CN111279195B

CN111279195B - 原发性肝癌的预后和随访方法

Info

Publication number: CN111279195B
Application number: CN201880067601.0A
Authority: CN
Inventors: T·波纳德
Original assignee: BIOPREDICTIVE; Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Current assignee: BIOPREDICTIVE; Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Priority date: 2017-10-16
Filing date: 2018-10-15
Publication date: 2024-01-23
Anticipated expiration: 2038-10-15
Also published as: CN111279195A; US20210208147A1; WO2019076830A1; EP3698139A1

Abstract

本发明涉及使用一种通过组合血液生化标记物的函数来评估患者(特别是患有慢性肝脏疾病的患者)随时间发展成原发性肝癌的风险的新方法。

Description

原发性肝癌的预后和随访方法

技术领域

本发明涉及一种新的非侵入性定量测试，尤其是，该定量测试使得有可能检测易于发展成肝癌的患者。

背景技术

原发性肝癌是肝细胞的癌症，肝脏中的正常细胞变得异常时，然后将破坏邻近的正常组织，并扩散到肝脏的其他区域和肝脏以外的器官。

大多数患有肝癌(肝癌)的人都是在慢性肝脏疾病的情况下罹患肝癌。实际上，肝癌的主要诱因是乙型肝炎、丙型肝炎和非酒精性(NAFLD)或酒精性(ALD)脂肪肝疾病引起的硬化。实际上，在超过90％的原发性肝癌病例中存在晚期纤维化(根据METAVIR分类为F2、F3或F4)。

最常见的类型是肝细胞癌(HCC)(占病例的80％)和胆管癌。较少见的类型包括粘液性囊性肿瘤和导管内***状胆汁性肿瘤。

诊断通常由医学影像和使用某些血液标记物以及组织活检证实来支持。

影像形式包括超声检查(超声)、计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)。在95％的病例中超声检查大于2cm的实体和超血管化团块指示HCC。

发生在肝门区且通常存在胆管阻塞的胆管癌，通常通过内镜逆行胰胆管造影(ERCP)、超声、CT、MRI和磁共振胰胆管造影(MRCP)检测。

用于诊断肝癌的血液标记物是甲胎蛋白(AFP)，其在70％的肝癌患者中可以升高。但是，该蛋白的检测不是很灵敏，因为肝癌中AFP水平可能正常，尽管AFP水平升高通常是肝癌的标识。人们还寻找脱-γ-羧基凝血酶原、碳水化合物抗原19-9(CA19-9)、癌胚抗原(CEA)和癌症抗原125(CA125)的血液水平变化。但是，这些标记物不具特异性。

检测出具有发展成肝癌的高风险的患者是重要的，以便能够建议他们进行定期监测。与总体患者群体相比，这些患者具有相对高的患原发性肝癌的风险。因此，这将允许及早发现癌症发生，增加治愈的机会，同时降低发病率和治疗费用。能够在患有晚期纤维化的患者群体中确定具有较高的风险发展成肝癌的患者，建议仅对这些患者进行定期监测和昂贵的病因治疗(例如抗丙型肝炎病毒)，是一项重要的公众健康议题。

然而，鉴于该群体中这种癌症的发生率相对较低(约占患者的1-2％)，因此难以建议所有患有慢性肝脏疾病的患者检测原发性肝癌。如果能够将该群体分为多个类别，其中某些类别的患者比其他类别的患者具有更高的患有原发性肝癌的风险，这样既可以减少制定特定医学检查(影像)的数量，又可以增加检查的患者中阳性病例的百分比。

发明内容

本申请公开了一种新的测试，使用通过组合各种生化血液标记物的测量值而制成的函数，该测试检测患者(特别是患有慢性肝脏疾病的患者)是否具有较高的患有原发性肝癌的风险。该增加的风险对应于相对增加的风险，即事实是患者被置于一个组中，在该组中患有原发性肝癌的总体风险高于不在该组中的患者。换句话说，可以确定定义两组(或类)患者的阈值(函数值低于或高于阈值)。因此，其中一组的患者患有原发性肝癌的相对风险将显著高于另一组的患者。函数是定量的，因此阈值越高，相对风险越高。还可以确定多于一个的阈值，由此构成的每个组(类)中的相对风险都不同。

要注意的是，本文公开的函数是使用一群患者获得的，其中一些患者患有肝癌。然而，令人惊讶的是，该函数不是患者中存在或不存在原发性肝癌的指标，而是其可能确定尚未患癌症的患者具有增加的患癌症的风险。

测试质量通常通过绘制接收工作特征曲线(ROC)并测量接收工作特征曲线下的面积(AUROC)来确定。

根据获得的测试结果，对不同阈值(从0到1)对患者进行分类之后，通过绘制灵敏度与(1-特异性)的曲线绘制ROC曲线。

通常公认的是，曲线下的面积值大于0.7的ROC曲线是很好的预测曲线。必须承认ROC曲线是允许预测测试质量的曲线。最好将AUROC尽可能地接近1，此值描述了100％特异和灵敏的测试。

值得提醒的是：

(1)灵敏度是指在具有所寻求表型的个体中诊断为阳性的概率(真阳性检测)：如果患者具有该表型，则该测试为阳性。当假阴性数高时，灵敏度低。灵敏度的计算公式为SE＝(存在标识(sign)的具有表型的个体数)/(存在标识的具有表型的个体数+缺乏标识的具有表型的个体数)。

(2)特异性是指在没有所寻求表型的个体中诊断为阴性的概率(真阴性的未检测到)：如果患者未患病，则测试为阴性。假阳性数高时，特异性低。特异性的计算公式为：SP＝(缺乏标识的不具有表型的个体数)/(缺乏标识的不具有表型的个体数+存在标识的不具有表型的个体数)。

(3)阳性预测值(PPV)：是指如果诊断测试为阳性，患病的概率(即患者不是假阳性)：如果测试为阳性，则患者具有表型。阳性预测值的计算公式为：PPV＝(存在标识的具有表型的个体数)/(存在标识的具有表型的个体数+存在标识的不具有表型的个体数)。

(4)阴性预测值(NPV)：是指如果诊断测试为阴性，不患病的概率(即患者不是假阴性)：如果测试为阴性，则患者不具有表型。阴性预测值的计算公式为：NPV＝(缺乏标识的不具有表型的个体数)/(缺乏标识的不具有表型的个体数+缺乏标识的具有表型的个体数)。

为了获得良好的诊断测试，重要的是同时提高特异性和灵敏度。

在开发本文所公开的测定法和测试中，发明人增加了现有测试的灵敏度(Fibrotest仅查看纤维化的存在并寻找AFP作为肝癌标记物)。发明人表明，通过创建如本文所述的新测试，获得了更好的AUROC，在使用纤维化标记物和AFP的测试中仍然增加了AUROC。

一般地，诊断(或预后)方法包括：

i.从患者收集信息的步骤；

ii.比较所述信息与阈值的的步骤；

iii.根据患者信息和阈值之间的差异推导出患者是否患有特定疾病、患者疾病的阶段或患者的状态是否将演变为给定状态的步骤。

作为说明

i.从患者收集的信息可以直接地从患者收集(例如来自NMR、扫描仪、放射线照相、对比增强计算机断层扫描的图像)，或间接地从患者收集，例如来自已经从患者获得的生物样品(例如尿液、血液样品...)。信息可以是特定生物标记物的存在(或不存在)和/或水平，无论是对病原决定因素(细菌或病毒DNA/RNA)特异的，还是患者标记物水平的升高；

ii.一旦获得信息，就将其与不同的值/标准进行比较，并评估相对于这些标准的偏差。作为说明，应将某些生物标记物的水平与健康患者通常观察到的水平以及患有该疾病的患者(或对于预后方法而言，已知后来会演变为特定疾病阶段的患者)通常观察到的水平进行比较。可存在阈值，其中超过该阈值的95％的患者患有疾病，并且没有超过该阈值的95％的患者没有患有疾病。对于可以确定多个临床阶段的疾病，这种阈值可以区分不同的阶段。在此步骤ii中，可以将各种类型的信息与其各自的标准进行比较，以便能够在步骤iii中进行诊断(作为说明，可以使用从各种血液或血浆标记物的测量、扫描仪的图像和身体质量指数获得的值和信息)。

iii.最后的步骤实际上是进行诊断(或者，确定预后)，即确定患者是否患有所寻求的疾病，或者患者是否将演变成给定的临床状态)，特别是考虑到从患者收集的信息，如上所述的阈值。医生还可以考虑其他因素(例如所收集信息的一致性等)来进行诊断。

某些方法，例如本申请中公开的方法，还应包括步骤i.a)，其包括修改从患者获得的信息以便获得一种新型信息的步骤，其是步骤ii中与标准相比较的信息。此类修改是将函数中变量的值组合，并获得最终值。

还应注意的是，如本文公开的，仅测量患者血浆或血清中标记物水平的值并将其在算法中组合是方法的一部分，但仅提供中间结果(最终值或指数)，然后将其与参考指数(阈值)进行比较，以真正能够进行诊断。

还应注意，就输出值(由本文公开的公式计算出的指数)不是关于患者状态的明确答案的意义而言，本文公开的测试不是“金标准”测试。实际上，这些测试是基于统计学的，因此可能会有假阳性或假阴性结果，这就是为什么解释指数时医生的具体经验对于为每位患者做出预后和决定采取哪种随访是至关重要的原因。

然而，由于本文为指数的各种阈值提供的测试的特异性、灵敏度、阳性预测值和阴性预测值，因此在调研临床病例时，这些测试在为医师提供帮助方面具有极大的意义。因此，如上公开的步骤iii不是直接且立即来自步骤ii，因为医师必须根据临床和一般情况来解释结果才能得出结论。

因此，本申请公开了一种新的测试，该测试使得可以确定患者是否将在给定的时间期间内(例如在接下来的5、10或15年内)发展为肝癌，尤其是当患者患有慢性肝脏疾病时。

所述方法包括以下步骤：将从所述患者的血液、血清或血浆中存在的标记物测量的值通过函数组合，以获得最终指数，该最终指数指示患者所属的“肝癌风险类别”。

该方法在体外或离体进行。

该方法特别有趣，因为它可以管理患者的随访，并仅对最处于发展成癌症风险的一部分患者建议进一步的肝癌诊断测试(例如影像学检查或新的特定肝癌测试)。对于其他在短期(少于5年)内不具患有肝癌风险的患者，可以在其他时间重复该方法，以确定是否有任何演变成状态的风险(最终值)，以及风险是否保持稳定或增加(患者的风险类别是否变化)。因此，该方法使得可以在早期检测到原发性肝癌并开始治疗，从而降低了死亡率、发病率和相关费用。

以下描述了可用于执行本文公开的方法的一些函数。然而，应注意的是，遵循本发明的教导，获得和开发与本文公开的函数一样(或更)有效的其他函数没有技术上的困难。

还应注意，本文公开的某些函数仅利用经典肝标记物(纤维化标记物)的血液(或血浆或血清)测量值，而不使用肝癌标记物的值。令人惊讶地注意到，可以在不使用任何癌症特异性标记物的情况下做出这种癌症发生的预后。这也是非常有用的，因为“经典”(不包括肝癌标记物)标记物已被本领域的医师广泛研究。因此，使用不包含肝癌标记物的函数可以使医师首先评估患者的风险，然后要求进行进一步的血液测试以测量肝癌标记物的值并使用本文公开的其他函数完善测试。

还应注意，尽管已通过逻辑回归获得了本文的示例性函数，但是可以使用其他统计学方法来获得发展为原发性肝癌的风险，特别是Cox回归(危险是原发性肝癌的发生)，因此其将提供与本文示例的逻辑回归函数输出相同类型的其他函数(测量发生原发性肝癌的风险)。

尽管可以在所公开的函数中使用任何标记物，可以选择不使用胆红素(总胆红素)和/或转移酶(ALT(丙氨酸氨基转移酶)或AST(天冬氨酸氨基转移酶))。这是因为这样的标记物可能由于多种原因而大不相同。

从另一方面讲，优选的是函数使用触珠蛋白和载脂蛋白A-1(apoA1)的水平。

因此，本发明涉及一种用于确定患者(特别是患有慢性肝脏疾病的患者)是否具有发展为原发性肝癌的风险的方法，该方法包括以下步骤：通过组合血液标记物值的函数，将患者血液、血清或血浆中测量的血液标记物的值进行组合。该方法还是用于监测肝脏疾病的进展、对患者进行随访的方法，并且可以包括治疗患者或对患者进行进一步适当的诊断和/或随访测试的步骤。

因此，有可能获得最终值，并且将该最终值与预定阈值进行比较，其中，如果该最终值高于/低于预定阈值，则患者具有发展为原发性肝癌的风险。

实际上，本发明因此将涉及一种确定患者是否具有发展为原发性肝癌的风险的方法，该方法包括以下步骤：通过函数将患者血液、血清或血浆中测量的生化标记物的值进行组合、获得最终值、比较该最终值与预定值(阈值)，其中该最终值相对于预定值的变化指示患者发展为原发性肝癌的风险。

如上所述，应针对测试后的给定时间段(最长可达15年)获得风险。本申请的附图尽管是说明性的并且与特定函数有关，可用于在长达15年的任何持续时间内，确定每类原发性肝癌发生的百分比，从而确定每类的风险。尤其是，可以评估5年、10年或15年的风险。

患者优选患有慢性肝脏疾病，其优选选自乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、酒精性肝脏疾病(ALD)。该患者还可能患有NASH疾病(非酒精性脂肪性肝炎)。

血液标记物优选是肝纤维化血液标记物，测量其量并用于函数中。这对应于当患者患有肝脏疾病时，会发生变化的血液标记物(当存在这样的疾病时通常会出现纤维化)。

因此，标记物可以选自α2-巨球蛋白(A2M)、GGT(γ谷氨酰转肽酶)、触珠蛋白、载脂蛋白A-1(apoA1)、胆红素、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯、总胆固醇、空腹葡萄糖、γ-球蛋白、白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、IL10、TGF-β1、apoA2、apoB、细胞角蛋白18、血小板数、凝血酶原水平、透明质酸、尿素、N-端III型原胶原蛋白、1型组织抑制剂金属蛋白酶(TIMP-1)、IV型胶原蛋白(Coll IV)、骨保护素、miRNA122、细胞角蛋白18、血清淀粉样蛋白A(SAA)、α-1-抗胰蛋白酶(同种型1)、果糖二磷酸醛缩酶A、果糖二磷酸醛缩酶B、富马酰乙酰乙酸酶、运甲状腺素蛋白、PR02275、C反应蛋白(同种型1)、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A11、DNA指导的RNA聚合酶I亚基RPA1、遮蔽蛋白(obscurin)(同种型1)、α骨骼肌肌动蛋白、主动脉平滑肌肌动蛋白、碱性磷酸酶、未鉴定的蛋白C22orf30(同种型4)、血清淀粉样蛋白A2(同种型a)、载脂蛋白C-III、载脂蛋白E、载脂蛋白A-II、聚合免疫球蛋白受体、von Willebrand因子、氨基酰化酶-1、G蛋白偶联受体98(同种型1)、对氧磷酶/芳基酯酶1、补体成分C7、血液结合素、补体C1q亚成分、对氧磷酶/内酰胺酶3、补体C2(片段)、多能蛋白聚糖核心蛋白(同种型Vint)、细胞外基质蛋白1(同种型1)、E3SUMO-蛋白连接酶RanBP2、触珠蛋白相关蛋白(同种型1)、脂联素、视黄醇结合蛋白、铜蓝蛋白、α2抗纤溶酶、抗凝血酶、甲状腺素结合蛋白、蛋白C、α2脂蛋白、四连蛋白、岩藻糖基化的A2M、岩藻糖基化的触珠蛋白、岩藻糖基化的apoA1和碳水化合物不足转铁蛋白。

这些标记物浓度的变化与非特异性肝损伤相关，因此与原发性肝癌没有特异性相关。

在一个优选的实施方案中，所述生物化学标记物选自下组：α2-巨球蛋白(A2M)、GGT(γ谷氨酰转肽酶)、触珠蛋白、载脂蛋白A-1(apoA1)、胆红素、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯、总胆固醇、空腹葡萄糖、细胞角蛋白18、血小板数、凝血酶原水平、透明质酸、淀粉样蛋白A(SAA)、血液结合素和碳水化合物不足转铁蛋白。该组还包含蛋白质的岩藻糖基化形式，尤其是岩藻糖基化的A2M、岩藻糖基化的触珠蛋白、岩藻糖基化的apoA1。

如上所述，也可以使用至少一种肝癌标记物，例如甲胎蛋白(AFP)、岩藻糖基化的AFP、HSP27(热休克蛋白)、HSP70、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)尤其是SCCA-IgM IC(一种由SCCA和IgM组成的循环免疫复合物)、高尔基体蛋白73(GP73)、α-L-岩藻糖苷酶(AFU)、Des-γ-羧基凝血酶原(DCP或PIVKA)、骨桥蛋白(OPN)或人羰基还原酶。其他肝细胞癌(HCC)标记物具体地公开在Zhao等人Mol Clin Oncol.2013年7月；1(4):593-598，Salloom，Int J Health Sci(Qassim).2016年1月；10(1):121-136，Tara Behne和Copur，International Journal of Hepatology，vol.2012，Article ID859076，第7页。这些标记物浓度的变化与原发性肝癌相关(因此这些标记物可被视为对肝癌具有特异性)。

要注意的是，甲胎蛋白(AFP)是一种可以被岩藻糖基化或不被岩藻糖基化的蛋白质，其具有三种糖型(AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3)，根据其与凝集素晶体凝集素(lectin lensagglutinin，LCA)的结合能力命名。可以检测任何形式的AFP蛋白，单独或这些同种型的组合。尤其是，可以对AFP和AFP-L3(甲胎蛋白的小扁豆Lens culinaris凝集素反应部分)进行组合检测。

因此可以使用如上所述使用肝脏疾病血清标记物值和至少一种癌症标记物值的函数。

作为函数中的变量，还可以包括至少一种选自以下的其他变量：患者的性别、年龄和BMI(身体质量指数)。也可以使用空腹血糖水平。

如上所述，可以在本文公开的方法中使用的函数可以是通过逻辑回归获得的函数(可以称为逻辑函数)。

进行逻辑回归的方法是本领域已知的。总之，其包括评估受试者群体(一个具有例如肝癌的输出，另一个不具有输出)之间标记物的个体差异。可以选择变化最大的标记物，并进行逻辑回归分析以考量所选标记物的独立可区分值。如果某些标记物在组之间无变化，则这些标记物在函数中的系数会很低(从而表明这些标记物的权重对于性状的存在没有真正的影响)。

然后可以对函数进行归一化(例如，使最终结果始终介于0到1之间)。

在本发明中，可以通过以下公开的任何方法获得函数，特别是通过

a)评估一组患者(优选患有慢性肝脏疾病的患者)在给定的时间段后是否存在肝癌，其中在该时间段开始时，已知函数中使用的患者的血液标记物的变量值；

b)通过一维分析，已测量其值的血液标记物中，鉴定以下各组之间值显著不同的那些血液标记物：

i.患有肝癌的患者

ii.没有肝癌的患者；

c)针对给定时间段内肝癌的发生，进行逻辑回归分析以评估和考量步骤b)中鉴定的标记物的独立可区分值，

d)从而通过将这些鉴定的独立因子组合起来获得函数。

为了获得尽可能准确的函数，该组中的患者数量应尽可能多，这表明优选包含多于50名患者，优选多于100名患者，优选多于200名患者，优选多于500名患者，或甚至多于1000名患者。如所示，患者数量没有上限，并且越多越好。

时间段由本领域技术人员选择。如果希望函数指示5年内的肝癌发生，则时间段应为5年。这意味着b)组将是5年后患有肝癌的患者和5年后没有肝癌的患者。可以使用其他时间段(10、15年或更长)。在本申请中，所公开的函数已被设计为15年的期间。令人惊讶地注意到，这些函数仍然指示在较短的时间段(5年和10年)内发生原发性肝癌的风险。但是，发明人可能已经设计了其他函数以及其他终点时间段，其对于这些特定终点可能更准确。

特别地，发明人已经表明，使用针对α-2-巨球蛋白(A2M)、apoA1、GGT和触珠蛋白测量的值，可以获得精确的函数。在一个更具体的实施方案中，该函数不包括血液、血清或血浆的其他标记物的值。换句话说，在逻辑函数内使用的血液、血清或血浆标记物的仅有值是针对apoA1、A2M、GGT和触珠蛋白测量的值。

该函数可以进一步包括选自患者的性别、年龄和BMI的至少一个其他变量。在该实施方案中，逻辑函数将使用来自血液、血清或血浆的标记物的值以及如上所述其他变量中的至少一个测量的值。优选的是逻辑函数进一步考虑患者的性别(性别)和年龄。

因此，在本发明的上下文中可使用的函数可以具有以下形式：

F1＝a0+a1×Log(A2M，g/l)+a2×年龄(岁)+a3×ApoA1(g/l)+a4×性别(女性为0，男性为1)+a5×Log(GGT，IU/1)+a6×Log(触珠蛋白，g/l)。

在这个实施方案中，

--6≤a0≤-3.4，优选-5.2≤a0≤-4.7

-2.4≤a1≤4.6，优选3≤a1≤4

-0.02≤a2≤0.07，优选0.03≤a2≤0.07

--2.6≤a3≤-0.8，优选-2.2≤a3≤-1.0

--1.5≤a4≤-0.5，优选-1.2≤a4≤-0.6

-0.9≤a5≤1.9，优选1.2≤a5≤1.7

--1.5≤a6≤-0.5，优选-1.1≤a6≤-0.6。

在一个优选的实施方案中，该函数是

F1-a＝-4.819+3.673×LogA2M(g/L)+.053×年龄(岁)-1.983×ApoA1(g/L)-1.122×性别(女性为0，男性为1)+1.603×LogGGT(IU/L)-0.834×Log触珠蛋白(g/L)。

这种用于诊断同期肝癌(当前存在肝癌)的函数具有0.915的AUROC值与0.896的FibroTest AUROC值，AUROC差为0.019(95％CI；0.005-0.033；P＝0.0001)，即相差2％，特异性和灵敏度均增加(图1)。

在另一个实施方案中，函数是：

F1-b＝-4.982+3.713×LogA2m(g/L)+0.0473×年龄(岁)-1.133×ApoA1(g/L)-0.791×性别(女性为0，男性为1)+1.343×LogGGT(IU/L)-1.062×Log触珠蛋白(g/L)。

本文公开的函数能将提供与阈值进行比较以确定患者所属的患者类别的最终结果(指数或分数)。

例如，对于函数F1-a，如果最终结果低于0.25，则该患者属于“低癌症风险”类别，表明患有原发性肝癌的风险为0.9792(在10000名指数低于0.25的患者群体中将有208名患有原发性肝癌的病例)。

如果最终结果高于0.25，则该患者属于“高癌症风险”类别，表明患有原发性肝癌的风险为0.8449(在10000名指数高于或等于0.25的患者群体中将有1551名原发性肝癌病例)。

因此，这两个类别之间的相对风险是，在指数高于或等于0.25的患者组中高出多于7倍。

因此，在这种情况下，将阈值设置为0.25可以检测属于具有增加的发展为原发性肝癌的风险的组的患者，该组由最终结果大于或等于0.25的患者组成。

也可以设置其他阈值，从而设计其他组(类别)的具有增加的发展为原发性肝癌的风险的患者。作为说明，可以设计一组最终结果大于或等于0.25且小于0.50的患者，或大于或等于0.50且小于0.75的患者，或大于或等于0.75的患者。

如果最终结果高于0.25且低于0.50，则患者属于“适度癌症风险”类别，表明患有原发性肝癌的风险为0.9124(在10000名指数高于或等于0.25且低于0.50的患者群体中将有876名原发性肝癌病例)。

如果最终结果高于0.50且低于0.75，则患者属于“中间癌症风险”类别，表明患有原发性肝癌的风险为0.8225(在10000名指数高于或等于0.25且低于0.50的患者群体中将有1775名原发性肝癌病例)。因此，该类别中的相对风险是“适度癌症风险”类别中风险的两倍。

如果最终结果高于0.75，则患者属于“极高癌症风险”类别，表明患有原发性肝癌的风险为0.6933，这意味着在10,000名指数高于或等于0.75的患者群体中将有3067名原发性肝癌病例(相对于“低癌症风险”类别的相对风险超过14倍)。

也可以设计和使用这样的函数，其中也使用原发性肝癌标记物。尤其是，发明人表明，将AFP添加到其他标记物中，可以使设计的函数与不包含这些标记物的函数相当或者较之更有效。还应注意，非特异性标记物和特异性癌症标记物可以在相同的函数中组合或用于独立的并置分析中。

因此，函数可以是：

F2＝a0+a1×Log(A2M，g/l)+a2×年龄(岁)+a3×ApoA1(g/l)+a4×性别(女性为0，男性为1)+a5×Log(GGT，IU/1)+a6×Log(触珠蛋白，g/l)+a7×Log AFP(μg/L)。

在这样的函数中

a)-7≤a0≤-5.5，优选-6.5≤a0≤-6

b)2.2≤a1≤3.2，优选2.5≤a1≤2.9

c)0.02≤a2≤0.06，优选0.04≤a2≤0.05

d)-1.65≤a3≤-1.25，优选-1.55≤a3≤-1.35

e)-0.3≤a4≤-0.22，优选-0.28≤a4≤-0.24

f)1.25≤a5≤1.85，优选1.45≤a5≤1.65

g)-0.75≤a6≤-0.55，优选-0.7≤a6≤-0.6

h)1.3≤a7≤1.9，优选1.5≤a7≤1.8。

函数可以是：

F2-a＝-6.214+2.713LogA2m(g/L)+0.0447×年龄(岁)-1.451×ApoA1(g/L)-0.260×性别(女性为0，男性为1)+1.557×LogGGT(IU/L)-0.633×Log触珠蛋白(g/L)+1.662×LogAFP(μg/L)。

如上所述，函数可以是(多变量)Cox函数。这种Cox函数优选通过以下获得：

a)在给定的时间段后，评价/评估患有慢性肝脏疾病的患者中肝癌的存在，其中在该时间段开始时已知该函数中使用的变量的值；

b)基于给定时间段后肝癌的发生，通过组合所述值进行多变量Cox回归；

c)通过多变量Cox回归分析，评价值的独立可区分值，

d)当标记物与观察的肝癌发生呈负相关时，则将在多变量Cox回归中独立确定的每个标记物的值的相对权重与负号组合。

可以在该方法中使用的标记物与上面公开的相同。时间段由本领域技术人员选择，通常为多年(例如5、10、15年)。

在本发明的上下文中可以使用的Cox函数的示例是：

C1＝b1×ApoA1(g/L)-b2×Log触珠蛋白(g/L)+b3×LogGGT(IU/L)+b4×LogA2m(g/L)+b5×年龄(岁)+b6×性别(女性为0，男性为1)。

其中

-0.6≤b1≤0.8

-1.0≤b2≤1.1

-1.4≤b3≤1.5

-2.6≤b4≤2.7

-0.05≤b5≤0.07

-0.8≤b6≤1.1

特别地，函数可以是(近似小数点后第五位)：

C1-a＝0.67930×ApoA1(g/L)-1.02404×Log触珠蛋白(g/L)+1.46545×LogGGT(IU/L)+2.65740×LogA2m(g/L)+0.06346×年龄(岁)+0.97350×性别(女性为0，男性为1)。

C1-b＝0.67930×ApoA1(g/L)-1.05404×Log触珠蛋白(g/L)+1.46545×LogGGT(IU/L)+2.65740×LogA2m(g/L)+0.06346×年龄(岁)+0.97350×性别(女性为0，男性为1)。

这些函数对于确定10年后患肝癌的风险特别有用。

另一个函数是

C2＝c1×Log AFP(μg/L)-c2×ApoA1(g/L)-c3×Log触珠蛋白(g/L)+c4LogGGT(IU/L)+c5×LogA2m(g/L)+c6×年龄(岁)+c7×性别(女性为0，男性为1)。

其中

-0.8≤c1≤1.0

-0.7≤c2≤0.9

-0.5≤c3≤0.7

-1.1≤c4≤1.3

-1.4≤c5≤1.5

-0.06≤c6≤0.08

-0.4≤c7≤0.6

特别地，函数可以是(近似小数点后第五位)：

C2＝0.88166×Log AFP(μg/L)-0.82480×ApoA1(g/L)-0.62809×Log触珠蛋白(g/L)+1.20973LogGGT(IU/L)+1.42462×LogA2m(g/L)+0.07235×年龄(岁)+0.53213×性别(女性为0，男性为1)。

评价5年肝癌风险的特别感兴趣的另一个函数是：

C3＝d1×Log AFP(μg/L)-d2×ApoA1(g/L)-d3×Log触珠蛋白(g/L)+d4LogGGT(IU/L)+d5×LogA2m(g/L)+d6×年龄(岁)+d7×性别(女性为0，男性为1)。

其中

-0.6≤c1≤0.8

-1.0≤c2≤1.2

-0.7≤c3≤0.9

-1.1≤c4≤1.3

-1.3≤c5≤1.5

-0.06≤c6≤0.09

-0.2≤c7≤0.4

特别地，函数可以是(近似到小数点后第五位)：

C3＝0.68030×Log AFP(μg/L)-1.13208×ApoA1(g/L)-0.82013×Log触珠蛋白(g/L)+1.20152LogGGT(IU/L)+1.39771×LogA2m(g/L)+0.07582×年龄(岁)+0.31238×性别(女性为0，男性为1)。

该函数可以如下使用：

通过本领域中已知的任何方法(WO 02/16949中的式f5；瞬时弹性成像，如/>)确定患者中硬化的存在。

如果患者患有硬化，则其已经有原发性肝癌的风险，医生应根据当前的标准方法(通常每6个月进行影像学、AFP剂量)监测该风险。也可以使用其他方法来监测肝癌的出现。

如果患者没有任何硬化标记物，则应进行C1-a或C1-b。如果由于这些公式高的负预测值，结果低于中位数(约0.039)，则无论情况如何，均应仅对患者进行肝脏疾病的治疗。如果结果高于或等于中位数(约0.039)，则应进行C3。

如果由于这些公式高的负预测值，C3的值低于中位数(约0.026)，则无论情况怎样，均应仅对患者进行其肝脏疾病的治疗。也可以在随访中定期进行Fibrotest(或Fibroscan)、C1-a、C1-b和C3(如果需要)。如果结果高于或等于中位数，则应视为患者已患有硬化，医生应根据可用方法(通常每6个月进行影像学、AFP剂量)监测原发性肝癌。

尽管本申请公开了可以在本文提出的方法中使用的函数，但是本发明还涉及用于获得函数的方法，所述函数可以帮助医师确定患者(特别是患有慢性肝脏疾病的患者)是否处于发展为原发性肝癌的风险，其中所述逻辑函数组合了所述患者血清中生化标记物的浓度值。因此，根据本领域技术人员选择的标记物，可以获得除本文公开的函数以外的其他函数。

现有技术已经描述了可以通过逻辑回归获得函数的不同方法，其最终值指示肝纤维化程度。特别地，可以引用WO 2002/016949，以及WO 2002/016949中首先描述的方法的不同方面：WO 2010/149767、WO 2006/10357、WO 2006/082522、WO 2003/073822、WO 2011/039321、WO 2005/116901、WO 2010/058295和WO 2010/097472。

在当前情况下，通过以下公开的方法获得的函数的最终值指示患者患有原发性肝癌的风险。

因此，本发明涉及一种获得函数的方法，所述函数可以帮助医师确定患者(特别是患有慢性肝脏疾病的患者)在给定的时间段后是否具有发展为原发性肝癌的风险，其中所述函数组合了所述患者血液/血清或血浆中生化标记物的浓度值以及可选地年龄、性别和BMI，所述方法包括以下步骤：

a)根据给定时间段后是否存在原发性肝癌将一组患者分为两组；

b)通过一维分析鉴定已在给定时间段开始时在患者中测量了其值的生化标记物中，在发生癌症的患者组与没有发生癌症的患者组之间显著不同的生化标记物；

c)对于原发性肝癌的发生，进行逻辑回归分析以评价在步骤b)中鉴定的这些标记物的独立可区分值；

d)通过组合这些鉴定的独立因子获得函数。

因此，在另一个实施方案中，本发明涉及一种获得函数的方法，所述函数可以帮助医师确定患者(特别是患有慢性肝脏疾病的患者)是否处于发展成原发性肝癌的风险，其中所述函数组合了所述患者的血液/血清或血浆中的生化标记物的浓度值以及任选地年龄、性别和BMI，所述方法包括以下步骤：

a)根据患者中是否存在原发性肝癌将一组患者分为两组；

b)通过一维分析鉴定已在患者中测量了其值的生化标记物中，在患有原发性肝癌的患者组与没有患有原发性肝癌的患者组之间显著不同的生化标记物；

d)通过组合这些鉴定的独立因子获得函数。

此方法与之前公开的方法不同，此处的函数是针对同期肝癌设计的，而之前的函数是针对在给定时间段内出现原发性肝癌设计的。

对于这两种方法，都可以通过经典的统计学方法确定可将患者分类为风险类别的阈值。

如实施例所示，已经在第二种方法的基础上设计了本文所公开的函数(使用同期癌症)，并且已经证明其可预测未来发展为癌症的风险。因此，这种测试是可预测的事实是出乎意料的，因为即使能够预期该函数将指示同期存在的肝癌，但也无法预期该函数将能够预测未来发生的肝癌(进行测试后一年以上)。

优选步骤b)的生化标记物选自α2-巨球蛋白(A2M)、GGT(γ谷氨酰转肽酶)、触珠蛋白、载脂蛋白A1(apoA-1)、胆红素、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯、总胆固醇、空腹血糖、γ-球蛋白、白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、IL10、TGF-β1、apoA2、apoB、细胞角蛋白18、血小板数、凝血酶原水平、透明质酸、尿素、N-端III型原胶原蛋白、1型组织抑制剂金属蛋白酶(TIMP-1)、IV型胶原蛋白(Coll IV)、骨保护素、miRNA122、细胞角蛋白18、血清淀粉样蛋白A(SAA)、α-1-抗胰蛋白酶(同种型1)、果糖二磷酸醛缩酶A、果糖二磷酸醛缩酶B、富马酰乙酰乙酸酶、运甲状腺素蛋白、PR02275、C反应蛋白(同种型1)、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A11、DNA指导的RNA聚合酶I亚基RPA1、遮蔽蛋白(同种型1)、α骨骼肌肌动蛋白、主动脉平滑肌肌动蛋白、碱性磷酸酶、未鉴定的蛋白C22orf30(同种型4)、血清淀粉样蛋白A2(同种型a)、载脂蛋白C-III、载脂蛋白E、载脂蛋白A-II、聚合免疫球蛋白受体、von Willebrand因子、氨基酰化酶-1、G蛋白偶联受体98(同种型1)、对氧磷酶/芳基酯酶1、补体成分C7、血液结合素、补体C1q亚成分、对氧磷酶/内酰胺酶3、补体C2(片段)、多能蛋白聚糖核心蛋白(同种型Vint)、细胞外基质蛋白1(同种型1)、E3SUMO-蛋白连接酶RanBP2、触珠蛋白相关蛋白(同种型1)、脂联素、视黄醇结合蛋白、铜蓝蛋白、α2抗纤溶酶、抗凝血酶、甲状腺素结合蛋白、蛋白C、α2脂蛋白、四连蛋白、岩藻糖基化的A2M、岩藻糖基化的触珠蛋白、岩藻糖基化的apoA1和碳水化合物不足转铁蛋白。

优选步骤b)的生化标记物选自下组：α2-巨球蛋白(A2M)、GGT(γ谷氨酰转肽酶)、触珠蛋白、载脂蛋白A-1(apoA1)、胆红素、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯、总胆固醇、空腹葡萄糖、细胞角蛋白18、血小板数、凝血酶原水平、透明质酸、淀粉样蛋白A(SAA)、血液结合素和碳水化合物不足转铁蛋白。该组还包含蛋白质的岩藻糖基化形式，尤其是岩藻糖基化的A2M、岩藻糖基化的触珠蛋白、岩藻糖基化的apoA1。

也可以使用至少一种肝癌标记物用于获得函数，例如甲胎蛋白(AFP)、岩藻糖基化的AFP、HSP27(热休克蛋白)、HSP70、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)，尤其是SCCA-IgM IC(一种由SCCA和IgM组成的循环免疫复合物)、高尔基体蛋白73(GP73)、α-L-岩藻糖苷酶(AFU)、Des-γ-羧基凝血酶原(DCP或PIVKA)、骨桥蛋白(OPN)或人羰基还原酶。

尽管可以在所述方法中使用的标记物的数量没有上限，但是优选的是选择至少或恰好两个、至少或恰好三个、至少或恰好四个、至少或恰好五个或至少或恰好六个这些标记物。

然而，优选使用相对少量的标记物，以减少进行预后方法的成本(降低血液分析的成本)。因此，优选使用三个、四个或五个标记物。

函数能可以进一步包括至少一个选自患者的性别、年龄和BMI的其他变量。也可以使用空腹血糖水平。但是，人们更愿意使用性别和年龄，因为这些很容易确定，而BMI或空腹血糖可能存在一些差异(患者可能无法提供正确的体重或在采血前已进食)。

在另一个实施方案中，可以获得函数，所述函数组合了所述患者的血液/血清或血浆中的生化标记物的浓度值以及任选地年龄、性别和BMI，所述方法包括以下步骤：

a)在给定的时间段后，根据患者中是否存在原发性肝癌将一组患者中的患者分为两组；

b)提供

i.在给定的时间段开始时从患者获得的指数(或分数)，其中如上所述的指数方法获得第一函数，其将所述患者血液/血清或血浆中的生化标记物的浓度值与任选的年龄、性别和BMI组合，其中生化标记物优选不包含原发性肝癌标记物；

ii.在给定的时间段开始时的原发性肝癌标记物水平的值；

c)针对原发性肝癌的发生，进行逻辑回归分析以评价步骤b)的变量i.和ii.的独立可区分值；

d)通过组合这些变量获得函数。

或者，可以获得函数，所述函数组合了所述患者的血液/血清或血浆中的生化标记物的浓度值以及任选地年龄、性别和BMI，所述方法包括以下步骤：

a)根据患者中是否存在原发性肝癌将一组患者中的患者分为两组；

b)提供

i.从患者获得的指数(或分数)，其中如上所述的指数方法获得第一函数，其将所述患者血液/血清或血浆中的生化标记物的浓度值与任选的年龄、性别和BMI组合，其中生化标记物优选不包含原发性肝癌标记物；

ii.原发性肝癌标记物水平的值；

d)通过组合这些变量获得函数。

优选用于获得b)i.中使用的函数的生化标记物选自下组：α2-巨球蛋白(A2M)、GGT(γ谷氨酰转肽酶)、触珠蛋白、载脂蛋白A-1(apoA1)、胆红素、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯、总胆固醇、空腹葡萄糖、γ-球蛋白、白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、IL10、TGF-β1、apoA2、apoB、细胞角蛋白18、血小板数、凝血酶原水平、透明质酸、尿素、N-端III型原胶原蛋白、1型组织抑制剂金属蛋白酶(TIMP-1)、IV型胶原蛋白(Coll IV)、骨保护素、miRNA122、细胞角蛋白18、血清淀粉样蛋白A(SAA)、α-1-抗胰蛋白酶(同种型1)、果糖二磷酸醛缩酶A、果糖二磷酸醛缩酶B、富马酰乙酰乙酸酶、运甲状腺素蛋白、PR02275、C反应蛋白(同种型1)、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A11、DNA指导的RNA聚合酶I亚基RPA1、遮蔽蛋白(同种型1)、α骨骼肌肌动蛋白、主动脉平滑肌肌动蛋白、碱性磷酸酶、未鉴定的蛋白C22orf30(同种型4)、血清淀粉样蛋白A2(同种型a)、载脂蛋白C-III、载脂蛋白E、载脂蛋白A-II、聚合免疫球蛋白受体、von Willebrand因子、氨基酰化酶-1、G蛋白偶联受体98(同种型1)、对氧磷酶/芳基酯酶1、补体成分C7、血液结合素、补体C1q亚成分、对氧磷酶/内酰胺酶3、补体C2(片段)、多能蛋白聚糖核心蛋白(同种型Vint)、细胞外基质蛋白1(同种型1)、E3SUMO-蛋白连接酶RanBP2、触珠蛋白相关蛋白(同种型1)、脂联素、视黄醇结合蛋白、铜蓝蛋白、α2抗纤溶酶、抗凝血酶、甲状腺素结合蛋白、蛋白C、α2脂蛋白、四连蛋白、岩藻糖基化的A2M、岩藻糖基化的触珠蛋白、岩藻糖基化的apoA1和碳水化合物不足转铁蛋白，更优选地选自下组：α2-巨球蛋白(A2M)、GGT(γ谷氨酰转肽酶)、触珠蛋白、载脂蛋白A-1(apoA1)、胆红素、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯、总胆固醇、空腹葡萄糖、细胞角蛋白18、血小板数、凝血酶原水平、透明质酸、淀粉样蛋白A(SAA)、血液结合素和碳水化合物不足转铁蛋白。该组还包含蛋白质的岩藻糖基化形式，特别是岩藻糖基化的A2M、岩藻糖基化的触珠蛋白、岩藻糖基化的apoA1。

至少一种b)ii.的肝癌标记物优选选自甲胎蛋白(AFP)、岩藻糖基化的AFP、HSP27(热休克蛋白)、HSP70、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)，尤其是SCCA-IgMIC(一种由SCCA和IgM组成的循环免疫复合物)、高尔基体蛋白73(GP73)、α-L-岩藻糖苷酶(AFU)、Desγv-羧基凝血酶原(DCP或PIVKA)、骨桥蛋白(OPN)或人羰基还原酶。

在上述方法中，患者组应包含足够高的患者数量，以确保稳健的统计学分析。因此，其将包含至少50名患者、更优选至少100名患者、或优选至少250名患者、更优选至少500名患者。

在上述方法中，使用在步骤c)中计算的系数进行步骤d)的组合，这取决于在步骤c)中鉴定的可区分值。可以进行其他步骤，例如函数的归一化以将最终结果保持在两个选定的边界内。

因此，本文公开的方法利用不同变量值的离体组合，以获得指示原发性肝癌发生风险的最终结果。因此，将排除对患者的人体施加的任何步骤。在本文公开的方法中，应理解，测量其值并作为变量用于函数中的标记物是存在于患者的血液、血浆或血清中的循环蛋白质或天然成分。所选标记物的值应根据本领域已知的方法在先前采集的血液、血浆或血清样品上进行测量。该值以根据本领域的单位表示。但是，如果本领域技术人员选择其他单位来表示测量值，则这将仅仅改变逻辑函数内的系数。因此该方法将仍然适用。

但是，在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于预后患者(特别是患有慢性肝脏疾病的患者)发生原发性肝癌的方法，该方法包括以下步骤：从患者采集血液、血浆或血清，测量采集的样品中存在的标记物的值，和通过上述函数组合测量的值。标记物如上所公开。

如本文所公开的方法和函数可以用于确定患者在其慢性肝脏疾病的随访期间发展为PLC(原发性肝癌)的个体风险。因此，其通常在患者已经患有慢性肝脏疾病时使用。还可以在常规随访期间使用，以便为医师提供帮助，来决定开始通过影像学进行监测、或者通过通常仅针对慢性丙型肝炎严重阶段进行昂贵的抗病毒药对患者进行早期治疗。

本发明还涉及一种用于预后患者患有原发性肝癌的风险的装置，其包括第一装置，其中所述第一装置通过函数将患者血清或血浆中存在的标记物测量的值(以及任选地年龄和性别)进行组合，来提供指数。

该装置中待实施的函数和标记物是本说明书中公开的函数和标记物。如本文所公开的，该装置优选地可以使用函数F1(特别是上面公开的F1-a或F-1b)来获得指数。

在另一个实施方案中，该装置可以使用函数F2(特别是上面公开的F2a)来获得指数。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种包括计算机算法的微处理器，该计算机算法执行确定患者患有原发性肝癌的风险的方法：提供患者的血液标记物的值以及可选地提供年龄和患者性别所指定的值；和执行数学函数(如上所述或如上所述获得)以组合这些值以获得可用于预后患者发生原发性肝癌风险的评分。

本发明还涉及函数、装置和/或微处理器的用途，以便通过使用函数并将结果与预定阈值进行比较以确定患者是否存在原发性肝癌，从而对患者中原发性肝癌的存在进行诊断。

利用该函数的结果，医师将能够根据患者患肝癌的风险向患者提出个体化的随访。

如果患者为F2或F3(METAVIR分类)并且测试分数低于0.25，通常将在3至4年后再次诊视患者，然后将再次进行新的测试(Fibrotest，肝癌测试)。

如果患者为F4(METAVIR，表明存在硬化)且分数<0.25，则将进行常规随访(每3至6个月)。

如果分数>＝0.25，则具有患肝癌的风险。因此将提出基于影像学的监测(由医师确定间隔)，以便早期检测到癌症发生，并早期治疗以限制复发、死亡和发病的风险。可以对较高风险的人建议影像学，以避免使临床检查的附加值降低(避免产生大量阴性结果而很少获得阳性结果)。只有通过对患者进行风险类别的分类，才可以增加被检出的阳性病例的比例。还应注意，医师可以决定定期向风险类别中分数接近0.25(例如0.25和0.50之间的分数)的人建议进行新的血液检查，并且只有在分数高于0.50(此数字仅作为举例，实际数字由医师选择)时才开始影像学。

还应注意，本文提供的阈值仅用于本申请中详细公开的函数，并且其他阈值将用于其他函数。

本发明还涉及一种随访患者的方法，以确定患有(优选慢性)肝脏疾病的患者中原发性肝癌的发生，该方法包括以下步骤：

(1)任选地确定患者是否患有硬化(这可以通过本领域中的任何可用的测试来完成，例如)；

(2a)如果患者患有硬化，则进行监测(影像学和AFP剂量或HR2c剂量或本文开发的函数，其包含本文公开的生化标记物和至少癌症标记物)；

(2b)如果患者没有硬化，则进行HR1c(或本文开发的函数，其包含本文公开的生化标记物，但不包含癌症标记物)；

(3a)如果HR1c的值低于中位数，则不进行其他特定的监测、定期随访和/或治疗患者的肝脏疾病；

(3b)如果HR1c的值高于或等于中位数，则按上述进行监测；

(4a)如果影像学数据正常并且AFP值(如果测量了)正常，或者HR2c的值(如果测量了)低于中位数，则不进行其他特定的监测、定期随访和/或治疗患者的肝脏疾病，大约六个月后进行新的监测，

(4b)存在以下至少一种情况

i)影像学不正常，或

ii)AFP值(如果测量了)不正常，或

iii)HR2c的值高于或等于中位数，

然后对HCC或CC诊断和治疗进行广泛调查。

因此，本发明还涉及一种治疗有此需要的患者的方法，包括以下步骤：

1.进行本文公开的方法以鉴定患者是否患有原发性肝癌，或是否具有发展为原发性肝癌的高风险，和

2.根据原发性肝癌的存在或发展为原发性肝癌的风险，对有此需要的患者应用治疗方案。

步骤2)的治疗方案可以是以下一种或组合：

-进行手术或非手术方法(射频、动脉内化学栓塞...)以从肝脏除去癌性肿块，

-向患者提供抗肿瘤药物，

-进行影像学，

-制定患者随的访时间表，

-提供对慢性肝脏疾病的非常早期的治疗，例如在CHC(慢性丙型肝炎)、CHB(慢性乙型肝炎)或NAFLD治疗中的直接抗病毒剂。

总而言之，本发明的方法提供了易于使用的血液测试，使得可以鉴定罹患肝癌的高风险患者，从而他们可以使用能够定位非常小的癌症的最新影像学技术。

以下实施例旨在描述本发明的一个方面，但不应限制本发明。

附图说明

图1：通过函数F1-a(HR1V4)和Fibrotest(FTfirst)(在WO 02/16949中公开为f5)以检测同期原发性肝癌的比较AUROC(接收工作曲线下面积)。

图2：通过函数F2-a(HR2V4cont)、Fibrotest(FTfirst)和甲胎蛋白以检测同期原发性肝癌的比较AUROC(接收工作曲线下面积)。

图3：代表随时间的无癌症的患者的百分比，根据使用f2-a函数获得的分数对患者分类。表示了95％置信区间。0-0.25：分数低于0.25的患者；0.25-1：分数高于或等于0.25的患者。

图4：代表随时间的无癌症的患者的百分比，根据使用f2-a函数获得的分数对患者分类。表示了95％置信区间。HR2 25：分数低于0.25的患者；HR2 2575：分数高于或等于0.25且低于0.75的患者；HR2 75：分数高于或等于0.75的患者。

图5：代表随时间的无癌症的患者的百分比，根据使用f1-a函数和AFP水平的独立测量而获得的分数对患者分类。表示了95％置信区间。AFP10HR1 25：分数低于0.25且AFP水平低于10μg/L的患者；AFp1020HR1 2575：分数高于或等于0.25且低于0.75，且AFP水平在10至20μg/L之间的患者；AFP20HR1 75：分数高于或等于0.75或AFP水平高于20μg/L的患者。

图6：代表随时间的无癌症的患者的百分比，根据使用f1-b函数获得的分数对患者分类(四个类别)。表示了95％置信区间。0-0.25：分数低于0.25的患者；0.25-0.5：分数高于或等于0.25且低于0.5的患者；0.5-0.75：分数高于或等于0.5且低于0.75的患者；0.75-1：分数高于或等于0.75的患者。

图7：对患者状态的随访和分析的说明。A.当前程序。B.使用函数HR1c建议的程序，以将更多患者纳入癌症监测(影像学和(AFP或HR2c评价)。

实施例

实施例描述了完全是本发明一部分的实施方案。

实施例1.方法

在9925名患有慢性肝脏疾病的患者组(称为预先纳入(pre-inclusion)群)中获得函数，所有患者接受FibroTest测量(Fibrotest如WO 2002/016949中公开)。由于Fibrotest公式为4.467×Log(α2巨球蛋白(g/l))-1.357×Log(触珠蛋白(g/l))+1.017×Log(GGT(IU/l))+0.0281×年龄(岁)+1.737×Log(胆红素(μmol/l))-1.184×ApoA1(g/l)+0.301x性别(女性＝0,男性＝1)-5.540，这确保了测量的α2巨球蛋白、触珠蛋白、GGT、年龄(进行Fibrotest时)、胆红素、ApoA1水平和性别都可获得。此外，只有在以前没有肝移植并且没有PLC史的情况下，就将患者预先纳入在内。

根据活检，或者如果没有活检，则根据巴塞罗那标准或死亡证明将原发性肝癌定义为肝细胞癌(HCC)或胆管癌(CC)。

在构成群体(称为P0群体)中，如说明书中所述，使用α2巨球蛋白、触珠蛋白、GGT、年龄(在进行Fibrotest测量时)、胆红素、ApoA1和性别，通过逻辑回归获得了各种数学函数，例如f1-a、f1-b和f2-a。仅考虑同期PLC。使用针对同期PLC诊断的AUROC来评价函数的性能。

使用AUROC和Cox模型在第二群体P1(称为纵向验证群体)中评价了测试的预后值，该第二群体的患者在基线测试后至少一年未发展为PLC。这确保了分析不受同期肝癌的偏倚，并且分数是发生原发性肝癌的良好预后分数。

使用一个内部验证群体(称为P2群体)，其是P1的一个亚群，进行至少2次重复测试(两次生化标记物的重复测量)，以评价患者内的变异性。

共有9700名患者被包括在P0，其中

-33.9％的慢性丙型肝炎(CHC)，

-20.5％的慢性乙型肝炎(CHB)，

-10.8％的非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)，

-4.8％酒精性肝脏疾病(ALD)，

-30.0％混合或其他原因。

P0中存在134例同期PLC(129例肝细胞癌，5例胆管癌)。

共有9791名患者包括在P1中，其中在15年内观察到，存在225例发生的PLC(216例肝细胞癌，9例胆管癌)。结合考虑在这个时间段内失去的患者，可以计算出15年无PLC的生存率(SwC)＝90％(95％CI：88-92)。

P2中总共包括1,773名患者(58例发生了PLC，其中在(7.2(5.8-6.2)年后至少2次重复测试)，得到15年SwC 81％(95％CI 72-91))。

实施例2.函数的评估

确定函数的诊断能力

在P0中，HR测试(HR-Test)的AUROC＝0.915(0.889-0.936)，该HR测试是三种蛋白质、一种肝功能测试、年龄和性别的组合，如fl-a所示。

在P1中，HR测试检索到显著的AUROC＝0.828(0.803-0.850)，而在P2的配对病例中：＝0.812(CI 0.772-0.846)。

如图所示的其他数据–函数预后能力的确定

从图1中可以看出，使用相同标记物进行的血液测试(HR1V4)比Fibrotest测试(实际上使用较少的生化标记物)对于检测原发性肝癌(同期肝癌)的存在更灵敏且更特异，更高的AUROC证明了这一点。

图2显示，使用Fibrotest中使用的纤维化标记物和AFP(肝癌标记物)进行的血液测试，比这两种测试检测原发性肝癌(同期肝癌)的存在更灵敏且更特异，更高的AUROC证明了这一点。与FibroTest相比，AFP更特异，但灵敏度更低。

图2显示了根据f1-a函数的分数分类的两个类别的患者，随时间的没有原发性肝癌的生存率。可以清楚地看到，低于0.25的分数指示在5、10或15年内罹患原发性肝癌的风险很小，而对于分数等于或高于0.25的患者，随着时间的推移(最快在测试后一年)该风险增加。

在图3中，使用了组合纤维化标记物和癌症标记物的测试(f2-a)将患者分为三个类别。这三类之间存在明显差异，在测试时分数高于0.75的患者在接下来的15年中患肝癌的风险明显增加(在15年时绝对风险为50％)。

在图5中，使用了f1-a测试和独立的AFP测量测试，并且根据这两种测试中每种测试的结果将患者分类。该图表明，这两种测试可以一起使用，以获得随着时间推移患者患原发性肝癌的风险。这可以用于鉴定新的肝癌标记物。

在图6中，根据f1-b的分数，确定了四类经过重复测试的患者。可以再次看出，分数低于0.25的患者在接下来的25年中罹患癌症的风险很小。

总之，这些图表明，本文公开的方法、函数、测试和分数比现有的血液测试对检测同期肝癌更敏感且更特异。其还可以预测患者随时间患原发性肝癌的风险。此外，这些测试是定量的，结果增加指示风险增加。这些测试、函数和分数可以单独使用，也可以与现有的肝癌测试一起使用。它们进一步提高了这些测试的质量。

实施例3.开发Cox函数

对一个正在进行的组所前瞻性收集的标本进行了回顾性分析。为了设计早期敏感的高风险测试(HR1c-测试)，将肝保护性蛋白(载脂蛋白A1、触珠蛋白)与已知的风险因子(性别、年龄、γ-谷氨酰转肽酶)、和肝纤维化标记物(α2-巨球蛋白)在Cow模型中组合。然后，为了增加特异性，将这些组分与甲胎蛋白(肝癌的直接标记物)组合(HR2c-测试)。主要终点是通过HR1预测10年的肝癌，并在5年时HR2比甲胎蛋白具有更高的性能。

结果。包括9,892例患者，其中85.9％无硬化，随访中位数为5.9年[IQR；4.3-9.4]。221名患者患上了肝癌。在4,944例随机病例构建亚组中，HR1预测癌症的时间依赖性ROC曲线下面积(AUROC-T)为0.874(95％置信区间[CI]，0.838至0.910)，在4,948例验证亚组中没有差异，为0.815(0.769-0.862；P＝0.98)。在整合的数据库中(n＝4,053)，HR2的AUROC-T为0.870(0.834-0.905)，其高于单独的AFP，0.718(0.664-0.772；P<0.001)。组合硬化-HR1-HR2的算法的阴性预测值为99.0％，10例需要调查。

结论在患有慢性肝脏疾病的患者中，HR1c和HR2c测试鉴定出罹患肝癌的高风险人群，包括那些没有硬化的人群。

原发性肝癌(PLC)是第二大最常见的与癌症相关的死亡原因，主要发生在具有慢性肝脏疾病的患者中。能够区分这些患者中PLC的高风险人群与PLC的低风险人群是非常重要的。大多数已公布的PLC风险分数都将组织学上的硬化作为主要组分，而这受活检的不良事件和成本的限制。纤维化的非侵入性测试的开发可以改善对大量人群患癌风险的预测。

1997年，建立了纤维化血液测试(美国FibroSure)，并已在慢性丙型肝炎(CHC)和乙型肝炎(CHB)、酒精性肝脏疾病(ALD)和非酒精性脂肪肝脏疾病(NAFLD)中得到验证，具有相似的预后值。因此，在构建新的测试来预测有风险的候选监测对象时，FibroTest可以代替活检以确定是否存在硬化。

目的是构建一种“高风险”的个体化血液测试(HR1，申请待决中)，以测量患有肝脏疾病患者中(无或有硬化)10年的PLC风险。使用六种组分：apoA1和触珠蛋白作为肝保护性标记物，GGT作为细胞毒性因子标记物，考虑到纤维化的严重程度对A2M进行了调整，以及年龄和性别。HR1c可以作为肝癌风险的非常早期标记物(HR1c)，其目的是将迄今为止仅限于硬化患者的影像学监测范围潜在扩展到具有高癌症风险的非硬化患者。

第二个目的是获得组合了HR1c的六种组分与甲胎蛋白(AFP)的癌症早期标记物(HR2c)，以预测5年的癌症。如果HR2c比单独的AFP具有更好的性能(更好的灵敏度)，则可将其用于HR1c升高的非硬化患者和硬化患者。

第三个目的是，在没有或患有硬化的所有患者中，与限于患有硬化患者的标准监测(影像学和AFP)相比，对组合HR1c和HR2c用于进行监测的效率进行评价。

对于构建和内部验证，患者来自1997年组织的项目FIBROFRANCE的"GroupeHospitaller Pitiécohort"(临床注册号：NCT01927133)。该方案已获得机构审查委员会、监管机构的批准，并按照《良好临床实践》的原则执行。所有患者在加入前均提供书面知情同意书。所有作者均可访问研究数据，并审核和批准最终手稿。

选择2013年之前进行FibroTest的患者，其之前没有PLC或肝移植。根据最新指南安排了随访和肝炎治疗。对于纳入的硬化患者，建议每6个月进行一次超声波(US)检查和AFP。PLC的诊断基于经验丰富的病理学家的组织学检查或概率性非侵入性标准。确定PLC的诊断后，使用多学科方法决定治疗方案。三位资深肝脏疾病专家(TP、YN和MM)再次审查了显示局灶性肝脏病变的影像学技术报告，并根据Milan标准进行了分类。

保留率定义为通过FibroTest或弹性成像进行第二次纤维化阶段评估的患者数量。通过邮件、致电患者或他的私人医生以及国家死亡登记***(INSERM-CépiDC)来跟踪失去随访患者的结果。

统计学分析

将包括的患者随机分为构建和内部验证亚组，并对其应用模型结果。

HR1和HR2的构建和验证

采用Kaplan-Meier方法评估了无PLC发生的患者的累积生存期。在使用标定的Schoenfeld残差检查变量确认了比例风险假设之后，使用单变量和多变量Cox比例风险模型评估组分的性能。

PLC风险评估是纳入时基于Cox模型的预测分数。通过以下等式在构建的亚组中估算了预计的PLC风险：其中S₀是包含无PLC的概率，β为Cox回归系数，x各风险因子值，xi为构建组中风险因子的平均值。对于10年的HR1c，该模型构建了可预测非常早期的PLC风险；对于5年的HR2c，则可预测5年的PLC发生。200个事件的样本量对应于建议。通过时间依赖性ROC曲线下面积(AUROCt)来表达和比较性能。

第一个目的是为HR1c的构建亚组获得显著的预后性能，AUROCt>0.5，而在验证亚组中无显著差异。通过Logrank检验，比较了低风险(定义为HR1低于或高于中位数的值)患者的无PLC生存与高风险患者的生存。

第二个目的是在整合的数据库中获得比单独的AFP性能更好的HR2c(AUROCt)，在检查其AUROCt没有差异后，组合构建亚组和验证亚组。

第三个目的是评估在没有或有硬化的所有患者中组合HR1c和HR2c进行监测的效率。为了考虑其利弊，我们使用以下“F4-或-HR1c-之后-癌症监测”算法计算了在监测中筛选一个PLC所需的受试者数(NNS)：

[如果有硬化，则进行监测(影像学+(HR2c或AFP剂量))；如果无硬化，且HR1c高(≥中位数)，则进行HR2c，如果HR2c高(≥中位数)，则进行监测(影像学+HR2c或AFP剂量)]。该算法如图7B所示。

换句话说，患有硬化的患者(例如，通过或其他方法所确定，例如)应进行癌症监测(影像学+HR2c或AFP剂量)。

对于没有硬化的患者，将进行HR1c。如果HR1c的值高于中位数，则患者应进行癌症监测(影像学+HR2c或AFP剂量)。

实际上，HR1c公式可以将更多患者(一些无硬化的患者，其HR1c值≥中位数)包括在癌症监测方案中。

当前的癌症监测方案包括每6个月进行影像学和对AFP水平测量，除非其中一个值不正常，则之后需要进行广泛调查。

对于具有PLC风险的患者(硬化患者和HR1c值≥中位数的患者)，仍可以执行此当前方案。

但是，除了影像学之外还进行HR2c测试，而不是单独的AFP剂量，是有利的。实际上，HR2c测试组合了HR1c值+AFP的值，并被证明比单独的AFP更有效。

因此，建议将有风险的患者的癌症监测方案改为每6个月进行影像学和HR2c计算，除非影像学不正常或HR2c高于平均值，则之后需要进行广泛的研究。

总之，本文公开的公式使得有可能：1)通过HR1c公式增加处于原发性肝癌风险监测中的人数(从而提高灵敏度)，以及2)通过HR2c公式改善癌症监测的质量。

还应当注意，可以使用本文描述或教导的其他公式代替HR1c和HR2c。用于将患者纳入“风险”群体中的公式是不包含肝癌标记物的公式(例如上面公开的F1、F1-a、F1-b或C1函数)，而用于癌症监测的公式包含肝癌标记物，例如AFP(以及F2、C2和C3函数以及其他函数，例如可以使用本说明书的教导开发的函数)。

比较对象是限于硬化患者的标准监测(影像学+AFP)。NNS限于50岁或50岁以上的患者，评估了已知的PLC危险因子以提高效率。

为了评估校准，通过Hare方法(https://CRAN.R-project.org/package＝rms)，将研究期间观察到的发生PLC的风险相对于预测的风险进行作图。

灵敏度分析

如标准FibroTest截止值0.74所定义，根据纳入时是否存在硬化，在整合的数据库中评估和比较了HR1c和HR2c的AUROCt。为了防止FibroTest分层(与HR1c和HR2c共享组分)对共线性的任何影响，使用了三种其他的硬化定义；单独的弹性>12.5k-Pascal，单独的活检或这两种方法中的至少一种。

在纳入PLC的患者以及重复进行HR1c-HR2c测量的患者中，评估了患者特征的影响，这种影响可以通过谱效应人为地改变AUROC。一种分析(Cox模型)评估了哪些特征独立地与发生PLC相关，另一种分析(逻辑回归)评估了与硬化相关的那些特征。为了使随访期间适用于不同肝脏疾病的反应标准(慢性病毒抑制、糖尿病治疗、体重或酒精摄入)均匀化，ALT氨基转移酶被用作坏死性炎症活动的间接标记物，没有共线性风险，因为ALT不是FibroTest组分。HR1c的显著改善定义为在纳入与重复HR1c之间减少了至少四分之一。使用逻辑回归评估了与改善相关的因子的单变量和多变量分析。

在检查了HR1c的四分位范围截止值的可区分性能后，将3个外部群体中的这些截止值用来估计4种PLC风险水平的患病率，IQR-1＝极低，IQR-2＝低，IQR-3＝适度，IQR-4＝高。一个群体包括7,554名健康志愿者，一个群体包括133,055名美国高风险NAFLD患者，一个群体包括728,051名美国高风险CHC患者。

所有统计学分析均使用NCSS-12.0和R软件(包括timeROC库)进行。

结果

在10481名连续纳入的患者中，排除了453名。组保留率为62.8％(10,481个中的6581)。总共包括了10,028名患者，随机分配为构建(n＝5,014)或验证(n＝5,014)亚组。随机分的亚组之间的患者特征相似。慢性肝脏疾病最常见的独特原因是CHC(34.3％)和CHB(20.5％)。在随访期间，几乎所有CHB病例(97.0％)和46.9％的CHC达到了病毒抑制。在没有同期PLC的群体中(n＝9892)，随访中位数5.9年[IQR；4.3-9.4]后，有221名患者被诊断为PLC。总体上，有138例(74.3％)检测的PLC潜在可切除，并且有166名(75.5％)患者符合米兰的移植标准。在构建亚组和验证亚组之间，PLC特征没有显著差异。HR2c群体(n＝4,053)比HR1c群体有更多的硬化和更多的PLC，这是由于通过AFP监测了硬化。

HR1c和HR2c的构建和验证

验证了这六个组分的比例危害假设，对于10年的随访校准图是可以接受的。

HR2c对应于C3＝0.68030×Log AFP(μg/L)-1.13208×ApoA1(g/L)-0.82013×Log触珠蛋白(g/L)+1.20152LogGGT(IU/L)+1.39771×LogA2m(g/L)+0.07582×年龄(岁)+0.31238×性别(女性为0，男性为1)。

HR1c对应于C1-b＝0.67930×ApoA1(g/L)-1.05404×Log触珠蛋白(g/L)+1.46545×LogGGT(IU/L)+2.65740×LogA2m(g/L)+0.06346×年龄(岁)+0.97350×性别(女性为0，男性为1)。

第一目的

在构建亚组中，HR1c的AUROCt为0.874(0.838-0.910)，在验证亚组中，为0.815(0.769-0.862)，主要终点无显著性差异(P＝0.06)。在构建亚组中，2528名HR1c<中位数(0.039)的患者中，只有10名患者具有PLC，代表无PLC的10年生存率99.2％(98.7-99.7)，而2,420名HR1c≥中位数的患者中有98名具有PLC，93.1％(91.7-94.7；P<0.001)，验证亚组中得到相似的结果，在2,472中7例，99.6％(99.3-100.0)，相对于2,472中106例，93.0％(91.4-94.6；P<0.001)。这相当于一个非常有趣的负预测值(VPN)。

第二目的

在整合的数据库中(n＝4,053)，HR2c的AUROCt高于单独的AFP，0.870(0.834-0.905)相对于0.718(0.664-0.772；P<0.001)。HR2c在构建亚组中对癌症的预测为0.902(0.860-0.945)，而在验证亚组中没有差异，为0.828(0.771-0.886；P＝0.98)。在构建亚组中，1,008名HR2c<0.026(中位数)的患者中，只有2名患者具有PLC，代表无PLC的5年生存率99.8％(99.5-100)，而1007名高HR2患者中，有52名具有PLC，即93.9％(92.3-95.6；P<0.001)，在验证亚组中的结果相似。同样，VPN很高。

HR1c和HR2c的AUROC显著高于单独组分的AUROC，其都对PLC具有显著的风险比。

第三目的

回顾性地将HR1c和HR2c测试应用于4,053例患者，这两项测试都证明了对包括非硬化在内的所有患者进行监测的可能有效性。针对标准监测，算法(“F4orHR1thenHR2”)实现了NSS＝10(1930/183)，负预测值＝99.2％(2,105/2，123相对于26(755/127)和97.8％(3,224/3,298)。在50岁或50岁以上的患者中，结果始终支持该算法(“F4orHR1thenHR2”)，NNS＝10，阴性预测值＝99.5％相对于NNS＝5，但对于标准监测，阴性预测值更低(96.5％)。

这为医师确定了新的决策树和程序(图7.B)

(1)确定患者是否患有硬化；

(2a)如果患者患有硬化，则进行监测(影像学和AFP剂量或HR2c剂量，或含有本文公开的生化标记物和至少一个癌症标记物的本文开发的函数)；

(2b)如果患者没有硬化，则进行HR1c(或含有本文公开的生化标记物，但不包含癌症标记物的本文开发的函数)；

(3a)如果HR1c的值低于中位数，则不进行其他特定监测，定期随访和/或治疗患者的肝脏疾病；

(3b)如果HR1c的值高于或等于中位数，则如上所述进行监测；

(4a)如果影像学数据正常并且AFP值(如果测量了)正常，或者HR2c(如果测量了)的值低于中位数，则不进行其他特定的监测，定期随访和/或治疗患者的肝脏疾病，大约六个月后进行新的监测；

(4b)存在以下至少一种情况

i)影像学不正常，或

ii)AFP值(如果测量了)不正常，或

iii)HR2c的值高于或等于中位数，

然后对HCC或CC诊断和治疗进行广泛的调查。

根据是否存在硬化进行灵敏度分析

在随机分的亚组中，在整合的数据库中以及在同时使用HR1c、HR2c和AFP的情况下，无硬化的患者中HR1c的AUROCt高于有硬化的患者。在4,990例低HR1的无硬化的患者中，10年内17例发生了PLC(99.4％；99.1-99.7)，而在3,507名高HR1的患者中，为67例(96.6％；95.7-97.6)(P<0.001)。

在硬化患者中，HR2c的AUROCt为0.727(0.664-0.789)，而AFP为0.642(0.575-0.709；P＝0.06)，在无硬化的患者中，分别为0.773(0.678-0.869)与0.680(0.569-0.790；P＝0.21)。在10例低HR1c的硬化病例中，在15年内0例发生PLC，无PLC的10年生存率为100％(CI未估计)，而1385例高HR2c的患者中为137例(84.7％；81.1-87.0；P＝0.001)。

根据硬化定义进行灵敏度分析

通过弹性成像、活检和这两种方法之一分别获得硬化的存在，其中在用HR1c的病例中2897、895和3552例，以及用HR2c时为1858、462和2160例。结果类似于使用FibroTest进行的硬化定义所观察到的结果，HR1c的AUROCt范围＝0.802-0.825，HR2c的范围＝0.780-0.850。

根据患者的主要特征进行灵敏度分析

尽管HIV与硬化有关，但不能预示PLC，提示HIV治疗有益。尽管它与硬化无关，但糖尿病的存在预示着PLC，提示其机制与纤维化的进展无关。

混杂变量和AUROC的解释

正如预期的那样，几乎所有特征中，无硬化患者的HR1c AUROCt高于(显著地或不显著地)有硬化的患者，除了HIV感染患者。由于肝癌的数量少(非硬化HIV中只有5种)，因此无法清楚地解释这一结果。

其他灵敏度分析

HR1c和HR2c的AUROCt并不因为肝脏疾病和种族的不同而不同，并且排除了8例胆管癌患者(数据未显示)。

对于同期PLC(121/4,047)的诊断，由于灵敏度提高，HR2c的AUROC(0.905；0.875-0.928)高于AFP(0.796；0.741-0.840)(P<0.001)。

纳入后3.6年(3.6-7.0)，对3,931例患者进行了HR1c的重复测量。调整纳入特性后，在245名(6.2％)病例中观察到至少四分之一的HR1c改善，并且在单变量或多变量分析中与ALT评估的坏死和炎症改善高度相关(优势比＝19.8；13.4-29.3；p<0.001)。在245例HR1c改善的病例中，有3例发生PLC(1.2％)，而在3646例没有HR1c改善的患者中，为140例(3.6％)(Fisher精确检验p＝0.03)。

纳入后3.99年(IQR 1.86-6.62)，在1,856例患者的亚组中重复测量HR1c和HR2c，二者的AUROC对癌症预测保持显著性(130/1856；发生率7％)，分别为0.821(0.730-0.834)和0.837(0.782-0.891)，高于重复的AFP(0.706；0.637-0.775)。

HR1四分位数截止值的可区分值。

在汇总了构建和验证组后，对于慢性肝脏疾病患者，可能的选择是IQR-2(中位截止值)，其中特异性为0.892，灵敏度为0.333。如果PLC的患病率为1％，则阴性预测值为0.993(95％CI 0.990-0.994)，如果PLC的患病率为1/1000，则阴性预测值上升到0.999。

外部群体的PLC风险水平

根据年龄和性别，评估了HR1c的每个四分位数在外部应用中假定的无PLC生存。根据使用情况、年龄和性别，10年内的高风险患病率(HR1c＝IQR-4)从50岁以下健康女性中的0％(0-0.004)(0/895)，变化到50岁或50岁以上男性NAFLD中的56.4％(55.8-56.9；21,542/38,196)，而在CHC中为73.5％(73.3-73.6；227,964/310,305)。

讨论

在本研究中，构建了两个多变量分析血液测试，并在内部进行了验证：HR1c可以鉴定在10年内高风险非硬化患者，HR2c比AFP具有更高的预测5年内PLC发生的性能，而无论是在无硬化的患者还是有硬化的患者中。结果强烈地表明，评估非硬化患者的HR1c，以及评估硬化患者或无硬化患者但具有高HR1c的患者中的HR2c，将改善仅限于针对硬化患者而进行的超声波检查和AFP的标准监测效率。这种简单的算法具有较高的灵敏度和较高的阴性预测值，并且不会显著增加在50岁或50岁以上的患者中用于筛查一种癌症检测的患者数量(n＝10)。

对于前瞻性组的该回顾性分析的评论如下：

第一优势是证明了这些测试在无硬化患者中的性能，这样的患者占组中的86％。迄今为止，已在CHB组中对大多数无硬化的患者进行了调查。只有一项研究使用了弹性成像技术，发现该技术具有预测价值，但未构建多变量分析测试。只有一项研究在活检时无硬化的CHC患者中构建了测试，但他们没有使用任何经过验证的纤维化标记物。

而且，核心分析仅包括在第一年的随访之后检测到的PLC发生。因此，PLC的发生处于早期阶段，具有80％的切除可能性。

此外，尽管我们的群体是从第三级中心选出的，但患者的特征范围很广，包括纤维化的所有阶段(无纤维化的占48％)、不同病因的肝脏疾病、种族和合并症。在所有这些亚组中，性能都是相似的。认识到在20年前设计的该组，旨在验证非侵入性纤维化生物标记物的性能，并且即使进行的AFP减少两倍，也可以对硬化受试者进行生物学监测。由于这种特殊的使用环境，并且根据发生PLC的数量少，必须进行外部验证。

尽管如此，前瞻性随访时间是足够长的，足以获得足够数量的事件并验证在1856名患者中的重复测试性能。在另一项研究中，在没有代谢因素的HBV亚洲男性携带者中，估计的PLC 10年发生率为4.8％。当分析我们的没有2型糖尿病的亚洲男性亚组时，癌症的10年发病率(7/227)相似，即4.2％(0.8-6.5)。

第五，与PLC相关的因子是由不同的潜在机制而组合。尽管GGT在有和没有硬化的患者中具有相似的风险比，但是潜在的肝保护性标记物ApoA1和触珠蛋白在没有硬化的患者中比有硬化的患者中预测PLC的风险比更高。

因此，HR1c是鉴定没有PLC特异性标记物的高风险病例的灵敏测试，且与硬化的存在无关。此外，与单独的AFP相比，HR2c组合HR1c组分与AFP(标准的特异性PLC标记物)，在不降低灵敏度的情况下具有更高的特异性。

可以使用其他可用的特异性PLC标记物轻松地进一步改善此策略。最近，一项研究将蛋白质和遗传生物标记物(CancerSEEK)组合，以提高灵敏度，同时又不降低检测同期实体瘤的特异性。该测试的AUROC为0.910(0.900-0.920)。HR2c的AUROC对同期PLC的诊断相似，即0.917(0.887-0.939)。适当的比较需要在相同患者中进行直接比较，但是该分析针对PLC发生验证HR2c时使用了肝脏疾病患者作为对照而非健康对照，这样可能人为地提高了CancerSeek的性能。CancerSEEK的两个组分，即金属蛋白酶-1的组织抑制剂和肝细胞生长因子，与HR1c中使用的两个蛋白质(A2M和触珠蛋白)结合。

最后，HR1c和HR2c组合了简单、可获得和负担得起的组分，其中假阳性和假阴性的风险众所周知。当HR1c应用于不同的使用环境时，10年内PLC的高风险从50岁以下健康女性的0％变化为50岁或50岁以上CHC男性的74％。在患有慢性肝脏疾病的患者中，HR1c的高阴性预测值将允许鉴定出没有硬化的患者，与硬化的患者相比，他们将受益于同样的监测。

HR1c的构建主要针对没有硬化的患者，根据没有硬化的CHB携带者和NAFLD患者(包括肥胖患者和2型糖尿病)中，可能发生PLC但尚未确定PLC发生的增加。在没有硬化的患者中验证新测试的需求尚未得到满足，但是HR1c在硬化患者中几乎没有或者没有临床兴趣，因为已经知道硬化是PLC的主要风险因子。HR2c在没有硬化和高HR1c的患者以及有硬化的患者中都有临床效用。

同样，公认的其他潜在组分也可以为单一肝脏疾病提供额外的预测值，例如HBV或HCV标记物，不包括HCC家族史。

此外，没有分析随访过程中演变的风险因子的预测值，例如饮酒或糖尿病。至少在重复样品的大亚组中，测试的性能持续存在。脂肪变性、超重、烟草、咖啡、巧克力或摄入***、体育锻炼或长期用药的预测值，所有这些都可能与纤维化或PLC的风险相关，也未进行分析。但是，GGT与PLC的风险高度相关，可能是由于它与细胞毒性因子(如酒精和代谢因子)相关。确实，2型糖尿病的存在预示着PLC，尽管它与纳入时的硬化无关，提示与纤维化的进展无关的机制。基于***回顾，非酒精性脂肪肝疾病与肝细胞癌风险之间的关联尚未得到证实，但在没有硬化的患者中高度怀疑。

在10年的随访期间，一些已知或未知因子可能与PLC的风险有关。在此，HR1c的目的是在务实的使用环境中，构建一个非常早期的PLC风险的灵敏标记物，并假设这些因子可能导致的可变性。为了在随访过程中使适用于不同肝脏疾病(病毒抑制、糖尿病治疗、体重或摄取酒精)的反应标准均一，ALT氨基转移酶被用作坏死性炎症活动的标记物。结果显示，HR1c的改善与ALT、以及作为肝脏疾病病因的CHC之间的高度相关性，这与这些患者中慢性病毒抑制的有益作用一致。在这个大组中，比例风险假设得到了验证，并且没有鉴定到显著的协变量，只有小的年龄效应，这可以在外部验证中进行检查。

在考虑进行筛查测试时，必须考虑其利弊，包括假阳性的影响。没有进行成本效益分析，但是对筛查所需数量和阴性预测值的简单分析表明组合了HR1c和HR2c的算法对没有硬化的患者进行监测，可以与仅包括硬化的标准进行比较。

另一个限制可能是，当PLC的年发生率超过1％时，监测是经济有效的。在此，在使用HR1c和HR2c的群体中，15年发病率为13％(95％CI 10-16％)，即排除不包括PLC的第一年后为0.9％，如果将患者限定为年龄超过50岁，则为1.1％。

早期PLC的诊断容易受到偏差的影响，例如领先时间偏差(由于预期的诊断，明显改善了生存率，主要发生在5年以内的随访中)和时长偏差(生长缓慢肿瘤的过度表现)。在这里，风险很小，因为HR1c并非旨在诊断小癌症，而是在癌症发生前10年(包括非硬化病例)鉴定风险概况。对于HR2c，终点为5年，但不包括第一年发生的所有PLC，并且在10年或15年时观察到相同的性能。此外，比较对象AFP与HR2c具有相同的偏差风险。

还公认的是，我们的病例中只有41％接受了AFP测量，现在更推荐与超声波检查一起使用。其他组合也应通过影像学和即将上市的新的直接PLC标记物进行测试。多变量分析测试HR2c，使用HR1c组分组合单独的AFP作为PLC特异性标记物，但我们没有组合第二代PLC生物标记物，其可以进一步提高HR2c的质量。

总之，在慢性肝脏疾的病患者中，构建了两项具有显著性能的测试，HR1c用于非硬化患者的癌症风险的早期分层，HR2c用于提高单独AFP的灵敏度。外部验证应允许将50岁以后的影像学监测范围扩大到高HR1c的无硬化的患者，并确认相对于单独AFP，HR2c在具有高HR1c的硬化患者和无硬化患者中性能增强。

Claims

1.一种用于确定患有慢性肝脏疾病的患者是否具有发展为原发性肝癌的风险的装置，其中所述装置通过函数将患者血液、血清或血浆中测量的生化标记物的值进行组合来提供最终值，其中所述最终值与预定值进行比较，且其中所述最终值相对于预定值的变化指示着患者发展为原发性肝癌的风险；其中所述函数是a0 + a1 × LogA2M + a2 × 年龄 +a3 × ApoA1 + a4 × 性别 + a5 × LogGGT + a6 × Log触珠蛋白，其中

a）-6 ≤ a0 ≤ -3.4

b）2.4 ≤ a1 ≤ 4.6

c）0.02 ≤ a2 ≤ 0.07

d）-2.6 ≤ a3 ≤ -0.8

e）-1.5 ≤ a4 ≤ -0.5

f）0.9 ≤ a5 ≤ 1.9

g）-1.5 ≤ a6 ≤ -0.5，

其中A2M代表α2-巨球蛋白的值，ApoA1代表载脂蛋白A-1的值，GGT代表γ谷氨酰转肽酶的值，触珠蛋白代表触珠蛋白的值，其中A2M的单位为g/L，年龄的单位为岁，ApoA1的单位为g/L，性别为女性为0、男性为1，GGT的单位为IU/L，触珠蛋白的单位为g/L，其中患者的最终值高于或等于预定值表示，相对于其最终值低于预定值的其他患者，所述患者具有更高的发展为原发性肝癌的风险。

2.根据权利要求1所述的装置，其中

a）-5.2 ≤ a0 ≤ -4.7

b）3 ≤ a1 ≤ 4

c）0.03 ≤ a2 ≤ 0.07

d）-2.2 ≤ a3 ≤ -1.0

e）-1.1 ≤ a4 ≤ -0.6

f）1.2 ≤ a5 ≤ 1.6

g）-1.1 ≤ a6 ≤ -0.6。

3.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述函数选自：

a）F1-a = -4.819 + 3.673 × LogA2M + 0.053 × 年龄 - 1.983 × ApoA1 -1.122 × 性别 + 1.603 × LogGGT - 0.834 × Log触珠蛋白，和

b）F1-b = -4.982 +3.713 × LogA2M + 0.0473 × 年龄 - 1.133 × ApoA1 -0.791 × 性别 + 1.343 × LogGGT - 1.062 × Log触珠蛋白。

4.根据权利要求3所述的装置，其中所述预定值为0.25，并且其中当最终结果高于或等于0.25时，则所述患者发展为原发性肝癌的风险增加。

5.一种用于确定患有慢性肝脏疾病的患者是否具有发展为原发性肝癌的风险的装置，其中所述装置通过函数将患者血液、血清或血浆中测量的生化标记物的值进行组合来提供最终值，其中所述最终值与预定值进行比较，且其中所述最终值相对于预定值的变化指示着患者发展为原发性肝癌的风险；其中所述函数为a0 + a1 × LogA2M + a2 × 年龄 +a3 × ApoA1 + a4 × 性别 + a5 × LogGGT + a6 × Log触珠蛋白 + a7 × LogAFP，其中，

a）-7 ≤ a0 ≤ -5.5

b）2.2 ≤ a1 ≤ 3.2

c）0.02 ≤ a2 ≤ 0.06

d）-1.65 ≤ a3 ≤ -1.25

e）-0.3 ≤ a4 ≤ -0.22

f）1.25 ≤ a5 ≤ 1.85

g）-0.75 ≤ a6 ≤ -0.55

h）1.3 ≤ a7 ≤ 1.9，

其中A2M代表α2-巨球蛋白的值，ApoA1代表载脂蛋白A-1的值，GGT代表γ谷氨酰转肽酶的值，触珠蛋白代表触珠蛋白的值，AFP代表甲胎蛋白的值，其中A2M的单位为g/L，年龄的单位为岁，ApoA1的单位为g/L，性别为女性为0、男性为1，GGT的单位为IU/L，触珠蛋白的单位为g/L，AFP的单位为μg/L，其中患者的最终值高于或等于预定值表示，相对于其最终值低于预定值的其他患者，所述患者具有更高的发展为原发性肝癌的风险。

6.根据权利要求5所述的装置，其中

a）-6.5 ≤ a0 ≤ -6

b）2.5 ≤ a1 ≤ 2.9

c）0.04 ≤ a2 ≤ 0.05

d）-1.55 ≤ a3 ≤ -1.35

e）-0.28 ≤ a4 ≤ -0.24

f）1.45 ≤ a5 ≤ 1.65

g）-0.7 ≤ a6 ≤ -0.6

h）1.5 ≤ a7 ≤ 1.8。

7.根据权利要求5或6所述的装置，其中所述函数是F2-a = -6.214 + 2.713 LogA2M +0.0447 × 年龄 - 1.451 × ApoA1 - 0.260 × 性别 + 1.557 × LogGGT - 0.633 ×Log触珠蛋白 + 1.662 × LogAFP。

8.一种用于确定患有慢性肝脏疾病的患者是否具有发展为原发性肝癌的风险的装置，其中所述装置通过函数将患者血液、血清或血浆中测量的生化标记物的值进行组合来提供最终值，其中所述最终值与预定值进行比较，且其中所述最终值相对于预定值的变化指示着患者发展为原发性肝癌的风险；其中所述函数是多变量Cox函数，且其中所述函数选自

C1 = b1 × ApoA1 - b2 × Log触珠蛋白 + b3 × LogGGT + b4 × LogA2M + b5× 年龄 + b6 × 性别，

其中

-0.6 ≤ b1 ≤ 0.8

-1.0 ≤ b2 ≤ 1.1

-1.4 ≤ b3 ≤ 1.5

-2.6 ≤ b4 ≤ 2.7

-0.05 ≤ b5 ≤ 0.07

-0.8 ≤ b6 ≤ 1.1；

C2 = c1 × LogAFP - c2 × ApoA1 - c3 × Log触珠蛋白 + c4 × LogGGT + c5× LogA2M + c6 × 年龄 + c7 × 性别，

其中

-0.8 ≤ c1 ≤ 1.0

-0.7 ≤ c2 ≤ 0.9

-0.5 ≤ c3 ≤ 0.7

-1.1 ≤ c4 ≤ 1.3

-1.4 ≤ c5 ≤ 1.5

-0.06 ≤ c6 ≤ 0.08

-0.4 ≤ c7 ≤ 0.6，

和

C3 = d1 × LogAFP - d2 × ApoA1 - d3 × Log触珠蛋白 + d4 × LogGGT + d5× LogA2M + d6 × 年龄 + d7 × 性别，

其中

-0.6 ≤ d1 ≤ 0.8

-1.0 ≤ d2 ≤ 1.2

-0.7 ≤ d3 ≤ 0.9

-1.1 ≤ d4 ≤ 1.3

-1.3 ≤ d5 ≤ 1.5

-0.06 ≤ d6 ≤ 0.09

-0.2 ≤ d7 ≤ 0.4，

9.根据权利要求8所述的装置，其中所述函数选自：

C1-a = 0.67930 × ApoA1 - 1.02404 × Log触珠蛋白+ 1.46545 × LogGGT +2.65740 × LogA2M + 0.06346 × 年龄 + 0.97350 × 性别，

C1-b = 0.67930 × ApoA1 - 1.05404 × Log触珠蛋白+ 1.46545 × LogGGT +2.65740 × LogA2M + 0.06346 × 年龄 + 0.97350 × 性别，

C2 = 0.88166 × LogAFP - 0.82480 × ApoA1 - 0.62809 × Log触珠蛋白 +1.20973 × LogGGT + 1.42462 × LogA2M + 0.07235 × 年龄 + 0.53213 × 性别，

和

C3 = 0.68030 × LogAFP - 1.13208 × ApoA1 - 0.82013 × Log触珠蛋白 +1.20152 × LogGGT + 1.39771 × LogA2M + 0.07582 × 年龄 + 0.31238 × 性别。