游分选级的下游的结构或装置的流体的回流(例如，阀，如图30A所示)被关闭，因此，流体无法返回到分选级，同时过滤器上游的阀被打开，以允许细胞通过流动路径到达小瓶进行收集。
跨过过滤器的一个或多个特定部分的压差的增加(例如，局部压力增加)有助于从过滤器释放细胞。通过阻塞过滤器的一部分(例如，阻塞包括一个或多个孔的过滤器的一部分)来减小允许流体流动的过滤器的横截面积，从而实现局部压力的增加。通过连接到过滤区域的流动路径将聚苯乙烯珠添加到过滤器下游的过滤区域中来堵塞过滤器的孔。
最初，不具有与孔物理关联(例如，目标细胞完全或部分地阻塞孔的上游侧)的目标细胞过滤器元件孔的允许流体流动的横截面比带有相关细胞的孔的横截面大，并且其将比具有一个或多个与上游侧的孔关联的目标细胞的过滤器孔具有更高的流体流速，因为一个或多个与孔关联的细胞部分或完全阻塞了通过孔的流体路径。通过在流体流动逆转期间将能够阻塞一个或多个过滤器孔的材料(例如，颗粒，如珠)引入到过滤器的下游侧，与没有将材料引入到过滤器的下游侧相比，推动与过滤器孔的上游侧关联的一个或多个目标细胞离开过滤器的压力增加更有针对性且更大程度，提高了目标细胞从过滤器被释放的机会。当聚苯乙烯珠被用于阻塞过滤器孔并增加跨过过滤器的局部压力，可以预料，可以使用任意的阻塞过滤器的孔的手段，如在过滤器下游引入其他形状的颗粒。
图29B例示了将多个珠引入到过滤器的下游部分以增加过滤器孔中的局部压力，以提高细胞(例如，目标细胞)从过滤器上游侧的释放。在通过装置的流体流动被逆转后，包含聚苯乙烯珠的溶液(例如，额外的流体)被引入过滤器中。部分或完全被过滤器上游侧的一个或多个细胞阻塞的通过过滤器孔的流动在最初低于没有部分或完全被过滤器上游侧的一个或多个细胞阻塞的通过过滤器孔的流动。聚苯乙烯珠优选与过滤器的下游侧上的孔相关联，所述孔不与细胞关联，或者由于较低的阻力和较高的流速而具有较小的被过滤器的上游侧上的细胞阻塞的横截面积。在反向流体流动期间，流体流动和压力在没有在过滤器下游侧上被珠部分或完全阻塞的孔(例如，与过滤器上游侧上的一个或多个细胞关联的孔)中增加，导致对细胞的压力增加并帮助细胞自过滤器的释放。
当反向流体流动通过过滤器时应减至最小，(例如，如果流体流动逆转，小细胞可能会从下游向上游流回过滤器)，通过过滤器下游的正压的施加、过滤器上游的负压的施加或将其组合自过滤器释放细胞，可在整个过滤器上均衡流体压力。
自过滤区域的过滤器释放细胞后，细胞将从过滤区域(例如，过滤器的过滤区域上游的一部分)的上游部分冲洗到一个连接过滤区域和收集小瓶的流动路径中。
实施例5
高颗粒浓度的多级分选和分散
该实施例描述了根据本公开的一个方面的多级分选设备的“高浓度”版本。包括多级分选设备及其使用的高浓度版本的方法和***可有助于避免在收集，离心和/或过滤细胞至适合于后续制备步骤和测定(例如，通过减少流体体积)的流体体积的步骤中常见的细胞损失。
液体收集体积减少
图30A示出了多级分选设备的流动路径(例如，多级eDAR***)中的阀的实施例，可以被用于任何可以封闭流动路径的方法或***中，包括那些涉及流体体积中稀有颗粒浓度的流动路径。在多级分选设备的高浓度版本中，阀位于多级分选设备的第二分选级的下游。在一些情况下，该阀被集成到包含多级分选设备的微流体芯片中(例如，如图30A所示)，并且在一些情况下，该阀在微流体芯片的外部(例如，如图30A所示)。阀被配置为保持关闭，除非目标细胞从第二分选级(阀的上游)进入到流体体积中的阀中。阀是一个电磁阀，被配置为短暂打开然后再次快速关闭，以允许包含目标细胞的流体体积通过流动路径。阀的打开由来自计算机的信号控制，该计算机与配置为检测细胞(例如目标细胞)的上游检测器通信。
在许多情况下，电磁阀被配置为在2-3毫秒或更短的时间内打开和关闭。根据包含目标颗粒的流体到达阀时的压力和速度，该阀的响应时间足够快，仅允许几纳升或更少的流体通过该阀所在的流动路径(例如，用于收集目标细胞)。在流动路径中的流速为5μL/分钟的情况下，每次打开阀时，阀可以迅速打开和关闭，使得0.17nL至0.25nL通过阀。在流动路径中的流速为1000μL/分钟的情况下，每次打开阀时，阀可以迅速打开和关闭，使得34nL至50nL通过阀。其结果是，每次打开阀使目标细胞通过时，阀可以允许0.17nL至50nL穿过阀所在的流动路径。高浓度版本的多级分选设备能够使用电磁阀将16个SKBr-3细胞从原来的2mL血液体积中分选为最终的30μL流体体积，该电磁阀位于第二分选级的流通路径下游的某点。通过阀所在的流动路径后，将浓缩的体积收集在与流动路径流体连通的一个收集小瓶中。对于***的许多应用和配置，当从第二分选级接收到流体体积时，将对减少流体体积。
图30B示意了一个高浓度***配置的示意图，其可用于在流体体积中浓缩分选的目标细胞，而包含目标细胞的流体体积接收自第二分选级。在该实施例中，图30B示出的流动路径配置与微流体芯片下游的多级分选设备连接。引自分选级的第一流动路径分支到第二流动路径和第三流动路径，第二流动路径包括可变形管并与颗粒收集小瓶连接，且第三流动路径包括可变形管并与废物小瓶连接。双向螺线管夹管阀相对于第二和第三流动路径定位，以使得双向夹管阀封闭(例如，捏紧关闭)第二流动路径，且在默认状态下使第三流动路径保持打开，但在被激活时关闭第三流动路径、并保持打开第二流动路径。
与位于第二分选级的检测器连通的计算机控制双向夹管阀的激活。可以预期，计算机可被可替代地或附加地连接到多级分选设备的第一分选级中的检测器、或多级分选设备的过滤区域中的检测器，以控制双向夹管阀。当通过检测器检测目标颗粒(即，该实施例中的目标细胞)时，计算机激活双向夹管阀，并且夹管阀的状态进行切换以允许流体通过第二流动路径流向收集小瓶并封闭通过第三流动路径的流体流动。
通过在包含连接微流体芯片和收集小瓶的挠性管的第二流动路径中包括列式双向电磁阀，可改善目标细胞的收集。在其默认状态中，列式双向阀被配置为通过压缩挠性管在第二流动路径的下游位置捏住(或关闭)第二流动路径的一部分，以允许在第二流动路径的上游位置流过第二流动路径的一部分。当被激活，列式双向阀被配置为在第二流动路径的上游位置捏住(或关闭)第二流动路径的一部分，以允许在下游位置流过第二流动路径的一部分。当通过多级分选设备的第二分选级和/或多级分选设备的微流体芯片中的检测器检测目标细胞时，目标细胞进入流动路径的上游和下游位置之间的第二流动路径的一部分，列式双向电磁阀被激活以允许1-30nL量级的包含目标细胞的小体积进入收集小瓶。允许通过列式双向阀的流体的体积取决于第二流动路径的上游和下游位置之间的距离和第二流动路径的直径。
在另一实施例中，阀位于第二分选级和多级分选设备的出口之间的流动路径，其位于微流控芯片的下游，导致目标颗粒收集在第二分选级和微流体芯片之间的流动路径中。完成分选后，将流动路径与收集小瓶相接(例如，通过将收集瓶连接到出口的端口或通过将出口物理地移动到小瓶上。然后打开阀，将目标颗粒冲出流动路径出口。
将已知数量的SKBr-3细胞加入到2、4或8mL血液中并使用两级分选设备如本文所述进行处理和分离。对收集在收集小瓶中的细胞进行计数并且将数量与每个实验中添加的细胞数量进行比较。使用此配置进行流体体积中颗粒的浓缩，细胞回收效率在50％至100％的范围内，中位数为77％。流体体积减少后，收集细胞的最终流体体积为20uL至150uL。
在这些实施例中，通过独立于多级分选设备的检测器来触发阀激活(例如，切换阀状态以及关闭流动路径和打开流动路径)，可以实现更好地控制颗粒运动和更好地控制多级分选设备收集的体积。双向夹管阀(或多级分选设备中的任何其他阀)的独立激活可以通过多种方式控制，包括使用计时器的信号、压力传感器或用户输入装置。
图30C示出了一个***的配置，其中用于浓缩和/或收集分选的目标细胞或多个分选的目标细胞的阀在包含多级分选设备的微流体芯片的外部。电磁阀可被用于此目的。用于浓缩一个或多个目标细胞的外部阀与流动路径流体连通，并被配置为短暂打开并快速重新关闭，以允许包含目标细胞的流体体积通过流动路径。外部阀的打开由来自计算机的信号控制，该计算机与配置为检测细胞(例如目标细胞)的上游检测器通信。当在第二分类级中检测到每个细胞时，外部阀被配置为短暂打开(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20毫秒，小于2毫秒，2毫秒至20毫秒，或20毫秒至50毫秒)。当阀打开2到20毫秒的时间时，会有1到30纳升(nL)的流体通过阀，将流体中的细胞向下移动到流体路径上。
如图30C所示，该阀(例如，外部收集阀)通过管连接到微流体分选芯片的出口。在第二分选级中分选细胞后，分选的细胞存在于第二分选级和阀之间的流体体积中(例如，位于第二分选级和阀之间的芯片和/或管(例如，收集管)的流动路径中的细胞)。管与阀断开并且与收集小瓶流体连通(例如，手动或通过计算机控制的机械位移)。通过在一个或两个分选级的上游施加流体压力，存在于第二分选级和阀之间的流体体积中的细胞从流动路径和/或管中被冲出并进入收集小瓶。
具有额外的流体路径的流体收集体积减少
用于减少收集有目标颗粒的流体的体积的被动方法和装置在某些本文所述的方法和设备的实施方式中使用。如图31所示，通过配置流体体积在离开第二分选级后通过的流动路径的几何形状以促进交叉流动过滤(即，切向过滤)，流体体积中的目标细胞(例如，目标颗粒)的浓缩在包含目标细胞的流体体积离开多级分选设备的第二分选级后被提高。在该实施例中，流动路径的一部分包括过滤器，其将包含目标细胞的流体体积和与流体出口(例如，初级流体出口)流体连通的滤液区3130分开。在这样的情况下，流动路径可通过具有狭缝(或穴、台阶、间隙、和/或孔)3120的过滤器3110与多个区域和流体出口分开，该狭缝具有至少一个尺寸，该尺寸防止目标细胞通过过滤器同时允许流体和/或具有更小尺寸或更大程度的可变形性的细胞通过过滤器的狭缝(或穴、台阶、间隙、和/或孔)3120。
如图31所示，滤液区3130可能具有比包括过滤器的流动路径的体积更大的体积。当流体体积进入具有这些特征的流动路径部分时，流体体积的一部分通过过滤器进入滤液区3130。目标细胞在它们通过包括过滤器的流动路径的部分时被防止通过过滤器的狭缝(例如，由于过滤器的狭缝具有一个或多个尺寸，该尺寸防止细胞通过任何过滤器的狭缝)并保留在过滤器的与滤液区3130的相反侧。如图31所示，流动路径可与多个滤液区3130流体连通，每个滤液区可与一个或多个流体出口流体连通。
当目标细胞所在的流动路径部分与滤液区3130的体积差足以导致流体体积的一部分穿过过滤器扩散到滤液区域3130的较大体积时，额外的浓缩流体体积中细胞的被动手段在本文所述的方法和设备中是有用的。
例如，在一个示例中，流动路径不是直的，且包括在流动路径的不直的部分处分布于流动路径的外壁上的过滤器。当包含目标细胞的流体体积流向流动路径中不直的部分时，流体体积的动量对过滤器产生作用力，且流体体积的一部分穿过过滤器孔到达位于过滤器的与细胞相反侧的流动路径的一部分(例如，滤液区)。过滤器孔的大小可阻止细胞通过过滤器，并且阻止流体体积的细胞通过过滤器。在该示例中，通过允许流体体积的惯性使一部分流体体积通过过滤器而不允许细胞同样通过，来减少流体体积。
可以预期，由于通过具有此结构和几何形状的一部分流动路径而使细胞与过滤器接触会对细胞施加力，这可能会影响细胞的表型或活力。如果流动路径中不直的部分在流动路径中与原始方向成90度或更大的角度或弯曲，通常会发生这种情况。当特别关注横向位移或惯性力对细胞表型或活力的影响时，应使流动路径中的角度或弯曲度与其原始方向的夹角小于90度。无论如何，分选后，用于减少流体体积的流动路径中的弯曲角度取决于流体体积(以及流体体积中包含的细胞)的速度以及细胞的大小、可变形性和形态。
在这些被动流体体积减少的示例中使用的过滤器包括形状和大小相似的孔；然而，可以预料，各种形状或大小的孔的连续过滤器或包括不同的形状或尺寸的孔的多个过滤器对于分离不同的尺寸或性质的细胞而言是有用的。在一个示例中，在包含螺旋形弯曲部分的一部分流通路径中，过滤器的孔在过滤器上游部分的截面积要比在过滤器的下游部分处的过滤器孔小。当包含细胞异质混合物的流体体积通过流动路径时，较小的细胞将通过过滤器的上游部分，而较大的细胞将通过过滤器的下游部分，仅留下无法穿过过滤器原来一侧的任何一个过滤器孔的最大的细胞。在这种情况下，流动路径沿着流动路径的长度在不同点与多个出口通道连接，使得沿着流动路径的长度在不同点通过过滤器的不同尺寸的细胞可通过多个出口通道的不同通道被分开收集。

Claims (20)

1.一种收集流体样本中颗粒的方法，所述方法包括：
检测样本的第一等分试样中颗粒的第一存在，其中等分试样包括包含颗粒的多个颗粒，且其中多个颗粒的颗粒占据三维空间并且其中的颗粒随机分布在三维空间内；
在检测到第一等分试样中颗粒的存在后，将第一等分试样的流动引向第一体积以形成第一分离样本；
分散第一分离样本，其中分散第一分离样本受通过流动路径的第一分离样本的抛物线流动影响或受人字混合器中的第一收集样本的人字形混合影响，以形成分散的样本，其包括流动路径或人字形混合器下游的颗粒，其中分散第一分离样本导致包含颗粒的第一分离样本整体变长；以及
对分散的样本进行分离程序。
2.如权利要求1所述的方法，其中，分离程序是主动分离程序或被动分离程序。
3.如权利要求1所述的方法，其中，检测所述颗粒的第一存在包括：
用第一电磁辐射的源问询第一等分试样中的颗粒；并且
检测第一电磁辐射与第一等分试样中的颗粒的第一相互作用。
4.如权利要求1所述的方法，其中，在流体样本的连续流动期间进行第一等分试样中颗粒的第一存在的检测。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述颗粒是稀有颗粒。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述稀有颗粒是细胞。
7.如权利要求1所述的方法，其中，分散第一分离样本包括第一收集样本的流动拉伸。
8.如权利要求1所述的方法，其中，分散第一分离样本受通过流动路径的第一收集样本的抛物线流动或第一收集样本的人字混合影响。
9.如权利要求1所述的方法，其中，分散第一分离样本包括第一分离样本的堰混合。
10.如权利要求1所述的方法，其中，分散第一分离样本受通过多个流动路径的第一分离样本的流动影响。
11.如权利要求1所述的方法，其中，所述多个颗粒包含细胞，分散第一分离样本包括改变细胞的速度。
12.如权利要求11所述的方法，其中，分散第一分离样本受第一分离样本流过屏障的影响，所述屏障包括过滤器结构或通道的收缩。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述屏障基于细胞的物理属性改变细胞的速度，所述细胞的物理属性选自下组：细胞体积、细胞形状、和细胞可变形性。
14.如权利要求1所述的方法，其中，分离程序包括：
用第二电磁辐射的源问询颗粒；以及
检测第二电磁辐射与颗粒的第二相互作用。
15.如权利要求1所述的方法，其中，分离程序包括选自下组的程序：荧光活化等分试样分选，综合决策等分试样定级eDAR，流式细胞术，荧光活化细胞分选FACS，磁性活化细胞分选MACS。
16.如权利要求1所述的方法，其中，在流体样本的连续流动期间进行颗粒的第二存在的检测。
17.如权利要求1所述的方法，其中，还包括将颗粒收集在选自下组的结构中：小瓶、孔板、和过滤体积。
18.如权利要求1所述的方法，其中分散第一分离样本包括使第一分离样本通过一个或多个屏障、一个或多个堰拉伸器、一个或多个微狭缝或一个或多个微滤器。
19.如权利要求1所述的方法，还包括通过使分散的样本通过被动流体结构来纯化颗粒。
20.一种收集流体样本中颗粒的设备，所述设备包括：
输入通道；
配置为检测输入通道中的颗粒的检测器；
与输入通道流体连通的定向流动通道；
配置为在定向流动通道中调节流体流动的阀；
与输入通道流体连通的输出通道；
与输出通道流体连通的分散级；和
包括处理器和在其上存储有可执行指令的非暂时性存储器的计算机，当用处理器执行时，将导致设备：
操作检测器以检测样本的第一等分试样中的颗粒的第一存在；
在检测第一等分试样中颗粒的存在后，操作阀以将第一等分试样的流动引向第一体积以形成第一分离样本；
将第一分离样本引向分散级以形成分散的样本；并且
在分散的样本上进行分离程序。
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