CN111278861B - Pd-l1抗体、其抗原结合片段及医药用途 - Google Patents

Pd-l1抗体、其抗原结合片段及医药用途 Download PDF

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Abstract

一种新的PD‑L1抗体、其抗原结合片段及医药用途。包含所述PD‑L1抗体CDR区的人源化抗体，以及包含PD‑L1抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为药物的用途。一种人源化的PD‑L1抗体在制备用于治疗PD‑L1相关的疾病或病症的药物中的用途。

Description

PD-L1抗体、其抗原结合片段及医药用途
本申请要求申请日为2018年01月10日的中国专利申请CN201810023267.0的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。
技术领域
本公开涉及PD-L1抗体以及其抗原结合片段，进一步地，本公开还涉及包含所述PD-L1抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体，本公开还涉及包含所述PD-L1抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为PD-L1相关疾病诊断剂和治疗药物的用途。
背景技术
这里的陈述仅提供与本发明有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。
肿瘤免疫治疗是肿瘤治疗领域一个长时期的热点，其中T细胞的肿瘤免疫治疗又处于其核心位置。肿瘤免疫治疗是充分利用、调动肿瘤患者体内的杀伤性T细胞，对肿瘤进行杀伤作用，它可能是最有效的也是最安全的***的途径。与此同时，肿瘤逃逸是肿瘤免疫治疗面临的一个巨大障碍，肿瘤细胞利用其自身对免疫***的抑制作用促进了肿瘤的快速生长。
肿瘤的免疫逃逸机制与机体对肿瘤的免疫应答之间存在着极为复杂的关系。肿瘤免疫治疗早期肿瘤特异性的杀伤性T细胞是有其生物活性的，但随着肿瘤生长后期失去了杀伤的功能。所以肿瘤免疫治疗是为了最大限度的提高患者自身对肿瘤的免疫***反应，它不但要在体内激活原有的免疫***反应，更要维持免疫***反应的持续时间和反应强度，才是免疫***的关键。
人体内T细胞的活化采取了两条信号通路***，除了需要通过抗原呈递细胞递呈MHC-抗原肽给T细胞提供第一信号外，还需要一系列协同刺激分子提供第二信号，进而才能使T细胞产生正常的免疫应答。这个双信号通路***对体内免疫***的平衡起着至关重要的作用，它严格调控机体对自身和非自身抗原产生不同的免疫应答。如果缺少协同刺激分子提供的第二信号，将会导致T细胞的无应答或持续特异性免疫应答，从而产生耐受。因此，第二信号通路在机体免疫应答的整个过程中起着非常关键的调节作用。
程序性死亡分子1(programmed death-l，PD-l)是1992年发现的表达在T细胞表面的一个蛋白受体，参与到细胞的凋亡过程之中。PD-l属于CD28家族，与细胞毒性T淋巴细胞抗原4(cytotoxic T Iymphocyte antigen 4，CTLA-4)具有23％的氨基酸同源性，但其表达却与CTLA不同，主要表达在活化的T细胞、B细胞和髓系细胞上。PD-1有两个配体，分别为PD-L1和PD-L2。PD-L1主要表达于T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cell，DC)上，在活化后细胞上的表达能够进行上调。而PD-L2的表达相对较局限，主要表达在抗原呈递细胞上，如活化的巨噬细胞和树突状细胞。
PD-L1通过和PD-1及B7-1的结合抑制免疫***，很多肿瘤细胞及肿瘤组织微环境的免疫细胞表达PD-L1。新的研究发现乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌及肝癌等人类肿瘤组织中检测到高PD-L1蛋白的表达，且PD-L1的表达水平和患者的临床及预后紧密相关。
由于PD-L1起到第二信号通路抑制T细胞增殖的作用，所以阻断PD-L1/PD-1之间结合成为了肿瘤免疫治疗领域一个非常有潜力的新兴靶点。
目前有多家跨国制药公司在研发针对PD-L1的单克隆抗体，它通过阻断PD-L1/PD-1之间结合，最大限度的提高患者自身对肿瘤的免疫***反应，从而达到对肿瘤细胞进行杀伤的目的。相关的专利如：WO0139722、WO2013173223、WO2014195852、WO2013181634、WO2015048520、WO2015036511、US2014335093、WO2014100079、WO2014055897、US6803192B1、WO2014022758、US8617546B2和WO2010089411A2。
发明内容
本公开提供与PD-L1的胞外区的氨基酸序列或三维结构结合的单克隆抗体或抗原结合片段(也可称人PD-L1结合分子)。
在一些可选的实施方案中，本公开提供一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或抗原结合片段结合人PD-L1，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
(i)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ IDNO：10、12和13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ IDNO：14、15和16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区，所述SEQ ID NO.12所示的HCDR2中X1为F或M，X2为R或V，X3为N或H；或
(ii)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ IDNO：11、12和13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ IDNO：14、15和16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区，所述SEQ ID NO.12所示的HCDR2中X1为F或M，X2为R或V，X3为N或H；或
(iii)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ IDNO：20、21和22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ IDNO：23、24和25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3依次不同时为SEQ ID NO：30、38、22、23、40和25，
所述SEQ ID NO.20和21所示的HCDR1和HCDR2中X4为S或D，X5为Y或K，X6为H或M，X7为T、S、H或G，X8为S、N或G，X9为S、L或G，X10为F、L、W或M，X11为A、P或T，X12为M、V、L或S，X13为F或Y，所述SEQ ID NO：24所示的LCDR2中X14为V或A，X15为Y或N，X16为A、L或V，X17为E、F、Y或A(其中包括X17选自E、F和A与X17选自Y的情况)。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或其抗原结合片段结合人PD-L1，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的HCDR1、如SEQ ID NO：28或29所示的HCDR2和如SEQ ID NO：13所示的HCDR3区，轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：14、15和16氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或其抗原结合片段的所述重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的HCDR1、如SEQ ID NO：28或29所示的HCDR2和如SEQ IDNO：13所示的HCDR3区，所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：14、15和16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或其抗原结合片段的所述重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示的HCDR1、如SEQ ID NO：32至37任一所示的HCDR2和如SEQ ID NO：22所示的HCDR3区，所述轻链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO：23的LCDR1、如SEQ ID NO：39、40、41、67和69任一的LCDR2和如SEQ ID NO：25的LCDR3区。
在一些实施方案中，如前的所述单克隆抗体或其抗原结合片段的所述重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示的HCDR1、如SEQ ID NO：32、33、34、35、36和37任一所示的HCDR2和如SEQ ID NO：22所示的HCDR3区，所述轻链可变区包含氨基酸序列如SEQ IDNO：23的LCDR1、如SEQ ID NO：39、40、41、67和69任一的LCDR2和如SEQ ID NO：25的LCDR3区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或其抗原结合片段所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：14-16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区；或
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或其抗原结合片段所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：14-16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区；或
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或其抗原结合片段所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：14-16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区；或
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或其抗原结合片段所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：39、SEQ IDNO：25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区；或
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或其抗原结合片段所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区；或
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或其抗原结合片段所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区；或
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或其抗原结合片段所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区；或
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或其抗原结合片段所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区；或
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或其抗原结合片段所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：67和SEQ IDNO：25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或其抗原结合片段所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：69和SEQ IDNO：25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或其抗原结合片段所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：41和SEQ IDNO：25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区；
或在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或其抗原所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区；或
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或其抗原结合片段所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区；或
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或其抗原结合片段所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或其抗原结合片段与人PD-L1的亲和力KD值小于10-9M或10-10M。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或其抗原结合片段交叉结合食蟹猴或恒河猴PD-L1和/或小鼠PD-L1。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQID NO：17所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQID NO：18所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQID NO：26所示的重链可变区和SEQ ID NO：27所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQID NO：42所示的重链可变区和SEQ ID NO：45所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQID NO：43所示的重链可变区和SEQ ID NO：45所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQID NO：44所示的重链可变区和SEQ ID NO：45所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQID NO：46所示的重链可变区和SEQ ID NO：55、56和57任一所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ IDNO：47所示的重链可变区和SEQ ID NO：55、56和57任一所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQID NO：48所示的重链可变区和SEQ ID NO：55、56和57任一所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQID NO：49所示的重链可变区和SEQ ID NO：55、56和57任一所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ IDNO：50所示的重链可变区和SEQ ID NO：55、56和57任一所示的轻链可变区。
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在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQID NO：53所示的重链可变区和SEQ ID NO：55、56和57任一所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQID NO：54所示的重链可变区和SEQ ID NO：55和57任一所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQID NO：46所示的重链可变区和SEQ ID NO：55、56、57、70和72任一所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQID NO：47所示的重链可变区和SEQ ID NO：55、56、57、70和72任一所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQID NO：48所示的重链可变区和SEQ ID NO：55、56、57、70和72任一所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQID NO：49所示的重链可变区和SEQ ID NO：55、56、57、70和72任一所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQID NO：50所示的重链可变区和SEQ ID NO：55、56、57、70和72任一所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQID NO：51所示的重链可变区和SEQ ID NO：55、56、57、70和72任一所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQID NO：52所示的重链可变区和SEQ ID NO：55、56、57、70和72任一所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQID NO：53所示的重链可变区和SEQ ID NO：55、56、57、70和72任一所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQID NO：66所示的重链可变区和SEQ ID NO：55、56、57、70和72任一所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQID NO：54所示的重链可变区和SEQ ID NO：55、57、70和72任一所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体为全长抗体，进一步包括人抗体恒定区，优选地，所述人抗体恒定区的重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区及其常规变体，所述人抗体恒定区的轻链恒定区选自人抗体κ和λ链恒定区及其常规变体，优选包含氨基酸序列如SEQ ID NO：58、60或65所示的人抗体重链恒定区和SEQ ID NO：59所示的人轻链恒定区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体为全长抗体，进一步包括人抗体恒定区，包含氨基酸序列如SEQ ID NO：58所示的人抗体重链恒定区和SEQ ID NO：59所示的人轻链恒定区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体为全长抗体，进一步包括人抗体恒定区，包含氨基酸序列如SEQ ID NO：60所示的人抗体重链恒定区和SEQ ID NO：59所示的人轻链恒定区。
在一些实施方案中，如前所述单克隆抗体为全长抗体，进一步包括人抗体恒定区，包含氨基酸序列如SEQ ID NO：65所示的人抗体重链恒定区和SEQ ID NO：59所示的人轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗原结合片段是选自Fab、Fab′、F(ab′)2、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)和包含CDR的肽的抗原结合片段。
另一方面，本公开提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据前述所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，优选地，所述治疗有效量的单克隆抗体或其抗原结合片段为单位剂量0.1-3000mg/kg的如前所述单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一些方面，本公开提供一种核酸分子，其编码前述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一些方面，本公开提供一种重组载体，其包含如前所述的核酸分子。
在一些方面，本公开提供一种用根据如前所述的重组载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞，优选为真核细胞，更优选哺乳动物细胞。
在一些方面，本公开提供用于生产如前所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括将前述的宿主细胞在培养基中进行培养以形成并积累前述的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及从培养物回收所述单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一些方面，本公开提供用于免疫检测或测定人PD-L1的方法，所述方法包括使用如前所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一些方面，本公开提供如前所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备与人PD-L1相关的疾病的诊断剂中的应用。
在一些方面，本公开提供与人PD-L1相关的疾病的治疗方法，所述方法包括向受试者施用药物有效量的如前所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或包含如前所述的药物组合物，或如前所述的核酸分子，以治疗人PD-L1相关的疾病，其中所述疾病优选为肿瘤或癌症；更优选为鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)、神经胶质瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞样白血病(CML)、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、髓样细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓异常增生综合征(MDS)、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、***癌、甲状腺癌、黑素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子***、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、透明细胞肾细胞癌(RCC)、头和颈癌、咽喉癌、肝胆癌(hepatobiliary cancer)、中枢神经***癌、食管癌、恶性胸膜间皮瘤、全身性轻链淀粉样变性、淋巴浆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、神经内分泌肿瘤、梅克尔细胞癌、睾丸癌和皮肤癌，最优选为PD-L1阳性的鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)、神经胶质瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞样白血病(CML)、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、髓样细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓异常增生综合征(MDS)、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、***癌、甲状腺癌、黑素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子***、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、透明细胞肾细胞癌(RCC)、头和颈癌、咽喉癌、肝胆癌(hepatobiliary cancer)、中枢神经***癌、食管癌、恶性胸膜间皮瘤、全身性轻链淀粉样变性、淋巴浆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、神经内分泌肿瘤、梅克尔细胞癌、睾丸癌和皮肤癌。
在一些方面，本公开提供如前所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或包含如前所述的药物组合物，或如前所述的核酸分子在制备与人PD-L1相关的疾病的治疗剂中的应用，其中所述疾病优选为肿瘤或癌症；更优选为鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)、神经胶质瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞样白血病(CML)、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、髓样细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓异常增生综合征(MDS)、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、***癌、甲状腺癌、黑素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子***、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、透明细胞肾细胞癌(RCC)、头和颈癌、咽喉癌、肝胆癌(hepatobiliary cancer)、中枢神经***癌、食管癌、恶性胸膜间皮瘤、全身性轻链淀粉样变性、淋巴浆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、神经内分泌肿瘤、梅克尔细胞癌、睾丸癌和皮肤癌，最优选为PD-L1阳性的鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)、神经胶质瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞样白血病(CML)、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、髓样细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓异常增生综合征(MDS)、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、***癌、甲状腺癌、黑素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子***、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、透明细胞肾细胞癌(RCC)、头和颈癌、咽喉癌、肝胆癌(hepatobiliary cancer)、中枢神经***癌、食管癌、恶性胸膜间皮瘤、全身性轻链淀粉样变性、淋巴浆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、神经内分泌肿瘤、梅克尔细胞癌、睾丸癌和皮肤癌。
作为药物的如前所述单克隆抗体或其抗原结合片段，或包含如前所述的药物组合物，或如前所述的核酸分子。
作为药物的根据如前所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或包含如前所述的药物组合物，或如前所述的核酸分子，所述药物用于治疗PD-L1阳性的肿瘤或癌症，优选地，所述癌症选自鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)、神经胶质瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞样白血病(CML)、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、髓样细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓异常增生综合征(MDS)、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、***癌、甲状腺癌、黑素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子***、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、透明细胞肾细胞癌(RCC)、头和颈癌、咽喉癌、肝胆癌(hepatobiliary cancer)、中枢神经***癌、食管癌、恶性胸膜间皮瘤、全身性轻链淀粉样变性、淋巴浆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、神经内分泌肿瘤、梅克尔细胞癌、睾丸癌和皮肤癌。
附图说明
图1：PD-L1抗体在PBMC-T淋巴细胞激活实验中对细胞IFNγ的分泌促进作用。
图2：不同PD-L1抗体的IgG1形式与IgG4形式的ADCC效应比较。图2A是HRP00049的IgG1和IgG4形式比较，图2B是H5L11的IgG1和IgG4形式比较，图2C是HRP00052的IgG1和IgG4形式比较，图2D是H6L11的IgG1和IgG4形式比较，图2E是H18L61的IgG1和IgG4形式比较，图2F是H12L64的IgG1和IgG4形式比较。
图3：PD-L1抗体对小鼠A375异种移植模型肿瘤体积的影响。
图4：PD-L1抗体对小鼠结肠癌模型肿瘤体积的影响。
图5：PD-L1抗体对小鼠移植瘤模型肿瘤体积的影响。
具体实施方案
一.术语
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
本公开所述的“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
在本公开中，本公开所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。
在本公开中，本公开所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本公开所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDR1-3)。
本公开的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。
“单克隆抗体”是指从基本上均质抗体的群体获得的抗体，即除可能的变体抗体(例如含有天然存在的突变或在制造单克隆抗体制剂的期间产生的突变，这些变体通常以少量存在)之外，构成所述群体的个别抗体相同和/或结合相同表位。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物(制剂)的每个单克隆抗体是针对抗原上的单一决定簇的。因此，修饰语“单克隆”指示如从基本上均质抗体群体获得的抗体的特性，且不应解释为需要通过任何特定方法来制造抗体。例如，本公开的单克隆抗体可通过各种技术制备，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，此类方法以及用于制备单克隆抗体的其他示例性方法在本文中进行描述。
术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的对人PD-L1的单克隆抗体。制备时用PD-L1抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本公开一个优选的实施方案中，所述的鼠源PD-L1抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其变体的重链恒定区。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后***表达载体中，最后在真核***或原核***中表达嵌合抗体分子。在本公开一个优选的实施方案中，所述的PD-L1嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述的PD-L1嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变(如YTE突变或回复突变)的IgG1、IgG2或IgG4变体。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本公开的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。在本公开一个优选的实施方案中，人的抗体可变区框架经过设计选择，其中所述抗体重链可变区上的重链FR区序列，来源于人种系重链IGHV3-23*04和hJH4.1的组合序列，和人种系轻链IGKV1-12*01和hJK4.1的组合序列。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变(回复突变，即将人抗体来源的FR区氨基酸残基突变成原始来源抗体对应位置的氨基酸残基)，以保持活性。
CDR的移植可由于与抗原接触的构架残基而导致产生的PD-L1抗体或其抗原结合片段对抗原的亲和力减弱。此类相互作用可以是体细胞高度突变的结果。因此，可能仍然需要将此类供体构架氨基酸移植至人源化抗体的构架。来自非人PD-L1抗体或其抗原结合片段的参与抗原结合的氨基酸残基可通过检查鼠单克隆抗体可变区序列和结构来鉴定。CDR供体构架中与种系不同的的各残基可被认为是相关的。如果不能确定最接近的种系，那么可将序列与亚型共有序列或具有高相似性百分数的鼠序列的共有序列相比较。稀有构架残基被认为可能是体细胞高度突变的结果，从而在结合中起着重要作用。
术语抗体的“抗原结合片段”或“功能片段”是指抗体的保持特异性结合抗原(例如，PD-L1)的能力的一个或多个片段。已显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段；(v)单结构域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)可任选地通过合成的接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选片段。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
本公开的抗原结合片段包括Fab、F(ab′)2、Fab′、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)、包含CDR的肽等。
Fab是通过用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H链的224位的氨基酸残基)处理IgG抗体分子所获得的片段中的具有约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中H链N端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。
本公开的Fab可以通过用木瓜蛋白酶处理本公开的特异性识别人PD-L1并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体来生产。此外，可以通过将编码所述抗体的Fab的DNA***到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab来生产所述Fab。
F(ab′)2是通过用酶胃蛋白酶消化IgG铰链区中两个二硫键的下方部分而获得的分子量为约100,000并具有抗原结合活性并包含在铰链位置相连的两个Fab区的抗体片段。
本公开的F(ab′)2可以通过用胃蛋白酶处理本公开的特异性识别人PD-L1并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体来生产。此外，可以通过用硫醚键或二硫键连接下面描述的Fab′来生产所述F(ab′)2。
Fab′是通过切割上述F(ab′)2的铰链区的二硫键而获得的分子量为约50,000并具有抗原结合活性的抗体片段。本公开的Fab′可以通过用还原剂例如二硫苏糖醇处理本公开的特异性识别PD-L1并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的F(ab′)2来生产。
此外，可以通过将编码抗体的Fab′片段的DNA***到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab′来生产所述Fab′。
术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；VH)和抗体轻链可变结构域(或区域；VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成，例如使用1-4个重复的变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用于本公开的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
本公开的scFv可以通过以下步骤来生产：获得本公开的特异性识别人PD-L1并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA，将所述DNA***到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达scFv。
双抗体是其中scFv被二聚体化的抗体片段，是具有二价抗原结合活性的抗体片段。在二价抗原结合活性中，两个抗原可以是相同或不同的。
本公开的双抗体可以通过以下步骤来生产：获得本公开的特异性识别人PD-L1并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA以使肽接头的氨基酸序列长度为8个残基或更少，将所述DNA***到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达双抗体。
dsFv是通过将其中每个VH和VL中的一个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代的多肽经由半胱氨酸残基之间的二硫键相连而获得的。可以按照已知方法(ProteinEngineering，7，697(1994))基于抗体的三维结构预测来选择被半胱氨酸残基取代的氨基酸残基。
本公开的dsFv可以通过以下步骤来生产：获得本公开的特异性识别人PD-L1并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码dsFv的DNA，将所述DNA***到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达dsFv。
包含CDR的肽是通过包含VH或VL的CDR中的一个或多个区域而构成的。包含多个CDR的肽可以被直接相连或经由适合的肽接头相连。
本公开的包含CDR的肽可以通过以下步骤来生产：构建本公开的特异性识别人PD-L1并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的CDR的编码DNA，将所述DNA***到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达所述肽。也可以通过化学合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法来生产所述包含CDR的肽。
术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定义应用于轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(CDRL1、CDRL2、CDRL3或L1、L2、L3)，以及重链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR H1、CDR H2、CDR H3或H2、H3)。
本文中使用的术语“抗体框架”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。
人抗体重链恒定区和人抗体轻链恒定区的“常规变体”是指现有技术已公开的来源于人的不改变抗体可变区结构和功能的重链恒定区或轻链恒定区的变体，示例性变体包括对重链恒定区进行定点改造和氨基酸替换的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区变体，具体替换如现有技术已知的YTE突变，L234A和/或L235A突变，或S228P突变，或获得knob-into-hole结构的突变(使得抗体重链具有knob-Fc和hole-Fc组合)，或上述突变体的组合，这些突变已被证实使得抗体具有新的性能，但不改变抗体可变区的功能。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位(例如，PD-L1分子上的特定部位)。表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸。参见，例如，Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-8M，例如大约小于10-9M、10- 10M、10-11M或更小的亲和力(KD)结合。
术语“KD”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本公开的抗体以小于大约10-7M，例如小于大约10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合PD-L1，例如，如使用表面等离子体共振(SPR)技术在BIACORE仪中测定的。
当术语“竞争”用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如中和抗原结合蛋白或中和抗体)的情况中时，意指在抗原结合蛋白之间竞争，其通过以下测定法来测定：在所述测定法中，待检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如PD-L1抗原或其片段)的特异性结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等，1983，Methodsin Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，ALaboratory Manual(抗体，实验室手册)，Cold Spring Harbor Press)；用I-125标记物的固相直接标记RIA(参见例如Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Cheung，等，1990，Virology176：546-552)；和直接标记的RIA(Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常所述测定法涉及使用结合荷有未标记的检测抗原结合蛋白及标记的参考抗原结合蛋白任一种的固态表面或细胞的纯化的抗原。通过测量在所测抗原结合蛋白存在下结合固态表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常所测抗原结合蛋白过量存在。由竞争性测定(竞争抗原结合蛋白)鉴定的抗原结合蛋白包括：结合与参考抗原结合蛋白同一表位的抗原结合蛋白；和结合充分接近参考抗原结合蛋白的结合表位的邻近表位的抗原结合蛋白，所述两个表位在空间上互相妨碍发生结合。在本文实施例中提供关于用于测定竞争性结合的方法的其它详细资料。通常当竞争的抗原结合蛋白过量存在时，其将抑制(例如降低)至少40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或75％或更多参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合。在某些情况下，结合被抑制至少80-85％、85-90％、90-95％、95-97％或97％或更多。
本文中使用的术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
术语“载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。在另一个实施方案中，载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。本文中公开的载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。
现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人PD-L1或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http：//imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。
本公开工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达***会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与人PD-L1特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用pH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本公开的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Studentt检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology ofthe Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。
“有效量”包含足以改善或预防医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：例如，待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“外源性”指根据情况在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据情况在细胞、生物或人体内产生的物质。
“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源；如果两个序列中的100个位置有95个匹配或同源，那么两个序列为95％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
本文使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美国专利号4,683,195中所述扩增的程序或技术。一般来说，需要获得来自目标区域末端或之外的序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列方面与待扩增模板的对应链相同或相似。2个引物的5’末端核苷酸可以与待扩增材料的末端一致。PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般参见Mullis等(1987)Cold Spring HarborSymp.Ouant.Biol.51：263；Erlich编辑，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press，N.Y.)。本文使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例，但不是唯一的实例，所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶，以扩增或产生核酸的特定部分。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
此外，本公开包括用于治疗与PD-L1阳性细胞相关的疾病的药剂，所述药剂包含本公开的单克隆抗体或其抗体片段作为活性成分。
对与PD-L1相关的疾病没有限制，只要它是与PD-L1相关的疾病即可，例如利用本公开的分子诱导的治疗反应可通过结合人类PD-L1，然后阻遏PD-L1与其配体PD-1、B7-1的结合，或杀伤过表达PD-L1的肿瘤细胞。因此，当处于适于治疗应用的制备物和制剂中时，本公开的分子对这样一些人是非常有用的，他们患有肿瘤或癌症，优选黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌、非小细胞肺癌、膀胱癌等。
此外，本公开涉及用于免疫检测或测定PD-L1的方法、用于免疫检测或测定PD-L1的试剂、用于免疫检测或测定表达PD-L1的细胞的方法和用于诊断与PD-L1阳性细胞相关的疾病的诊断剂，其包含本公开的特异性识别人PD-L1并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体或抗体片段作为活性成分。
在本公开中，用于检测或测定PD-L1的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫检测或测定方法。
免疫检测或测定方法是使用标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫检测或测定方法的实例包括放射性物质标记的免疫抗体方法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法、蛋白质免疫印迹法、物理化学方法等。
上述与PD-L1阳性细胞相关的疾病可以通过用本公开的单克隆抗体或抗体片段检测或测定表达PD-L1的细胞来诊断。
为了检测表达多肽的细胞，可以使用已知的免疫检测方法，并优选使用免疫沉淀法、荧光细胞染色法、免疫组织染色法等。此外，可以使用利用FMAT8100HTS***(AppliedBiosystem)的荧光抗体染色法等。
在本公开中，对用于检测或测定PD-L1的活体样品没有特别限制，只要它具有包含表达PD-L1的细胞的可能性即可，例如组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿液、粪便、组织液或培养液。
根据所需的诊断方法，含有本公开的单克隆抗体或其抗体片段的诊断剂还可以含有用于执行抗原-抗体反应的试剂或用于检测反应的试剂。用于执行抗原-抗体反应的试剂包括缓冲剂、盐等。用于检测的试剂包括通常用于免疫检测或测定方法的试剂，例如识别所述单克隆抗体、其抗体片段或其结合物的标记的第二抗体和与所述标记对应的底物等。
通过改造，本公开获得了亲和力更高、肿瘤杀伤活性更强、免疫原性更低等效果的PD-L1抗体。
二.实施例与测试例
以下结合实施例进一步描述本公开，但这些实施例并非限制着本公开的范围。本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1.PD-L1抗体的亲和力成熟酵母文库的构建以及文库的验证
为获得药效更佳的抗人PD-L1抗体，在HRP00052和HRP00049两个抗体的基础上设计并制备scFv抗体的亲和力成熟酵母文库，并从中筛选新的人PD-L1抗体。HRP00052和HRP00049的CDR和轻重链可变区序列均来自WO2017084495A1。具体序列如下：
HRP00049：9-2(H2/L10)IgG4(AA)(S228P)
重链：HRP00049抗体重链序列：(SEQ ID NO：1)
Figure GPA0000288035050000231
HRP00049抗体重链序列编码基因序列：(SEQ ID NO：2)
Figure GPA0000288035050000232
Figure GPA0000288035050000241
轻链：HRP00049抗体轻链序列：(SEQ ID NO：3)
Figure GPA0000288035050000242
HRP00049抗体轻链序列编码基因序列：(SEQ ID NO：4)
Figure GPA0000288035050000243
Figure GPA0000288035050000251
HRP00052：24D5(GF)IgG4(AA)(S228P)
重链：HRP00052抗体重链序列：(SEQ ID NO：5)
Figure GPA0000288035050000252
HRP00052抗体重链序列编码基因序列：(SEQ ID NO：6)
Figure GPA0000288035050000253
Figure GPA0000288035050000261
轻链：HRP00052抗体轻链序列：(SEQ ID NO：7)
Figure GPA0000288035050000262
HRP00052抗体轻链序列编码基因序列：(SEQ ID NO：8)
Figure GPA0000288035050000263
Figure GPA0000288035050000271
上述抗体序列中下划线部分为抗体的可变区部分，其他正体部分为抗体恒定区部分。
酵母文库的构建：设计简并引物，通过PCR的方法将设计的突变氨基酸引入到HRP00049和HRP00052抗体的文库中。再通过二代测序的方法对文库的QC进行验证，其中基于HRP00049和HRP00052序列分别各构建了7个库容为109级别的抗体酵母文库。
实施例2.抗原的制备
设计并合成人PD-L1-IgG1Fc融合蛋白，经Protein A的亲和柱纯化，可获得高纯度的重组PD-L1-Fc蛋白，用于检测抗PD-L1抗体与抗原的结合。
人PD-L1-IgG1Fc：(SEQ ID NO：9)
Figure GPA0000288035050000272
注释：信号肽+胞外区+hIgG1Fc。
实施例3.抗体的筛选
HRP00052文库利用生物素化的人PD-L1-hIgG1Fc抗原，经过两轮MACS筛选(链霉素磁珠，Invitrogen)和两轮FACS筛选(BD FACSAriaTM FUSION)。再挑选400个左右的酵母单克隆培养和诱导表达，FACS(BD FACSCanto II)检测酵母单克隆对人PD-L1-hIgG1Fc抗原的结合，挑选出比野生型HRP00052抗体亲和力高的酵母单克隆测序验证，经过对测序克隆进行比对分析，去除冗余序列之后，将非冗余序列转换成全长IgG(γ1，κ)进行哺乳动物细胞表达。亲和纯化之后的全长抗体采用BIAcoreTMX-100(GE Life Sciences)进行亲合力测定。
HRP00049文库利用生物素化的人PD-L1-hIgG1Fc抗原和生物素化的小鼠PD-L1-hIgG1Fc，经过三轮MACS筛选和三轮FACS筛选。再挑选400个左右的酵母单克隆培养和诱导表达，FACS检测酵母单克隆对人PD-L1-hIgG1Fc抗原和小鼠PD-L1-hIgG1Fc抗原的结合，挑选出同时结合人PD-L1-hIgG1Fc抗原和小鼠PD-L1-hIgG1Fc抗原的酵母单克隆测序验证。去除冗余序列之后，将非冗余序列转换成全长IgG(γ1，κ)进行哺乳动物细胞表达。亲和纯化之后的全长抗体采用BIAcoreTMX-100(GE Life Sciences)进行亲合力测定。
经筛选确认选择抗体CDR区序列。
来自HRP00049突变文库的抗体
基于HRP00049序列的突变文库所挑选的克隆与HRP00049在HCDR1和HCDR2上有差异。相关的CDR序列或通式及其相应重链可变区如下所描述。
Figure GPA0000288035050000281
进而获得相关的重链可变区序列通式如下：
Figure GPA0000288035050000282
或
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGX1ISX2AGSTYX3TPSLKGRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSS(SEQ ID NO：18)。上述SEQ IDNO.12所示的HCDR2和SEQ ID NO.17或18所示的重链可变区中X1选自F或M，X2选自R或V，X3选自N或H。
获得相关的轻链可变区序列如下：(SEQ ID NO：19)
Figure GPA0000288035050000283
来自HRP00052突变文库的抗体
基于HRP00052序列的突变文库所挑选的克隆与HRP00052在HCDR1和HCDR2及LCDR2上有差异。相关的HCDR1和HCDR2及LCDR2通式及其相应重轻链可变区如下所描述。
Figure GPA0000288035050000291
进而获得相关的重链可变区序列通式如下：(SEQ ID NO：26)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTX4X5WMX6 WVRQAPGQGLEWMGRIX7PX8X9GX10X11X12Y NEKX13KNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS，上述SEQ ID NO.20和21所示的HCDR1和HCDR2及SEQ ID NO.26所示的重链可变区中X4选自S和D，X5选自Y和K，X6选自H和M，X7选自T，S，H和G，X8选自S，N和G，X9选自S，L和G，X10选自F，L，W和M，X11选自A，P和T，X12选自M，V，L和S，X13选自F和Y。
进而获得相关的轻链可变区序列通式如下：(SEQ ID NO：27)
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYX14ASX15X16X17SGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK，上述SEQ ID NO：24所示的LCDR2及SEQ ID NO.27所示的轻链可变区中X14选自V和A，X15选自Y和N，X16选自A，L和V，X17选自E，F，Y和A(其中包括X17选自E，F和A与X17选自Y的情况)。获得的具体相关序列包括但不限于表1和表2所述：
表1.亲和力筛选所确定的重链可变区序列
Figure GPA0000288035050000292
Figure GPA0000288035050000301
表2.亲和力筛选所确定的轻链可变区序列
Figure GPA0000288035050000302
Figure GPA0000288035050000311
衍生自HRP00049抗体突变文库的抗体轻重链可变区具体序列：
9-2 H5重链可变区(SEQ ID NO：42)
Figure GPA0000288035050000312
9-2 H6重链可变区(SEQ ID NO：43)
Figure GPA0000288035050000313
9-2 H7重链可变区(SEQ ID NO：44)
Figure GPA0000288035050000314
9-2 L11轻链可变区(SEQ ID NO：45)
Figure GPA0000288035050000315
衍生自HRP00052抗体突变文库的抗体轻重链可变区具体序列：
24D5 H12重链可变区(SEQ ID NO：46)
Figure GPA0000288035050000316
24D5 H13重链可变区(SEQ ID NO：47)
Figure GPA0000288035050000317
24D5 H14重链可变区(SEQ ID NO：48)
Figure GPA0000288035050000318
24D5 H15重链可变区(SEQ ID NO：49)
Figure GPA0000288035050000321
24D5 H16重链可变区(SEQ ID NO：50)
Figure GPA0000288035050000322
24D5 H17重链可变区(SEQ ID NO：51)
Figure GPA0000288035050000323
24D5 H18重链可变区(SEQ ID NO：52)
Figure GPA0000288035050000324
24D5 H19重链可变区(SEQ ID NO：53)
Figure GPA0000288035050000325
24D5 H20重链可变区(SEQ ID NO：54)
Figure GPA0000288035050000326
24D5 H21重链可变区(SEQ ID NO：66)
Figure GPA0000288035050000327
24D5 L64轻链可变区(SEQ ID NO：55)
Figure GPA0000288035050000328
24D5 L61轻链可变区(SEQ ID NO：56)
Figure GPA0000288035050000331
24D5 L66轻链可变区(SEQ ID NO：57)
Figure GPA0000288035050000332
24D5 L67轻链可变区(SEQ ID NO：70)
Figure GPA0000288035050000333
24D5 L68轻链可变区(SEQ ID NO：71)
Figure GPA0000288035050000334
24D5 L69轻链可变区(SEQ ID NO：72)
Figure GPA0000288035050000335
上述抗体的轻重链可变区，选用人重链IgG1/轻链kappa的恒定区分别与各重链可变区和轻链可变区组合，形成完整的抗体重链和轻链，具体重链恒定区和轻链恒定区序列如下：
IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：58)
Figure GPA0000288035050000336
kappa轻链恒定区(SEQ ID NO：59)
Figure GPA0000288035050000337
表3由HRP00049突变衍生的完整抗体的轻重链可变区组合
抗体名称 重轻链可变区组合
H5L11 9-2 H5和9-2 L11
H6L11 9-2 H6和9-2 L11
H7L11 9-2 H7和9-2 L11
表4-1由HRP00052突变衍生的完整抗体的轻重链可变区组合
Figure GPA0000288035050000341
表4-2由HRP00052突变衍生的完整抗体的轻重链可变区组合
可变区名称 24D5 L61 24D5 L64 24D5 L66 24D5 L67 24D5 L68 24D5 L69
24D5 H12 H12L61 H12L64 H12L66 H12L67 H12L68 H12L69
24D5 H13 H13L61 H13L64 H13L66 H13L67 H13L68 H13L69
24D5 H14 H14L61 H14L64 H14L66 H14L67 H14L68 H14L69
24D5 H15 H15L61 H15L64 H15L66 H15L67 H15L68 H15L69
24D5 H16 H16L61 H16L64 H16L66 H16L67 H16L68 H16L69
24D5 H17 H17L61 H17L64 H17L66 H17L67 H17L68 H17L69
24D5 H18 H18L61 H18L64 H18L66 H18L67 H18L68 H18L69
24D5 H19 H19L61 H19L64 H19L66 H19L67 H19L68 H19L69
24D5 H20 H20L61 H20L64 H20L66 H20L67 H20L68 H20L69
24D5 H21 H21L61 H21L64 H21L66 H21L67 H21L68 H21L69
在本公开具体实施方案中，如表5-1和表5-2所述衍生自HRP00049和HRP00052突变抗体文库中的重轻链可变区，在与重轻链恒定区连接形成完整抗体时，均表示与上述人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：58)和kappa轻链恒定区(SEQ ID NO：59)连接形成完整抗体，如H15L61即指由H15与IgG1重链恒定区连接形成重链和L61与kappa轻链恒定区连接形成轻链，轻重链组合形成完整抗体，其他命名类推。
HRP00052-IgG1则指将HRP00052的重链恒定区(IgG4亚类)替换为上述IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：58)后形成的完整抗体。
表5-1重链可变区连接IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：58)和轻链可变区连接kappa轻链恒定区(SEQ ID NO：59)后的全长抗体名称
Figure GPA0000288035050000342
Figure GPA0000288035050000351
表5-2重链可变区连接IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：58)和轻链可变区连接kappa轻链恒定区(SEQ ID NO：59)后的全长抗体名称
可变区名称 9-2 H5 9-2 H6 9-2 H7
9-2L11 H5L11 H6L11 H7L11
为了与连接人IgG1重链恒定区的完整抗体进行对比，某些具体实施方案中，表6-1和表6-2中的全长抗体，是上述衍生自HRP00049和HRP00052突变抗体文库中筛选获得的重轻链可变区分别与下述人IgG4重链恒定区(如SEQ ID NO：60所示，含S228P和234A235A突变)和kappa轻链恒定区(同SEQ ID NO：59)连接形成完整抗体，如H15L61-IgG4即指由H15与IgG4重链恒定区连接形成重链和L61与kappa轻链恒定区连接形成轻链，轻重链组合形成完整抗体，其他命名类推。
人IgG4重链恒定区：(SEQ ID NO：60)
Figure GPA0000288035050000352
表6-1重链可变区连接人IgG4重链恒定区(SEQ ID NO：60)和轻链可变区连接kappa轻链恒定区(SEQ ID NO：59)后的全长抗体名称
Figure GPA0000288035050000353
Figure GPA0000288035050000361
表6-2重链可变区连接人IgG4重链恒定区(SEQ ID NO：60)和轻链可变区连接
kappa轻链恒定区(SEQ ID NO：59)后的全长抗体名称
可变区名称 9-2 H5 9-2 H6 9-2 H7
9-2L11 H5L11-IgG4 H6L11-IgG4 H7L11-IgG4
某些具体实施方案中，表7-1和表7-2中的全长抗体，是上述衍生自HRP00049和HRP00052突变抗体文库中筛选获得的重轻链可变区分别与下述人IgG4 S228P重链恒定区(如SEQ ID NO：65所示，含S228P突变)和kappa轻链恒定区(同SEQ ID NO：59)连接形成完整抗体，如H15L61-IgG4即指由H15与IgG4重链恒定区连接形成重链和L61与kappa轻链恒定区连接形成轻链，轻重链组合形成完整抗体，其他命名类推。IgG4 S228P的重链恒定区序列如下：(SEQ ID NO：65)
Figure GPA0000288035050000362
表7-1重链可变区连接人IgG4 S228P重链恒定区(SEQ ID NO：65)和轻链可变区连接kappa轻链恒定区(SEQ ID NO：59)后的全长抗体名称
Figure GPA0000288035050000363
Figure GPA0000288035050000371
表7-2重链可变区连接人IgG4 S228P重链恒定区(SEQ ID NO：65)和轻链可变区连接kappa轻链恒定区(SEQ ID NO：59)后的全长抗体名称
可变区名称 9-2 H5 9-2 H6 9-2 H7
9-2L11 H5L11-IgG4 S228P H6L11-IgG4 S228P H7L11-IgG4 S228P
具体轻重链恒定区并非作为本公开抗体恒定区的限制，也可选用本领域其它已知的轻重链恒定区及其突变体来增加其性能。
本公开以Merck的PD-L1抗体Avelumab(A09)和/或Genetech的3280A为阳性对照，其中A09的轻重链氨基酸序列(来源自US20140341917)如下：
＞A09重链：(SEQ ID NO：61)
Figure GPA0000288035050000372
＞A09轻链：(SEQ ID NO：62)
Figure GPA0000288035050000373
3280A(Genetech，Atezolizumab，WHO Drug Information，Vol.28，No.4，2014，P488)的轻重链氨基酸序列如下：
＞3280A重链：(SEQ ID NO：63)
Figure GPA0000288035050000381
＞3280A轻链：(SEQ ID NO：64)
Figure GPA0000288035050000382
PD-L1抗体经常规方法纯化获得。
以下实施例中抗体均为全长抗体
实施例4.抗体和配体阻断试验
深入研究了本品对PD-L1与PD1结合的阻断作用，同时与在临床试验中的同类产品进行了比较。方法参照WO2017084495A1测试例2和3，在小鼠PD-L1/PD-1结合阻断试验中使用人PD-L1抗体阻断小鼠PD-L1/PD-1的结合。数据详见下表8。
表8 PD-L1抗体阻断PD-L1与其配体的结合测试
Figure GPA0000288035050000383
Figure GPA0000288035050000391
*10μg/ml，5μg/ml和1μg/ml分别是不同阻断试验中PD-L1的浓度。
配体阻断实验证明，本公开PD-L1抗体能够阻断PD-L1与PD1的结合，也能够阻断PD-L1与B7-1的结合，并且由HRP00049突变而来的H5L11，H6L11抗体具有小鼠PD-L1交叉结合活性，可阻断小鼠PD-L1与PD-1结合的能力。
实施例5.实例性抗体的BIAcore抗体亲和力实验
按照人抗捕获试剂盒(Cat.#BR-1008-39，GE)说明书中的方法将人抗捕获抗体共价偶联于生物传感芯片CM5(Cat.#BR-1000-12，GE)生物芯片上，从而亲和捕获一定量的人PD-L1(Cat.#10084-H08H，Sino Biological)，猴PD-L1(Cat.#90251-C08H，SinoBiological)，小鼠PD-L1(Cat.#50010-M08H，Sino Biological)。用Biacore X100，GE仪器测定PD-L1抗体和PD-L1的反应亲和力。试验使用的是HBS-EP+10X缓冲溶液(Cat.#BR-1006-69，GE)用D.I.Water稀释至1×(pH7.4)，用BIAevaluation version 4.1，GE软件以(1∶1)Langmuir模型拟合数据，得出亲和力数值，结果见表9。
表9-1 HRP00049和HRP00052及其突变抗体与不同物种PD-L1结合的Biacore亲和力(同批次试验)
Figure GPA0000288035050000392
Figure GPA0000288035050000401
表9-2 HRP00052及其突变抗体与不同物种PD-L1结合的Biacore亲和力(同批次试验)
Figure GPA0000288035050000402
结果显示，筛选自HRP00052突变抗体文库的抗体(除H21L68外)与人PD-L1的亲和力均较HRP00052有所提高，且均高于阳性对照抗体。而筛选自HRP00049突变抗体文库的抗体H5L11，H6L11，H7L11则产生较强的鼠PD-L1交叉亲和活性。
实施例6.PD-L1抗体在PBMC-T淋巴细胞激活实验中对细胞IFNγ的分泌作用
为了研究PD-L1抗体对人原代T淋巴细胞功能的影响，收集和纯化人外周血单核细胞(PBMC)，采用结核菌素(TB)体外刺激5天后，检测细胞因子IFNγ分泌水平。实验过程简单描述如下：
新鲜血液利用Ficoll-Hypaque密度梯度离心(Stem Cell Technologies)得到PBMC，于RPMI 1640培养基中培养，该培养基中添加10％(v/v)FBS，37℃、5％CO2条件下培养。
新鲜分离纯化的PBMC以RPMI 1640培养基调整密度为2×106/ml，20mL细胞悬液中加入25μl结核菌素，37℃、5％CO2培养箱培养5天。第6天，收集上述培养的细胞离心，用PBS洗一次，重悬至新鲜的RPMI 1640培养基中，调整密度为1×106/ml，接种至96孔细胞培养板，每孔90μl。同时加入梯度稀释的抗体样品(用PBS稀释)或等量的同型IgG作为空自对照，每孔10μl。细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱孵育3天。取出细胞培养板，离心(4000rpm，10min)收集细胞培养上清，采用ELISA的方法(人IFN-γ检测试剂盒，欣博盛，EHC102g.96)检测IFN-γ的水平。具体操作参考试剂说明书。
结果(见图1)显示，H18L61，H12L64，H5L11，H6L11均能较强地刺激细胞IFNγ的分泌，其中H12L64，H5L11，H6L11在促进细胞IFNγ分泌时，呈现出剂量依赖关系，上述四种抗体在某些剂量或所有剂量上优于HRP00052-IgG1的作用。
实施例7.实例性抗体介导的PD-L1+细胞的ADCC效应
将人全血用等体积的PBS缓冲液进行稀释后，加入已有适量Lymphoprep(STEMCELLTechnologies Inc.，07851)的SepMate(STEMCELL Technologies Inc.，15460)管底部，室温下以1200g离心10分钟。将管中上层液体倒入新的50ml离心管中，用PBS缓冲液洗涤细胞，并以300g离心8分钟，得到PBMC。用含有5％LowIgGFBS(BIOSUN，BS-0007-500)的RPMI-1640培养液重悬PBMC，进行细胞计数。
将CHO-S/PD-L1细胞用含有5％Low IgG FBS的RPMI1640培养基重悬并计数，以每孔10,000个细胞的密度接种在96孔板中，然后加入梯度稀释的PD-L1抗体孵育15分钟，再在每孔中加入300,000个人PBMC细胞作用4小时，设置培养基对照，CHO-S/PD-L1细胞自发释放对照，PBMC细胞自发释放对照和CHO-S/PD-L1细胞最大裂解对照。4小时后，将96孔板离心，每孔取50μL上清转移至另一96孔板，每孔加入50μL CytoTox 96 Non-RadioactiveCytotoxicity Assay(Promega，G1780)，避光室温孵育30分钟，加入终止液，在490nm波长处读取吸光值。按照下列公式分析数据，计算出裂解率，用Graphpad Prism软件根据抗体各浓度与相应的裂解率计算抗体ADCC效应的EC50值。
裂解率％＝(样品孔490nm-PBMC细胞自发释放490nm-CHO-S/PD-L1细胞自发释放490nm)/(CHO-S/PD-L1细胞最大裂解490nm-CHO-S/PD-L1细胞自发释放490nm)×100
结果显示(图2A至图2F所示)，不同PD-L1抗体HRP00049-IgG1，H5L11，HRP00052-IgG1，H6L11，H18L61，H12L64的IgG1形式都有较强的ADCC效应，并且这些分子的ADCC效应均明显优于各PD-L1抗体的IgG4形式。
实施例8.实例性抗体在人的黑色素瘤A375异种移植模型中的作用
将培养的A375细胞与PBMC混合接种于NOG小鼠皮下。实验分为PBMC+PBS组、PBMC+H12L64 20mg/kg组、PBMC+H12L64-IgG4-20mg/kg组和PBMC+HRP00052 20mg/kg组。每组6只，每两天一次，腹腔注射给药，连续给药11次。给药实验结束后，使用肿瘤生长抑制率TGI(％)和相对肿瘤增值率T/C(％)进行疗效评价。
结果见图3和表10，H12L64 20mg/kg组TGI为98.15％，与PBMC+PBS组相比有显著性差异(p＝0.0018)；H12L64-IgG4 20mg/kg组肿瘤抑制率TGI为82.15％，与PBMC+PBS组相比有显著性差异(p＝0.0064)；HRP00052 20mg/kg组肿瘤抑制率TGI为68.84％，与PBMC+PBS组相比有显著性差异(p＝0.0291)。该结果表明，H12L64 20mg/kg组和H12L64-IgG4 20mg/kg及HRP00052 20mg/kg能有效抑制A375的生长(p＜0.05)。在整个实验过程中，H12L64，H12L64-IgG4和HRP00052荷瘤小鼠均没有出现体重下降或动物死亡情况，表明小鼠对该剂量下的H12L64，H12L64-IgG4和HRP00052耐受性良好。
表10 PD-L1抗体在人源化A375皮下移植瘤模型的疗效
Figure GPA0000288035050000421
TGI％：抑瘤率；T/C％：肿瘤增值率；CR：肿瘤消退。
实施例9.PD-L1抗体在小鼠结肠癌模型MC38-hPD-L1中的作用
将MC38-hPD-L1细胞(向小鼠结肠癌细胞MC38转化hPD-L1后在细胞表面可表达hPD-L1，4×105个)100μl接种至50只C57小鼠右肋部皮下，7天后去除肿瘤体积过大过小动物，按平均肿瘤体积约52mm3将小鼠随机分为：3个PD-L1抗体单用组和阴性对照组，共4组，每组10只。分组后腹腔给与各药物(对照组注射等量体积的PBS)，每周天三次，共12次，给药周期28天，停药后两天结束对荷瘤小鼠的监测。每周测2次瘤体积，称体重，记录数据。分组及给药情况见下表。各组动物体重、肿瘤体积以及瘤重均用平均值±标准差(Mean±SEM)表示，并用Graphpad Prism 5和Excel软件作图，使用student t test统计分析。
肿瘤体积(TV)＝1/2×L长×L短 2
肿瘤增殖率T/C％＝(T-T0)/(C-C0)×100％
抑瘤率％TGI＝1-T/C％
G 组别 动物只数 给药剂量(mg/kg) 给药途径
Group1 对照组(PBS) 10 - ip
Group2 HRP00052-IgG1-10mpk 10 10 ip
Group3 H6L11-10mpk 10 10 ip
Group4 A09-10mpk 10 10 ip
实验结果(见图4)显示，H6L11，A09都能显著抑制MC38-hPD-L1小鼠皮下移植瘤的生长。与阴性对照组相比，两组瘤体积从给药后3天都出现统计学差异(p＜0.05)，实验结束时(给药后27d)，两组抑瘤率分别为106.74％、103.47％，与阴性对照组有极显著差异(p＜0.001)，约80％-90％的肿瘤能完全消退，H6L11比A09抑瘤效果更好，但二者没有统计学差异(见图4)。HRP00052-IgG1在实验结束时，抑瘤率为29.10％。
实验结束后将荷瘤鼠安乐死并剥瘤称重，瘤重结果与瘤体积大小基本相符：三个药物组中，H6L11组平均瘤重最小，A09组次之，HRP00052-IgG1的平均瘤重最大；H6L11，A09两组与对照组之间都存在显著差异(p＜0.001)。荷瘤小鼠对各药物均能很好耐受，无药物致体重减轻等症状发生。
实施例10.PD-L1抗体在小鼠结肠癌模型MC38-hPD-L1中的作用
将MC38-hPD-L1细胞以5.8×105个/100μl/只接种到C57/BL-6小鼠皮下，荷瘤模型确立后，测量肿瘤体积，去除体重、肿瘤过大和过小的动物，按照肿瘤体积大小将荷瘤小鼠随机分为2组(n＝7)：IgG-PBS(C25-IgG4)对照组、H5L11-IgG4 S228P实验组，以分组给药日期设定为D0。分组后腹腔给与各药物，每周三次，共10次，给药周期18天，停药后两天结束对荷瘤小鼠的监测。每周测2次瘤体积，称体重，记录数据。分组及给药情况见下表。各组动物体重、肿瘤体积以及瘤重均用平均值±标准差(Mean±SEM)表示，并用Graphpad Prism 6和Excel软件作图，使用student t test统计分析。
肿瘤体积(TV)＝1/2×L长×L短 2
肿瘤增殖率T/C％＝(T-T0)/(C-C0)×100％
抑瘤率％TGI＝1-T/C％
如图5结果显示，与小鼠PD-L1存在交叉反应的PD-L1单抗(H5L11-IgG4 S228P组)实验组肿瘤体积显著小于对照组，并且在给药后一周左右开始即与对照组之间出现统计学差异。
实验结束后对荷瘤小鼠进行安乐死并剥瘤称重，瘤重结果与瘤体积大小存在一定相似性。实验过程中，给药组与对照组动物体重未出现明显差异，小鼠对各给药抗体耐受良好。
虽然为了清楚的理解，已经借助于附图和实例详细描述了上述发明，但是描述和实例不应当解释为限制本公开的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完整地清楚结合。
序列表
<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司
上海恒瑞医药有限公司
<120> PD-L1抗体、其抗原结合片段及医药用途
<150> CN201810023267.0
<151> 2018-1-10
<160> 72
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> HRP00049抗体重链序列
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Asp
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Gly Gly Trp Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 2
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> HRP00049抗体重链序列编码基因序列
<400> 2
caggtgcaac tgcaggagag cggccccgga ctcgtgaaac cctcccagac cctgagcctg 60
acctgtaccg tgagcggcgg cagcatcagc aacgactact ggacttggat caggcagcac 120
cccggcaaag gcctggagta catcggctac atcagctaca ccggctccac ctactacaac 180
cccagcctga agtccagggt gaccatcagc cgggacacca gcaagaacca gttcagcctg 240
aagctgagca gcgtgaccgc tgccgacaca gccgtgtact attgtgccag aagcggcgga 300
tggctggccc ctttcgacta ctggggcaga ggcaccctgg tgaccgtgag cagcgcttcc 360
accaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 420
gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc 600
tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gtccaaatat 660
ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct gaggctgctg ggggaccatc agtcttcctg 720
ttccccccaa aacccaagga cactctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 780
gtggtggacg tgagccagga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc ccatcccagg aggagatgac caagaaccag 1080
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tctacagcag gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc 1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa gagcctctcc 1320
ctgtctctgg gtaaatga 1338
<210> 3
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> HRP00049抗体轻链序列
<400> 3
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr His
20 25 30
Ser Asn Gln Lys His Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 4
<211> 663
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> HRP00049抗体轻链序列编码基因序列
<400> 4
gacatcgtga tgacccagag ccctgatagc ctggctgtga gcctgggcga gagagccacc 60
atcaactgca agagcagcca gagcctgttc taccatagca accagaagca cagcctcgcc 120
tggtatcagc agaagcccgg ccaacccccc aagctgctga tctacggcgc cagcacaaga 180
gagagcggag tgcccgatag gttcagcggc agcggatccg gcaccgattt caccctgacc 240
atcagcagcc tgcaggccga ggatgtggcc gtgtactact gccagcagta ctacggctac 300
ccttacacct tcggcggcgg caccaaggtg gagatcaagc gtacggtggc tgcaccatct 360
gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420
ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480
caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540
ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600
gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660
tga 663
<210> 5
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> HRP00052抗体重链序列
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 6
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> HRP00052抗体重链序列编码基因序列
<400> 6
caggtgcaac tggtgcagag cggtgccgag gtgaagaagc ctggcgcaag cgtgaaagtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaggcaggcc 120
cctggacagg gcctggagtg gatgggcagg atcgggccca acagtggttt cactagctac 180
aatgaaaagt tcaagaacag ggtaaccatg accagggaca cctccaccag cacagtgtat 240
atggagctga gcagcctgag gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaggcggc 300
agcagctacg actacttcga ctattggggc cagggcacca ccgtgaccgt gagcagtgct 360
tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 420
acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac gaagacctac 600
acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagtccaaa 660
tatggtcccc catgcccacc atgcccagca cctgaggctg ctgggggacc atcagtcttc 720
ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatccc aggaggagat gaccaagaac 1080
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctctacag caggctcacc gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat 1260
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 1320
tccctgtctc tgggtaaatg a 1341
<210> 7
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> HRP00052抗体轻链序列
<400> 7
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His
20 25 30
Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 8
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> HRP00052抗体轻链序列编码基因序列
<400> 8
gacatcgtgc tgacccagag tcccgcctca cttgccgtga gccccggtca gagggccacc 60
atcacctgta gggccagcga gagcgtgagc atccacggca cccacctgat gcactggtat 120
caacagaaac ccggccagcc ccccaaactg ctgatctacg ccgccagcaa cctggagagc 180
ggcgtgcccg ccaggttcag cggctccggc agcggcaccg acttcaccct cactatcaac 240
cccgtggagg ccgaggacac cgccaactac tactgccagc agagcttcga ggaccccctg 300
accttcggcc agggcaccaa gctggagatc aagcgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttga 657
<210> 9
<211> 401
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人PD-L1-IgG1Fc
<400> 9
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn
20 25 30
Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn
35 40 45
Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu
50 55 60
Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala
65 70 75 80
Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val
85 90 95
Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala
100 105 110
Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala
115 120 125
Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr
130 135 140
Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg
145 150 155 160
Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys
165 170 175
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
180 185 190
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
195 200 205
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
210 215 220
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
225 230 235 240
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
245 250 255
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
260 265 270
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
275 280 285
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
290 295 300
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
305 310 315 320
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
325 330 335
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
340 345 350
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
355 360 365
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
370 375 380
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
385 390 395 400
Lys
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> HRP00049抗体HCDR1序列1
<400> 10
Asp Gly Ser Ala Tyr Trp Ser
1 5
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> HRP00049抗体HCDR1序列2
<400> 11
Asn Asp Tyr Trp Thr
1 5
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 来源于HRP00049抗体酵母菌展示文库的抗体HCDR2通式序列
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa选自Phe或Met
<220>
<221> UNSURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa选自Arg或Val
<220>
<221> UNSURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa选自Asn或His
<400> 12
Xaa Ile Ser Xaa Ala Gly Ser Thr Tyr Xaa Thr Pro Ser Leu Lys Gly
1 5 10 15
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> HRP00049抗体HCDR3
<400> 13
Ser Gly Gly Trp Leu Ala Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> HRP00049抗体LCDR1
<400> 14
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr His Ser Asn Gln Lys His Ser Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> HRP00049抗体LCDR2
<400> 15
Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> HRP00049抗体LCDR3
<400> 16
Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 17
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 来源于HRP00049抗体酵母菌展示文库的抗体重链可变区序列通式
<220>
<221> UNSURE
<222> (52)..(52)
<223> Xaa选自Phe或Met
<220>
<221> UNSURE
<222> (55)..(55)
<223> Xaa选自Arg或Val
<220>
<221> UNSURE
<222> (61)..(61)
<223> Xaa选自Asn或His
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asp Gly
20 25 30
Ser Ala Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Tyr Ile Gly Xaa Ile Ser Xaa Ala Gly Ser Thr Tyr Xaa Thr Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Gly Gly Trp Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 来源于HRP00049抗体酵母菌展示文库的抗体重链可变区序列通式
<220>
<221> UNSURE
<222> (50)..(50)
<223> Xaa选自Phe或Met
<220>
<221> UNSURE
<222> (53)..(53)
<223> Xaa选自Arg或Val
<220>
<221> UNSURE
<222> (59)..(59)
<223> Xaa选自Asn或His
<400> 18
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Asp
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Xaa Ile Ser Xaa Ala Gly Ser Thr Tyr Xaa Thr Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Gly Gly Trp Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> HRP00049抗体轻链可变区序列
<400> 19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr His
20 25 30
Ser Asn Gln Lys His Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 来源于HRP00052抗体酵母菌展示文库的抗体HCDR1序列通式
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa选自Ser和Asp
<220>
<221> UNSURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa选自Tyr和Lys
<220>
<221> UNSURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa选自His和Met
<400> 20
Xaa Xaa Trp Met Xaa
1 5
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 来源于HRP00052抗体酵母菌展示文库的抗体HCDR2序列通式
<220>
<221> UNSURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa选自Thr，Ser，His和Gly
<220>
<221> UNSURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa选自Ser，Asn和Gly
<220>
<221> UNSURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa选自Ser，Leu和Gly
<220>
<221> UNSURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa选自Phe，Leu，Trp和Met
<220>
<221> UNSURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa选自Ala，Pro和Thr
<220>
<221> UNSURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa选自Met，Val，Leu和Ser
<220>
<221> UNSURE
<222> (15)..(15)
<223> Xaa选自Phe和Tyr
<400> 21
Arg Ile Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Asn Glu Lys Xaa Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> HRP00052抗体HCDR3序列
<400> 22
Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> HRP00052抗体LCDR1序列
<400> 23
Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His Gly Thr His Leu Met His
1 5 10 15
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 来源于HRP00052抗体酵母菌展示文库的抗体LCDR2序列通式
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa选自Val和Ala
<220>
<221> UNSURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa选自Tyr和Asn
<220>
<221> UNSURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa选自Ala，Leu和Val
<220>
<221> UNSURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa选自Glu，Phe，Trp,Tyr和Ala
<400> 24
Xaa Ala Ser Xaa Xaa Xaa Ser
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> HRP00052抗体LCDR3序列
<400> 25
Gln Gln Ser Phe Glu Asp Pro Leu Thr
1 5
<210> 26
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 来源于HRP00052抗体酵母菌展示文库的抗体重链可变区序列通式
<220>
<221> UNSURE
<222> (31)..(31)
<223> Xaa选自Ser和Asp
<220>
<221> UNSURE
<222> (32)..(32)
<223> Xaa选自Tyr和Lys
<220>
<221> UNSURE
<222> (35)..(35)
<223> Xaa选自His和Met
<220>
<221> UNSURE
<222> (52)..(52)
<223> Xaa选自Thr，Ser，His和Gly
<220>
<221> UNSURE
<222> (54)..(54)
<223> Xaa选自Ser，Asn和Gly
<220>
<221> UNSURE
<222> (55)..(55)
<223> Xaa选自Ser，Leu和Gly
<220>
<221> UNSURE
<222> (57)..(57)
<223> Xaa选自Phe，Leu，Trp和Met
<220>
<221> UNSURE
<222> (58)..(58)
<223> Xaa选自Ala，Pro和Thr
<220>
<221> UNSURE
<222> (59)..(59)
<223> Xaa选自Met，Val，Leu和Ser
<220>
<221> UNSURE
<222> (64)..(64)
<223> Xaa选自Phe和Tyr
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Xaa Xaa
20 25 30
Trp Met Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Asn Glu Lys Xaa
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 来源于HRP00052抗体酵母菌展示文库的抗体轻链可变区序列通式
<220>
<221> UNSURE
<222> (54)..(54)
<223> Xaa选自Val和Ala
<220>
<221> UNSURE
<222> (57)..(57)
<223> Xaa选自Tyr和Asn
<220>
<221> UNSURE
<222> (58)..(58)
<223> Xaa选自Ala，Leu和Val
<220>
<221> UNSURE
<222> (59)..(59)
<223> Xaa选自Glu，Phe，Trp，Tyr和Ala
<400> 27
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His
20 25 30
Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Ala Ser Xaa Xaa Xaa Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 28
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 9-2 H5的HCDR2序列
<400> 28
Phe Ile Ser Arg Ala Gly Ser Thr Tyr Asn Thr Pro Ser Leu Lys Gly
1 5 10 15
<210> 29
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 9-2 H7的HCDR2序列
<400> 29
Met Ile Ser Val Ala Gly Ser Thr Tyr His Thr Pro Ser Leu Lys Gly
1 5 10 15
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 H12 的HCDR1
<400> 30
Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 H15 的HCDR1
<400> 31
Asp Lys Trp Met Met
1 5
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 H12 的HCDR2
<400> 32
Arg Ile Thr Pro Ser Ser Gly Phe Ala Met Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 H13 的HCDR2
<400> 33
Arg Ile Ser Pro Ser Leu Gly Leu Ala Val Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 H14 的HCDR2
<400> 34
Arg Ile His Pro Ser Leu Gly Leu Pro Leu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 H17的HCDR2
<400> 35
Arg Ile Gly Pro Asn Leu Gly Trp Ala Met Tyr Asn Glu Lys Tyr Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 H18 的HCDR2
<400> 36
Arg Ile Ser Pro Ser Ser Gly Met Ala Val Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 H19 的HCDR2
<400> 37
Arg Ile Ser Pro Gly Gly Gly Phe Thr Leu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 H20的 HCDR3
<400> 38
Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 L64 的LCDR2序列
<400> 39
Val Ala Ser Tyr Ala Ala Ser
1 5
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 L61的LCDR2序列
<400> 40
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 L66的LCDR2序列
<400> 41
Val Ala Ser Asn Val Phe Ser
1 5
<210> 42
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 9-2 H5重链可变区
<400> 42
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asp Gly
20 25 30
Ser Ala Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Tyr Ile Gly Phe Ile Ser Arg Ala Gly Ser Thr Tyr Asn Thr Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Gly Gly Trp Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 43
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 9-2 H6重链可变区
<400> 43
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Asp
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Phe Ile Ser Arg Ala Gly Ser Thr Tyr Asn Thr Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Gly Gly Trp Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 44
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 9-2 H7重链可变区
<400> 44
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Asp
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Met Ile Ser Val Ala Gly Ser Thr Tyr His Thr Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Gly Gly Trp Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 45
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 9-2 L11轻链可变区
<400> 45
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr His
20 25 30
Ser Asn Gln Lys His Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 46
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 H12重链可变区
<400> 46
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Thr Pro Ser Ser Gly Phe Ala Met Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 47
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 H13重链可变区
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Ser Leu Gly Leu Ala Val Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 48
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 H14重链可变区
<400> 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile His Pro Ser Leu Gly Leu Pro Leu Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 49
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 H15重链可变区
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Lys
20 25 30
Trp Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Thr Pro Ser Ser Gly Phe Ala Met Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 H16重链可变区
<400> 50
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Met Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Ser Leu Gly Leu Ala Val Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 51
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 H17重链可变区
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Gly Pro Asn Leu Gly Trp Ala Met Tyr Asn Glu Lys Tyr
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 52
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 H18重链可变区
<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Ser Ser Gly Met Ala Val Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 53
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 H19重链可变区
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ser Pro Gly Gly Gly Phe Thr Leu Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 54
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 H20重链可变区
<400> 54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 55
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 L64轻链可变区
<400> 55
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His
20 25 30
Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Tyr Ala Ala Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 56
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 L61轻链可变区
<400> 56
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His
20 25 30
Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 57
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 L66轻链可变区
<400> 57
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His
20 25 30
Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Val Phe Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 58
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> IgG1重链恒定区
<400> 58
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 59
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> kappa轻链恒定区
<400> 59
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 60
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 人IgG4重链恒定区
<400> 60
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 61
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> Avelumab(A09) 的重链序列
<400> 61
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 62
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> Avelumab(A09) 的轻链序列
<400> 62
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 63
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> 3280A(Genetech) 的重链序列
<400> 63
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 64
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> 3280A(Genetech)的轻链序列
<400> 64
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 65
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 人IgG4 S228P重链恒定区
<400> 65
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 66
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 H21重链可变区
<400> 66
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Lys
20 25 30
Trp Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Thr Pro Ser Ser Gly Phe Ala Met Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 L67的LCDR2
<400> 67
Val Ala Ser Asn Val Glu Ser
1 5
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 L68的LCDR2
<400> 68
Val Ala Ser Asn Val Trp Ser
1 5
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 L69的LCDR2
<400> 69
Val Ala Ser Asn Val Tyr Ser
1 5
<210> 70
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 L67轻链可变区
<400> 70
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His
20 25 30
Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 71
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 L68轻链可变区
<400> 71
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His
20 25 30
Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Val Trp Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 72
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 24D5 L69轻链可变区
<400> 72
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His
20 25 30
Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Val Tyr Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (19)

1.一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或抗原结合片段结合人PD-L1，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：14、SEQID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或抗原结合片段包含：
氨基酸序列如SEQ ID NO：42所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO：45所示的轻链可变区。
3.如权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为全长抗体，进一步包括人抗体恒定区。
4.如权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述人抗体恒定区的重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区，所述人抗体恒定区的轻链恒定区选自人抗体κ和λ链恒定区。
5.如权利要求4所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述全长抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：65所示的人抗体重链恒定区和氨基酸序列如SEQ ID NO：59所示的人轻链恒定区。
6.如权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体、二聚化的V区和二硫键稳定化的V区。
7.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1至6任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
8.一种核酸分子，其编码权利要求1至6任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
9.一种重组载体，其包含权利要求8所述的核酸分子。
10.一种用如权利要求9所述的重组载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
11.如权利要求10所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
12.用于生产如权利要求1至6任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括将如权利要求10或11所述的宿主细胞在培养基中进行培养以形成并积累权利要求1至6任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及从培养物回收所述单克隆抗体或其抗原结合片段。
13.如权利要求1至6任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备免疫检测或测定人PD-L1的药物中的应用。
14.如权利要求1至6任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备与人PD-L1相关的疾病的诊断剂中的应用。
15.如权利要求1至6任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或包含权利要求7所述的药物组合物在制备与人PD-L1相关的疾病的治疗剂中的应用。
16.如权利要求15所述的应用，其中所述疾病是肿瘤或癌症。
17.如权利要求15所述的应用，其中所述疾病选自PD-L1阳性的骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、骨髓异常增生综合征、胃肠癌、肾癌、卵巢癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞白血病、子宫内膜癌、***癌、黑素瘤、胰腺癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子***、膀胱癌、乳腺癌、头和颈癌、肝胆癌、中枢神经***癌、食管癌、恶性胸膜间皮瘤、全身性轻链淀粉样变性、淋巴浆细胞性淋巴瘤、神经内分泌肿瘤、睾丸癌和皮肤癌。
18.如权利要求15所述的应用，其中所述疾病选自PD-L1阳性的鳞状细胞癌、肝癌、多发性骨髓瘤、神经胶质瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞样白血病、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤、脑癌、胃癌、甲状腺癌、软骨肉瘤、透明细胞肾细胞癌、咽喉癌、骨髓增生性肿瘤、结肠直肠癌和梅克尔细胞癌。
19.如权利要求15所述的应用，其中所述疾病为PD-L1阳性的头和颈鳞状细胞癌、肝细胞瘤、肝细胞癌、多形性成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤或结肠癌。
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