CN111278844A - 用于使用氧化铁颗粒提取核酸的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

提供了用于从生物样品中提取核酸例如微RNA(miRNA)的方法和组合物。所述方法的多个方面包括使生物样品与蛋白酶K接触，然后在酸性条件下与氧化铁颗粒接触，以诱导所述氧化铁颗粒与所述样品中的核酸(例如，miRNA)之间的结合。在一些情况下，所述氧化铁颗粒作为可溶解膜的一部分提供，所述可溶解膜在溶剂化时释放所述氧化铁颗粒。在一些实施方案中，在所述核酸与所述氧化铁颗粒结合之后，将所述颗粒从所述样品中磁性分离，并与碱性洗脱缓冲液接触以释放所述核酸。

Description

用于使用氧化铁颗粒提取核酸的方法和组合物
相关申请的交叉引用
根据美国法典第35篇第119条(e)款，本申请要求2017年9月13日提交的美国临时专利申请序列号62/558,074的提交日期的优先权；所述申请的公开内容以引用的方式并入本文。
发明背景
微RNA(miRNA)是小的(长度为18-25个核苷酸)非编码RNA，其可以通过与其3'非翻译区(UTR)结合来有效减少靶mRNA的表达。这种活性通过装配由催化酶构成的RNA诱导的沉默复合物而发生，所述催化酶中的一种被称为Argonaut。如果miRNA序列与靶3'-UTR之间的同源性是不完全的，则此复合物通过阻断翻译来降低表达。但是，如果同源性是完全的，则靶mRNA的降解可能是最终结果。迄今为止，已经鉴定出能够靶向数千种基因的超过2000种不同的人类miRNA。每个组织都具有标记miRNA，这些标记miRNA在正常的生理状态下以一致的水平表达。但是，在患病表型的情况下，这些miRNA为异常调控的。各种研究已表明单个miRNA调控癌基因和肿瘤抑制基因表达的能力，且其他研究已表明miRNA基因缺失或突变可以有助于肿瘤发生。
发明内容
提供了用于从生物样品中提取核酸例如微RNA(miRNA)的方法和组合物。所述方法的多个方面包括使生物样品与蛋白酶K接触，然后在酸性条件下与氧化铁颗粒接触，以诱导所述氧化铁颗粒与所述样品内的核酸(例如，miRNA)之间的结合。在一些情况下，所述氧化铁颗粒作为可溶解膜的一部分提供，所述可溶解膜在溶剂化时释放所述氧化铁颗粒。在一些实施方案中，在所述核酸与所述氧化铁颗粒结合之后，将所述颗粒从所述样品中磁性分离，并与碱性洗脱缓冲液接触以释放所述核酸。
所提供方法的实施方案是有效和安全的。例如，本公开的方法不需要使用氯仿或苯酚，并且在一些情况下在不到三十分钟内完成。主题方法和组合物与任何方便的生物样品相容，包括但不限于：培养的细胞、保存(例如，交联/固定)的细胞、全血、血清、血浆、***固定石蜡包埋的(FFPE)组织样品、活检、生物，包括感染性疾病生物，例如细菌和病毒等。在一些情况下，提取的核酸(例如，miRNA)可用于各种下游应用(例如，诊断)，这些应用可以包括定量分析，例如核酸测序，例如通过下一代测序(NGS)、定量RT-PCR、链置换扩增(SDA)和微阵列杂交进行的核酸测序。在一些情况下，例如使用缀合至与丰富的微RNA杂交的核酸探针的氧化铁颗粒来从样品中消耗一种或多种丰富的miRNA。
所述方法的实施方案的多个方面包括鉴定与靶微RNA结合的生物分子。例如，在一些情况下，使生物样品与缀合至与靶微RNA互补的核酸探针的氧化铁颗粒群体接触，并且所述方法包括鉴定与靶miRNA结合的一种或多种生物分子。
还提供了用于进行主题方法的组合物和试剂盒。
本发明的实施方案满足了对用于从生物样品中提取核酸例如miRNA的有效方法的需求。本文提供的组合物和方法有助于从多种生物样品类型中有效地提取核酸(例如，miRNA)。提取的核酸可以用作诊断指标和/或治疗用靶标。
附图说明
图1描绘了由评估洗脱前的混合量是否影响miRNA的产量所获得的结果。
图2描绘了由评估在步骤5和7(施加磁场后)去除所有残余液体，相对于留下一些残余液体(例如，5μL或50μL残余)是否影响miRNA的产量所获得的结果。
图3描绘了由评估使用不同洗脱体积是否提高了miRNA的产量所获得的结果。
图4描绘了以下实验结果，所述实验测试了对基于FOX的核酸提取方法的各种修改(例如，所用蛋白酶K的量、与蛋白酶K一起孵育的温度以及结合缓冲液的体积)是否增加miRNA的产量和/或当测定提取的核酸样品中特异性miRNA的存在时是否增加检测的灵敏度。
图5描绘了以下实验结果，所述实验测试了在核酸(miRNA)提取方法中省略变性步骤(“煮沸”，以使蛋白酶K失活)或减少结合缓冲液/蛋白酶K孵育时间是否将改进从提取的核酸中检测miRNA。
图6描述了以下实验结果，所述实验测试了改进的基于FOX的核酸提取方法是否可以移接到BD Viper LT自动化平台上。
图7，图A至图F。(图A)尝试模拟BD Viper LT平台的体积限制，以评估在100ul而不是50ul中的洗脱是否增加miRNA的检测。低于1.0表示改进。(图B)评估了改进的方案(图19右侧)(“std”)，相对于添加两个FOX晶片(“2个条”)，相对于在添加稀释剂之前添加蛋白酶K(“proK先于HDB”)，相对于添加蛋白酶K且仅添加一半稀释剂(“0.5HDB”)。(图C)评估了改变稀释剂的体积是否改进miRNA的检测。(图D)评估了添加DNA酶和洗涤是否改进miRNA的检测。(图E)评估了2次相对于3次洗涤以及不同量的洗脱用的中和缓冲液。(图F)重复2次洗涤实验，并使用700uL稀释剂提取miRNA。
图8显示了使用蛋白酶K的不同来源是否影响miRNA提取的试验的数据。
图9，图A至图C。培养人结肠癌(HCT15)细胞，并收获1.6×10E6个细胞。左列表示使用原始氧化铁(FOX)方案(左列)或上面的改进方案(右列)进行DNA和RNA提取的结果。(图A)使用改进的方案时，DNA和RNA的产量均显著增加。(图B)所描绘的图显示了使用改进方法从人结肠癌(HCT15)细胞中提取的DNA和RNA的高纯度。(当A260/280比率大于1.8时，纯核酸是典型的)(图C)。所描绘的图表明，使用改进的方案从人结肠癌(HCT15)细胞提取的纯化DNA或RNA中剩余的杂质(可能是盐)减少。
图10显示了测量(使用qPCR)使用旧方案(参见图19左侧)提取的核酸中5种不同的示例miRNA时获得的原始Ct与改进方案的比较。
图11显示了实验数据，在所述实验中使用原始FOX或改进的FOX提取方案提取了血清和血浆核酸。使用qPCR从样品中测量了5种不同的miRNA(miR-16、miR-21、miR-99b、miR-181a和miR-451a)的量。对于每种miRNA：左侧的第一条代表使用改进方案从中提取RNA的血清样品；第二条代表使用原始方案从中提取RNA的血清样品；第三条代表使用改进方案从中提取RNA的血浆样品；以及第四条代表使用原始方案从中提取RNA的血浆样品
图12显示了实验数据，在所述实验中将各种人癌细胞系(PC3、LNCaP和HCT15)培养、沉淀并重悬于200uL水中，然后使用改进的FOX方案提取核酸。使用qPCR从样品中测量了5种不同的miRNA(miR-16、miR-21、miR-99b、miR-181a和miR-451a)的量。使用无模板(NTC)和负反转录酶对照(NRT)确定特异性。
图13显示了实验数据，在所述实验中从保存了不同时间量的BD SurePath保存的细胞(HCT15细胞)中提取了核酸(使用改进的FOX方案)。使用qPCR从样品中测量了5种不同的miRNA(miR-16、miR-21、miR-99b、miR-181a和miR-451a)的量。
图14显示了实验数据，在所述实验中从***固定石蜡包埋的(FFPE)组织中提取核酸(使用改进的FOX方案)：已归档(5年)的人结肠腺癌样品(顶图)和已归档的人非小细胞肺癌(NSCLC)样品(底图)。对于每个患者样品，在提取RNA之前，将三个10um组织切片合并在一起。组织块的龄期范围为3至5年。使用qPCR从样品中测量了5种不同的miRNA(miR-16、miR-21、miR-99b、miR-181a和miR-451a)的量。
图15提供了实验数据，在所述实验中从***固定石蜡包埋的(FFPE)组织和人血清样品中提取核酸(使用改进的FOX方案)。使用qPCR从样品中测量了5种不同的miRNA(miR-16、miR-21、miR-99b、miR-181a和miR-451a)的量。
图16显示了实验数据，在所述实验中合并患者血液，并使用200uL加工样品以使用三种不同方法从外周血中提取mRNA：(i)提取核酸的改进的FOX方案(每种mRNA的左边三个条)；每个方案Paxgene(每种mRNA的中间三个条)和Zymo全血RNA(每种mRNA的右边三个条)。使用SuperScript III和对GAPdH(跨越外显子7-8)、GusB和Hprt1特异的引物进行标准qPCR以测量mRNA。
图17显示了实验数据，在所述实验中使用改进的FOX方案从200uL冷冻血清中提取微RNA。qPCR中每ng使用4ng或约103个拷贝。
图18，图A至图B显示了实验数据，在所述实验中将不同量的总RNA添加到每个miR-99b qPCR反应中，以确定来自改进的FOX方案或其他经测试的提取方法的遗留盐是否具有抑制作用。数据以两种方式显示(图A和图B)。
图19显示了一个表格，其突出显示并比较了原始FOX提取方案(左列)和改进的FOX提取方案(右列)。
具体实施方式
提供了用于从生物样品中提取核酸例如微RNA(miRNA)的方法和组合物。所述方法的多个方面包括使生物样品与蛋白酶K接触，然后在酸性条件下与氧化铁颗粒接触，以诱导所述氧化铁颗粒与所述样品中的核酸(例如，miRNA)之间的结合。在一些情况下，所述氧化铁颗粒作为可溶解膜的一部分提供，所述可溶解膜在溶剂化时释放所述氧化铁颗粒。在一些实施方案中，在所述核酸与所述氧化铁颗粒结合之后，将所述颗粒从所述样品中磁性分离，并与碱性洗脱缓冲液接触以释放所述核酸。
在一些实施方案中，提供了鉴定与靶微RNA结合的生物分子的方法。例如，在一些情况下，使生物样品与缀合至与靶微RNA互补的核酸探针的氧化铁颗粒群体接触，并且所述方法包括鉴定与靶miRNA结合的一种或多种生物分子。
还提供了用于进行主题方法的组合物和试剂盒。
在更详细描述本公开的实施方案之前，应了解本公开不限于所述特定实施方案，因此所述实施方案当然可变化。如本领域技术人员所理解的，本公开涵盖各种替代、修改和等效物。也应理解本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意图进行限制，因为本公开的范围将仅受限于所附权利要求书。
在提供值的范围的情况下，应理解在那个范围的上限与下限之间的每个中介值(intervening value)(除非上下文另外清楚地指出，否则直至下限的单位的十分之一)以及那个陈述的范围内的任何其他陈述值或中介值都涵盖在公开内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在本公开内，属于陈述的范围内的任何明确排除的极限。当陈述的范围包括一个或两个极限时，排除那些包括的极限中的任一个或两个的范围也包括在本公开中。
在确定数字是否接近或近似具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在其出现的上下文中提供与具体列举的数字大致等同的数字。
应注意，如本文和所附权利要求书中所用，除非上下文另外清楚指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指示物。应进一步指出，权利要求书可以拟订成排除任何任选的要素。因此，这种陈述意图充当结合权利要求要素的叙述来使用诸如“仅仅”、“仅”等排他性术语或使用“否定”限制的前提基础。
如将为本领域技术人员在阅读本公开后显而易知，本文描述和说明的每个单独的实施方案具有离散的组成部分和特征，其可易于与任何其他若干实施方案的特征分开或组合而不脱离本公开的范围或精神。任何所陈述方法均可按所陈述事件的次序或按逻辑上可能的任何其他次序进行。
本说明书中引用的任何公布和专利均以引用的方式并入本文，如同每个单独的公布或专利被具体并且单独地指示为以引用的方式并入并且以引用的方式并入本文中以公开和描述引用公布所结合的方法和/或材料。任何公布的引用都是因为它的公开在提交日期之前，而不应解释为认可本公开由于先前公开而无权先于所述公布。另外，所提供的公布日期可能不同于实际的公布日期，实际的公布日期可能需要独立确认。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然与本文所述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可用于实践或测试本公开，但是现在描述代表性例示性方法和材料。
方法和组合物
本公开的多个方面包括用于从生物样品中提取核酸(例如，微RNA、mRNA、DNA)的方法。在一些情况下，提取的核酸是微RNA(miRNA)。因而，本公开的多个方面包括用于从生物样品中提取微RNA(miRNA)的方法。
如本文所用，术语“生物样品”涵盖任何生物来源的样品，并且涵盖诸如全血、血浆、血清、吸出物、脑脊髓液、尿液、唾液、腹水、肿瘤液、巴氏(pap)涂片样品、生物流体的样品并且还包括通过手术切除获得的组织、通过活检获得的组织、培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解液、组织样品、器官、骨髓等。“生物样品”包括生物流体和由其衍生的细胞(例如，癌细胞、感染细胞等)，例如，从此类细胞获得的包含多核苷酸的样品(例如，细胞裂解液或其他包含多核苷酸的细胞提取物)。所述定义还包括微生物，例如细菌、病毒等，其中在一些情况下，微生物是例如引起感染性疾病病状的感染性微生物。所述定义还包括在采购后以任何方式，例如通过使用试剂(例如固定试剂)进行处理、溶解、富集某些组分或标记(例如使用标记进行非共价或共价标记)操作过的样品。
在一些情况下，生物样品是细胞样品，并且在一些情况下，生物样品是无细胞的(不包含细胞)。待提取的核酸可以在生物样品的细胞内，并且在一些情况下，样品包含细胞外核酸(例如，在外来体中、在微泡中、未封装、无细胞等)。因此，在一些情况下，仅提取细胞外核酸(例如，如果生物样品不包含细胞和/或如果所述方法不包括诸如暴露细胞内核酸的细胞裂解步骤的步骤)。在一些情况下，仅提取细胞内核酸(例如，如果生物样品不包含细胞外核酸)。在一些情况下，提取细胞外和细胞内核酸。
因此，在一些实施方案中，本公开的方法(即“主题方法”)不包括裂解样品的细胞的步骤，并且在一些情况下，主题方法包括裂解样品的细胞的步骤。在一些情况下，主题方法不包括使样品的细胞与包含去污剂的溶液接触的步骤(例如，从细胞和/或从外来体和微泡等中释放核酸)。在一些情况下，主题方法包括使样品的细胞与包含去污剂的溶液接触的步骤(例如，从细胞和/或从外来体和微泡等中释放核酸)。当需要时，可以使用任何方便的方法(例如，使用裂解缓冲液、与去污剂接触、不使用去污剂例如使用超声和/或其他物理手段的裂解等)进行细胞裂解。
在一些情况下，生物样品的核酸是交联的。例如，在一些情况下，样品先前已被固定(例如，用甲醛固定)。在一些此类情况下，生物样品是固定的细胞样品(例如，包含在培养物中固定的细胞的样品、包含在体内固定的细胞的样品)。在一些情况下，生物样品是***固定石蜡包埋的(FFPE)组织样品。在一些情况下，生物样品包含来自FFPE组织样品的细胞。
主题方法可以是DNA酶相容的，并且因此在一些情况下，主题方法包括与DNA酶接触以从样品中去除DNA同时保留RNA(例如miRNA)完整的步骤。在一些情况下，主题方法的一个或多个步骤是通过液体处理机器人执行的。在一些情况下，主题方法的所有步骤都是通过液体处理机器人执行的。在一些情况下，所述方法(从与蛋白酶例如蛋白酶K接触到洗脱)在45分钟或更短时间(例如，40分钟或更短时间、35分钟或更短时间、30分钟或更短时间)内完成。
样品稀释剂
在一些情况下，将样品在样品稀释剂中稀释，例如在一些情况下，在与蛋白酶(例如，蛋白酶K)接触之前，以及在一些情况下，在与蛋白酶(例如，蛋白酶K)接触之后。样品稀释剂可以是与保留核酸相容的任何方便的缓冲液。例如，在一些情况下，样品稀释剂包含缓冲剂，例如Tris(例如，Tris HCl)(例如，在一些情况下，浓度在200mM-1.5M之间)。
在一些情况下，样品稀释剂可用作裂解缓冲液。因此，在一些情况下，样品稀释剂包含一种或多种去污剂(例如Triton X-100、Triton X-114、NP-40、BriJ-35、BriJ-58、Tween 20、Tween 80、辛基葡糖苷、辛基硫代葡糖苷、SDS、CHAPS、CHAPSO等)。在一些此类情况下，去污剂的浓度范围为0.2％至2％(例如，0.2-1.5％、0.2-1％、0.5-2％、0.5-1.5％或0.5-1％)。
可以使用任何方便的体积(用于样品稀释剂)，并且在一些情况下可以根据起始材料的量进行选择。例如，当使用200μL生物样品时，在一些情况下所使用的样品稀释剂的体积范围可为500至1000μL(例如，500至900、500至800、500至750、500至700、600至1000、600至900、600至800、600至750、600至700、650至1000、650至900、650至800、650至750或650至700μL)。作为另一个实例，当使用200μL生物样品时，在一些情况下所使用的样品稀释剂的体积范围可为600至800μL(例如，650至750μL)。作为另一个实例，当使用200μL生物样品时，所使用的样品稀释剂的体积为约600、650、700、750、800或850μL。在一些此类情况下，所使用的样品稀释剂的体积为约700μL。在一些情况下，所使用的样品稀释剂的体积为约850μL。在一些情况下，所使用的样品稀释剂的体积为约750μL。在一些情况下，所使用的样品稀释剂的体积为约800μL。
如本公开中其他地方所指出的，在本公开的附图和文本中呈现为特定值的体积(例如“x”μL)(对于主题方法中所使用的所有试剂，而不仅仅是关于样品稀释剂体积所讨论的那些)可以基于生物样品的起始体积按比例调整。作为例示性实例，在一些情况下，所使用的样品稀释剂的量范围为2.5至5体积(相对于生物样品的起始体积)(例如，2.5至4.5、2.5至4、2.5至3.75、2.5至3.5、2.5至3、3至5、3至4.5、3至4、3至3.75、3至3.5、3.5至5、3.5至4.5、3.5至4或3.25至3.75体积)。在一些情况下，所使用的样品稀释剂的量范围为3.25至3.75体积(相对于生物样品的起始体积)。在一些情况下，所使用的样品稀释剂的量为约3.5体积(相对于生物样品的起始体积)。在一些情况下，所使用的样品稀释剂的量为约4.25体积(相对于生物样品的起始体积)。在一些情况下，所使用的样品稀释剂的量为约4体积(相对于生物样品的起始体积)。
在一些情况下，样品稀释剂是碱性的。例如，在一些情况下，样品稀释剂的pH值范围为8-12.5(例如，8-12、8-11、8-11.5、8-10.5、8-10、8-9.5、8-9、8.5-12.5、8.5-12、8.5-11.5、8.5-11、8.5-10.5、8.5-10、8.5-9.5、9-12.5、9-12、9-11.5、9-11、9-10.5或9-10)。在一些情况下，样品稀释剂包含抗微生物剂(例如，Proclin)。
合适的样品稀释剂的一个例示性实例是包含599mM Tris-HCl、373mM Tris碱、243mM NaCl、0.83％Triton X-100和0.03％Proclin的稀释剂。
蛋白酶K
如上所述，在一些实施方案中，使生物样品与蛋白酶K接触。但是，可以使用任何方便的蛋白酶(蛋白质消化酶)。在一些情况下，蛋白酶可以是任何非特异性蛋白酶，例如任何非特异性丝氨酸蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶或其他枯草杆菌蛋白酶型蛋白酶)。
使样品与蛋白酶(例如，蛋白酶K)接触降解样品中存在的蛋白质，并且可以在多种温度下并且在多种时间内进行。在一些实施方案中，与蛋白酶(例如，蛋白酶K)的接触在范围为45℃至56℃(例如，45至55、45至54、45至53、45至52、45至51、45至50、47至56、47至55、47至54、47至53、47至52、47至51、47至50、48至56、48至55、48至54、48至53、48至52、48至51、48至50、49至56、49至55、49至54、49至53、49至52或49至51℃)的温度下进行。在一些情况下，与蛋白酶(例如，蛋白酶K)的接触在范围为45℃至55℃(例如，45至54、45至53、45至52、45至51、45至50、47至55、47至54、47至53、47至52、47至51、47至50、48至55、48至54、48至53、48至52、48至51、48至50、49至55、49至54、49至53、49至52或49至51℃)的温度下进行。在一些情况下，与蛋白酶(例如，蛋白酶K)的接触在范围为47℃至53℃(例如47至52、47至51、47至50、48至53、48至52、48至51、49至53、49至52或49至51℃)的温度下进行。在一些情况下，与蛋白酶(例如，蛋白酶K)的接触在范围为49℃至51℃(例如，50℃)的温度下进行。
在一些实施方案中，与蛋白酶(例如，蛋白酶K)的接触进行持续范围为8至40分钟(例如，8至35、8至30、8至25、8至20、8至18、8至15、8至12、10至40、10至35、10至30、10至25、10至20、10至18、10至15、10至12、15至40、15至35、15至30、15至25、15至20、15至18、20至40、20至35、20至30、25至40、25至35、25至30或28至32分钟)的时间段。在一些情况下，与蛋白酶(例如，蛋白酶K)的接触进行持续范围为20至40分钟(例如，20至35、20至30、25至40、25至35、25至32、25至30、28至40、28至35或28至32分钟)的时间段。在一些情况下，与蛋白酶(例如，蛋白酶K)的接触进行约10分钟。在一些情况下，与蛋白酶(例如，蛋白酶K)的接触进行约15分钟。在一些情况下，与蛋白酶(例如，蛋白酶K)的接触进行约20分钟。在一些情况下，与蛋白酶(例如，蛋白酶K)的接触进行约25分钟。在一些情况下，与蛋白酶(例如，蛋白酶K)的接触进行约30分钟。
在一些实施方案中，与蛋白酶(例如，蛋白酶K)的接触在范围为47℃至53℃的温度下进行并且持续范围为8至40分钟(例如，8至15、8至12、25至40、25至35、25至32、28至40、28至25或28至32分钟)的时间段。在一些实施方案中，与蛋白酶(例如，蛋白酶K)的接触在范围为47℃至53℃的温度下进行并且持续约30分钟。在一些实施方案中，与蛋白酶(例如，蛋白酶K)的接触在范围为47℃至53℃的温度下进行并且持续约10分钟。在一些情况下，与蛋白酶(例如，蛋白酶K)的接触在范围为48℃至52℃的温度下进行并且持续范围为10至30分钟的时间段。在一些情况下，与蛋白酶(例如，蛋白酶K)的接触在范围为47℃至53℃(例如，48至52℃或49至51℃，或50℃)的温度下进行并且持续范围为20至35分钟(例如，25至35分钟、28至32分钟或29至31分钟，或30分钟)的时间段。在一些实施方案中，与蛋白酶(例如，蛋白酶K)的接触在范围为48℃至52℃的温度下进行并且持续约30分钟。在一些实施方案中，与蛋白酶(例如，蛋白酶K)的接触在范围为48℃至52℃的温度下进行并且持续约10分钟。
在一些实施方案中，蛋白酶(例如，蛋白酶K)的使用浓度范围为750至1600μg/mL(例如，750至1500、750至1400、750至1350、800至1600、800至1500、800至1400、800至1350、900至1600、900至1500、900至1400、900至1350、1000至1600、1000至1500、1000至1400、1000至1350、1100至1600、1100至1500、1100至1400、1100至1350、1200至1600、1200至1500、1200至1400或1200至1350μg/mL)。在一些情况下，蛋白酶(例如，蛋白酶K)的使用浓度范围为1100至1400μg/ml(例如1250μg/ml)。在一些情况下，蛋白酶(例如，蛋白酶K)的使用浓度为约1250μg/ml。作为例示性实例(例如，参见图19的右侧)，如果蛋白酶K的储备浓度为20mg/mL，并将60μL储备溶液添加到900μL(例如200μL样品加700μL稀释剂)中，则蛋白酶K的使用浓度为1.3mg/mL。
在一些实施方案中，蛋白酶(例如，蛋白酶K)的使用浓度范围为22至48mAU/mL(例如，25至45、25至40、30至48、30至40、35至48、35至45或35至40mAU/mL)。在一些情况下，蛋白酶(例如，蛋白酶K)的使用浓度范围为35至40mAU/mL(例如，37.5mAU/mL)。
可以使用任何方便的体积(对于蛋白酶)，并且这很可能取决于起始材料的量。例如，当使用200μL生物样品时，在一些情况下，所使用的蛋白酶(例如，蛋白酶K)的体积范围可为45至80μL(例如，45至75、45至70、45至65、45至62、50至80、50至75、50至70、50至65、50至62、55至80、55至75、55至70、55至65、55至62、58至80、58至75、58至70、58至65或58至62μL)。作为另一个实例，在一些此类情况下，所使用的蛋白酶(例如，蛋白酶K)的体积为约45、50、55、60、65、70或80μL。在一些情况下，所使用的蛋白酶(例如，蛋白酶K)的体积为约45μL。在一些情况下，所使用的蛋白酶(例如，蛋白酶K)的体积为约50μL。在一些情况下，所使用的蛋白酶(例如，蛋白酶K)的体积为约55μL。在一些情况下，所使用的蛋白酶(例如，蛋白酶K)的体积为约60μL。在一些情况下，所使用的蛋白酶(例如，蛋白酶K)的体积为约70μL。
如本公开中其他地方所指出的，在本公开的附图和文本中呈现为特定值的体积(例如“x”μL)(对于主题方法中所使用的所有试剂，而不仅仅是关于蛋白酶体积所讨论的那些)可以基于生物样品的起始体积按比例调整。作为例示性实例，在一些情况下，所使用的蛋白酶(例如，蛋白酶K)的量范围为0.225至0.4体积(相对于生物样品的起始体积)(例如，0.225至0.375、0.225至0.35、0.225至0.325、0.225至0.31、0.25至0.4、0.25至0.375、0.25至0.35、0.25至0.325、0.25至0.31、0.275至0.4、0.275至0.375、0.275至0.35、0.275至0.325、0.275至0.31、0.29至0.4、0.29至0.375、0.29至0.35、0.29至0.325或0.29至0.31体积)。在一些情况下，所使用的蛋白酶(例如，蛋白酶K)的量为约0.225、0.25、0.275、0.29、0.3、0.31、0.325、0.35、0.375或0.4体积(相对于生物样品的起始体积)。在一些情况下，所使用的蛋白酶(例如，蛋白酶K)的量为约0.15体积(相对于生物样品的起始体积)。在一些情况下，所使用的蛋白酶(例如，蛋白酶K)的量为约0.25体积(相对于生物样品的起始体积)。在一些情况下，所使用的蛋白酶(例如，蛋白酶K)的量为约0.275体积(相对于生物样品的起始体积)。在一些情况下，所使用的蛋白酶(例如，蛋白酶K)的量为约0.3体积(相对于生物样品的起始体积)。在一些情况下，所使用的蛋白酶(例如，蛋白酶K)的量为约0.325体积(相对于生物样品的起始体积)。在一些情况下，所使用的蛋白酶(例如，蛋白酶K)的量为约0.35体积(相对于生物样品的起始体积)。
在一些情况下，例如通过在95℃至100℃下加热来使蛋白酶(例如，蛋白酶K)变性是有益的。在一些此类情况下，可以在使样品与蛋白酶K接触之后并且在与氧化铁颗粒接触之前使用变性步骤。如果使用加热(例如，煮沸)进行变性，那么在一些情况下太高的温度可能是有害的。例如，在一些情况下，使用加热进行变性，且温度低于114℃(例如，低于110℃或低于105℃)。在一些情况下，使用加热进行变性，且变性的温度范围为90-113℃(例如，90-110℃、90-105℃、90-100℃、92-113℃、92-110℃、92-105℃、92-100℃、92-98℃、95-113℃、95-110℃、95-105℃或95-100℃)。在一些情况下，变性步骤(例如，加热)进行5至30分钟(例如，5至25、5至20、5至15、5至12、7至13、8至12、9至11、7至30、7至25、7至20、7至15、7至12、8至30、8至25、8至20或8至15分钟)。在一些情况下，变性的温度范围为92-98℃并且进行8至12分钟。
在变性步骤之后，可以将样品冷却(例如，至低于40℃)。在一些情况下，冷却在空气中(例如，在室温下)进行。在一些情况下，冷却在冰上和/或水中进行(例如，持续时间范围为1-20分钟，例如1-15分钟、1-10分钟、1-5分钟、2-20分钟、2-15分钟、2-10分钟、2-5分钟或2分钟)。在一些情况下，冷却在冰上和/或水中进行至少1分钟(例如，至少2分钟)。
核酸与氧化铁颗粒的结合
在一些实施方案中，在使生物样品与蛋白酶(例如，蛋白酶K)接触后，然后使样品在酸性条件下与氧化铁(FOX)颗粒接触以诱导氧化铁颗粒与样品的核酸(例如，miRNA)之间的结合。如上所述，术语“氧化铁颗粒”在本文中用于涵盖所有形式的氧化铁颗粒(例如，氢氧化铁颗粒、四氧化三铁颗粒等)。接触是在酸性条件下进行的，因为FOX颗粒在酸性pH下变得带正电并与带负电的核酸结合(稍后在碱性(basic/alkaline)条件下进行洗脱，因为FOX颗粒在碱性pH下变得带负电，而带负电的核酸从FOX颗粒释放到溶液中)。
在一些情况下，可以通过添加酸性结合缓冲液实现“酸性条件”。在一些此类情况下，样品与FOX颗粒之间的接触发生在添加酸性结合缓冲液之前。例如，在一些情况下，使蛋白酶(例如，蛋白酶K)接触的样品与FOX颗粒接触。在一些此类情况下，FOX颗粒是可溶解膜的一部分，并且样品在与酸性结合缓冲液接触之前先与FOX颗粒混合。
在一些实施方案中，FOX颗粒与样品的混合(并且在一些情况下，这包括可溶解膜的溶剂化)可以通过移液完成。在一些此类情况下，在添加结合缓冲液之前，将样品移液3次或更多次(例如，4次或更多次、5次或更多次、6次或更多次、7次或更多次、8次或更多次、9次或更多次或10次或更多次)。在一些情况下，在添加结合缓冲液之前，将样品移液约10次。在一些此类情况下，在添加酸性结合缓冲液后，将样品移液3次或更多次(例如，4次或更多次、5次或更多次、6次或更多次、7次或更多次、8次或更多次、9次或更多次或10次或更多次)。在一些情况下，在添加酸性结合缓冲液后，将样品移液约10次。在一些此类情况下，在添加酸性结合缓冲液之前和之后，将样品移液3次或更多次(例如，4次或更多次、5次或更多次、6次或更多次、7次或更多次、8次或更多次、9次或更多次或10次或更多次)。在一些情况下，在添加酸性结合缓冲液之前和之后，将样品移液约10次。
酸性结合缓冲液可以是任何方便的缓冲液(例如，包含磷酸钠和/或磷酸钾的缓冲液)，并且在一些情况下，可以使用酸(例如硫酸)以使缓冲液的pH达到所需范围。作为例示性实例，酸性结合缓冲液在一些情况下可以包含磷酸二氢钠(例如，0.5M)和硫酸(例如，3.75M)。
在一些实施方案中，酸性结合缓冲液的pH范围将为1.2至3(例如，1.2至2.8、1.2至2.6、1.2至2.4、1.2至2.2、1.2至2、1.3至3、1.3至2.8、1.3至2.6、1.3至2.4、1.3至2.2、1.3至2、1.4至3、1.4至2.8、1.4至2.6、1.4至2.4、1.4至2.2、1.4至2、1.5至3、1.5至2.8、1.5至2.6、1.5至2.4、1.5至2.2或1.5至2)。在一些情况下，酸性结合缓冲液的pH范围为1.5至2。
可以使用任何方便的体积(对于酸性结合缓冲液)，并且这很可能取决于起始材料的量。例如，当使用200μL生物样品时，在一些情况下，所使用的酸性结合缓冲液的体积范围可为40至120μL(例如，40至115、40至100、40至90、40至80、40至70、40至60、40至55、40至52、40至50、45至115、45至100、45至90、45至80、45至70、45至60、45至55、45至52、45至50、50至115、50至100、50至90、50至80、50至70或50至60μL)。作为另一个实例，在一些此类情况下，所使用的酸性结合缓冲液的体积为约45、47、50或55μL。在一些情况下，所使用的酸性结合缓冲液的体积为约47μL。在一些情况下，所使用的酸性结合缓冲液的体积为约55μL。
如本公开中其他地方所指出的，在本公开的附图和文本中呈现为特定值的体积(例如“x”μL)(对于主题方法中所使用的所有试剂，而不仅仅是关于酸性结合缓冲液体积所讨论的那些)可以基于生物样品的起始体积按比例调整。作为例示性实例，在一些情况下，所使用的酸性结合缓冲液的量范围为0.2至0.6体积(相对于生物样品的起始体积)(例如，0.2至0.5、0.2至0.4、0.2至0.3、0.2至0.25、0.2至0.235、0.225至0.5、0.225至0.4、0.225至0.3、0.225至0.285、0.225至0.25或0.225至0.235体积)。在一些情况下，所使用的酸性结合缓冲液的量为约0.225、0.235、0.25或0.275体积(相对于生物样品的起始体积)。在一些情况下，所使用的酸性结合缓冲液的量为约0.225体积(相对于生物样品的起始体积)。在一些情况下，所使用的酸性结合缓冲液的量为约0.235体积(相对于生物样品的起始体积)。在一些情况下，所使用的酸性结合缓冲液的量为约0.275体积(相对于生物样品的起始体积)。
在一些情况下，提供/使用作为可溶解膜的一部分的本公开的磁响应颗粒(氧化铁颗粒)，所述可溶解膜溶解以释放结合到样品的核酸的FOX颗粒。术语“氧化铁颗粒”在本文中用于涵盖所有形式的氧化铁颗粒(例如，氢氧化铁颗粒、四氧化三铁颗粒等)。合适于与本公开结合使用的膜可以通过本领域技术人员熟悉的技术制成，例如美国专利号6,419,903(所述专利以全文引用方式并入本文)中描述的技术，例如对于关于制造膜的技术的教导。还参见美国专利号9,267,167(所述专利以全文引用方式并入本文)，例如对于其关于“磁响应颗粒”(例如，铁氧化物颗粒)和可溶解膜的教导。
在一些情况下，可溶解膜由包括以下一种或多种的材料形成：羟烷基甲基纤维素；羧甲基纤维素；羧酸羟烷基酯单体；乙氧基化(甲基)丙烯酸羟烷基酯；丙氧基化(甲基)丙烯酸羟烷基酯；聚乙二醇(PEG)；聚乙烯醇(PVA)；及其组合。
合适的技术包括形成包含膜的组成组分的溶液或浆液、流延并干燥所述溶液或浆液以形成膜。一旦干燥，可以将膜切成段。或者，可以将膜连续流延并以卷的形式积累。用于将物质或组分掺入膜中的任选技术可以包括通过任何合适的技术来生产膜，以及通过表面施加技术将组分或物质掺入膜中。例如，膜可以处于未完全干燥或固化的状态，然后将组分或物质引入其表面并完成干燥或固化过程。所得膜在膜表面上或附近包含组分。对这种技术的修改也是可能的。例如，完全干燥或固化的膜可以形成起始材料。然后可以对干燥或固化的膜进行诸如加热或润湿的过程，以使表面被改性以更容易地接受组分或物质。然后可以将组分或物质添加到改性的表面上，并且将膜干燥或冷却以得到在膜的表面处包含掺入其中的组分或物质的膜。或者，可以将物质或额外组分简单地施加到完全干燥或固化的膜的表面上。
可以以任何合适的方式将磁响应颗粒引入膜中。例如，可以将颗粒引入形成膜的溶液或浆料中，使得在流延和干燥时，膜包含分散在可溶解的基质中并被可溶解的基质捕获的磁响应颗粒。或者，可通过任何方便的表面施加技术将颗粒掺入膜中。在膜溶解时，磁性颗粒被释放，并且可以例如分散到充当溶剂的物质或混合物中。磁响应颗粒可以是被涂覆或未被涂覆、被处理或未被处理和/或缺乏任何方便类型的表面改性的。
磁分离和残余液体的去除
在一些实施方案中，主题方法包括将氧化铁(FOX)颗粒从它们所在的溶液中磁性分离出的步骤。因此，将磁场(例如，使用磁体)施加到样品，使得FOX颗粒在物理上彼此聚集。此时存在的样品的液体在本文中称为“残余液体”。在一些情况下，在进行下一步之前，去除残余液体。在一些此类情况下，去除了90％或更多的残余液体(例如，95％或更多、98％或更多或100％的残余液体)。在一些情况下，去除尽可能多的残余液体。
洗涤缓冲液
在一些实施方案中，主题方法包括洗涤步骤(例如，使用酸性洗涤缓冲液-关于合适的缓冲液和合适的pH范围的描述，参见上面的酸性结合缓冲液部分)。当包含时，可以执行任意数目的方便的洗涤(例如1次、2次、3次、4次等)。在一些情况下，洗涤缓冲液包含去污剂。在一些情况下，洗涤缓冲液包含抗微生物剂(例如，Proclin 300)。在一些情况下，洗涤缓冲液包含去污剂(例如，Tween-20)。
在一些情况下，当使用洗涤缓冲液时，在去除洗涤溶液之前先将样品混合(颗粒与洗涤缓冲液混合)。在一些此类情况下，将样品用洗涤缓冲液移液3次或更多次(例如，4次或更多次、5次或更多次、6次或更多次、7次或更多次、8次或更多次、9次或更多次或10次或更多次)。在一些情况下，将样品用洗涤缓冲液移液约3次。在一些情况下，将样品用洗涤缓冲液移液约5次。在一些情况下，将样品用洗涤缓冲液移液约10次。
洗脱缓冲液
洗脱缓冲液可以是碱性的，以便从氧化铁颗粒洗脱核酸。在一些情况下，洗脱缓冲液的pH值范围为10至13(例如，10至12.8、10至12.5、10至12、10.5至13、10.5至12.8、10.5至12.5、10.5至12、11至13、11至12.8、11至12.5、11至12或11.3至11.8；或pH值为约11.5、11.8、12或12.2)。在一些情况下，洗脱缓冲液的pH为11.4至11.8。在一些情况下，洗脱缓冲液的pH值为11.5至12.5。在一些情况下，洗脱缓冲液的pH值为约12。
洗脱缓冲液可包含任何方便的有机和/或无机缓冲剂。例如，在一些情况下，洗脱缓冲液包含2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇(Tris，三(羟甲基)氨基甲烷)。在一些情况下，洗脱缓冲液包含氢氧化钾(例如，在一些情况下，50mM-70mM或约60mM氢氧化钾)。
在一些情况下，洗脱缓冲液包含Tris且pH值范围为10至13(例如，10至12.8、10至12.5、10至12、10.5至13、10.5至12.8、10.5至12.5、10.5至12、11至13、11至12.8、11至12.5、11至12或11.3至11.8；或pH值为约11.5、11.8、12或12.2)。在一些情况下，洗脱缓冲液将包含浓度为1与100mM之间(例如，1与20mM之间或5与15mM之间，或约1、2、5、10、15、20、25、30、40或50mM)的缓冲剂(例如，Tris)。在一些情况下，洗脱缓冲液包含浓度范围为9-11mM的缓冲剂(例如，Tris)。在一些情况下，洗脱缓冲液包含浓度为约10mM的缓冲剂(例如，Tris)。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液可包含以下一种或多种(例如，在一些情况下除Tris外)：(1)4-(环己氨基)-1-丁磺酸(CABS)；(2)3-(环己氨基)-1-丙磺酸(CAPS)；(3)3-(环己氨基-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)；(4)2-(环己氨基)乙磺酸(CHES)；(5)N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(3-丙磺酸)(EPPS)；(6)N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸(HEPES)；(7)2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)；(8)3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)；(9)哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸(PIPES)；(10)[(2-羟基-1,1-双[羟甲基]乙基)氨基]-1-丙磺酸(TAPS)；(11)乙醇胺；和(12)3-氨基-1-丙磺酸。在一些情况下也可以使用无机缓冲剂如磷酸钠和磷酸钾，并且洗脱缓冲液可以包含多于一种缓冲剂的组合。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液不包含螯合剂。但是，可能希望使用螯合剂。当存在时，螯合剂可包括但不限于EDTA和EGTA(例如，浓度范围为0.1mM至100mM，例如0.5至50mM或1至10mM)。
在一些情况下可以使用防腐剂，例如叠氮化钠(例如，浓度范围为约0.1％至0.4％)。在一些情况下可以使用稳定剂，例如聚乙二醇(例如，浓度范围为约0.04％至1％)。
可以使用任何方便的洗脱体积，并且洗脱体积可能取决于起始材料的量。例如，当使用200μL生物样品时，在一些情况下，洗脱步骤中使用的洗脱缓冲液的量可以范围为10至200μL(例如，10至150、10至120、10至100、10至80、10至60、10至50、10至40、10至30、20至200、20至150、20至120、20至100、20至80、20至60、20至50、20至40、20至30、30至200、30至150、30至120、30至100、30至80、30至60、30至50、30至40、40至200、40至150、40至120、40至100、40至80、40至60、40至50、50至200、50至150、50至120、50至100、50至80或50至60μL)。作为另一个实例，在一些此类情况下，洗脱步骤中使用的洗脱缓冲液的量为约10、20、30、40、50、60、80或100μL。在一些情况下，洗脱步骤中使用的洗脱缓冲液的量为约30μL。在一些情况下，洗脱步骤中使用的洗脱缓冲液的量为约40μL。在一些情况下，洗脱步骤中使用的洗脱缓冲液的量为约50μL。在一些情况下，洗脱步骤中使用的洗脱缓冲液的量为约100μL。
选择的体积可以取决于选择的下游应用。例如，对于一些下游应用，增加的总体产量可能比浓度更重要，并且可以选择使用较高的洗脱体积来增加总体产量；而对于其他下游应用，增加浓度可能比总体产量更重要，并且可以选择使用减少的洗脱体积来增加浓度。
在本公开的附图和文本中呈现为特定值的体积(例如“x”μL)(对于主题方法中所使用的所有试剂，而不仅仅是关于洗脱缓冲液体积所讨论的那些)可以基于生物样品的起始体积按比例调整。作为例示性实例，在一些情况下，洗脱步骤中使用的洗脱缓冲液的量范围为0.05至1体积(相对于生物样品的起始体积)(例如，0.05至0.8、0.05至0.6、0.05至0.5、0.05至0.4、0.05至0.3、0.05至0.2、0.05至0.1、0.1至1、0.1至0.8、0.1至0.6、0.1至0.5、0.1至0.4、0.1至0.3、0.1至0.2、0.1至0.1、0.15至1、0.15至0.8、0.15至0.6、0.15至0.5、0.15至0.4、0.15至0.3、0.15至0.2、0.15至0.1、0.2至1、0.2至0.8、0.2至0.6、0.2至0.5、0.2至0.4、0.2至0.3、0.2至0.2、0.2至0.1、0.25至1、0.25至0.8、0.25至0.6、0.25至0.5、0.25至0.4、0.25至0.3、0.25至0.2或0.25至0.1体积)。在一些情况下，洗脱步骤中使用的洗脱缓冲液的量为约0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4或0.5体积(相对于生物样品的起始体积)。在一些情况下，洗脱步骤中使用的洗脱缓冲液的量为约0.15体积(相对于生物样品的起始体积)。在一些情况下，洗脱步骤中使用的洗脱缓冲液的量为约0.2体积(相对于生物样品的起始体积)。在一些情况下，洗脱步骤中使用的洗脱缓冲液的量为约0.225体积(相对于生物样品的起始体积)。在一些情况下，洗脱步骤中使用的洗脱缓冲液的量为约0.5体积(相对于生物样品的起始体积)。
在一些实施方案中，可以通过移液完成FOX颗粒与洗脱缓冲液的充分混合。在一些此类情况下，在添加洗脱缓冲液后将样品移液3次或更多次(例如，4次或更多次、5次或更多次、8次或更多次、10次或更多次、12次或更多次、15次或更多次或18次或更多次)。在一些情况下，在添加洗脱缓冲液后将样品移液15次或更多次。在一些情况下，在添加洗脱缓冲液后将样品移液约20次。
中和试剂
在一些情况下(例如，为了促进下游应用)，例如，因为洗脱缓冲液是碱性的，所以期望中和洗脱的核酸样品的pH。由于核酸倾向于在弱碱性pH(例如，pH高于7)下稳定，因此术语“中和”并不意味着溶液的最终pH将为7。如本文所用的术语“中和”不一定意指溶液的最终pH为7，而是意指使溶液的pH比先前更接近于7。例如，如果洗脱的碱性核酸样品的pH范围为10至12，则中和溶液的步骤可能(例如，通过添加中和缓冲液)使溶液的pH达到范围7.2至9(例如，约7.2、约7.5、约7.6、约8、约8.2等)。因此，在一些情况下，主题方法包括将中和剂(例如，中和缓冲液、酸)添加到洗脱的核酸样品中以降低样品的pH的步骤。
缀合颗粒-消耗-鉴定
本公开的多个方面包括缀合至与靶微RNA(例如，丰富的miRNA)互补的核酸探针(例如，DNA探针)的氧化铁(FOX)颗粒。在一些情况下，可以提供作为可溶解膜的一部分(例如，参见本公开中其他地方的可溶解膜的讨论)的缀合的FOX颗粒群体(缀合至与靶微RNA互补的核酸探针)。
在一些实施方案中，主题方法包括消耗一种或多种丰富的miRNA的样品，例如，以使得丰富的miRNA不干扰聚焦于不太丰富的miRNA的分析。在这种情况下，上述缀合的FOX颗粒可用于与样品接触，以使靶miRNA(例如，丰富的miRNA)与缀合的FOX颗粒结合，然后将颗粒与样品分离，因此消耗了靶miRNA的样品。在一些此类情况下，丰富的靶miRNA是选自以下的一种或多种miRNA：miR-191、miR-320、miR-29b、miR-143、miR-145和miR-424。作为另一个实例，在一些情况下，可能希望鉴定与给定靶miRNA结合的生物分子(例如，mRNA)。因此，上述缀合的FOX颗粒可用于与样品接触，以使得感兴趣的靶miRNA与缀合的FOX颗粒结合，并且靶miRNA在与FOX颗粒接触之前也保持与结合的生物分子的结合。因此，一旦将缀合的FOX颗粒从样品中分离出来，就可以对其进行分析，以鉴定与靶miRNA“共纯化”的生物分子。因此，本公开的缀合的FOX颗粒可用于鉴定与给定的靶miRNA结合的生物分子(例如，RNA)。
在使用缀合的FOX颗粒(缀合至与靶微RNA互补的核酸探针的FOX颗粒)的一些实施方案中，群体的20％或更多氧化铁颗粒(例如，群体的40％或更多、50％或更多、70％或更多、85％或更多、90％或更多或100％氧化铁颗粒)缀合至与同一微RNA(例如，同一丰富的miRNA)互补的核酸探针。在使用缀合的FOX颗粒(缀合至与靶微RNA互补的核酸探针的FOX颗粒)的一些情况下，群体的20％或更多氧化铁颗粒(例如，群体的40％或更多、50％或更多、70％或更多、85％或更多、90％或更多或100％氧化铁颗粒)缀合至同一核酸探针(例如，同一DNA探针)。给定的缀合的FOX颗粒群体(缀合至与靶微RNA互补的核酸探针的FOX颗粒)可以包含各自缀合至靶向不同miRNA的探针的颗粒。例如，在一些情况下，缀合的FOX颗粒群体包含缀合至第一核酸探针(例如，DNA探针)的第一颗粒，并且包含缀合至第二核酸探针(例如，DNA探针)的第二颗粒，其中第一和第二核酸探针与不同的靶微RNA(例如，不同的丰富的miRNA)互补。
下游用途
来自细胞或血液中循环的miRNA可用作诊断指标或治疗用替代标记。因此，使用本公开的方法和组合物提取的核酸(例如，miRNA)可以用于任何方便的应用，包括诊断和预后方法。例如，提取的miRNA可以在进行以诊断/预后病状的方法中用作诊断和/或预后生物标记(例如，诊断疾病或病状，例如癌症、心血管疾病、神经肌肉疾病、糖尿病、乳腺癌、感染性疾病等；预测给定个体是否将对给定药物(例如，用于治疗如癌症的疾病的药物)有应答；等)。例如，主题方法可以用于诊断疑似患有癌症或癌前病状的患者。液体活检结合预测性和预后性生物标记可能在精确或个性化医学中发挥重要作用。本公开提供了用于从多种生物试样中提取和分离miRNA的稳健方法。
因此，在一些情况下，主题方法包括测量提取的核酸样品中存在的一种或多种核酸(例如，miRNA)的丰度。
可以使用任何方便的测量技术。例如，在一些情况下，测量包括以下一种或多种：核酸测序(例如，通过下一代测序(NGS)方案)、定量RT-PCR、链置换扩增(SDA)和微阵列杂交。在一些情况下，一旦测量了靶核酸(例如，miRNA)或靶核酸群体(例如，多个miRNA)，这些值就可以用于许多不同目的，包括用于诊断/预后。
试剂盒
还提供了用于实施一种或多种上述方法的试剂、组合物和试剂盒。主题试剂、组合物和试剂盒可以有很大的不同，并且可以包括以下一种或多种的任何组合：(i)氧化铁(FOX)颗粒(例如，作为可溶解膜的一部分)；(ii)蛋白酶(例如，蛋白酶K)；(iii)用于将核酸与氧化铁颗粒结合的酸性缓冲液；(iv)用于从氧化铁颗粒中释放核酸的碱性洗脱缓冲液；(v)对照微RNA(例如，用于阳性对照)；(vi)细胞裂解缓冲液；(vii)DNA酶；(viii)磁体；(ix)酸性洗涤溶液；和(x)缀合至与靶微RNA(例如miR-191、miR-320、miR-29b、miR-143、miR-145、miR-424等)互补的核酸探针的氧化铁颗粒。各种组分可以存在于单独的容器中，或者它们中的一些或全部可以预先合并至单一试剂混合物或单容器中。
除了上述组分之外，主题试剂盒还可包括(在某些实施方案中)用于实践主题方法的说明书。这些说明书可以各种形式存在于主题试剂盒中，所述形式中的一种或多种可存在于所述试剂盒中。这些说明书可存在的一种形式如在合适的介质或基材(例如，在其上打印信息的一张纸或多张纸)上打印的信息、在试剂盒的包装中、在包装插页中等。这些说明书的又一种形式为在其上记录信息的计算机可读介质，例如软盘、光盘(CD)、闪存驱动器等。可能存在的这些说明书的又一种形式为网站地址，其可通过互联网使用来访问移送站点的信息。
本公开的示例性非限制性方面
上文所述的本发明主题的各方面(包括实施方案)可单独有益或与一个或多个其他方面或实施方案组合地有益。在不限制前述描述的情况下，以下提供了本公开的某些非限制性方面，并编号为1-62。对于本领域的普通技术人员在阅读本公开内容时将显而易见的是，每个单独编号的方面可与前面或后面的任何单独编号的方面一起使用或组合。这旨在为所有此类方面的组合提供支持，并且不限于以下明确提供的方面的组合：
1.一种从生物样品中提取核酸的方法，所述方法包括：
(a)使包含核酸的生物样品与蛋白酶K在范围为47℃至53℃的温度下接触范围为10至40分钟的时间段，以降解所述样品中存在的蛋白质，从而产生蛋白酶K处理过的样品；(b)在酸性条件下使所述蛋白酶K处理过的样品与氧化铁颗粒接触，以诱导所述氧化铁颗粒与所述核酸之间的结合；(c)从所述蛋白酶K处理过的样品中磁性分离所述核酸结合的氧化铁颗粒；(d)使所述核酸结合的氧化铁颗粒与碱性洗脱缓冲液接触，以将所述核酸从所述氧化铁颗粒释放到所述碱性洗脱缓冲液中，从而产生碱性核酸样品；以及(e)从所述碱性核酸样品中磁性分离所述氧化铁颗粒，从而产生提取的核酸样品。
2.如1所述的方法，其还包括在步骤(e)的所述磁性分离之后，通过使所述碱性核酸样品与缓冲溶液接触来中和所述碱性核酸样品，以产生所述提取的核酸样品。
3.如1或2所述的方法，其中在步骤(b)中将所述蛋白酶K处理过的样品与包含所述氧化铁颗粒的可溶解膜接触，由此所述膜溶解并释放所述氧化铁颗粒。
4.如3所述的方法，其中所述膜由包含以下至少一种的材料形成：羟烷基甲基纤维素；羧甲基纤维素；羧酸羟烷基酯单体；乙氧基化(甲基)丙烯酸羟烷基酯；丙氧基化(甲基)丙烯酸羟烷基酯；聚乙二醇(PEG)；聚乙烯醇(PVA)；及其组合。
5.如1-4中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括通过移液5次或更多次将所述蛋白酶K处理过的样品与所述氧化铁颗粒混合。
6.如1-5中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括去除90％或更多的所述蛋白酶K处理过的样品。
7.如1-6中任一项所述的方法，其中所述提取的核酸样品包含微RNA。
8.如7所述的方法，其还包括鉴定与一种或多种所述微RNA结合的生物分子的步骤。
9.如1-8中任一项所述的方法，其中所述方法不包括使用氯仿或苯酚。
10.如1-9中任一项所述的方法，其中所述方法在少于30分钟内完成。
11.如1-10中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含交联的核酸。
12.如1-11中任一项所述的方法，其中所述生物样品是全血样品。
13.如1-12中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含细胞。
14.如13所述的方法，其中所述方法包括在步骤(a)之前裂解所述生物样品的细胞。
15.如14所述的方法，其中所述裂解包括使所述生物样品与碱性稀释剂接触。
16.如1-15中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含固定细胞。
17.如1-16中任一项所述的方法，其中所述生物样品是***固定石蜡包埋的(FFPE)组织样品。
18.如1-17中任一项所述的方法，其中所述生物样品是活检物。
19.如1-11中任一项所述的方法，其中所述生物样品是血清样品。
20.如1-11中任一项所述的方法，其中所述生物样品是血浆样品。
21.如1-20中任一项所述的方法，其中所述生物样品来自疑似患有癌症或患有癌前病状的个体。
22.如1-21中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在步骤(b)之前和/或步骤(e)之后，从所述蛋白酶K处理过的样品中消耗丰富的微RNA。
23.如22所述的方法，其中所述丰富的微RNA选自由以下组成的群组：miR-191、miR-320、miR-29b、miR-143、miR-145和miR-424。
24.如22或23所述的方法，其中所述消耗包括(i)使所述蛋白酶K处理过的样品与缀合至与所述丰富的微RNA杂交的核酸探针的氧化铁颗粒接触，和(ii)从所述蛋白酶K处理过的样品中分离与所述丰富的微RNA杂交的所述探针缀合的氧化铁颗粒。
25.如1-24中任一项所述的方法，其包括测量所述提取的核酸样品中存在的一种或多种核酸的丰度。
26.如25所述的方法，其中所述测量包括以下一种或多种：核酸测序、定量RT-PCR、链置换扩增(SDA)和与微阵列的杂交。
27.如1-26中任一项所述的方法，其还包括基于所述测量来对个体进行诊断。
28.一种氧化铁颗粒群体，其包括缀合至与丰富的微RNA互补的核酸探针的氧化铁颗粒。
29.如28所述的氧化铁颗粒群体，其中所述丰富的微RNA选自由以下组成的群组：miR-191、miR-320、miR-29b、miR-143、miR-145和miR-424。
30.如28或29所述的氧化铁颗粒群体，其中所述群体的20％或更多的所述氧化铁颗粒缀合至与同一丰富的微RNA互补的核酸探针。
31.如28-30中任一项所述的氧化铁颗粒群体，其中所述群体的50％或更多的所述氧化铁颗粒缀合至与同一丰富的微RNA互补的核酸探针。
32.如28-31中任一项所述的氧化铁颗粒群体，其中所述群体的20％或更多的所述氧化铁颗粒缀合至同一核酸探针。
33.如28-32中任一项所述的氧化铁颗粒群体，其中所述群体的50％或更多的所述氧化铁颗粒缀合至同一核酸探针。
34.如28-33中任一项所述的氧化铁颗粒群体，其中所述群体的第一颗粒缀合至第一核酸探针，并且所述群体的第二颗粒缀合至第二核酸探针，其中所述第一和第二核酸探针与不同的丰富的微RNA互补。
35.一种可溶解膜，其包含如28-34中任一项所述的氧化铁颗粒群体。
36.如35所述的可溶解膜，其中所述膜由包含以下至少一种的材料形成：羟烷基甲基纤维素；羧甲基纤维素；羧酸羟烷基酯单体；乙氧基化(甲基)丙烯酸羟烷基酯；丙氧基化(甲基)丙烯酸羟烷基酯；聚乙二醇(PEG)；聚乙烯醇(PVA)；及其组合。
37.一种试剂盒，其包含：氧化铁颗粒；蛋白酶K；用于使核酸与所述氧化铁颗粒结合的酸性缓冲液；用于从所述氧化铁颗粒中释放核酸的碱性洗脱缓冲液；以及对照微RNA。
38.如37所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含两种或更多种对照微RNA。
39.如37或38所述的试剂盒，其还包含细胞裂解缓冲液或DNA酶。
40.如37-39中任一项所述的试剂盒，其还包含磁体。
41.如37-40中任一项所述的试剂盒，其还包含酸性洗涤溶液。
42.如37-41中任一项所述的试剂盒，其中所述蛋白酶K是冻干的。
43.如42所述的试剂盒，其还包含蛋白酶K的稀释剂。
44.如37-43中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含含有所述氧化铁颗粒的可溶解膜。
45.如44所述的试剂盒，其中所述可溶解膜由包含以下至少一种的材料形成：羟烷基甲基纤维素；羧甲基纤维素；羧酸羟烷基酯单体；乙氧基化(甲基)丙烯酸羟烷基酯；丙氧基化(甲基)丙烯酸羟烷基酯；聚乙二醇(PEG)；聚乙烯醇(PVA)；及其组合。
46.如37-45中任一项所述的试剂盒，其还包含缀合至与丰富的微RNA互补的核酸探针的氧化铁颗粒。
47.如46所示的试剂盒，其中所述丰富的微RNA选自由以下组成的群组：miR-191、miR-320、miR-29b、miR-143、miR-145和miR-424。
48.如46或47所述的试剂盒，其中20％或更多的所述DNA缀合的氧化铁颗粒缀合至与同一丰富的微RNA互补的核酸探针。
49.如46-48中任一项所述的试剂盒，其中50％或更多的所述DNA缀合的氧化铁颗粒缀合至与同一丰富的微RNA互补的核酸探针。
50.如46-49中任一项所述的试剂盒，其中20％或更多的所述DNA缀合的氧化铁颗粒缀合至同一核酸探针。
51.如46-50中任一项所述的试剂盒，其中50％或更多的所述DNA缀合的氧化铁颗粒缀合至同一核酸探针。
52.如46-51中任一项所述的试剂盒，其中第一DNA缀合的氧化铁颗粒缀合至第一核酸探针，并且第二DNA缀合的氧化铁颗粒缀合至第二核酸探针，其中所述第一和第二核酸探针与不同的丰富的微RNA互补。
53.如46-52中任一项所述的试剂盒，其包含含有DNA缀合的氧化铁颗粒的可溶解膜。
54.如53所述的试剂盒，其中所述膜由包含以下至少一种的材料形成：羟烷基甲基纤维素；羧甲基纤维素；羧酸羟烷基酯单体；乙氧基化(甲基)丙烯酸羟烷基酯；丙氧基化(甲基)丙烯酸羟烷基酯；聚乙二醇(PEG)；聚乙烯醇(PVA)；及其组合。
55.一种用于鉴定与微RNA结合的生物分子的方法，所述方法包括：使包含微RNA及其靶生物分子的生物样品与氧化铁颗粒群体接触，其中所述氧化铁颗粒群体包含缀合至与靶微RNA互补的核酸探针的氧化铁颗粒；从所述生物样品中磁性分离所述氧化铁颗粒以产生包含与所述靶miRNA结合的所述氧化铁颗粒的样品，其中所述靶miRNA与来自所述生物样品的生物分子结合；以及鉴定与所述靶miRNA结合的所述生物分子。
56.如55所述的方法，其中所述群体的20％或更多的所述氧化铁颗粒缀合至与同一微RNA互补的核酸探针。
57.如55所述的方法，其中所述群体的50％或更多的所述氧化铁颗粒缀合至与同一微RNA互补的核酸探针。
58.如55-57中任一项所述的方法，其中所述群体的20％或更多的所述氧化铁颗粒缀合至同一核酸探针。
59.如55-57中任一项所述的方法，其中所述群体的50％或更多的所述氧化铁颗粒缀合至同一核酸探针。
60.如55-59中任一项所述的方法，其中所述群体的第一颗粒缀合至第一核酸探针，并且所述群体的第二颗粒缀合至第二核酸探针，其中所述第一和第二核酸探针与不同的的微RNA互补。
61.如55-60中任一项所述的方法，其中使所述生物样品与包含所述氧化铁颗粒的可溶解膜接触，由此所述膜溶解并释放所述氧化铁颗粒。
62.如61所述的方法，其中所述膜由包含以下至少一种的材料形成：羟烷基甲基纤维素；羧甲基纤维素；羧酸羟烷基酯单体；乙氧基化(甲基)丙烯酸羟烷基酯；丙氧基化(甲基)丙烯酸羟烷基酯；聚乙二醇(PEG)；聚乙烯醇(PVA)；及其组合。
实施例
提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并且不意图限制发明人认为其发明的范围，也不意图表示以下实验是进行的所有或唯一实验。已经努力确保所用数字(例如，量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另外指出，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度并且压力是大气压或接近大气压。此外，可以使用常见的实验室方案缩写(例如，hr＝小时，min＝分钟，ml＝毫升，ul＝微升，rpm＝每分钟转数，g(在离心的情况下)＝重力的倍数等)。
以下实验导致改进的FOX提取方案，所述方案可靠地从包括全血、血浆、血清、FFPE和癌细胞的各种样品类型中提取出可扩增的核酸(例如，miRNA)。在一些情况下，总提取时间减少了30分钟，而同时增加了灵敏度。除miRNA外，改进的方案还可用于提取DNA。改进的方案不需要离心或旋转柱步骤进行大小选择，从而减少了用于核酸分离的消耗品的总成本。与目前市场上的miRNA分离试剂盒(例如，miRVANA)不同，本文所述的方案不需要苛刻的化学物质，例如氯仿和苯酚(它们需要额外的安全防范，并且可能会对下游应用如PCR产生负面影响)。另外，与其他试剂盒相比，本文所述的改进方案的每次反应成本便宜了10倍(基于宣传为研究试剂的目录价格)。
因此，以下实施例中提供的数据证明，本公开的方法和组合物可用于从多种生物样品类型中有效提取核酸(例如，miRNA)。数据显示可以在提取的核酸中检测到特定的miRNA，并且示例miRNA的检测表达水平与使用市售的黄金标准miRNA分离***检测到的表达水平在统计学上是相同的。本公开的方法比替代方法更具成本效益并且更安全。而且，在测试了各种生物样品之后，仍然存在与主题方法不相容的样品。因此，本文所提供的核酸(例如，miRNA)分离***可用于任何样品(***固定石蜡包埋的(FFPE)样品、血液样品、血清样品、血浆样品、细胞样品等)，并被认为是同类产品中最好的。
来自以下呈现的实验的三个观察结果包括：(i)PCR重复(用于从提取的核酸中检测特定的靶miRNA)非常好，并且加标模板的Ct值的变异性是令人满意的；(ii)基于FOX的miRNA提取在Ct值方面提供了与黄金标准方法相当的结果；以及(iii)改进的方案提高了提取核酸的质量和数量。
实施例1-评估参数：混合、残余液体、洗脱体积(图1至图3)
从图19左侧所示的DNA提取方案开始，为了达到实现有效提取miRNA的改进方案的目标，对各个步骤进行了改变。如下面的实施例3(图9)和4(图16)所示，有效提取miRNA的主题方法也可用于有效提取mRNA和DNA。
从图19左侧所示的DNA提取方案开始，操作了以下步骤：(i)在步骤5和7去除所有残余的液体，相对于留下一些残余的液体(例如，5μL或50μL残余)；(ii)改变在步骤8和10中添加的体积(例如，10、20、30、40、50、100μL)；(iii)去除步骤，例如不使用HPV LBC稀释剂、不使用蛋白酶K或在步骤1和2不进行孵育。使用微RNA Quant-it测定miRNA产量，并通过MiRXES RT-qPCR测定miRNA丰度(每ng总RNA拷贝数)。
图1描绘了由评估洗脱前的混合量是否影响miRNA的产量所获得的结果。结果表明，移液不充分降低产量和丰度。
图1使用的方案
1.将850μL人***状病毒(HPV)液基细胞学(LBC)稀释剂和40μL蛋白酶K加入200μL血清中；
2.56℃30分钟，100℃20分钟，然后冷却至<40℃；
3.将所有加热的样品转移到FOX提取管中，移液X次*使膜溶解；
4.加入111μL结合缓冲液，移液X次以混合；
5.放上磁体，去除所有液体和气泡；
6.加入950μL洗涤缓冲液，移液X次以混合；
7.放上磁体，去除所有液体和气泡；
8.加入30μL洗脱缓冲液，移液X次以混合；
9.放上磁体，将30μL液体转移到新管中；
10.将30μL中和缓冲液加入新试管中。
注意
(a)X为1、2、3、4、6、8或10(使用多变量设计进行实验，以帮助确定可以在哪些步骤修改混合以改进提取)
(b)“结合缓冲液”是pH 1.5-2.0的磷酸钠
(使用硫酸使缓冲液的pH在一定范围内)
(c)“洗涤缓冲液”是Proclin 300-Tween-20溶液，pH约2.0
图2描绘了由评估在步骤5和7去除所有残余液体(相对于留下一些残余液体，例如5μL或50μL残余)是否影响miRNA的产量所获得的结果。
图2使用的方案
1.将850μL HPV LBC稀释剂和40μL蛋白酶K加入200μL血清中；
2.56℃30分钟，100℃20分钟，然后冷却至<40℃；
3.将所有加热的样品转移到FOX提取管中，移液10次使膜溶解；
4.加入111μL结合缓冲液，移液10次以混合；
5.施加磁体，
去除(所有液体和气泡，相对于留下5μl或50μl残余物)
6.加入950μL洗涤缓冲液，移液10次以混合；
7.施加磁体，
去除(所有液体和气泡，相对于留下5μl或50μl残余物)
8.加入30μL洗脱缓冲液，移液10次以混合；
9.放上磁体，将30μL液体转移到新管中；
10.将30μL中和缓冲液加入新试管中。
图3描绘了由评估使用不同洗脱体积是否提高了miRNA产量所获得的结果。结果表明增加洗脱体积(例如，至100μL)增加总体产量。
图3使用的方案
1.将850μL HPV LBC稀释剂和40μL蛋白酶K加入200μL血清中；
2.56℃30分钟，100℃20分钟，然后冷却至<40℃；
3.将所有加热的样品转移到FOX提取管中，移液10次使膜溶解；
4.加入111μL结合缓冲液，移液10次以混合；
5.放上磁体，去除所有液体和气泡
6.加入950μL洗涤缓冲液，移液10次以混合；
7.放上磁体，去除所有液体和气泡
8.加入XμL洗脱缓冲液*，移液10次以混合；
9.放上磁体，将XμL液体*转移到新管中；
10.将30μL中和缓冲液加入新试管中。
注意
X是10、20、30、40、50或100
实施例2-评估参数：蛋白酶K和其他参数(图4至图8)
将各种修改(例如，所用蛋白酶K的量、与蛋白酶K一起孵育的温度以及结合缓冲液的体积)结合到FOX提取方案中，以达到测试这些修改是否可以增加miRNA产量的目的。Invitrogen Quant-iT RNA测定试剂盒用于定量总miRNA产量(每个圆圈代表技术重复)，并且qPCR用于测量miR-16的水平(显示原始Ct值)。数据显示在图4中。除miR-16外，还测试了其他四种miRNA(miR-21、miR-99b、miR-181a和miR-451a)，并重现了对方案的改进。
然后测试了省去煮沸步骤或将结合缓冲液/Pro K在56℃下的孵育时间从30分钟缩短至5分钟是否改进miRNA的检测(将miR-16值视为黄金标准，并将其与miR-21、miR-99b、miR-181a和miR-451a的ΔCt值进行比较)(图5)。将改进的FOX提取方法(参见图19的右侧)直接与Qiagen miRNA Easy方案(“Q std”)进行比较。
然后测试了新优化的FOX提取方案是否可以移接到BD Viper LT自动化平台上(图6)。同样，将miR-16ΔCt值用作黄金标准。MM＝使用qPCR的手动miRNA提取/手动miR-16检测方法。VV＝完整的Viper LT自动化，MV＝手动miRNA提取/Viper LT自动化检测，VM＝在实验台上Viper LT自动化miRNA提取/手动检测。ΔCt值与黄金标准相关性很好，但是在使用完全或部分自动化时检测到更多的可变性。
然后评估改进方案的多个步骤(参见图19的右侧)，以查看其他改变是否进一步增加miRNA测定的分析灵敏度(对使用FOX miRNA提取方案提取的miRNA进行分析)(图7)。换句话说，单独评估了多个步骤以甚至进一步改进方案：
1.在较少的洗脱缓冲液中洗脱，以浓缩RNA并模拟自动化过程
2.增加了两个FOX晶片(具有氧化铁颗粒的可溶解膜)，而不是单个膜；结论＝不变
3.在添加稀释剂之前添加蛋白酶K；结论＝性能下降
4.在一半体积的稀释剂中添加蛋白酶K
5.添加更少或更多的稀释剂；结论＝没有一致地增加灵敏度。
6.添加DNA酶；结论＝测定是DNA酶相容的。
7.尝试额外的2次和3次洗涤，相对于一次洗涤；结论＝提高灵敏度
除上面列出的测试条件外，使用以下方案：
所用方案
1.将850μL HPV LBC稀释剂和70μL蛋白酶K加入200μL血清中；
2.50℃10分钟，95℃10分钟，然后冰冷却2分钟；
3.将所有样品转移到FOX提取管中；
4.等待5分钟，然后移液10次使膜溶解；
5.加入55μL结合缓冲液，移液10次以混合；
6.放上磁体，去除所有液体和气泡；
7.加入950μL洗涤缓冲液，移液10次以混合；
8.放上磁体，去除所有液体和气泡；
9.加入50μL洗脱缓冲液，移液10次以混合；
10.放上磁体，将50μL液体转移到新管中；
11.将5μL 11X中和缓冲液加入新试管中。
然后进行其他实验以确定起始稀释剂、蛋白酶K和/或结合缓冲液的体积变化是否进一步改进miRNA提取。数据显示，使用700μL HPV LBC稀释剂(与850μL相比)、60μL蛋白酶K(与70μL相比)和47μL酸性结合缓冲液(与55μL相比)是等效的或更佳。
然后测试蛋白酶K的不同来源以评估蛋白酶K的来源是否影响miRNA提取(使用改进的miRNA提取方案时，参见上文：使用700μL HPV LBC稀释剂、60μL蛋白酶K和47μL酸性结合缓冲剂)。结果在图8中提供。来自Amresco或Qiagen的蛋白酶K是等效的，并且两者都比不使用蛋白酶K更佳。
实施例3-比较(图9至图10)
图9中显示的数据表明，改进的FOX提取方案可改进DNA和RNA的数量和质量。
图9.(图A至图C)培养人结肠癌(HCT15)细胞，并收获1.6×10E6个细胞。左列表示使用原始氧化铁(FOX)方案(左列)或上面的改进方案(右列)进行DNA和RNA提取的结果。(图A)使用改进的方案时，DNA和RNA的产量均显著增加。(图B)所描绘的图显示了使用改进方法从人结肠癌(HCT15)细胞中提取的DNA和RNA的高纯度。[当A260/280比率大于1.8时，纯核酸是典型的](图C)。所描绘的图表明，使用改进的方案从人结肠癌(HCT15)细胞提取的纯化DNA或RNA中剩余的杂质(可能是盐)减少。
图10中显示的数据显示了测量(使用qPCR)使用旧方案(参见图19左侧)提取的核酸中5种不同的示例miRNA时获得的原始Ct与改进方案的比较。与原始方案相比，改进方案的Ct平均降低2.8(较低的Ct表示样品中测得的RNA更丰富和/或样品允许更高的灵敏度)。
实施例4-可以从多种不同样品类型中有效提取核酸(例如，mRNA和miRNA)(图11至图16)
从以下成功提取核酸：(i)血清和血浆；(ii)新鲜培养的细胞(例如，人***癌(PC3)细胞、雄激素敏感性人***腺癌(LNCaP)细胞和人结肠肿瘤(HCT15)细胞)；(iii)BDSurePath保存的细胞(例如，HCT15细胞)(例如，保存7天)；(iv)***固定石蜡包埋的(FFPE)组织(例如，已归档(5年)的人结肠腺癌样品和已归档的人非小细胞肺癌样品)；以及(v)全血(例如在BD PAXgene管中收集)。使用qPCR从样品中测量了5种不同miRNA(miR-16、miR-21、miR-99b、miR-181a和miR-451a)的量，并选择了特定的miRNA，因为它们代表了组织中丰富和稀有miRNA的范围。对于全血样品，从提取的核酸中测量mRNA。
图11.使用原始FOX或改进的FOX提取方案提取了血清和血浆核酸。使用qPCR从样品中测量了5种不同的miRNA(miR-16、miR-21、miR-99b、miR-181a和miR-451a)的量。如所表明的，在与原始方案(图19左侧)相比时，改进的方案产生的miRNA多4至16倍。对于每种miRNA：左侧的第一条代表使用改进方案从中提取RNA的血清样品；第二条代表使用原始方案从中提取RNA的血清样品；第三条代表使用改进方案从中提取RNA的血浆样品；以及第四条代表使用原始方案从中提取RNA的血浆样品。
图12.将各种人癌细胞系(PC3、LNCaP和HCT15)培养、沉淀并重悬于200uL水中，然后使用改进的FOX方案提取核酸。使用qPCR从样品中测量了5种不同的miRNA(miR-16、miR-21、miR-99b、miR-181a和miR-451a)的量。使用无模板(NTC)和负反转录酶对照(NRT)确定特异性。
图13.从保存了不同时间量的BD SurePath保存的细胞(HCT15细胞)中提取了核酸(使用改进的FOX方案)。使用qPCR从样品中测量了5种不同的miRNA(miR-16、miR-21、miR-99b、miR-181a和miR-451a)的量。
图14.从***固定石蜡包埋的(FFPE)组织中提取核酸(使用改进的FOX方案)：已归档(5年)的人结肠腺癌样品(顶图)和已归档的人非小细胞肺癌(NSCLC)样品(底图)。对于每个患者样品，在提取RNA之前，将三个10um组织切片合并在一起。组织块的龄期范围为3至5年。使用qPCR从样品中测量了5种不同的miRNA(miR-16、miR-21、miR-99b、miR-181a和miR-451a)的量。如所表明的，通过qPCR从提取自FFPE组织块的核酸(miRNA)中检测到特异性miRNA。NTC＝无模板对照，并且YP10-13汇集的NRT＝模板RNA，但未添加逆转录酶作为另一个阴性对照。
图15.从***固定石蜡包埋的(FFPE)组织和人血清样品中提取核酸(使用改进的FOX方案)。使用qPCR测量了来自样品的5种不同的miRNA(miR-16、miR-21、miR-99b、miR-181a和miR-451a)的量。如所表明的，通过qPCR从提取自FFPE组织块和人血清样品的核酸(miRNA)中检测到特异性miRNA。
图16.从患者抽取全血，然后将其稳定在PreAnalytiX PAXgene Blood RNA管中。合并患者血液，并使用200uL加工样品以使用三种不同方法从外周血中提取mRNA：(i)提取核酸的改进的FOX方案(每种mRNA的左边三个条)；每个方案Paxgene(每种mRNA的中间三个条)和Zymo全血RNA(每种mRNA的右边三个条)。使用SuperScript III和对GAPdH(跨越外显子7-8)、GusB和Hprt1特异的引物进行标准qPCR以测量mRNA。数据表明，可以使用改进的FOX方案从全血(例如，PAXgene稳定的全血)中提取和测量核酸(例如，mRNA)。
实施例5-示例应用(图17至图18)
选择了可用于开发乳腺癌体外诊断测试的微RNA。与效率较低的其他方案(Qiagen、PAMAM、Ntera)相比，进行了实验以测试在用本文所述的改进的FOX提取方案提取(从患者乳腺癌血清样品中)后是否可检测到所选的miRNA。数据在图17中显示为如通过qPCR(MiRXES)所检测的每种靶miRNA的丰度(拷贝数/ng总miRNA)。
数据表明，可以从使用本文所述的改进的FOX方案提取自乳腺癌患者血清的核酸中测量选定的miRNA。从使用本文所述的改进的FOX方案提取的核酸中检测到所有17种选定的miR。改进的FOX方案至少与其他经过测试的提取方法表现得一样好，甚至更好。
图17.使用改进的FOX方案从200uL冷冻血清中提取微RNA。qPCR中每ng使用4ng或约103个拷贝。
图18.将不同量的总RNA添加到每个miR-99b qPCR反应中，以确定来自改进的FOX方案或其他经测试的提取方法的遗留盐是否具有抑制作用。两种提取方法之间的线性或R平方值是相当的。没有显著的来自提取的样品中存在的残余化学物质/组分的抑制。数据以两种方式显示(图A和图B)。
尽管出于清楚理解的目的，前述发明已经通过说明和示例的方式进行了相当详细的描述，但是根据本发明的教导，对于本领域的普通技术人员显而易见的是，在不脱离所附权利要求书的精神或范围的情况下可以对本发明作出某些改变和修改。
因此，前面仅仅说明了本发明的原理。应理解，本领域的技术人员将能够设计各种布置，这些布置尽管在本文没有明确地描述或示出，但是它们体现本发明的原理并且包括在其精神和范围内。此外，本文所叙述的所有实施例和条件语言主要意图帮助读者理解本发明的原理和由发明人提供的促进技术的构想，并且应解释为不对此类特别叙述的实施例和条件构成限制。此外，本文中叙述本发明的原理、方面和实施方案以及其特定实施例的所有陈述均意图涵盖其结构等效物和功能等效物。此外，意图此类等效物包括目前已知的等效物和未来开发出来的等效物，即不管结构如何，所开发的执行相同功能的任何元件。因此，本发明的范围不意图限于本文所示和描述的示例性实施方案。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。

Claims (15)

1.一种从初始生物样品中产生提取的核酸样品的方法，所述方法包括：
(a)使包含核酸的初始生物样品与蛋白酶K在范围为47℃至53℃的温度下接触范围为10至40分钟的时间段，以降解所述样品中存在的蛋白质，从而产生蛋白酶K处理过的样品；
(b)在酸性条件下使所述蛋白酶K处理过的样品与氧化铁颗粒接触，以诱导所述氧化铁颗粒与所述核酸之间的结合；
(c)从所述蛋白酶K处理过的样品中磁性分离所述核酸结合的氧化铁颗粒；
(d)使所述核酸结合的氧化铁颗粒与碱性洗脱缓冲液接触，以将所述核酸从所述氧化铁颗粒释放到所述碱性洗脱缓冲液中，从而产生碱性核酸样品；以及
(e)从所述碱性核酸样品中磁性分离所述氧化铁颗粒，
从而产生提取的核酸样品。
2.如权利要求1所述的方法，其还包括在步骤(e)的所述磁性分离之后，通过使所述碱性核酸样品与缓冲溶液接触来中和所述碱性核酸样品，以产生所述提取的核酸样品。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在步骤(b)中将所述蛋白酶K处理过的样品与包含所述氧化铁颗粒的可溶解膜接触，由此所述膜溶解并释放所述氧化铁颗粒。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述膜由包含以下一种或多种的材料形成：羟烷基甲基纤维素；羧甲基纤维素；羧酸羟烷基酯单体；乙氧基化(甲基)丙烯酸羟烷基酯；丙氧基化(甲基)丙烯酸羟烷基酯；聚乙二醇(PEG)；聚乙烯醇(PVA)；及其组合。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述提取的核酸样品包含微RNA。
6.如权利要求5所述的方法，其还包括鉴定与一种或多种所述微RNA结合的生物分子的步骤。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述方法不包括使用氯仿或苯酚。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述方法在少于30分钟内完成。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在步骤(b)之前和/或步骤(e)之后，从所述蛋白酶K处理过的样品中消耗丰富的微RNA。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述丰富的微RNA选自由以下组成的群组：miR-191、miR-320、miR-29b、miR-143、miR-145和miR-424。
11.如权利要求9或权利要求10所述的方法，其中所述消耗包括(i)使所述蛋白酶K处理过的样品与缀合至与所述丰富的微RNA杂交的核酸探针的氧化铁颗粒接触，和(ii)从所述蛋白酶K处理过的样品中分离与所述丰富的微RNA杂交的所述探针缀合的氧化铁颗粒。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其还包括测量所述提取的核酸样品中存在的一种或多种核酸的丰度。
13.一种氧化铁颗粒群体，其包含缀合至与丰富的微RNA互补的核酸探针的氧化铁颗粒。
14.一种可溶解膜，其包含如权利要求13所述的氧化铁颗粒群体。
15.一种试剂盒，其包含：
氧化铁颗粒；蛋白酶K；用于使核酸与所述氧化铁颗粒结合的酸性缓冲液；用于从所述氧化铁颗粒中释放核酸的碱性洗脱缓冲液；以及对照微RNA。
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