CN111286534A - 一组corin基因dna甲基化标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组CORIN基因DNA甲基化标志物及其在制备预测脑卒中发病风险的试剂盒中的应用。所述CORIN基因DNA甲基化标志物包括与CORIN基因启动子区的2个DNA甲基化位点：Chr4:47841408和Chr4:47841314。所述试剂盒包括同时扩增2个DNA甲基化位点的上游引物和下游引物。本发明的CORIN基因DNA甲基化标志物可以为预防和控制脑卒中的药物靶点提供重要的流行病学证据。

Description

一组CORIN基因DNA甲基化标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一组CORIN基因DNA甲基化标志物及其在制备预测脑卒中发病风险的试剂盒中的应用。
背景技术
“脑卒中”(stroke)又称“中风”、“脑血管意外”(cerebral vascular accident，CVA)，1984-2003年世界卫生组织曾依据“多国心血管病趋势和决定因素监测方案”(简称WHO MONICA方案)在全球28个国家共40个研究中心组织调查了脑卒中、冠心病等心脑血管疾病的流行状况。WHO MONICA方案对脑卒中的定义为：急骤发展的局灶或全脑功能障碍，持续24小时以上，包括蛛网膜下腔出血、脑出血、脑血栓形成、脑栓塞，不包括一过性脑供血不足，脑卒中发病以发病事件计算，28天以内发病1次或多次计1次发病事件，28天后复发计1次新的发病事件。
脑卒中作为一个全球性的健康问题，现成为威胁我国居民生命健康的首要疾病，每年给我国居民带来了巨大的疾病负担和经济损失。2015年中国卒中协会首次发布的《中国卒中流行报告》结果显示，我国每年脑血管病新发患者约270万，每年死于脑血管病的患者约130万，每12秒就有一人发生脑卒中，每21秒就有人死于脑卒中。因此，如何有效地预防和控制脑卒中是目前我国面临的重大公共卫生挑战，寻找并发现更多脑卒中的潜在危险因素和干预靶点迫在眉睫。
利钠肽轴是机体应对外界环境刺激的重要的心脏内分泌调节***，在维持机体水钠平衡、血压稳定和能量代谢平衡方面发挥着重要作用。利钠肽轴主要由心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、脑钠尿肽(brain natriuretic peptide,BNP)、C型钠尿肽(C-type natriuretic peptide,CNP)以及他们的受体构成。当血容量增加时，心肌细胞就会分泌并释放大量的无生物活性的心房钠尿肽前体(pro-atrial natriureticpeptide,pro-ANP)，pro-ANP进一步活化为有活性的ANP并与其受体结合激活利钠肽轴，进而促进水钠代谢、降低血容量、扩张血管、促进能量代谢，从而维持心血管稳态。已有大量流行病学证据表明，利钠肽轴尤其是ANP和BNP在脑卒中及其危险因素(肥胖、高血糖、高血压、动脉粥样硬化、血栓形成等)的发生发展过程中扮演重要角色。
将无活性的pro-ANP和pro-BNP转化为有活性的ANP和BNP的蛋白酶就是调控利钠肽轴功能的关键所在。经过几十年的努力，科学家们终于在1999年发现了pro-ANP的转化酶—corin。截至目前，已有一些研究报道了corin对心血管代谢的作用。基础研究和人群研究结果均提示，corin可能是预防和控制脑卒中的潜在干预靶点。作为连接基因与环境的媒介，DNA甲基化调控着基因的表达和功能，可以作为潜在的、可干预的药物靶点，已有大量证据表明基因启动子区DNA甲基化可以影响该基因的转录、抑制该基因的表达。因此，作为corin的编码基因，CORIN基因启动子区DNA甲基化可能抑制corin表达，引起corin缺乏，从而参与脑卒中的发病过程。
发明内容
本发明的目的是提供一组预测脑卒中发病风险的CORIN基因DNA甲基化标志物及其在预测脑卒中发病风险中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一组CORIN基因DNA甲基化标志物在制备预测脑卒中发病风险的试剂盒中的应用，所述CORIN基因DNA甲基化标志物包括与CORIN基因启动子区的2个DNA甲基化位点：Chr4:47841408和Chr4:47841314。
进一步地，所述试剂盒包括同时扩增2个DNA甲基化位点的上游引物和下游引物。
进一步地，所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示。
进一步地，所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示。
进一步地，所述的2个DNA甲基化位点在脑卒中病例中甲基化水平增加80％以上。
有益效果：本发明提供的CORIN基因DNA甲基化标志物可用于预测脑卒中发病风险，为临床医生进一步深入检查提供依据，达到快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度的效果。同时，为下一步及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。本发明不仅有助于阐释corin缺乏作用于脑卒中的分子机制，也将为CORIN基因甲基化作为预防和控制脑卒中的药物靶点提供重要的流行病学证据。
附图说明
图1为实施例1中CORIN基因启动子区域两个CpG位点发生甲基化的示意图。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
根据之前的一项病例对照研究(597例脑卒中病例和2498例社区健康对照)发现，脑卒中患者血清中corin蛋白水平显著低于健康对照(Stroke.2015；46:1758-1763)，与最高四分位水平组相比，最低四分位水平组罹患脑卒中的风险增加了2-5倍。该研究结果提示，corin蛋白缺乏可能是脑卒中的病因，然而，corin缺乏与脑卒中相关联的分子机制尚不清楚，但是，对corin参与脑卒中发病过程这一分子机制的研究将有助于发现针对corin缺乏的药物靶点，从而促进脑卒中的预防和控制。作为连接基因与环境的媒介，DNA甲基化调控着基因的表达和功能，可以作为潜在的、可干预的药物靶点。因此，本发明对CORIN基因DNA甲基化在脑卒中发病中的作用开展了进一步研究。
运用频数匹配，选择了853例脑卒中患者和918例健康对照作为研究对象，提取了每一位研究对象的全血DNA标本，运用目标区域测序技术检测了CORIN基因启动子区域各CpG位点甲基化水平，即利用ENSEMBL数据库查询人类CORIN基因(基因编号：ENSG00000145244)的启动子区域，该区域为Chr4:47838400-47841966(GRCh37/hg19，距TSS-2000～+1566bp)，在NCBI上截取该区域的核酸序列，将核酸序列导入EMBOSS Cpgplot软件预测CpG岛，然后运用Epidesigner程序对CpG岛及CpG密集区域序列进行引物设计，挑选合适的引物进行DNA甲基化检测。经过挑选，本发明对CORIN基因启动子区的2个片段进行甲基化检测，共获得11个CpG位点的甲基化水平。
表1列出了拟检测片段和引物序列：
表1 CORIN基因启动子区域DNA甲基化检测片段
Figure BDA0002157680370000031
具体检测方法为：
首先用EZ-96DNA甲基化试剂盒(Zymo Research,Orange,CA)对DNA标本进行重亚硫酸盐处理，将样本DNA中没有甲基化修饰的胞嘧啶C全部转化为胸腺嘧啶U。接着用设计好的引物，以重亚硫酸盐处理后的样品基因组为模板，进行多重PCR扩增。然后利用带有Index序列的引物，通过PCR扩增向文库末端引入和illumina平台兼容的特异性标签序列。最终，将所有样品Index PCR扩增产物等量混合，在Illumina Hiseq/Miseq平台，以2×150bp/2×250bp的双端测序模式进行高通量测序，获得FastQ数据。各CpG位点甲基化水平量化为该位点甲基化的reads数目(即检测到碱基C的reads数目)/该位点总的reads数目×100％。
研究结果如下：
1、研究对象临床特征
如表2所示，与健康对照相比，脑卒中患者年龄较大且具有更多的脑卒中传统危险因素，例如高血压、糖尿病、肥胖和高血脂。
表2研究对象临床特征
Figure BDA0002157680370000041
2、与脑卒中关系最强的甲基化位点
本发明共检测了11个CpG位点的甲基化水平，调整了年龄、性别、受教育程度、吸烟、饮酒、肥胖、血压、血糖、血脂等脑卒中传统危险因素之后，其中有2个CpG位点仍与脑卒中显著相关联，均位于CORIN基因的启动子区域。如表3所示，这两个位点的甲基化水平每升高5％，罹患脑卒中的风险分别增加12％和24％。较高的甲基化水平意味着更低的corin表达，即更低的血清corin蛋白水平，可见，该研究结果与之前发现的血清corin水平缺乏与脑卒中发病风险增加有关的结果一致。据此，这两个甲基化位点可以用于预测脑卒中的发病风险。
表3与脑卒中强相关的甲基化位点
Figure BDA0002157680370000051
*甲基化水平每升高5％，患脑卒中风险增加多少倍。
3、构建甲基化检测试剂盒
基于以上研究，可以得知：如图1所示，位于启动子区域的连个CpG位点发生甲基化之后，可能抑制CORIN基因表达和corin蛋白分泌，进而参与脑卒中的发病，可以作为脑卒中发病风险的预测标志物和潜在药物靶点。因此，本发明构建了基于这两个CpG位点的甲基化检测试剂盒。
具体检测方法为：
①全血DNA提取并质检
a.琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性：电泳条带清晰可见，无明显降解，且无RNA污染。
b.Nanodrop 2000检测基因组DNA质量：浓度≥20ng/μL，总量≥1μg，OD260/280＝1.7～2.0，OD260/230≥1.8。
②亚硫酸盐处理
用EZ-96DNA甲基化试剂盒(Zymo Research,Orange,CA)对质检合格的DNA标本进行亚硫酸盐处理，将样本DNA中没有甲基化的胞嘧啶C全部转化为尿嘧啶U。
③多重PCR扩增
接着用设计好的引物(F：GTAGATTTAGGGAGTTGAAGTGAAGTAA；R：ACCTTAACAATTAAATCCAACCCTTAT)对亚硫酸盐处理过的标本进行DNA扩增，得到带有T7 RNA聚合酶启动子序列的扩增产物。
④CpG片段切割
然后运用T7 RNA聚合酶将扩增的DNA产物转录为RNA片段，用RNaseA将所得的RNA片段切割成带有CpG的小片段。
⑤飞行质谱分析
最终，在每一个小的RNA片段内，未甲基化的CpG最终产物为CpA，甲基化的CpG最终产物为CpG，使用Agena MassArray飞行质谱分析***检测这两个最终产物的分子量。
⑥甲基化水平计算和脑卒中风险预测
各CpG位点甲基化水平量化为产物质量CpG/(CpG+CpA)×100％。任一CpG位点甲基化水平>80％提示脑卒中发病风险较高，应密切关注并采取预防性治疗措施。

Claims (5)

1.一组CORIN基因DNA甲基化标志物在制备预测脑卒中发病风险的试剂盒中的应用，其特征在于：所述CORIN基因DNA甲基化标志物包括与CORIN基因启动子区的2个DNA甲基化位点：Chr4:47841408和Chr4:47841314。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂盒包括同时扩增2个DNA甲基化位点的上游引物和下游引物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的2个DNA甲基化位点在脑卒中病例中甲基化水平显著增加80％以上。
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