CN111281938B

CN111281938B - 可活化能量、抗皱、抗发炎及美白的兰花芽胚组织萃取物

Info

Publication number: CN111281938B
Application number: CN201910093175.4A
Authority: CN
Inventors: 梁家华
Original assignee: Chia Nan University of Pharmacy and Science
Current assignee: Chia Nan University of Pharmacy and Science
Priority date: 2018-12-07
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2022-09-02
Anticipated expiration: 2039-01-30
Also published as: TWI701038B; CN111281938A; TW202021609A

Abstract

本发明公开了一种兰花芽胚组织萃取物的萃取方法，该方法的步骤包括：超音波萃取；以及过滤及去除溶剂。借由整体在非高温下进行，可避免低沸点与有效物质挥发及保持芽胚组织的生长活性，所得的萃取物具活化能量、抗发炎、伤口愈合、美白、抗皱、保护修护、抗氧化及抗老化等功效。

Description

可活化能量、抗皱、抗发炎及美白的兰花芽胚组织萃取物

技术领域

本发明涉及植物萃取方法，特别是涉及应用于兰花芽胚组织萃取物的萃取方法，所制成的萃取物可作为医药品、化妆品、保养品、香氛或人体清洁用品等产品的原料。

背景技术

中国台湾素有「兰花王国」美誉，拥有成熟的种植与组织培养技术，其中包括品种繁多丰富、纯熟的组织培养技巧、病毒检验能力及量产工程技术等。此外，中国台湾农业目前拥有推动兰花产业的优势条件，包括得天独厚的天然地理条件、傲视全球的多元化品种、技术顶尖的育种专家群、超水平的农业科技基础、遍布中国台湾的农业试验改良及学研等各类农业技术辅助机构、闻名世界的信息产业与现代化的物流通路等。

在中国台湾，全年蝴蝶兰产量约1亿3,294万株，外销总量约4千万株，占全球供应量的20％，销售地区遍及欧洲、日本与美国，因此需要应用精进的生物科技技术，进行大量繁殖以因应供货需求。而兰花的培育繁殖方法，最常见的有「播种繁殖法」、「花梗催芽繁殖法」、「断心催芽繁殖法」、「切茎繁殖法」及「组织培养法」等五种，可按照培殖品种的特性及需求选用适当繁殖方法进行培育。其中「组织培养法」大多撷取具有分生能力的「顶芽」部位来进行培养；而「茎顶生长点」部位的生产多采用芽体增殖(芽长芽)或诱导拟原球体(PLBs)分生苗方式，其中芽体增殖即减低或去除顶芽优势，使侧芽容易长出来，以此方式增殖芽体。

兰花除了可供观赏用外，近年来也广泛用于化妆品及保养品等产品中作为原料，使得兰花的经济价值提升，兰花的需求量更大；而兰花需经过萃取作业成为萃取物后，再作为化妆品及保养品的添加物。而因萃取兰花的部位不同，则要配合适当的萃取技术，萃取流程如有变化，所制成的萃取物成份也会不同，萃取物可达到的美白功能、抗氧化及抗老化效果也会受到影响。

由于人类皮肤经常受到紫外线、空气与温度等环境因素的影响，而有加速皮肤老化现象及罹患皮肤癌的风险，以皮肤老化来说，外因性因素占据60％，而其中紫外线又占了老化原因高达60％。在影响皮肤老化的研究中发现，紫外线不只会造成黑色素细胞的活跃性，导致皮肤斑点的出现，也会使真皮组织产生退化现象，并且加速皮肤的氧化，产生游离自由基，这些自由基会造成纤维母细胞破坏、胶原蛋白变性和含量减少以及弹性纤维组织退化而产生老化皱纹，更会加速细胞内DNA伤害，使得皮肤细胞更新能力变差，新细胞取代旧细胞的速度变慢。

因此市售的化妆品及保养品大多针对前述皮肤问题，开发出不同的化妆品原料，再配合添加其他具特殊效果的添加物或萃取物，其中添加植物萃取物的活性成份如花青素、类黄酮、多酚类等，对于皮肤的美白、抗氧化、抗老化或防皱等功效相当显着，因此市面上许多化妆或保养商品常见有各类植物活性成份添加其中。然而，因不同的植物、不同部位或所制成萃取物成份要求与功效不同，则需应用的萃取技术皆不同，以兰花而言，虽同样作为化妆品及保养品的添加原料，但其萃取技术应用有许多方式，且萃取作业的步骤、流程与环境参数也有差异。

现有的应用于化妆品的兰花的萃取技术，如中国发明专利申请号第CN201510295194.7号所揭露的「兰花萃取物及其制备方法和应用」，其特征在于，所述兰花为蝴蝶兰属，所述兰花萃取物由下列步骤所制备而得： (1)萃取：将所述兰花与溶剂以重量比例为0.5：1至10：1，进行混合粉碎或者破壁得到兰花浆，所述溶剂为水、醇类或醇类水溶液，其中所述醇类为乙醇、丙醇、或丁醇；(2)固液分离：将步骤(1)萃取的兰花浆进行固液分离，留下液态为兰花滤液；(3)活性划分：将步骤(2)所分离的兰花滤液以分子筛薄膜处理纯化，得到兰花萃取筛分液；(4)浓缩：将步骤(3)纯化的兰花萃取筛分液以分子筛薄膜处理浓缩，或者真空或蒸煮方式进行部分浓缩，得到活性沉淀物与具活性的液态活性萃取液。

另一种应用于化妆品的兰花的萃取技术，如中国发明专利公开号第CN105878122A号所揭露的「一种具有怯斑美白效果的天然提取物化妆品」，其包括功效成分泽兰提取物和石吊兰提取物，其中，所述泽兰提取物和石吊兰提取物的重量比为2至4：1。泽兰提取物和石吊兰提取物的制备方法为：将干燥的泽兰或石吊兰用乙醇热回流提取，合并滤液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液；再用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取；正丁醇萃取物用水溶解，过滤，滤液用大孔树脂富集活性成分，喷雾干燥即得。本发明提供的祛斑美白化妆品以植物提取物为功效成分，且通过控制泽兰提取物和石吊兰提取物的含量比值，可最大化去斑美白。

更有一种应用于化妆品的兰花的萃取技术，如中国台湾发明专利申请号第102140137号所揭露的「白花蝴蝶兰花瓣的萃取物及其制备方法与用途」，其借由下列步骤的方法而制得：以超临界CO₂来萃取白花蝴蝶兰花瓣，借此而得到白花蝴蝶兰花瓣的脂溶性萃取物以及残余物；以及以水来萃取残余物，以得到白花蝴蝶兰花瓣的水溶性萃取物，可用于促进皮肤美白、提升皮肤的保湿能力以及预防或推迟皮肤老化。

上述的萃取技术均为取得兰花的萃取物，其中第一案是以整株兰花施以萃取、固液分离、活性划分及浓缩等流程；第二案则以整株泽兰或石吊兰施以干燥、热回流提取、浓缩、稀释、溶解及过滤等步骤；第三案即利用白花蝴蝶兰的花瓣进行超临界CO₂萃取后，再以水来萃取残余物的作业流程。前述的现有技术利用兰花进行萃取的部位皆不同，第一、二案以整株进行，第三案则仅使用花瓣部位，且又因萃取方法、流程、使用设备及环境相关参数均不同，所取得的萃取物成份与含量也会不一样。

发明内容

无论以整株兰花或花瓣部位进行萃取，所制成的萃取物活性成份含量及效果仍会受到限制；此外，前述第二、三案的萃取过程中有通过高温进行的步骤，恐造成萃取物的活性减低或有效物质挥发的情形，以致化妆及保养产品美白功能、抗氧化及抗老化的效果不佳；再者，现有技术中以整株兰花进行萃取作业，使得兰花所有部位无论活性存量好坏，在同时萃取的情形下，制成的萃取物的活性平均下来质量将会受到限制，无法提升；又，现有技术中以醇类或醇类水溶液为溶剂的萃取方式，除了使用设备成本高外，过程中有挥发性气体产生而有安全上的疑虑。

另一方面，由于兰花的茎节部位具有优异的生长机能，通常此部位会成为生长点，此生长点的细胞拥有快速地***和分化以产生新芽的特性，并可使芽轴不断伸长，犹如动物的干细胞再生功能，如能撷取兰花茎节生长点细胞进行萃取，所得的萃取物活性成份含量与活性效益高，然而前述现有的兰花相关的萃取技术尚未见有针对兰花开花株的茎节部位进行萃取或提炼等技术；故本案发明提供一种兰花生长点切割及萃取技术，以解决前述问题，并获得活性成份含量高且效果佳的兰花萃取物。

于是，本发明的一目的即在提供一种兰花开花株茎节生长点的萃取方法及其萃取物，主要提供兰花茎节生长点的培育、切割及萃取的完整流程，且仅撷取并收集兰花最具有活性成份的茎节生长点的再生植物细胞来进行萃取作业，所制成的萃取物添加于化妆保养品产品中，具有活化能量、抗发炎、伤口愈合、美白、抗皱、保护修护、抗氧化及抗老化等功效。

本发明的另一目的即在提供一种兰花开花株茎节生长点的萃取方法及其萃取物，以开花株其茎节生长点部位进行诱导培育，使长出再生新侧芽后，且切割取得新侧芽的新生植物组织，此茎节生长点诱导培育方式可获得大量的新生植物组织，而可符合大量生产的需求。

本发明的再一目的即在提供一种兰花开花株茎节生长点的萃取方法及其萃取物，萃取方法在非高温下操作，以减少温度所造成的热损失，也可避免低沸点与有效物质挥发及保持生长点组织的生长活性。

本发明的更一目的即在提供一种兰花开花株茎节生长点的萃取方法及其萃取物，经超音波萃取所制成的半成品萃取液，再进行过滤及去除溶剂作业，可获得活性及稳定性高的萃取物。

有鉴于此，本发明一方面揭露一种兰花芽胚组织萃取物的用途，该萃取物是用于制备具活化能量、抗发炎、伤口愈合、美白、抗皱、保护修护、抗氧化及抗老化功效的组合物。

进一步地，本发明所揭露兰花芽胚组织萃取物的萃取方法，其步骤为： (a)超音波萃取：将芽胚组织秤取100克，放入超音波萃取设备，在低温下，以芽胚组织重量5倍量的纯水为溶剂将芽胚组织覆盖浸泡，以制成半成品萃取液；及(b)过滤及去除溶剂作业：将半成品萃取液经由抽真空的过滤作业后，再利用减压浓缩机将半成品萃取液进行去除溶剂作业，以制成萃取物。

进一步地，该兰花为大白兰花Phalaenopsis Sogo Yukidian V3品种。

进一步地，该芽胚组织为生长点新侧芽的新生植物组织，而该生长点新侧芽的新生植物组织的取得方法包含：(i)诱导再生新侧芽：将该兰花的开花株的茎节部位的梗芽切出多段梗芽，并进行培育作业使该多段梗芽长出新侧芽；(ii)切除梗芽并撷取新侧芽：将该梗芽切除并撷取该新侧芽后，取出生长点组织；(iii)去除壁膜：将各小片段的该生长点组织去除壁膜，成为该新生植物组织；以及(iv)收集新生植物组织：收集预设数量的该生长点新侧芽的新生植物组织。

本发明另一方面揭露一种兰花芽胚组织萃取物的用途，该萃取物是用于制备具促进皮肤细胞活化能量与粒线体活化或再生的组合物。

进一步地，本发明所揭露兰花芽胚组织萃取物的萃取方法，其步骤为：(a)超音波萃取：将该芽胚组织秤取100克，放入超音波萃取设备，在低温下，以该芽胚组织重量5倍量的纯水为溶剂将该芽胚组织覆盖浸泡，以制成半成品萃取液；以及(b)过滤及去除溶剂作业：将该半成品萃取液经由抽真空的过滤作业后，再利用减压浓缩机将该半成品萃取液进行去除溶剂作业，以制成该萃取物。

进一步地，该兰花为大白兰花Phalaenopsis Sogo Yukidian V3品种。

进一步地，该芽胚组织为生长点新侧芽的新生植物组织，而该生长点新侧芽的新生植物组织的取得方法包含：

(i)诱导再生新侧芽：将该兰花的开花株的茎节部位的梗芽切出多段梗芽，并进行培育作业使该多段梗芽长出新侧芽；

(ii)切除梗芽并撷取新侧芽：将该梗芽切除并撷取该新侧芽后，取出生长点组织；

(iii)去除壁膜：将各小片段的该生长点组织去除壁膜，成为该新生植物组织；以及

(iv)收集新生植物组织：收集预设数量的该生长点新侧芽的新生植物组织。

借由上述步骤，整个流程在非高温下进行，可避免低沸点与有效物质挥发及保持芽胚组织的生长活性，且所制成的萃取物添加于化妆保养品产品中，具有活化能量、抗发炎、伤口愈合、美白、抗皱、保护修护、抗氧化及抗老化等功效。

此外，本发明所揭露上述制成萃取物的用途为用于制备具有活化能量、抗发炎、伤口愈合、美白、抗皱、保护修护、抗氧化及抗老化功效的组合物，而此组合物可为医药品、化妆品、保养品、香氛或人体清洁用品。

另外，本发明所揭露上述制成萃取物的用途为用于制备具促进皮肤细胞活化能量与粒线体活化或再生的组合物，而此组合物可为医药品、化妆品、保养品、香氛或人体清洁用品。

再者，本发明所揭露上述制成萃取物的用途为用于制备具促进皮肤表皮及真皮层细胞伤口愈合的组合物，而此组合物可为医药品、化妆品、保养品、香氛或人体清洁用品。

而且，本发明所揭露上述制成萃取物的用途为用于制备具清除一氧化氮自由基抗发炎效能的组合物，而此组合物可为医药品、化妆品、保养品、香氛或人体清洁用品。

附图说明

图1为本发明所揭露的兰花开花株茎节生长点的萃取方法的流程示意图；

图2为本发明所揭露的萃取物对人类皮肤角质株化细胞型态影响的显微镜照片图；

图3为本发明所揭露的萃取物对人类皮肤角质株化细胞的细胞周期影响的流式细胞分析结果图；

图4为本发明所揭露的萃取物对细胞间隙影响的细胞显微镜照片图；

图5为本发明所揭露的萃取物对质体DNA型态影响的DNA胶体电泳结果图；

图6为本发明所揭露的萃取物对DNA marker型态影响的DNA胶体电泳结果图；

图7为本发明所揭露的萃取物对细胞存活影响的细胞存活分析结果图；

图8为本发明所揭露的萃取物对光产物CPD生成影响的荧光侦测结果图。

具体实施方式

以下将以图式揭露本发明的多个实施方式，为明确说明起见，许多实务上的细节将在以下叙述中一并说明。然而，应了解到，这些实务上的细节不应用以限制本发明。也就是说，在本发明部分实施方式中，这些实务上的细节是非必要的。此外，为简化图式起见，一些习知惯用的结构与组件在图式中将以简单示意的方式绘示。

除非另有定义，本文所使用的所有词汇(包括技术和科学术语)具有其通常的意思，其意思是能够被本领域技术人员所理解。更进一步的说，上述的词汇在普遍常用的字典中定义，在本说明书的内容中应被解读为与本发明相关领域一致的意思。除非有特别明确定义，这些词汇将不被解释为理想化的或过于正式的意思。

请参照图1，本发明所提供的一种兰花开花株茎节生长点的萃取方法，以最佳实施的大白兰花Phalaenopsis Sogo Yukidian V3品种作说明，其步骤依序为：(a)诱导再生新侧芽；(b)切除梗芽并撷取新侧芽；(c) 去除壁膜；(d)收集新生植物组织；(e)超音波萃取；(f)过滤及去除溶剂作业；及(g)制成萃取物；其中：

步骤(a)：将兰花其开花株的茎节部位的梗芽，在梗芽侧边进行切割，以茎节为单位切出若干段梗芽，各梗芽在预定时间内所切割的部位将自行愈合，消毒后种入进行培育作业，使梗芽切割的部位长出新侧芽；培育作业以苹果、马铃薯、香蕉、胡萝卜为培养基；培养温度为15至20℃；培养时间约为4至4.5周。

步骤(b)：将梗芽切除并撷取新侧芽后，在两片新侧芽交接的位置往下0.1cm的部位的生长点组织，切成小片段。

步骤(c)：将各小片段的生长点组织去除壁膜，成为新生植物组织，其再生的途径为经由梗芽等器官形成新生植物胚胎；新生植物组织呈形状一致的圆形。

步骤(d)：收集预设数量生长点新侧芽的新生植物组织。

步骤(e)：将收集的新生植物组织秤取100克，放入超音波萃取设备，在低温下，以新生植物组织重量5倍量的逆渗透纯水或灭菌的去离子水为溶剂将新生植物组织覆盖浸泡，置入超音波设备内，水温设定在50℃至 60℃，功率设定为300瓦，时间设定为40分钟，以超声波震荡对生长点的新生植物组织进行萃取作业，以制成半成品萃取液。

步骤(f)：先将半成品萃取液经由抽真空的过滤作业；再利用减压浓缩机以45℃加热，以旋转速度80转/分，将半成品萃取液减压浓缩，进行去除溶剂作业；且重复此去除溶剂作业1次至4次，以完整萃取。

步骤(g)：制成的萃取物具有总多酚及总黄酮等成份；所制成的萃取物，约1.51克，萃取率约1.51％；所制成的萃取物，可在冷冻干燥后在温度-20℃下保存冷藏；且所制成的萃取物可应用于医药品、化妆品、保养品、香精、香水或人体清洁用品等产品的原料。

借由上述步骤，可提供针对兰花茎节生长点的培育、切割及萃取的完整流程，使整个流程在非高温下进行，可避免低沸点与有效物质挥发及保持生长点组织的生长活性，且所制成的萃取物具有活化能量、抗发炎、伤口愈合、美白、抗皱、保护修护、抗氧化及抗老化等功效，同时此茎节生长点诱导培育方式可获得大量的新生植物组织，而可因应大量生产的需求，并且具有高经济价值与高实用性。

为进一步了解本发明技术特征、运用技术手段及所预期达成的功效，兹将本发明使用方式加以说明叙述如下：

实施例1

本发明的兰花茎节生长点萃取技术，主要针对兰花的茎节部位具有优异生长机能的生长点部位，利用此生长点的细胞拥有快速***和分化以产生新芽并可使芽轴不断伸长的特性，拥有高生命力及活性的特质，且兰花茎节生长点其再生的方式为经由芽胚等器官形成新生植物胚胎，犹如动物干细胞的再生功能；借此建立从生长点的培育、切割到萃取的一整套流程。再者，本发明除可应用于大白兰花Phalaenopsis Sogo Yukidian V3品种的生长点萃取外，其他品种的兰花也都可适用此萃取技术，以获得活性成份高的萃取物。

本发明的兰花茎结生长点培育方法，请参照步骤(a)的诱导再生新侧芽，本发明的诱导方式依开花株的茎节部位，先切出若干段梗芽，再进行培育繁殖作业，约4周至4.5周后，即能制成新侧芽。

本发明的兰花茎节生长点切割撷取方法，请参照步骤(b)的切除梗芽并撷取新侧芽及步骤(c)去除壁膜，将新侧芽切除梗芽后，再除去壁膜，则可得圆形的新生植物组织，本发明只使用此新生植物组织进行萃取。

本发明的兰花茎节生长点萃取方法，请参照步骤(e)超音波萃取，将前述所取的的新生植物组织，利用超音波高频恒速震荡、疏密有秩的特性，将超音波振动对液体瞬间造成「增压」及「减压」，推动介质，产生空穴效应(cavitation)。当萃取液中无数细小的真空气泡爆裂时，产生瞬间高温及强大冲击力，可将待萃取物的成份分离，而达到萃取效果。

本发明的兰花开花株茎节生长点萃取方法，具有下列功效：

一、本发明主要提供针对兰花茎节生长点的培育、切割及萃取的完整流程，且仅撷取并收集兰花最具有活性成份的茎节生长点的再生植物组织，来进行萃取作业，所制成的萃取物活性成分含量高，品质优，故相较于现有技术中将整株兰花或花瓣进行萃取的方法，本发明所制成的萃取物的品质较好。

二、因本发明的萃取物具有优于现有技术萃取物的活性成份含量及质量，因此将本发明的萃取物添加在化妆保养品产品中，具有活化能量、抗发炎、伤口愈合、美白、抗皱、保护修护、抗氧化及抗老化等功效。

三、本发明以开花株其茎节生长点部位进行诱导培育，使长出再生新侧芽后，且切割取得新侧芽的植物新生组织，此茎节生长点诱导培育方式可获得大量的新生植物组织，而可因应大量生产的需求。

四、本发明在开花株其茎节生长点部位先进行培育以大量繁殖新侧芽后，再切割出新生植物组织，此茎节生长点切割作业可去除其他茎梗叶部位，只使用具有较高生长活性含量的新生植物组织进行萃取，故具有去芜存菁的效果，进而可提升萃取物质量，解决现有技术的兰花萃取技术活性含量及质量无法提升的问题。

五、本发明的开花株其茎节生长点的萃取方法，为在非高温下操作，其萃取过程中温度约50℃至60℃，以减少温度所造成的热损失，也可避免低沸点与有效物质挥发及保持生长点组织的生长活性，故可维持新生植物组织的活性含量，解决现有技术以煮沸、蒸气或热回流提取等加工流程中所造成萃取物的活性减低或有效物质挥发的问题。

六、本发明以超音波水萃取方法，且只使用逆渗透纯水，未有其他溶剂，故能改良传统溶剂萃取方法成本高且萃取过程危险的缺点，又可减少处理时间和溶剂使用量并得到高产率。

七、本发明经超音波萃取所制成的半成品萃取液，再进行过滤及去除溶剂作业，因本发明所使用的溶剂为无毒无菌的纯水，因此不会有现有技术中使用醇类或醇类水溶液为溶剂的萃取方式的安全性问题，且本发明经此过滤及去除溶剂作业，可获得活性高及稳定性佳的萃取物。

实施例2

本发明的兰花生长点萃取技术所制成的萃取物，进行与「人体皮肤细胞安全性相关试验」，其试验方式包括有「细胞存活度试验」、「细胞型态变化观察」及「细胞周期试验」三种，各别试验方法详述如下：

本发明的兰花生长点萃取技术所制成的萃取物，进行「细胞存活度试验」，其试验方式如下：(1)从液态氮桶中将人类皮肤角质株化细胞株HaCaT迅速移至37℃水浴箱内使其在40至60秒内急速解冻，随即将细胞冷冻保存液(含10％DMSO的细胞培养液)加入细胞培养液，将细胞打散并移置25cm²细胞培养瓶，在37℃、5％CO₂细胞培养箱中生长，平均每隔2天更换一次培养液；(2)将培养瓶的细胞培养液吸去，以PBS清洗一次，再加入适量的1xTrypsin(即胰蛋白酶)。待细胞剥落后，离心去除上层液，接着加入培养液，把细胞均匀打散。取100μl细胞液到微量离心管，加入同体积的trypan blue(即台盼蓝)均匀混合。最后将混合液吸至血球计数器 (hemacytometer)在显微镜下计算细胞数目；(3)将人类皮肤角质株化细胞以1x10⁴个细胞/孔密度培养在96孔盘，并在37℃及5％CO₂培养箱中培养至少24小时；(4)加入不同浓度的萃取物以及在指定的时间作用，达到反应时间，移除旧的培养液，以PBS清洗一次，并换上新的培养液，加入10μL的MTT(3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)溶液反应，在37℃、5％CO₂反应4小时后移除培养液，加入100μL的DMSO(即二甲基亚砜)溶解formazan(即甲臜)沉淀物，最后在波长570nm下测定吸光值(BioTek，Synergy^TM2，USA)。其中，将人类皮肤角质株化细胞HaCaT分别作用0、0.05、0.1和0.5mg/mL兰花生长点萃取物作用24小时后，细胞存活度分别为100±2.2％、 108.5±1.2％、105.0±2.9％、127.0±3.2％。此结果显示兰花生长点萃取物浓度小于0.5mg/mL时，细胞存活度大于100％以上。

本发明的兰花生长点萃取技术所制成的萃取物，进行「细胞型态变化观察」，其试验方式如下：(1)将人类皮肤角质株化细胞HaCaT以1x10⁴个细胞/孔密度培养在96孔盘，并在37℃及5％CO₂培养箱中培养至少24 小时；(2)加入1μL兰花生长点萃取物作用人类皮肤角质株化细胞HaCaT24 小时，达到反应时间后，在显微镜(Nikon，TE2000-U，Japan)下观察细胞型态，并拍照记录。如图2所示，人类皮肤角质株化细胞经兰花生长点萃取物(0.05、0.1和0.5mg/mL)作用24小时后，细胞型态与控制组的细胞型态无明显差异。

本发明的兰花生长点萃取技术所制成的萃取物，进行「细胞周期试验」，其试验方式如下：(1)将1x10⁴个细胞/孔密度培养在24孔盘中至少24小时，之后加入10μL兰花生长点萃取物，在培养箱中反应。之后收集上清液至15mL离心管，再以trypsin-EDTA(即胰蛋白酶-EDTA)溶液将细胞取下至离心管中，与上清液一并离心1200rpm、5分钟。移除上清液，加入300μL 的PBS(即磷酸缓冲盐溶液)，缓慢震荡，并逐滴加入700μL绝对酒精固定细胞，再移至微量离心管，置于4℃冰箱中储存；(2)流式细胞仪上机前，细胞在4℃下以1200rpm离心5分钟，移除上清液，依序加入445μL 的PBS、5μL的RNase(即核糖核酸酶)(10mg/mL)、50μL的10％Triton X-100，将细胞的RNA破坏分解后，在37℃反应30分钟，以1200rpm离心 5分钟，移除上清液，加入400μL的PBS混合均匀，再加入5μL的PI(5 mg/mL)，在4℃避光反应5分钟，以过滤膜过滤；(3)利用流式细胞分析仪(flow cytometer，FACScan)，配合Winmdi计算机软件来分析细胞周期分布比例。如图3所示，兰花生长点萃取物(0.1和0.5mg/mL)作用在皮肤角质株化细胞24小时后，细胞周期无显着变化；具体地说，经兰花生长点萃取物(0.1和0.5mg/mL)作用后sub-G1(M1区域)比例为5.8和6.2％，皆小于10％。

实施例3

针对兰花生长点的活性评估，本发明也建立相关测试方法，包括「粒线体再生试验」、「皮肤胶原蛋白生成试验」、「抑制发炎因子一氧化氮活性试验」、「伤口愈合试验」、「抑制酪胺酸酶活性试验」、「DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)自由基清除试验」、「保护因紫外线及氧化伤害而造成的DNA损伤试验」、「保护片段化DNA效应试验」、「修护皮肤细胞经紫外线作用的细胞存活度试验」、「侦测DNA损伤的环丁嘧啶二聚体(cyclobutanepyrimidine dimers，CPD)生成量试验」，兹分别详细说明如下：

本发明的兰花生长点萃取技术所制成的萃取物，进行「粒线体再生试验」，其试验方式如下：(1)人类皮肤角质株化细胞HaCaT以1x10⁴个细胞/ 孔的密度培养于24孔盘，在37℃及5％CO₂培养箱中培养至少24小时，加入不同浓度兰花生长点萃取物处理，置入培养箱作用24小时；(2)达到反应时间后，移除培养液，加入PBS清洗，加入paraforaldehyde(即多聚甲醛)固定细胞，使用1％TritonX100作用5分钟，接着使用PBS清洗细胞，加入mitoview染剂及用Hoechst 33342staining solution染细胞核(作为定量细胞数)，使用荧光免疫分析仪(BioTek，Synergy^TM2，USA)测定粒线体(绿色，激发光：490nm，发射光：523nm)及细胞核荧光(蓝色，激发光：346nm，发射光：460nm)表现；(3)粒线体表现计算公式如下：

人类粒线体在体内有许多功能，最重要的功能为产生能量；然而，粒线体会随着年龄增加逐渐减少，因此粒线体质量与健康和老化有极大关系。依此结果，人类皮肤角质株化细胞HaCaT经兰花生长点萃取物(0.05、0.1、 0.5和1.0mg/mL)作用24小时后，粒线体质量分别为102.2±1.2％、 105.7±0.2％、110.5±2.1％和124.9±1.7％。此结果显示兰花生长点萃取物可促进人类皮肤角质株化细胞的粒线体再生。

本发明的兰花生长点萃取技术所制成的萃取物，进行「皮肤胶原蛋白生成试验」，其试验方式如下：(1)将3T3L-1细胞以2x10⁵个细胞/mL密度培养在3公分盘中24小时后，移除上清液再加入含有不同浓度兰花生长点萃取物的无血清培养液培养48小时，PBS清洗后，刮除细胞，离心 1200rpm、5分钟，再去除上清液；(2)利用Sircol solublecollagneassaykit(即西科尔可溶胶原酶检测试剂盒)进行胶原蛋白测定，为先将100μL 细胞液混合1mL的sircol dye reagent(即西科尔染料试剂)，再在室温下均匀摇晃30分钟，再离心12000rpm、10分钟，直接倒掉上清液，再加入750μL ice-cold acid-salt wash reagent(即冰冷酸洗盐试剂)，再离心12000rpm、10分钟，将dye reagent(即染料试剂)完全去除干净。之后加入250μL的alkali reagent(即碱性试剂)混合均匀，取100μL 至96孔盘，在555nm下以酵素免疫分析仪测吸光值。

胶原蛋白为保持肌肤弹性及抗皱的重要因子，其合成量受到年龄的影响，因此若能适时促进胶原蛋白的合成量，可避免肌肤生成皱纹、失去弹力光泽的情形。依此结果，经过兰花生长点萃取物(0.05、0.1和0.5mg/mL) 作用后，可促进纤维母细胞中胶原蛋白的生成量约4.7±0.4％、 21.1±2.1％及35.0±0.1％。此结果显示兰花生长点萃取物对于促进胶原蛋白生成量具有优异的效果。

本发明的兰花生长点萃取技术所制成的萃取物，进行「抑制发炎因子一氧化氮活性试验」，其试验方式如下：取2μL兰花生长点萃取物(0.05、 0.1、0.5和1.0mg/mL)各别加入98μL的25mM硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)SNP反应120分钟，之后加入100μL的Griess reagent (即格里斯试剂)反应10分钟，以酵素免疫分析仪检测546nm吸光值。

SNP本身是一氧化氮捐献体的一种，与氧反应会形成亚硝酸(nitrite)，亚硝酸再与Griess reagent反应会变成粉红色溶液，在波长546nm具有特定吸光值。若样品能抑制一氧化氮生成的速率而减少亚硝酸产生，其吸光值会降低；吸光值愈低，表示样品清除一氧化氮自由基的能力越强。依上述分析结果，兰花生长点萃取物(0.05、0.1、0.5和1.0mg/mL)清除一氧化氮自由基能力分别为22.0±1.4％、25.0±1.3％、34.7±1.1％和 63.4±1.9％。

本发明的兰花生长点萃取技术所制成的萃取物，进行「伤口愈合试验」，其试验方式如下：将***式细胞培养容器置于24孔盘后，细胞以3x10⁵个细胞/mL的密度种在培养杯内并于37℃及5％CO₂培养箱中培养至少24小时。移除培养杯形成500±50m宽的细胞间隙后，先对细胞进行20mJ/cm² UVB(即户外紫外线)照射再加入不同浓度兰花生长点萃取物培养4小时。接着，在培养后第0、12、24及48小时观察细胞间隙变化并定量。

如图4所示，在培养后第48小时，以未经UVB照射的细胞(控制组) 形成的间隙宽度为100.0±1.0％，而仅经UVB照射的细胞形成的间隙宽度为89.6±2.4％，经UVB照射与兰花生长点作用的细胞(0.05和0.1mg/mL) 形成的间隙宽度分别缩小至62.4±0.5％与55.3±2.8％。此结果显示兰花生长点可促进细胞生长并让细胞间隔变小，而可促进伤口愈合。

本发明的兰花生长点萃取技术所制成的萃取物，进行「抑制酪胺酸酶活性试验」，其试验方式如下：将不同浓度兰花生长点萃取物取2L至 96孔盘中，加入18L的DMSO混合，再加入25L的100unit香菇酪胺酸酶并在室温下反应10分钟。之后加入155L的2.5mM L-DOPA(即左旋多巴)，在492nm的波长以酵素免疫分析仪测定吸光值。

依此结果，兰花生长点萃取物(0.05、0.1、0.5和1.0mg/mL)抑制酪胺酸酶活性分别为12.8±1.5％、28.5±2.2％、46.2±2.5％和 75.2±1.8％。

本发明的兰花生长点萃取技术所制成的萃取物，进行「DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)自由基清除试验」，其试验方式如下：将兰花生长点萃取物配置成不同浓度，分别加入90μL新鲜配置的100μM 的DPPH自由基乙醇溶液后一起添加至96孔盘中反应，以酵素免疫分析仪检测517nm吸光值。试验标准品为AA，DPPH自由基清除率公式如下：

依此结果，兰花生长点(0.05、0.1、0.5和1.0mg/mL)清除DPPH自由基能力分别为19.6±1.2％、30.5±0.3％、50.0±0.2％和82.6±2.1％。

本发明的兰花生长点萃取技术所制成的萃取物，进行「保护因紫外线及氧化伤害而造成的DNA损伤试验」，其试验方式如下：(1)将DNA质体 pUC119(25μg，0.5μg/μl，Takara，Japan)以1:8比例用PBS稀释，进行各别处理：①控制组、②UVB(20mJ/cm²)与H₂O₂(1mM)+FeSO₄(0.5mM) 作用组、③UVB(20mJ/cm²)与H₂O₂(1mM)+FeSO₄(0.5mM)+兰花生长点萃取物作用组；(2)各取2μL的pUC119于微量离心管后，以①、②和③组别分别处理，并分别在37℃作用1小时；(3)加入loading dye(即装载染液)混合后，在0.8％agarose(即琼脂糖)胶体进行电泳30分钟后以电泳胶片影像撷取***分析；(5)分析S-form DNA和L-form DNA的比例。质体本为环状结构(supercoil form，S-form)，其受到氧化伤害及紫外线伤害时，会形成开放性(open form，O-form)或是直线型(linear form， L-form)的结构。质体pUC119为一段S-form结构的DNA质体，其经过氧化及UVB伤害后，质体会形成L-form、O-form，受到剧烈伤害时甚至会片段化。如图5所示，质体DNA经UVB和氧化伤害(H₂O₂+FeSO₄)作用后(第二条带)，DNA形成片段化，超螺旋结构比例仅为1.6％，而经过兰花生长点萃取物(0.1mg/mL)作用后(第四条带)，超螺旋结构比例为22.5％。此结果显示兰花生长点萃取物具有保护DNA质体不受UVB及氧化伤害的效能。

本发明的兰花生长点萃取技术所制成的萃取物，进行「保护片段化DNA 效应试验」，其试验方式如下：(1)将稀释的2μL的DNAMw Standard Marker 加入0.5mL微量管，进行各别处理：①控制组、②UV(即紫外线)与H₂O₂作用组、③UV与H₂O₂+萃取物作用组；(2)于在37℃下作用1小时后，加入loading dye混合，以琼脂胶凝胶核酸电泳分析。如图6所示，DNAmarker 为一片段DNA条状带(未经伤害的DNA，第一条状带)，DNA会依照不同分子量排列。一旦受到氧化及UVB伤害后，条状DNA会变成碎片(第二条状带)，而经过兰花生长点萃取物(0.05、0.1和0.5mg/mL)作用后，DNA仍保持明显的条状带，即兰花生长点萃取物于0.05mg/mL具有保护DNA效能。此结果再次证实兰花生长点萃取物具有保护DNA不受氧化及UVB伤害的效果。

本发明的兰花生长点萃取技术所制成的萃取物，进行「修护皮肤细胞经紫外线作用的细胞存活度试验」，其试验方式如下：(1)将人类皮肤角质细胞以1x10⁴个细胞/孔密度培养在96孔盘，并在37℃及5％CO₂培养箱中培养至少24小时，进行各别处理：①控制组-移除细胞上清液，更换无血清的新鲜培养液，培养4小时后，以PBS清洗置入无血清的新鲜培养液，继续培养4小时，进行存活度分析；②UV照射组-移除细胞上清液，更换无血清的新鲜培养液，放置细胞培养箱中培养4小时后，移除上清液以PBS 清洗并抽干，进行UV照射后，立即加入无血清之新鲜培养液，继续培养4 小时，进行存活度分析；③UV照射+萃取物组：移除细胞的上清液，将萃取物各别混合于无血清的新鲜培养液，加入培养4小时后，移除上清液以PBS 清洗并抽干，各别进行UV照射后，立即加入含萃取物的无血清新鲜培养液，继续培养4小时，进行存活度分析；(2)达到反应时间，移除旧的培养液，以PBS清洗一次，并换上新的培养液，加入10μL的MTT溶液反应，在37℃、 5％CO₂反应4小时后移除培养液，加入100μL的DMSO溶解formazan沉淀物，最后在波长570nm下测定吸光值(BioTek，Synergy^TM2，USA)。

由于化妆保养产品使用时最先接触皮肤角质层，故本试验选用人类皮肤角质株化细胞进行的理由于此。如图7所示，经UVB(20mJ/cm²)照射后，细胞存活度约80％，而经过兰花生长点萃取物(0.05、0.1和0.5mg/mL) 作用后，细胞存活度为92.1％、100.6％和132.9％；即，兰花生长点萃取物于0.05mg/mL便具有保护细胞免于UVB伤害的效能。此结果显示兰花生长点萃取物具有保护细胞免于UVB伤害的效能。

本发明的兰花生长点萃取技术所制成的萃取物，进行「侦测DNA损伤的环丁嘧啶二聚体生成量试验」，其试验方式如下：(1)将1x10⁵个细胞 /mL培养于24孔盘至少24小时，进行各别处理：①控制组、②UV照射组；③UV照射+萃取物组-萃取物作用4小时后进行UV照射，更换不含血清培养液培养4小时；(2)移除培养液以PBS清洗，以冰甲醇固定细胞，再以Triton X-100作用，加入2M的HCl溶液作用1小时，再以1％BSA填补细胞间隙，再以CPD一级抗体在37℃摇晃反应1小时，去除一级抗体后，再加入二级抗体避光反应30分钟，以PBS清洗并在激发光504nm，发射光524nm下侦测荧光表现；(3)再加入Hoechst 33342(10mg/mL)进行细胞核染色，以 PBS清洗后再以激发光355nm，发射光460nm下侦测荧光表现，并在荧光显微镜下观察拍照。

过量的紫外线照射引起DNA损伤的原因在于其能诱发DNA同条链内相邻的嘧啶碱基产生CPD光产物，使DNA空间结构发生变化，从而阻碍DNA 复制、转录进而影响蛋白质的生物功能。换言之，经过UVB照射后细胞受到伤害而碎裂并产生光产物堆积，CPD为一种光产物，可利用荧光侦测的特性进行试验。如图8所示，皮肤细胞经兰花生长点萃取物(0.1和0.5mg/mL) 作用再经UVB照射后，仅有些许光产物产生。即，兰花生长点萃取物于 0.1mg/mL便具有保护细胞免于UVB伤害的效能。

综合上述，本发明是提供一种针对兰花生长点切割及萃取技术，从培育、切割及萃取的完整流程，其利用兰花茎节生长点细胞会不断***和分化的再生特性，拥有高生命力及活性的特质，在非高温下进行，可避免低沸点与有效物质挥发及保持生长点组织的生长活性，且所制成的萃取物质量佳，使用在化妆保养产品中，可活化能量、抗发炎、伤口愈合、美白、抗皱、保护修护、抗氧化及抗老化等功效，且茎节生长点诱导培育方式可因应大量生产的需求，又配合过滤及去除溶剂作业可获得活性及稳定性高的萃取物，据以获致实用性高与经济价值高的兰花活性萃取物，以使整体确具产业实用性及成本效益。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种兰花芽胚组织萃取物在制备抗发炎、美白、抗皱、保护皮肤不受紫外线伤害及抗氧化的组合物的用途；

兰花芽胚组织萃取物的制备方法包含：

（a）超音波萃取：将兰花芽胚组织称取100克，放入超音波萃取设备，以兰花芽胚组织重量5倍量的纯水为溶剂将兰花芽胚组织覆盖浸泡，置入超音波萃取设备内，超音波萃取设备的水温为50℃至60℃，功率为300瓦，时间为40分钟，以超音波震荡对兰花芽胚组织进行萃取作业，以制成半成品萃取液；

（b）过滤及去除溶剂作业：将半成品萃取液经由抽真空的过滤作业后，再利用减压浓缩机将半成品萃取液进行去除溶剂作业，以制成兰花芽胚组织萃取物；

兰花为大白兰花Phalaenopsis Sogo Yukidian V3品种；

兰花芽胚组织为生长点新侧芽的新生植物组织；

生长点新侧芽的新生植物组织的取得方法包含：

（i）诱导再生新侧芽：将兰花开花株的茎节部位的梗芽，在梗芽侧边进行切割，以茎节为单位切出若干段梗芽，各梗芽在预定时间内所切割的部位将自行愈合，消毒后进行培育作业使梗芽切割的部位长出新侧芽；

（ii）切除梗芽并撷取新侧芽：将梗芽切除并撷取新侧芽后，在两片新侧芽交接的位置往下0.1cm的部位的生长点组织，切成小片段；

（iii）去除壁膜：将各小片段的生长点组织去除壁膜，成为新生植物组织，新生植物组织呈形状一致的圆形；

（iv）收集新生植物组织：收集预设数量的生长点新侧芽的新生植物组织。