CN111269978A - 一种人ApoE基因分型检测试剂盒 - Google Patents

一种人ApoE基因分型检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN111269978A
CN111269978A CN202010231941.1A CN202010231941A CN111269978A CN 111269978 A CN111269978 A CN 111269978A CN 202010231941 A CN202010231941 A CN 202010231941A CN 111269978 A CN111269978 A CN 111269978A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
detection
probe
kit
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010231941.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111269978B (zh
Inventor
曾亚平
赖楚明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Tianda Biological Medical Equipment Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Tianda Biological Medical Equipment Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Tianda Biological Medical Equipment Co ltd filed Critical Shenzhen Tianda Biological Medical Equipment Co ltd
Priority to CN202010231941.1A priority Critical patent/CN111269978B/zh
Publication of CN111269978A publication Critical patent/CN111269978A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111269978B publication Critical patent/CN111269978B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种人ApoE基因分型检测试剂盒，所述试剂盒反应体系中包括特异性检测ApoE突变基因的引物和探针组合，还包括内参引物和探针以及PCR反应液。本发明提供的检测技术将不对称PCR技术与溶解曲线技术相结合，最终实现在单管PCR体系中即可完成2个位点2个单核苷酸多态性的检测，PCR扩增结束再进行溶解曲线分析即可得到样本基因型。

Description

一种人ApoE基因分型检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种人类ApoE基因分型检测的引物探针组合物、试剂盒及应用，属于基因检测领域。
背景技术
载脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)是一种由299个氨基酸组成的载脂蛋白，载脂蛋白E是一种富含精氨酸的碱性蛋白，是一种多功能糖蛋白，ApoE蛋白参与脂质的运输、储存及***，同时也参与神经***的发育和损伤后的修复。人类高发的动脉粥样硬化和阿尔茨海默症均与ApoE蛋白参与的脂质代谢调节异常有关。研究表明，ApoE基因的多态性还与冠心病、高脂血症、脑梗塞的发生相关。
载脂蛋白E的氨基酸序列由两个SNP决定，位于112位氨基酸的碱基(C.388T>C，Cys130Arg)和158位氨基酸的碱基(C.526C>T，Arg176Cys)。依据112和158位氨基酸的不同组合，形成三种ApoE，即E2、E3和E4，在人群占比分别为8％，78％，14％，其中ApoE3是野生型基因，E3的112、158位氨基酸分别是半胱氨酸和精氨酸，Apo E2、E4分别是突变型，E2在112位和158氨基酸都是半胱氨酸，E4的112位和158位氨基酸都是精氨酸。根据2个SNP基因序列的不同，ApoE基因可以产生6种常见基因型，包括3种纯合型(E2/E2、E3/E3、E4/E4)和三种杂合型(E2/E3、E2/E4、E3/E4)。自然人群中，E3基因频率分布最高，在中国人群中，ApoE3/E3表型分布约占70％。
ApoE基因的多态性与阿尔海默氏症(AD)、冠心病等疾病密切相关，因此，ApoE基因型的检测可以作为临床辅助诊断和风险率评估的指标。ApoE基因是目前已知的阿尔茨海默病(AD)最亲密的遗传标志物，1993年，Rose研究发现，晚发性家族型AD病人ApoE E4等位基因频率增多，还发现ApoE和来源于淀粉样前体蛋白的小多肽Aβ的亲和力很高。其后陆续发现AD病人中携带ApoE4等位基因者占46.2％，而对照组占13.2％。还发现携带两个ApoE4等位基因的研究对象比携带一个E4等位基因的研究对象发生AD年龄早，比不携带ApoE4等位基因的研究对象发生AD年龄更早。结论是等位基因ApoE2与ApoE3使AD发病率降低，发病年龄延迟，ApoE4携带者患阿尔茨海默病的概率增加，携带一个ApoE4罹患AD的风险约是正常人的3.2倍，而携带两个ApoE4等位基因患AD的风险是正常人的8-12倍。ApoE4等位基因在普通人群中比例大约为15％，而在AD患者中的比例可达40％。ApoE是AD的重要危险因素，通过检测ApoE的基因型，可了解是否为AD易感人群，继而从病因学延缓AD的发生、发展，定期检查，以便早诊断、早治疗、最大程度的降低疾病造成的损害。
此外，ApoE通过多种途径参与机体的脂质代谢调节，是影响机体血脂水平的重要内在因素。ApoE基因与多种心脑血管疾病密切相关，包括高脂蛋白血症及动脉粥样硬化性血管病、冠心病等症。大量人群调查发现ApoE4等位基因可以显著地升高健康人的总胆固醇浓度，更易患动脉粥样硬化，相反，ApoE2等位基因可降低胆固醇浓度，其降低效应是E4升高胆固醇的2～3倍。研究发现ApoE2等位基因对冠状动脉硬化的发展有防护作用，而ApoE4/E3杂合子比E3/E2和E3/E3基因型者发生心肌梗塞年龄早。因此，同样可以通过基因检测有效地评估受检者患心脑血管疾病的遗传风险，根据风险等级的高低，为其提供个性化的预防建议。ApoE基因的多态性是这些疾病发展过程和药物治疗疗效个体差异的主要原因。
此外，由于基因缺陷是导致神经***疾病的重要因素，因此可以通过基因检测有效地评估受检者患各项神经***疾病的遗传风险，根据风险等级的高低，为其提供个性化的预防建议，同时，也可以从中找出预防的重点，从而有针对性地高效预防神经***疾病的发生，真正起到防患于未然的作用，为受检者的健康保驾护航。
综上所述，通过对患者的ApoE基因进行检测，得到特定位点的基因型，以基因检测结果作为中间的信息的方法，不属于疾病的诊断方法，以基因型的检测结果来确定药物的选择就可以实现个体化用药。
目前对ApoE基因的检测，常见的方法有直接测序法，基因芯片杂交法，PCR-TaqmanMGB探针分型法，ARMS-PCR法。
直接测序法，是SNP位点分析的金标准，但该检测方法受到测序仪器的限制，测序仪器昂贵，推广困难。另外，直接测序对模板量要求高，通常需要通过PCR扩增富集目的片段后进行测序，操作复杂，周期长，且为开管操作，容易造成污染。
基因芯片杂交法，珠海赛乐奇生物技术有限公司的“载脂蛋白E(ApoE)基因型检测试剂盒(基因芯片法)”是目前市面上已有通过CFDA认证的成型的检测试剂盒，该试剂盒采用PCR-基因芯片杂交法进行检测，经聚合酶链式反应(PCR)技术扩增相应的ApoE基因片段，并与芯片上特异性核酸探针杂交，以区分确定ApoE的基因型。该检测方法，操作步骤烦琐，易出错，实验耗时4个小时以上，耗时较长。PCR结束后需开管操作，易造成污染的问题。此外，该检测方法用肉眼来对结果判读，准确性会受到影响，会出现假阳性、假阴性的结果判读。
PCR探针分型法，因其操作简单，分型准确，全程闭管操作，检测周期短等特点，是目前比较主流的SNP分型方法。目前市面上已有通过CFDA认证的成型检测试剂盒，如武汉友芝友生物科技有限公司的“人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒(PCR-荧光探针法)”，然而其产品只是对ApoE的两个位点的碱基进行检测，只检测了ApoE2 526位点和ApoE4388位点，得到E2和E4的基因型组合，没有对E3进行进行。且MGB探针是属于美国LIFE公司专利技术，会在原材料上受到较多限制。
ARMS-PCR，等位基因特异性扩增法，也称扩增阻碍突变***，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3’端引物进行平行PCR，只有突变DNA完全互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物，由于错配位于引物的3’端则导致PCR不能延伸，则称为ARMS。该方法通过采用PCR反应结束后进行电泳，从有无放映条带来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的一起，但电泳操作，增加了PCR污染的结汇，而且耗时费力。
专利文献201810478466.0公开了一种用于人ApoE基因分型的引物探针组合及使用方法，具体是针对ApoE基因点突变基因序列设计等位基因特异性引物，针对野生型序列设计封闭引物，并采用突变富集扩增反应条件，根据Ct值可对ApoE基因进行分型检测。所述试剂盒中还包括野生型基因的封闭引物，成分较多，制备成本高。
专利文献201810988325.3公开了一种适合血液基因组DNA样本的ApoE基因分型检测的试剂盒及其PCR方法，其特征在于：包括用于ApoE基因分型检测的混合液和含有重组DNA的质控品，所述用于ApoE基因分型检测的混合液包括用于ApoE基因分型检测的特异性引物对、特异性探针对、Taq HS DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸混合液、反应缓冲液和反应增强剂。所述试剂盒成分更复杂，仅阳性质控品就包括三种，而且仅针对血液样本的检测试剂盒，应用范围窄。
综上分析可以看出，目前已有的ApoE基因分型检测方法在推广上都或多或少存在如试剂检测成本高，操作复杂，易产生污染，产生一定的假阴性和假阳性等缺陷。为了改善现有技术的缺陷，本发明提供一种基于不对称PCR溶解曲线法检测人类ApoE基因多态性检测试剂盒，将不对称PCR技术与溶解曲线技术相结合，针对ApoE基因的2个SNP位点C.388T>C和C.526C>T，分别设计一对引物和一条探针，以解决传统检测技术和成品检测试剂盒存在的检测仪器价格高，操作复杂，易污染，检测成本高，临床应用推广难等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种人ApoE基因分型检测试剂盒及应用该试剂盒检测人ApoE基因分型的方法，该检测技术将不对称PCR技术与溶解曲线技术相结合，针对ApoE基因的2个SNP位点C.388T>C和C.526C>T，分别设计一对引物和一条探针。使用不同浓度的上下游引物进行不对称扩增，随着循环的增加，量少的引物被逐渐耗尽，而超量的引物则继续进行线性扩增，富集到了大量的含有C.388T>C和C.526C>T的DNA单链。本发明设计的探针采用所核苷酸修饰，对SNP的区分能力更强，荧光背景低且能完全区分同一管反应液中不同荧光标记的探针，最终实现在单管PCR体系中即可完成2个位点2个单核苷酸多态性的检测，PCR扩增结束再进行溶解曲线分析即可知道样本基因型。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的。
第一方面，本发明提供一种人ApoE基因分型的特异性引物探针组合，所述组合包括ApoE2分型检测的引物探针组合、ApoE4分型检测的引物探针组合，具体的，ApoE2分型检测的引物探针组合包含：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，探针核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；ApoE4分型检测的引物探针组合包含：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，探针核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
优选的，所述的一种人ApoE基因分型的特异性引物探针组合还包括内参引物对和内参探针，内参引物对核苷酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示，内参探针核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
优选的，本发明所述的检测探针和内参探针5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。所述荧光基团选自FAM、JOE、VIC、HEX中的一种，淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA中的一种。
在本发明的优选实施方式中，所述人ApoE基因分型的特异性引物探针组合如下表所示：
表1本发明设计的引物探针组合
Oligo名称 5’-3’碱基序列
ApoE2-F ACGCGGGCACGGCTGTCCAAGG
ApoE2-R GGCGCTCGCGGATGGCGCTGA
ApoE2-Q FAM-ACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTG-BHQ1
ApoE4-F AGGCGGCGCAGGCCCGGCT
ApoE4-R CCCGGCCTGGTACACTGC
ApoE4-Q FAM-TGCCGATGACCTGCAGAAGCGCCTGGC-BHQ1
内参-F TCCAAAGCAAGGGCTATCGGG
内参-R CTCAGCGTATGCCTCATCGTTG
内参-Q JOE-TCCAGTTCAGACCGTGTAGAAACT-BHQ1
第二方面，本发明提供一种人ApoE基因分型检测的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物探针组合，以及PCR反应液，在所述反应体系中，引物及探针的浓度范围为0.01-1μmol/L，MgCl2终浓度选择1.5-2.0mM，等浓度的四种脱氧三磷酸腺苷(dNTPs)混合液终浓度为100-120nM，热启动DNA聚合酶浓度为1-2U/反应。
本发明申请人利用正交试验方法，通过大量实验对比，最终确定最优的PCR反应体系如下表所示：
表2本发明最优选PCR反应体系
Figure BDA0002429537470000061
Figure BDA0002429537470000071
最优选的，PCR总反应体积为25μL，待检测DNA样品加样量为2μL。
本发明中可用于检测的DNA样品为基因组DNA，DNA样品可来源于血液、唾液、生物组织。对于血液、唾液、生物组织中DNA的提取按照本领域技术人员熟知的操作方法进行。为了方便检测，减少操作步骤，本发明的DNA样本来自于血液或唾液。由于血液的采集对人体有创伤性，本发明的技术人员旨在提供一种可利用唾液DNA样本进行ApoE基因分型检测的试剂盒，发明人预料不到的发现在PCR反应体系中添加一组增效组合物，即可达到以唾液DNA为样本进行ApoE基因分型检测的效果，而且检测结果与基因测序一致，准确率高，对人体无创伤。
第三方面，本发明提供一种唾液DNA样本的人ApoE基因分型检测的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物探针组合和PCR反应液，还包括增效组合物。
所述增效组合物选自1,6-二磷酸果糖二钙盐(终浓度为5-10mmol/L)、D-葡萄糖酸钙盐(终浓度为5-10mmol/L)、D-半乳糖醛酸(终浓度为10-50mmol/L)、维生素C(终浓度为10-50mmol/L)中的一种或两种以上的组合。
优选的，所述增效组合物选自1,6-二磷酸果糖二钙盐与D-葡萄糖酸钙盐中的一种或两种，和D-半乳糖醛酸的组合。
更优选的，所述增效组合物为1,6-二磷酸果糖二钙盐和D-半乳糖醛酸的组合，在PCR反应体系中，1,6-二磷酸果糖二钙盐终浓度为5mmol/L，D-半乳糖醛酸终浓度为20mmol/L。
本发明申请人预料不到的发现1,6-二磷酸果糖二钙盐、D-葡萄糖酸钙盐、D-半乳糖醛酸、维生素C的加入能提高唾液DNA样本的ApoE基因分型检测准确性和灵敏度。具体所述增效组合物在反应体系中发挥的具体作用还有待确证，目前技术人员根据观察到的现象进行分析认为，一方面，增效组合物或许能提高唾液DNA样本在PCR反应体系中的抗逆性，提高唾液DNA在PCR反应中对温度变化的顺应性，D-半乳糖醛酸、维生素C可能为唾液DNA的扩增提供了更适宜的反应条件，增加DNA扩增能力，提高基因分型检测灵敏度；另一方面，技术人员认为增效组合物能提高溶解曲线溶解峰的辨识度，在溶解峰Tm差值判读方面出现的人为误差较少，提高检测准确性。其次，我们通过多次实验发现，当增效组合物选择两种钙盐时，检测结果还是存在误差，当选择一种钙盐和D-半乳糖醛酸或维生素C中的一种时，检测准确性最好，其中D-半乳糖醛酸的效果优于维生素C。
另外，让技术人员感到惊奇的是上述增效组合物加入到血液DNA样本中并不会出现提高检测灵敏度，出现这种差异的原因可能还是与DNA的来源有关，血液DNA样本和唾液DNA样本除了DNA以外可能还是存在其他成分的差异，而优选的增效组合物的加入能很好的排除唾液DNA样本中其他杂质物质的干扰，提高基因分型检测的准确度。
本发明申请人认为，引物、探针的筛选、PCR反应体系的优化是本发明的重点，本发明反应体系为多重不对称PCR，含有多条引物探针，ApoE基因GC含量高，扩增不稳定，探针与引物之间如果形成复杂的二级结构也会影响后续溶解曲线的结果，造成没有溶解峰出现。最终经过实验探索，最终确定本发明提供的试剂盒的最佳应用方法。
第四方面，本发明提供一种上述人ApoE基因分型检测试剂盒的应用方法，所述方法包括如下步骤：
(1)DNA的提取：从待检样本中提取基因组DNA，浓度优选为5-200ng/μL；
(2)荧光PCR扩增：将提取的基因组DNA作为模板进行荧光PCR扩增，获得溶解曲线结果；
(3)结果判读：根据溶解曲线溶解峰的Tm差值的变化判读待测样本是否含有相应基因突变，具体ApoE基因分型结果判读参照下表3。
表3本发明人ApoE基因分型结果对照表
Figure BDA0002429537470000091
+：溶解曲线出峰处 -：溶解曲线未出峰
标准对照的ApoE型质粒，可用于校正外部条件造成的实验误差，本发明对荧光PCR反应后的结果判定也较为简便，无需解读大量的数据和图形，根据溶解曲线Tm差值的变化即可判断ApoE基因分型。
优选的，本发明确定的荧光PCR扩增最佳反应条件如下表所示：
表4荧光PCR扩增最佳反应条件
Figure BDA0002429537470000101
本发明提供的人ApoE基因分型检测试剂盒具有如下有益的技术效果：(1)采用不对称PCR技术结合溶解曲线技术，可实现在一管内检测2个SNP位点的检测，大大节约了成本并节省了时间；(2)简便快速、耗时短，本发明试剂盒只有一管反应液，只需简单的加样上机，整个过程操作时间在3h内，步骤少；(3)特异性好，本发明中使用的探针为所核苷酸修饰探针，对SNP的区分能力强，荧光背景低，一条探针即可区分1个SNP位点，2条探针即可区分2个SNP；(4)均相检测、闭管操作：本发明为均相检测体系，添加模板后PCR扩增和溶解曲线分析都在同一封闭的反应管中完成，无需PCR后续操作，减少了气溶胶污染的几率；(5)本发明提供一种适用于唾液DNA样本进行基因分型检测的PCR反应体系，简单方便，样本采集不会对人体带来创伤，患者临床顺应性更好。
本发明涉及的核苷酸序列具体如下所示：
SEQ ID NO:1 ACGCGGGCACGGCTGTCCAAGG
SEQ ID NO:2 GGCGCTCGCGGATGGCGCTGA
SEQ ID NO:3 ACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTG
SEQ ID NO:4 AGGCGGCGCAGGCCCGGCT
SEQ ID NO:5 CCCGGCCTGGTACACTGC
SEQ ID NO:6 TGCCGATGACCTGCAGAAGCGCCTGGC
SEQ ID NO:7 TCCAAAGCAAGGGCTATCGGG
SEQ ID NO:8 CTCAGCGTATGCCTCATCGTTG
SEQ ID NO:9 TCCAGTTCAGACCGTGTAGAAACT
本发明中的技术术语“SNP”为单核苷酸多态性，具体是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和***。从理论上来看每一个SNP位点都可以有4种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换,二者之比为2:1。SNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T，原因是CG中的C常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。一般而言，SNP是指变异频率大于1％的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP，人类基因组上的SNP总量大概是3×106个。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1血液DNA样本ApoE基因分型检测
S1：采集10名受试者的血液各2mL，血液DNA样品的提取采用常规DNA提取试剂盒进行提取；
S2：向如表2所示的PCR反应体系中加入2μL步骤S1提取的DNA样品，进行PCR扩增反应，反应条件如下；
Figure BDA0002429537470000111
S3：扩增结束后获得溶解曲线，得到溶解峰Tm差值的变化，对照如表3所示的对照表，判读待检样本的ApoE基因分型。
同时，对受试者的血液DNA样本进行基因测序，将本实施例试剂盒检测的基因分型与测序结果进行比对，结果如表5所示。根据对比结果可以看到，本发明提供的试剂盒检测的受试者ApoE分型与基因测序结果一致，说明本发明提供的试剂盒检测准确性高。
表5血液DNA样本ApoE基因分型检测结果
Figure BDA0002429537470000121
实施例2唾液DNA样本ApoE基因分型检测
S1：采集实施例1招募的10名健康志愿者的唾液各1mL，提取DNA样本；
S2：向如表2所示的PCR反应体系中加入2μL步骤S1提取的DNA样品，进行PCR扩增反应，反应条件如实施例1所示；
S3：扩增结束后获得溶解曲线，判读待检样本的ApoE基因分型的方法如实施例1所示。
同实施例1，对唾液DNA进行基因测序，将本实施例试剂盒判读的结果与基因测序结果对比，结果如表6所示。
表6唾液DNA样本ApoE基因分型检测结果
Figure BDA0002429537470000131
根据上表对比数据可以看出，利用本发明提供的试剂盒及试剂盒应用方法检测的唾液DNA样本ApoE基因分型有3个数据与基因测序出现差异，在本发明的小样本实验中准确率仅70％。仔细对比结果技术人员惊奇的发现出现误差的基本是ApoE2分型的检测出现错误，至于原因我们还没有进行大量实验去验证。接下来，技术人员将出现检测错误的3个样本通过添加增效组合物的试剂盒进行重新检测，具体操作如实施例3-6所示。
实施例3唾液DNA样本ApoE基因分型检测
S1：拿取样本编号为5、6、7的唾液DNA样本进行进一步检测；
S2：向如表2所示的PCR反应体系中加入1,6-二磷酸果糖二钙盐，终浓度为5mmol/L，加入D-葡萄糖酸钙盐，终浓度为5mmol/L，再加入2μLDNA样品，进行PCR扩增反应，反应条件如实施例1所示；
S3：获得溶解曲线，如实施例1所示判读待检样本的ApoE基因分型。
表7唾液DNA样本ApoE基因分型检测结果
Figure BDA0002429537470000141
从上面再检测数据能看出，当PCR体系中加入1,6-二磷酸果糖二钙盐和D-葡萄糖酸钙盐作为增效组合物时，5号、6号和7号样本的检测结果中只有7号再次检测结果与基因测序一致，其他两个依然保持原来的检测结果。
实施例4唾液DNA样本ApoE基因分型检测
S1：拿取样本编号为5、6、7的唾液DNA样本进行进一步检测；
S2：向如表2所示的PCR反应体系中加入1,6-二磷酸果糖二钙盐，终浓度为5mmol/L，加入D-半乳糖醛酸，终浓度为20mmol/L，再加入2μL DNA样品，进行PCR扩增反应，反应条件如实施例1所示；
S3：获得溶解曲线，如实施例1所示判读待检样本的ApoE基因分型。
表8唾液DNA样本ApoE基因分型检测结果
Figure BDA0002429537470000142
从上面再检测数据能看出，当PCR体系中加入1,6-二磷酸果糖二钙盐和D-半乳糖醛酸作为增效组合物时，对于之前检测出现误差的3个样本再检测，得到的检测结果也基因测序结果完全吻合，说明增效组合物提高了检测准确性。
实施例5唾液DNA样本ApoE基因分型检测
S1：拿取样本编号为5、6、7的唾液DNA样本进行进一步检测；
S2：向如表2所示的PCR反应体系中加入D-葡萄糖酸钙盐，终浓度为5mmol/L，加入D-半乳糖醛酸，终浓度为20mmol/L，再加入2μL DNA样品，进行PCR扩增反应，反应条件如实施例1所示；
S3：获得溶解曲线，如实施例1所示判读待检样本的ApoE基因分型。
表9唾液DNA样本ApoE基因分型检测结果
Figure BDA0002429537470000151
当PCR体系中加入D-葡萄糖酸钙盐和D-半乳糖醛酸作为增效组合物时，之前检测出现误差的3个样本再检测，得到的检测结果也与基因测序结果完全一致，说明D-葡萄糖酸钙盐和D-半乳糖醛酸的组合物也能提高检测准确性。
实施例6唾液DNA样本ApoE基因分型检测
S1：拿取样本编号为5、6、7的唾液DNA样本进行进一步检测；
S2：向如表2所示的PCR反应体系中加入1,6-二磷酸果糖二钙盐，终浓度为5mmol/L，加入维生素C，终浓度为20mmol/L，再加入2μL DNA样品，进行PCR扩增反应，反应条件如实施例1所示；
S3：获得溶解曲线，如实施例1所示判读待检样本的ApoE基因分型。
表10唾液DNA样本ApoE基因分型检测结果
Figure BDA0002429537470000152
Figure BDA0002429537470000161
当PCR体系中加入1,6-二磷酸果糖二钙盐和维生素C作为增效组合物时，5号样本检测依然出现误差，基因测序结果是E4/E2，而我们的试剂盒检测结果还是E4/E4。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种人ApoE基因分型的特异性引物探针组合，所述组合包括ApoE2分型检测的引物探针组合、ApoE4分型检测的引物探针组合，具体的，ApoE2分型检测的引物探针组合包含：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，探针核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；ApoE4分型检测的引物探针组合包含：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，探针核苷酸序列如SEQID NO:6所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述的一种人ApoE基因分型的特异性引物探针组合还包括内参引物对和内参探针，内参引物对核苷酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示，内参探针核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述的检测探针和内参探针5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，所述荧光基团选自FAM、JOE、VIC、HEX中的一种，淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA中的一种。
4.一种人ApoE基因分型检测的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1-3任一所述的引物探针组合，以及PCR反应液，在所述反应体系中，引物及探针的浓度范围为0.01-1μmol/L，MgCl2终浓度选择1.5-2.0mM，等浓度的四种脱氧三磷酸腺苷(dNTPs)混合液终浓度为100-120nM，热启动DNA聚合酶浓度为1-2U/反应。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中PCR反应体系如下表所示：
Figure FDA0002429537460000011
Figure FDA0002429537460000021
PCR总反应体积为25μL，待检测DNA样品加样量为2μL。
6.一种唾液DNA样本的人ApoE基因分型检测的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求4或5所述的引物探针组合和PCR反应液，还包括增效组合物，所述增效组合物选自1,6-二磷酸果糖二钙盐(终浓度为5-10mmol/L)、D-葡萄糖酸钙盐(终浓度为5-10mmol/L)、D-半乳糖醛酸(终浓度为10-50mmol/L)、维生素C(终浓度为10-50mmol/L)中的一种或两种以上的组合。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述增效组合物选自1,6-二磷酸果糖二钙盐与D-葡萄糖酸钙盐中的一种或两种，和D-半乳糖醛酸的组合。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述增效组合物为1,6-二磷酸果糖二钙盐和D-半乳糖醛酸的组合，在PCR反应体系中，1,6-二磷酸果糖二钙盐终浓度为5mmol/L，D-半乳糖醛酸终浓度为20mmol/L。
9.一种权利要求4-8任一所述的人ApoE基因分型检测试剂盒的应用方法，所述方法包括如下步骤：
(1)DNA的提取：从待检样本中提取基因组DNA，浓度优选为5-200ng/μL；
(2)荧光PCR扩增：将提取的基因组DNA作为模板进行荧光PCR扩增，获得溶解曲线结果；
(3)结果判读：根据溶解曲线溶解峰的Tm差值的变化判读待测样本是否含有相应基因突变，具体结果判读参照下表，
Figure FDA0002429537460000031
10.根据权利要求9所述的试剂盒的应用方法，其特征在于，所述步骤(2)中荧光PCR扩增最佳反应条件如下表所示。
Figure FDA0002429537460000032
CN202010231941.1A 2020-03-27 2020-03-27 一种人ApoE基因分型检测试剂盒 Active CN111269978B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010231941.1A CN111269978B (zh) 2020-03-27 2020-03-27 一种人ApoE基因分型检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010231941.1A CN111269978B (zh) 2020-03-27 2020-03-27 一种人ApoE基因分型检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111269978A true CN111269978A (zh) 2020-06-12
CN111269978B CN111269978B (zh) 2020-12-08

Family

ID=70996174

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010231941.1A Active CN111269978B (zh) 2020-03-27 2020-03-27 一种人ApoE基因分型检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111269978B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112540179A (zh) * 2020-08-06 2021-03-23 武汉天德生物科技有限公司 一种测试ApoE4蛋白含量的ELISA试剂盒
CN113943790A (zh) * 2021-10-25 2022-01-18 北京华夏时代基因科技发展有限公司 一种检测ApoE单核苷酸多态性的方法
CN114214401A (zh) * 2021-12-27 2022-03-22 四川大家医学检测有限公司 一种用于PCR酶切分型检测ApoE基因型的引物、试剂盒及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1127120B1 (en) * 1998-11-04 2008-05-28 Serono Genetics Institute S.A. Genomic and complete cdna sequences of human adipocyte-specific apm1 and biallelic markers thereof
CN103014138A (zh) * 2011-09-23 2013-04-03 深圳北京大学香港科技大学医学中心 一种判定中国汉族人IL-12b基因rs6887695单核苷酸多态性与***性红斑狼疮相关性的方法
CN105886608A (zh) * 2015-12-22 2016-08-24 武汉康昕瑞基因健康科技有限公司 ApoE基因引物组、检测试剂盒和检测方法
CN107447030A (zh) * 2017-09-20 2017-12-08 苏州康吉诊断试剂有限公司 阿尔茨海默症apoe基因检测的试剂盒
CN110268269A (zh) * 2016-12-18 2019-09-20 赛隆特拉有限公司 使用apoe4基序介导的基因以用于诊断和治疗阿尔茨海默氏病

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1127120B1 (en) * 1998-11-04 2008-05-28 Serono Genetics Institute S.A. Genomic and complete cdna sequences of human adipocyte-specific apm1 and biallelic markers thereof
CN103014138A (zh) * 2011-09-23 2013-04-03 深圳北京大学香港科技大学医学中心 一种判定中国汉族人IL-12b基因rs6887695单核苷酸多态性与***性红斑狼疮相关性的方法
CN105886608A (zh) * 2015-12-22 2016-08-24 武汉康昕瑞基因健康科技有限公司 ApoE基因引物组、检测试剂盒和检测方法
CN110268269A (zh) * 2016-12-18 2019-09-20 赛隆特拉有限公司 使用apoe4基序介导的基因以用于诊断和治疗阿尔茨海默氏病
CN107447030A (zh) * 2017-09-20 2017-12-08 苏州康吉诊断试剂有限公司 阿尔茨海默症apoe基因检测的试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FRANCESC FRANCÉS ET AL.: "Single tube optimisation of APOE genotyping based on melting curve analysis", 《CLINICAL BIOCHEMISTRY》 *
MATTHEW DEAN POULSON ET AL.: "Closed-tube genotyping of apolipoprotein E by isolated-probe PCR with multiple unlabeled probes and high-resolution DNA melting analysis", 《BIOTECHNIQUES》 *
丰贵鹏等: "高分辨率熔解曲线法的非标记探针基因分型技术", 《生命的化学》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112540179A (zh) * 2020-08-06 2021-03-23 武汉天德生物科技有限公司 一种测试ApoE4蛋白含量的ELISA试剂盒
CN112540179B (zh) * 2020-08-06 2023-07-07 武汉天德生物科技有限公司 一种测试ApoE4蛋白含量的ELISA试剂盒
CN113943790A (zh) * 2021-10-25 2022-01-18 北京华夏时代基因科技发展有限公司 一种检测ApoE单核苷酸多态性的方法
CN114214401A (zh) * 2021-12-27 2022-03-22 四川大家医学检测有限公司 一种用于PCR酶切分型检测ApoE基因型的引物、试剂盒及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111269978B (zh) 2020-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111269978B (zh) 一种人ApoE基因分型检测试剂盒
WO2009059317A2 (en) Predicting amd with snps within or near c2, factor b, plekha1, htra1, prelp, or loc387715
CN107058538B (zh) 一种引物组合物及其组成的试剂盒和应用
CN110468192B (zh) 一种检测人类脊髓性肌萎缩症基因突变的飞行时间质谱核酸分析方法
CN114085903B (zh) 检测线粒体3243a＞g突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法
CN110387407A (zh) 用于检测人SLCO1B1和ApoE基因分型的引物探针组合物、试剂盒及检测方法
US20070275386A1 (en) Polymorphisms in the Epidermal Growth Factor Receptor Gene Promoter
CN111118138A (zh) 一种叶酸代谢能力基因mthfr和mtrr多态性检测试剂盒及方法
CN110408685A (zh) 用于检测人mthfr基因分型的引物探针组合物、试剂盒及检测方法
CN109234370B (zh) Mut基因突变检测试剂盒
CN110846408A (zh) 用于检测ttn基因突变的引物组合及其应用
CN110846409A (zh) 用于检测tnni3k基因突变的引物组合及其应用
Cui et al. Applications of the method of high resolution melting analysis for diagnosis of Leber's disease and the three primary mutation spectrum of LHON in the Han Chinese population
US8137916B2 (en) Susceptibility gene for alzheimer's disease
CN114381515B (zh) 一种检测异常血红蛋白基因突变的试剂盒
KR20170051747A (ko) 피부 주름 발생 민감도 진단용 단일염기다형성 마커 및 이의 용도
CN108753945A (zh) 与中国儿童肥胖和/或高三酰甘油血症相关的snp位点及其应用
CN116949143A (zh) 一种用于检测mthfr和mtrr基因的序列组合物、试剂盒及应用
CN110863044A (zh) 用于检测vcl基因突变的引物组合及其应用
CN113462771A (zh) Snp标记组合、引物探针组合、试剂盒及其制备中的应用
CN108504731B (zh) 诊断脂质代谢相关疾病或阿尔茨海默病标志物的方法
DE102017218522B3 (de) Verfahren zur genbasierten Diagnose eines Legasthenierisikos
US20100255468A1 (en) Method of assessing gene examination data, program therefor and apparatus of the same
Naja et al. Accurate and rapid prenatal diagnosis of the most frequent East Mediterranean β‐thalassemia mutations
CN110819709A (zh) 用于荧光定量pcr检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant