CN111269293B - 一种感应缬氨酸信号的转录因子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种感应缬氨酸信号的转录因子及其应用。本发明提供一种蛋白质或其变体，所述蛋白质包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1所示的序列具有至少60％同一性的氨基酸序列。本发明还提供编码所述蛋白质的多核苷酸以及相关的应用。本发明的蛋白质可以感应缬氨酸信号，调节微生物体内缬氨酸浓度以及保证细菌正常的生理代谢等。

Description

一种感应缬氨酸信号的转录因子及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种感应缬氨酸信号的转录因子及其应用。

背景技术

在自然界中，大多数病原细菌可以长期存活在各种环境并在寄主体内繁殖生存。这种趋利避害的能力需要细菌能够快速感应各种细胞内外的物理化学信号并在分子调控网络与信号通路的各个层面加以反应。其中，细胞内外的环境刺激包括营养物质、酸碱度、氧化还原电势、离子浓度、抗生素等；同时，细菌最重要的适应性反应是在转录水平，转录因子对特定环境响应基因或看家基因的精细表达调控。

MarR(Multiple Antibiotic Resistance Regulator)蛋白家族类转录因子最初在大肠杆菌中被鉴定为非特异性抗生素抗性抑制子，参与调控抗生素(四环素、氯霉素、水杨酸等)的抗性。随后发现MarR类转录因子广泛存在于微生物中，目前已有报道存在于118种细菌及15种古菌的6503个亚种中，并且参与调控多种细胞的毒力、胁迫反应、有害化学物的降解等。

目前，在病原细菌的相关研究中，转录因子直接感应环境中营养元素变化并调节细菌适应性表达的研究极少。本领域仍然需要对细菌营养感受和适应性调节进行更加深入的研究。

发明内容

本发明首次发现野油菜黄单胞菌的转录因子MarR蛋白(XC0449)能作为感应胞内环境中重要的蛋白合成原料——缬氨酸(Valine)信号的传感器(sensor)，直接感应缬氨酸的匮乏，从而调节胞内从头合成的缬氨酸稳态，最终保证正常的缬氨酸代谢相关途径的正常进行。

在一些实施方案中，本发明提供一种蛋白质或其变体，所述蛋白质包含SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1所示的序列具有至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述蛋白质来自黄单胞菌(Xanthomonas)或嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas)。在一些实施方案中，所述蛋白质具有以下一种或多种功能：1)感受环境中缬氨酸的含量，2)结合缬氨酸，3)调节缬氨酸的含量，4)调节缬氨酸的合成，5)调节参与缬氨酸合成的基因表达，6)结合参与缬氨酸合成的基因的启动子，和/或7)调节细菌致病性。在一些实施方案中，所述蛋白质的变体包括保留了上述一种或多种功能的变体。在一些实施方案中，所述蛋白质的变体包括丧失上述一种或多种功能的变体或具有降低的上述一种或多种功能的变体。在一些实施方案中，保留、丧失或降低上述上述一种或多种功能的变体可以通过例如氨基酸残基的置换、缺失、***等本领域已知的方法进行。在一些实施方案中，本发明的蛋白质包括与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多)氨基酸突变(包括保守突变，例如置换，***或缺失)的氨基酸序列，或由其列组成。在一些实施方案中，例如本发明已经鉴定到所述蛋白上两个关键的缬氨酸结合位点，并且发现突变后的蛋白不能结合缬氨酸，由此可以提供缺失功能突变，影响MarR蛋白对缬氨酸信号的感应。

在一些实施方案中，本发明所述的蛋白可以是缬氨酸信号传感器，例如作为微生物如细菌用于感受胞内和/或胞外环境中的营养成分如缬氨酸的传感器。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸是编码缬氨酸信号传感器，例如作为微生物如细菌用于感受胞内和/或胞外环境中的营养成分如缬氨酸的传感器的基因。在一些实施方案中，本发明包括表达载体和/或核酸构建体，其包含本发明的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸或载体或构建体可以引入到微生物如细菌中，以使所述微生物获得感受营养成分如缬氨酸。在一些实施方案中，本发明包括敲除微生物如细菌中的内源缬氨酸传感器或降低其表达，这可以通过本领域已知的方法，例如例如RNAi、利用同源重组进行基因敲除、利用CRISPR/Cas9的基因编辑方法等进行。在一些实施方案中，本文中提及的微生物包括细菌。在一些实施方案中，本文中提及的细菌包括例如黄单胞菌(Xanthomonas)，嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas)等等。在一些实施方案中，本文中提及的细菌包括例如黄单胞菌(Xanthomonas)，例如Xanthomonas campestris，X.albilineans，X.alfalfae，X.ampelina，X.arboricola，X.axonopodis，X.boreopolis，X.badrii，X.bromi，X.cassavae，X.citri，X.codiaei，X.cucurbitae，X.cyanopsidis，X.cynarae，X.euvesicatoria，X.frageriae，X.gardneri，X.holcicola，X.hortorum，X.hyacinthi，X.malvacearum，X.maltophila，X.manihotis，X.melonis，X.oryzae，X.papavericola，X.perforans，X.phaseoli，X.pisi，X.populi，X.sacchari，X.theicola，X.translucens，X.vasicola，X.vesicatoria等等。在一些实施方案中，在一些实施方案中，本文中提及的细菌包括嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas)，例如S.acidaminiphila，S.bentonitica，S.chelatiphaga，S.daejeonensis，S.dokdonensis，S.ginsengisoli，S.humi，S.indicatrix，S.koreensis，S.lactitubi，S.maltophilia，S.nitritireducens，S.pavanii，S.pictorum，S.rhizophila，S.terrae，S.tumulicola等等。

在一些实施方案中，本发明提供一种多核苷酸，其编码权利要求1所述蛋白质或其变体。在一些实施方案中，所述多核苷酸可以具有以下一种或多种性质：1)包含SEQ ID NO：2所示的多核苷酸序列，2)包含与SEQID NO：2所示的序列具有至少50％，55％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％同一性的多核苷酸序列，3)在严谨条件下(例如在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜的条件下)与SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列杂交，4)来自黄单胞菌(Xanthomonas)或嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas)，5)是编码细菌缬氨酸感受器基因，6)调节缬氨酸的含量，7)调节缬氨酸的合成，8)调节参与缬氨酸合成的基因表达，9)调节细菌致病性，和/或10)是一种选择标记或者一种筛选标记。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸包含与SEQ ID NO：2所示的多核苷酸序列编码的氨基酸序列相同的多核苷酸(考虑到密码子的简并性)。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸包括为了适合在不同宿主中表达而使用不同宿主偏爱密码子的多核苷酸。

在一些实施方案中，本发明提供包含所述多核苷酸的表达载体。在一些实施方案中，本发明提供包含所述多核苷酸或表达载体的细胞，如微生物细胞，如细菌细胞。在一些实施方案中，表达载体可以***到宿主细胞中，用于表达重组蛋白。

在一些实施方案中，本发明提供一种基因工程改造的细菌，如黄单胞菌(Xanthomonas)或嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas)，其中所述细菌具有降低或缺失表达的缬氨酸感受器基因，例如具有降低或缺失表达的本发明所述的多核苷酸编码的基因。在一些实施方案中，所述细菌包含功能突变的本发明所述的蛋白质或其编码基因。在一些实施方案中，可以通过本领域已知的方法降低所述基因的表达或敲除所述基因，例如RNAi、利用同源重组进行基因敲除、利用CRISPR/Cas9的基因编辑方法等。在一些实施方案中，所述基因编码突变的蛋白质，其下述一种或多种功能丧失或降低：1)感受环境中缬氨酸的含量，2)结合缬氨酸，3)调节缬氨酸的含量，4)调节缬氨酸的合成，5)调节参与缬氨酸合成的基因表达，6)结合参与缬氨酸合成的基因的启动子，和/或7)调节细菌致病性。在一些实施方案中，所述基因工程改造的细菌还可以包括另外的突变基因，例如突变的缬氨酸合成的基因，例如XC0356，突变的缬氨酸合成酶等。在一些实施方案中，所述基因工程改造的细菌为营养缺陷型细菌。在一些实施方案中，所述基因工程改造的细菌可以用于表达重组蛋白。

在一些实施方案中，本发明提供一种营养缺陷型宿主细胞，如黄单胞菌细胞，例如野油菜黄单胞菌细胞，其包含：1)编码重组蛋白的多核苷酸或其表达载体，和2)编码将营养缺陷型细胞回复为原养型的蛋白质的多核苷酸。在一些实施方案中，编码目标蛋白的表达载体包括选择标记。在一些实施方案中，所述选择标记是宿主细胞存活所需要的。在一些实施方案中，缺乏选择标记的宿主细胞是不能存活的。在一些实施方案中，表达载体可以包括适当的启动子。在一些实施方案中，表达载体可以包括一种或多种将营养缺陷宿主细胞转化成原养型基因。在一些实施方案中，可以使用本领域中已知的用于在宿主细胞中表达重组蛋白的载体，例如质粒，粘粒，和噬菌体等。在一些实施方案中，可以使用本领域已知的方法通过载体转化宿主细胞，例如采用穿孔方法如电穿孔方法，原生质体融合，细菌结合，和二价阳离子处理等。

在一些实施方案中，本发明提供一种生产重组蛋白的方法，所述方法包括：在宿主细胞中表达编码重组蛋白的多核苷酸或其表达载体，该宿主细胞已经被遗传修饰以形成对至少一种代谢物的营养缺陷型；编码将营养缺陷型细胞回复为原养型的蛋白质的多核苷酸；和使细胞在缺乏营养缺陷型代谢物的培养基上生长。

在一些实施方案中，本发明提供一种选择或鉴定含有重组标记基因的细胞，和/或选择或鉴定已经消除该重组标记基因的细胞的方法，其中所述标记基因编码本发明所述的蛋白质或其功能突变体。

在一些实施方案中，所述细胞是营养缺陷型的，在所述重组标记缺失时缺乏功能性缬氨酸感受器，并且其中将重组标记导入营养缺陷的宿主细胞中，随后在无缬氨酸但补充有缬氨酸合成底物的生长培养基中培养所述细胞，其中只有含有重组标记的细胞能够生长，其中该标记用作选择标记。在一些实施方案中，所述细胞是营养缺陷型的且含有编码功能性的缬氨酸感受器的重组标记基因，并且其中将标记基因随后从该细胞中消除，在无缬氨酸生长培养基中培养该细胞，其中只有消除标记基因的细胞被抑制，其中所述标记用作筛选标记。

在一些实施方案中，本发明提供所述蛋白质或其变体的用途。在一些实施方案中，所述蛋白质或其变体可以用于下述一种或多种用途：1)感受环境(例如胞内或胞外环境)中缬氨酸的含量，2)结合缬氨酸，3)调节缬氨酸的含量(例如细菌内缬氨酸含量)，4)调节缬氨酸的合成(例如细菌缬氨酸合成)，5)调节参与缬氨酸合成的基因表达(例如细菌缬氨酸合成的基因表达)，6)结合参与缬氨酸合成的基因的启动子(例如细菌缬氨酸合成的基因的启动子)，和/或7)调节(例如降低)细菌致病性。

在一些实施方案中，本发明提供所述多核苷酸的用途。在一些实施方案中，所述多核苷酸或其变体可以用于下述一种或多种用途：1)作为编码细菌缬氨酸感受器基因，2)调节缬氨酸的含量(例如细菌内缬氨酸含量)，3)调节缬氨酸的合成(例如细菌缬氨酸合成)，4)调节参与缬氨酸合成的基因表达(例如细菌缬氨酸合成的基因表达)，5)调节(例如降低)细菌致病性，和/或6)是一种选择标记或者一种筛选标记。

在一些实施方案中，本发明提供一种调节微生物如细菌营养感受和/或微生物如细菌致病性的方法，所述方法包括例如，在不具备内源性或缺失内源性缬氨酸感受器的微生物中，外源引入本发明的多核苷酸编码的缬氨酸感受器基因。在一些实施方案中，本发明提供一种调节微生物如细菌营养感受和/或微生物如细菌致病性的方法，所述方法包括降低或缺失内源性表达缬氨酸感受器基因的表达。在一些实施方案中，所述细菌包含功能突变的本发明所述的蛋白质或其编码基因。在一些实施方案中，可以通过本领域已知的方法降低所述基因的表达或敲除所述基因，例如RNAi、利用同源重组进行基因敲除、利用CRISPR/Cas9的基因编辑方法等。在一些实施方案中，所述缬氨酸感受器基因可以是例如本发明的多核苷酸编码的基因。

在一些实施方案中，本发明提供一种基因工程改造的细菌，如黄单胞菌(Xanthomonas)，例如野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)，其中所述细菌具有降低或缺失表达的缬氨酸感受器基因，例如具有降低或缺失表达的本发明所述的多核苷酸编码的基因。在一些实施方案中，所述细菌包含功能突变的本发明所述的蛋白质或其编码基因。在一些实施方案中，可以通过本领域已知的方法降低所述基因的表达或敲除所述基因，例如RNAi、利用同源重组进行基因敲除、利用CRISPR/Cas9的基因编辑方法等。

在一些实施方案中，本发明的方法和用途包括进一步结合缬氨酸合成基因进行，例如细菌缬氨酸从头合成途径中的一个或多个基因，尤其是本发明的多核苷酸编码的基因调节的缬氨酸合成基因，例如XC0356编码的基因。在一些实施方案中，本发明的方法和用途包括外源引入缬氨酸合成基因如XC0356编码的基因或包含所述基因的载体进行。在一些实施方案中，本发明的方法和用途包括缺失内源缬氨酸合成基因如XC0356编码的基因。

在一些实施方案中，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒可以在本发明的方法中使用。在一些实施方案中，所述试剂盒可以包含例如编码缬氨酸感受器的基因，相关引物或探针等。在一些实施方案中，所述试剂盒可以包含适合用于缺失或降低缬氨酸感受器基因表达的试剂，例如RNAi、利用同源重组进行基因敲除、利用CRISPR/Cas9的基因编辑的试剂等。在一些实施方案中，本发明的试剂盒可以进一步包含缬氨酸合成酶基因相关试剂，如引物等。在一些实施方案中，本发明的试剂盒可以进一步包含缺失缬氨酸合成酶基因或降低其表达相关的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包含含有缓冲液、稀释剂、载体的容器。在一些实施方案中，还可包括其他材料，如滤器等。在一些实施方案中，试剂盒中可以包含缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

在一些实施方案中，本发明提供一种感应缬氨酸信号的转录因子与应用。在一些实施方案中，本发明***筛选多个野油菜黄单胞菌的MarR突变体在致病及营养缺陷平板上的表型，鉴定了调控细菌缬氨酸匮乏信号的MarR(XC0449)转录因子基因。在一些实施方案中，本发明设计基因特异性引物，从野油菜黄单胞菌基因组DNA中获得MarR(XC0449)转录因子全长DNA，并在体内及体外进行功能验证。

在一些实施方案中，本发明提供一种细菌转录因子MarR蛋白(XC0449)。在一些实施方案中，所述蛋白可以来源于野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)，但不局限于此菌株。

在一些实施方案中，本发明所述感应缬氨酸信号的MarR转录因子在致病及响应缬氨酸匮乏信号，调节缬氨酸正常生理代谢过程中的应用。在一些实施方案中，所述细菌为野油菜黄单胞菌。

在一些实施方案中，本发明提供了一种感应缬氨酸信号的MarR转录因子基因及其编码蛋白在细菌致病及响应营养匮乏上的应用。

在一些实施方案中，本发明涉及的野油菜黄单胞菌基因名称为转录调节子marR/emrR家族，其基因编号是XC0449，编码的蛋白含有162个氨基酸残基。

SEQ ID NO：1：XC0449的氨基酸序列

MSDLDTPTPSPHPVLLNLEQFLPYRLSVLSNRISGNIAKVYGDRYGMAIPEWRVITILALYPGSSASEVSDRTAMDKVAVSRAVARLLERGFIRRETHGDDRRRSMLALSPAGRQVYETVAPLVNEMEQRLMSVFSAEEQQTLERLIDRLAKDGLPRMASKD

SEQ ID NO：2：XC0449的核苷酸序列

ATGAGCGATCTCGACACCCCCACACCGTCGCCGCATCCCGTCCTGCTCAACCTCGAGCAGTTCCTGCCCTATCGCCTCAGCGTGCTGTCCAACCGCATCAGCGGCAACATCGCCAAGGTCTACGGCGACCGCTATGGCATGGCCATTCCCGAGTGGCGGGTGATCACCATCCTGGCACTGTATCCGGGCTCCTCGGCCAGTGAAGTGTCAGACCGCACGGCGATGGACAAAGTTGCCGTCAGCCGCGCGGTGGCGCGCCTGCTGGAACGGGGCTTCATCCGGCGCGAAACGCACGGCGACGACCGCCGCCGCTCGATGCTGGCGCTGTCGCCGGCCGGGCGCCAGGTGTACGAGACCGTGGCACCGCTGGTCAACGAGATGGAGCAGCGGCTGATGTCGGTGTTCAGCGCCGAAGAACAGCAGACGCTGGAACGGCTGATCGACCGCCTGGCCAAGGACGGGTTGCCGCGGATGGCCAGCAAGGACTGA

XC0356的氨基酸序列和核苷酸序列

XC0356的氨基酸序列

MPEYRSKTSTHGRNMAGARALWRATGMKDGDFHKPIIAIANSFTQFVPGHVHLKDLGQLVAREIERVGGVAKEFDTIAVDDGIAMGHDGMLYSLPSREIIADSVEYMVNAHCADALVCISNCDKITPGMLMAALRLNIPTVFVSGGPMEAGKTKLADHNLDLIDAMVIAADDSASDEKVAEFERSACPTCGSCSGMFTANSMNCLTEALGLSLPGNGTVVATHADREQLFLRAGRVAVELCHRWYGGEDPTALPRGIATFEAFENAMTLDIAMGGSTNTILHLLAAAQEGEVPFGMFRDIDRLSKRVPQLCKVAPNTPKYHIEDVHRAGGIMSILGELARGGLLHTNAATVHTRTLADAIAQWDVTQVDDDKVHTFYKAGPAGIPTQIAFSQATRWDTLDTDRSEGCIRDVAHAFSQEGGLAVLyGNIARDGCVVKTAGVDESIHVFEGNTRVYESQDSAVKGILADEVKAGDVVVIRYEGPKGGPGMQEMLYPTSYLKSKGLGKHCALLTDGRFSGGTSGLSIGHASPEAAAGGAIGLVRNGDKILIDIPKRSIDLLVSDEELAARRTEQDAKGWKPVEVRPRKVTTALKAYALLATSADKGAVRDKAMLDG

XC0356的核苷酸序列

ATGCCCGAATACCGCTCAAAGACCTCCACCCACGGCCGCAACATGGCGGGCGCCCGCGCACTCTGGCGCGCCACCGGCATGAAGGATGGCGATTTCCACAAGCCGATCATTGCCATCGCCAATTCGTTCACGCAGTTCGTTCCCGGGCATGTGCACCTGAAGGATCTTGGGCAACTCGTGGCACGTGAGATCGAACGTGTCGGCGGCGTAGCCAAGGAGTTCGACACCATCGCCGTGGACGACGGTATCGCGATGGGCCACGACGGCATGCTGTACTCGCTGCCCAGCCGCGAGATCATCGCCGACTCGGTCGAGTACATGGTCAACGCGCATTGCGCCGACGCGCTGGTGTGCATTTCCAACTGCGACAAGATCACCCCCGGCATGTTGATGGCCGCCTTGCGCCTCAACATCCCGACGGTGTTCGTCTCCGGCGGGCCGATGGAAGCCGGCAAGACTAAGCTGGCCGACCATAATCTGGATCTGATCGACGCGATGGTGATCGCCGCCGACGACAGCGCCTCCGATGAAAAGGTCGCCGAGTTCGAACGCAGCGCCTGCCCCACGTGCGGCTCGTGCTCGGGCATGTTCACCGCCAACTCGATGAACTGCCTCACCGAAGCGCTGGGTCTTTCATTGCCCGGCAATGGCACCGTGGTGGCCACGCATGCCGACCGCGAGCAGCTGTTCCTGCGCGCCGGGCGCGTGGCGGTGGAGCTGTGCCATCGCTGGTATGGCGGCGAAGACCCCACCGCACTGCCGCGCGGCATCGCCACCTTCGAAGCGTTCGAAAACGCGATGACGCTGGACATCGCCATGGGCGGCTCCACCAACACCATCCTGCATTTGCTGGCTGCCGCACAGGAAGGCGAAGTGCCGTTCGGCATGCGCGATATCGACCGCCTGTCCAAGCGTGTGCCGCAGCTGTGCAAGGTCGCGCCGAACACGCCCAAGTACCACATCGAAGACGTGCACCGTGCCGGCGGCATCATGTCCATCCTCGGCGAACTGGCACGTGGCGGCTTGCTGCACACCAACGCAGCCACCGTGCACACACGCACGCTGGCCGACGCCATCGCGCAATGGGATGTCACCCAGGTCGACGACGACAAGGTGCATACGTTCTACAAGGCCGGCCCGGCCGGCATTCCCACGCAGATTGCGTTTAGCCAGGCCACGCGCTGGGACACCCTGGAIACCGATCGCAGCGAAGGCTGCATCCGCGATGTCGCACACGCGTTCTCGCAGGAAGGCGGCCTGGCGGTGCTGTACGGCAATATCGCGCGCGATGGCTGCGTGGTGAAGACCGCCGGCGTGGACGAATCCATCCATGTCTTCGAAGGCAACACACGCGTCTACGAGAGCCAGGATTCGGCGGTCAAGGGCATCCTCGCCGACGAAGTCAAAGCCGGCGATGTGGTGGTGATCCGCTACGAAGGCCCCAAGGGCGGCCCCGGCATGCAGGAGATGCTCTACCCCACCAGCTACCTGAAATCCAAGGGCCTGGGCAAACACTGCGCACTACTCACCGACGGCCGCTTCTCCGGCGGCACCTCGGGTCTGTCGATCGGCCACGCCTCGCCGGAAGCCGCCGCGGGCGGTGCGATCGGCCTGGTGCGCAACGGCGACAAGATTCTCATCGATATCCCCAAGCGCTCAATCGACCTGCTCGTCTCCGACGAAGAACTGGCCGCACGCCGCACCGAGCAGGACGCCAAGGGCTGGAAGCCGGTGGAAGTGCGCCCACGCAAAGTCACCACCGCGCTGAAGGCGTACGCGTTGCTGGCGACCAGTGCGGACAAGGGCGCGGTACGCGACAAGGCGATGCTGGACGGCTGA

在一些实施方案中，本发明涵盖含有本发明基因的表达载体、重组菌株。

在一些实施方案中，细菌的植物寄主为甘蓝。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明首次发现野油菜黄单胞菌的MarR蛋白(XC0449)能直接响应缬氨酸匮乏信号，解除与缬氨酸的直接结合，并且通过结合缬氨酸从头合成途径下游的关键酶基因XC0356的启动子区，启动关键酶基因XC0356的特异性表达，促进细菌体内缬氨酸从头合成，最终维持体内缬氨酸浓度在正常水平以保证细菌正常的生理代谢等活动。

同时，我们还鉴定到MarR蛋白上两个关键的缬氨酸结合位点，突变后的MarR蛋白不能直接结合缬氨酸，影响MarR蛋白对缬氨酸信号的直接感应。

附图说明

图1显示野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris8004)中MarR家族的***失活突变体表型分析。A，在Xcc8004中所有被注释的MarR家族的蛋白二级结构，蛋白结构域的预测都是通过Pfam和SMART数据库。结构域名称为HTH结构域以及LC(Lowcomplexity)结构域。蛋白长度也通过网站进行了预测。B和D，该家族9个***失活突变体和野生型菌株在NYG和MMX培养基上的表型，对应的生长曲线如C和E。

图2显示野油菜黄单胞菌8004(Xanthomonas campestris pv.campestris8004)中内删除突变体Δ0449致病力下降并且在NYG和MMX培养基上生长差异明显。A，Δ0449引起了甘蓝致病力的降低。将细菌注射到寄主京丰一号甘蓝的叶子中，用10mM氯化镁作为负对照，互补菌株可以部分回补野生型表型。B是A的致病力得分情况。C和E，Δ0449在不同培养基上的表型，可以看出在MMX培养基上Δ0449基本不生长，对应的生长曲线如D和F。G显示，采用了in-planta-growth方法说明在植物体内细菌的生长情况，Δ0449随着时间的增长在植物体内的菌量数明显低于野生型，而互补菌株可以部分回补表型。

图3显示通过染色体免疫共沉淀和高通量测序(ChIP-seq)进行0449蛋白在不同培养基条件下的全基因组分析。A，ChIP-seq实验数据与野油菜黄单胞菌8004(Xanthomonascampestris pv.campestris 8004)全基因组进行比对，得到其结合的峰图。B，通过ChIP-seq实验，分别得到在NYG和MMX培养基下所结合到的蛋白数量的韦恩图。0449蛋白可以结合在不同基因的操纵子上，功能分类统计数据如C。D，通过MEME网站预测到了0449的motif，图中显示的是核苷酸组成的motif。

图4显示0449蛋白是一个转录因子，可以调控下游基因XC0356。A和B，通过微量热涌动(MST)实验证明了蛋白0449可以结合预测的motif，并且将motif突变后结合能力消失。motif和突变motif是用5’fam标记的方法标记后和0449蛋白混合用标准毛细管进行微量热涌动(MST)实验。C，使用凝胶迁移实验(EMSA)分析蛋白0449和下游基因XC0356-DNA的集合。XC0356启动子的操纵子区域的PCR产物通过【γ-32】ATP标记后作为探针。在实验中未标记的DNA探针梯度增加作为竞争(从50x到100x)，每个实验重复三次。D，蛋白0449控制XC0356的转录，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)用于定量蛋白0449在不同菌株下的转录水平，tmRNA的cDNA量作为内参，每个实验有三个生物学重复。

图5显示XC0356参与缬氨酸的生物学合成。A，缬氨酸和异亮氨酸在Xanthomonascampestris pv.campestris 8004中的生物学合成通路。B，XC0356的不同菌株在不同培养基上的生长情况，每个实验有三次生物学重复。C，XC0356突变体的致病力完全丧失，D表示了相应的致病力得分情况。

图6显示XC0449蛋白参与体内体外缬氨酸合成。A，XC0449不同菌株在有无全部氨基酸、有无缬氨酸或者异亮氨酸的MMX培养基上的生长情况。B和C，微量热涌动实验(MST)证明了蛋白0449可以在体外结合缬氨酸，甘氨酸作为对照。D，微量热涌动实验(MST)表明缬氨酸的存在，影响了蛋白0449和5‘端Fam标记的motif的结合，使该结合消失。E，0449不同菌株在MMX培养基或者是含有100mM缬氨酸存在下的MMX培养基中对于XC0356的转录水平有影响，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)去定量在不同条件下不同菌株对于XC0356的mRNA的量，tmRNA作为内参。F，用ChIP-qPCR实验证明在缬氨酸浓度不同的情况下，蛋白0449和XC0356启动子的结合能力不同，运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)来定量分析XC0356在0449蛋白启动子区域的富集程度，实验有三次生物学重复。

图7显示31位的天冬酰胺和76位的天冬氨酸会影响0449蛋白感应缬氨酸。A和B，使用SwissDock进行分子对接预测，结果表明0449蛋白有两个可能和缬氨酸结合的结合位点，31位的天冬酰胺和76位的天冬氨酸，蓝色的代表0449蛋白的晶体结构，粉色区域为缬氨酸，它们二者通过绿色的氢键结合。C和D，是两个点突变互补菌株在MMX培养基和含有缬氨酸的MMX培养基上的生长情况。E，用凝胶迁移实验(EMSA)表明两个点突变蛋白可以结合在XC0356的操纵子区域。F，微量热涌动(MST)实验证明两个点突变蛋白不能在体外结合缬氨酸。G，XC0449不同的菌株在有无缬氨酸存在的情况下对于XC0356的转录水平有所不同，两个点突变的互补菌株和野生型互补菌株相比差异变小，tmRNA作为内参。K，用ChIP-qPCR实验证明在缬氨酸浓度不同的情况下，点突变蛋白0449和XC0356启动子的结合能力不同，运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)来定量分析XC0356在0449点突变蛋白启动子区域的富集程度，实验有三次生物学重复。

图8显示0449蛋白与在不同浓度缬氨酸存在的条件下与缬氨酸之间的调控模型。当细菌在没有缬氨酸的环境下生长的时候，0449蛋白会被激活去结合XC0356的操纵子。而XC0356蛋白时在缬氨酸合成通路上一个重要的酶并且在支链氨基酸氨基转移酶和异亮氨酸脱氢酶的存在下可以促进缬氨酸的合成。但是，当环境中存在足量的缬氨酸时，XC0449蛋白就会去结合缬氨酸而不会再去结合XC0356的启动子。

图9显示野油菜黄单胞菌8004(Xanthomonas campestris pv.campestris8004)中MarR家族***失活突变体表型筛选。A，细菌接种到寄主京丰一号甘蓝的叶子中的发病情况，用10mM氯化镁作为负对照，B为其对应的致病力得分情况。C-E，MarR家族的九个基因产生胞外酶的能力没有显著性差异，C为蛋白酶，D为纤维素酶，E为蛋白酶，F为每个菌株在培养基上的具***置。G为由胞外酶产生的透明圈大小的统计图。H，MarR家族全部基因的***失活突变体在金属离子、渗透性以及耐盐性板子上生长的表型，每个表性实验重复三次。I，突变体在1％过氧化氢和10％SDS胁迫下抑菌圈的生长情况，对应的抑菌圈大小的统计图如G。

图10显示Δ0449的其他表性分析。在产生胞外酶的能力上，野油菜黄单胞菌8004(Xanthomonas campestris pv.campestris 8004)野生型菌株和突变体没有显著性差异，A为淀粉酶，B为纤维素酶，C为蛋白酶，D为各种菌株在平板上所在的位置，E为其透明圈大小的统计图。F为Δ0449以及其互补菌株在金属离子、渗透胁迫和耐盐性的表性分析，每个表性实验重复三次。G，为不同菌株对于1％过氧化氢和10％SDS胁迫下抑菌圈的生长情况，对应的抑菌圈大小的统计图如H。

图11显示带有His₆标签的XC0449蛋白的纯化。A，采用NI柱纯化的方法在纯化过程中每一步的产物用考马斯亮蓝的方法进行跑胶验证。B，XC0449蛋白的凝胶过滤层析分析。每一个峰的样品收集后进行跑胶验证，如C，1-3代表峰1的样品，4-6是峰2的样品，7代表峰3，8位XC0449的纯化蛋白，作为正对照。右边的部分，9-11位峰4，12代表峰5，15为纯化蛋白。

图12显示在含有19中氨基酸的MMX板子上，Δ0449和野生型生长的差异，板子的终浓度为0.5g/L。B，圆二色谱实验验证XC0449蛋白XC0356与操纵子之间的结合是否受到缬氨酸的影响，甘氨酸作为阴性对照。

图13显示XC0449的啷个点突变互补菌株致病力情况。A和B采用的是对剪的方式，寄主为甘蓝京丰一号。C为致病力打分情况

图14显示XC0449与下游基因的体外结合。A，EMSA实验证明XC0449蛋白可以结合不同的下游基因。B，通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)来定量分析下游基因在XC0449蛋白启动子区域的富集程度，实验有三次生物学重复。

具体实施方式

以下实施例中如无特殊说明均为常规方法。

材料与方法

实验材料

培养基

LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，固体培养基加1.5％琼脂，pH＝7.0

NYG培养基5g/L蛋白胨，3g/L酵母提取物，20g/L甘油，固体培养基加1.5％琼脂，pH＝7.0；

210培养基：5g/L蔗糖，8g/L酸水解干酪素，4g/L酵母提取物，3g/LK₂HPO₄，0.3g/LMgSO₄，固体培养基加1.5％琼脂，pH＝7.0

MMX培养基：葡萄糖5g/L，(NH4)₂SO₄2g/L，柠檬酸三钠1g/L，K₂HPO₄4g/L，KH₂PO₄5g/L，MgSO₄0.2g/L，固体培养基加1.5％琼脂，pH＝7.0

菌株、引物和质粒

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α和BL21(DE3)均购自Invitrogen公司。模式菌种为野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris，Xcc 8004)，参见文献1：Deng，C.Y.，Zhang，H.，Wu，Y.，Ding，L.L.，Pan，Y.，Sun，S.T.，Li，Y.J.，Wang，L.and Qian，W.(2018)Proteolysis of histidine kinase VgrS inhibits its autophosphorylationand promotes osmostress resistance in Xanthomonas campestris.Nat Commun，9，4791。克隆载体pGEM T-easy购自Promega公司。敲除载体pK18mob，pK18mobsacB广寄主互补载体pHM1参见文献1。表达载体pET-30a购自BioLabs公司。在实验中用到的其他菌株和质粒以及设计的引物见附表。各种DNA限制性内切酶，T4DNA连接酶购自TaKaRa和Promega公司，各种Taq酶购自Qiagen公司

重要分子生物学试剂

各种DNA限制性内切酶，T4DNA连接酶购自TaKaRa和Promega公司，各种Taq酶购自Qiagen公司，标记试剂盒Primer-A-Gene Labeling System，购自Promga公司，双向电泳相关试剂购自GE公司，其他常用分子生物学及生化试剂均为国产或进口分析纯。

实验方法：

分子生物学基本操作

PCR扩增、酶切以及连接转化大肠杆菌感受态细胞等一系列基本分子生物学实验操作均参考Molecular Cloning(Sambrook et al.，1989)

微生物基本操作

菌株的保存

平板保存：需要进行实验的菌株通过划线或者是涂布的方法保存于相应的抗性平板上，并且可以贮存于4℃冰箱中保存，两周内活性较好。

甘油保存：取高温灭菌的1.5ml EP管，加入40％灭菌甘油0.4ml，后加入0.6ml菌液，混匀后贮存于-80℃冰箱。

细菌的培养条件

大肠杆菌所采用的是LB培养基，培养条件是37℃；Xcc8004所采用的是NYG丰富培养基，培养条件为28℃。在特殊实验条件下需要用MMX培养基进行诱导。抗生素的使用浓度如下：利福平(rifampicin，25μgmL-1)，卡那霉素(kanamycin，50μg mL-1)和壮观霉素(spectinomycin，150μg mL-1)。

黄单胞菌质粒DNA及其基因组DNA的制备

质粒的提取

(1)摇菌：将所需提质粒的菌株在前一天接种于相对应抗生素的液体培养基中，摇菌过夜。

(2)收菌：8,000×g离心3分钟后弃上清。

(3)重悬：加入250μl Solution I(50mM葡萄糖，25mMTris-HCl，pH 8.0，10mMEDTA，pH 8.0)吸打重悬后转移到1.5ml EP管中。

(4)裂解：加入250μlSolution II(0.2M NaOH，1％SDS)上下颠倒混匀，室温放置3min。

(5)除细胞残渣：加入350μlSolution III(冰乙酸11.5mL，水28.5mL，5M乙酸钾60ml)，上下颠倒混匀，13,000×g常温离心10分钟。

(6)除蛋白质：将上清吸取至离心吸附柱中，室温放置2分钟后，12,000×g离心1分钟后，倒掉收集管中的废液。再加入500μl去蛋白液，12,000×g离心1分钟后，倒掉收集管中的废液。

(7)清洗质粒：吸附柱中加入500μl Buffer PW 12,000×g离心1分钟后，倒掉收集管中的废液。重复一次后，12,000×g离心2分钟，并且在风机下吹2分钟，尽可能去除残留的液体。

(8)溶解和保存质粒：将吸附柱转移到新的EP管中，加入30μl提前在65℃水浴预热的ddH₂O，室温放置2分钟后，12,000×g离心1分钟后，吸取EP管中的液体重新至吸附柱上，再次离心后，丢到吸附柱，写好标记后，-20℃保存质粒。

黄单胞菌基因组DNA的快速制备

(1)收菌：将过夜培养的菌株取1ml于1.5ml EP管中，13,000×g离心一分钟后收集菌体，去除上清。

(2)重悬裂解：加入400μl细胞裂解液(40mM Tris-醋酸，pH7.8，20mM醋酸钠，pH7.8，1mM EDTA，pH 8.0，1％SDS)，吸打混匀菌体，静置5分钟，澄清后加入200μl 5M NaCl温和翻转后，再次静置2分钟，14,000×g离心10分钟。

(3)沉淀DNA：取上清至新EP管中，加入7/10的异丙醇，-20℃沉淀30分钟。

(4)洗涤DNA：沉淀后的DNA，12,000×g离心10分钟，去除上清，收集沉淀，加入300μl 70％乙醇洗涤，10,000×g离心10分钟，回收沉淀重复一次。

(5)干燥：将剩余的乙醇吸干净后，在吹风机下干燥后，溶于30μl提前65℃水浴加入的ddH2O中。

(6)定量保存：用NanoDrop测定DNA的浓度，进行标记后-20℃保存。

黄单胞菌感受态细胞的制备与转化

黄单胞菌感受态细胞的制备：

(1)培养菌体：取-80℃保存的菌株，在相应的培养基上用灭菌的牙签划线后，于28℃中培养2天后，挑取单菌落于10ml含相应抗生素的培养基中。

(2)扩大培养：按照1％的接种量接种于500ml 210培养基中。28℃扩大培养6-8小时，至OD₆₀₀＝0.4-0.6。

(3)收集菌体：将菌液平均分装在50ml的大离心管中，在冰上静置降温20分钟后，4℃，8,000×g离心收集菌体。与此同时，将10％甘油和灭好菌的1.5mlEP管置于4℃冰箱中预冷。

(4)洗涤菌体：用提前预冷后的甘油洗涤菌体，重复三次。

(5)分装和保存：洗涤好的菌体，吸出剩余甘油后，加入500μl甘油，分装成40μl一管，迅速放入液氮中，之后保存在-80℃冰箱中。

电击转化黄单胞菌感受态细胞：

取一管40μl的感受态细胞置于冰上融化，加入适量需要的质粒，混匀后转移到清洗干净的预冷电击杯中，轻敲桌面至感受态覆盖电击杯底部后立即加入电击仪中。采用BIO-RAD公司的Pulser Controller电击仪，电击参数如下：V＝1.8kV，C＝25μF，R＝200Q，电击时间应为3.8-6ms。电击后立即加500μl210液体培养基至电击杯中，使培养基和感受态吸打混匀，吸出感受态细胞置于50ml离心管中，28℃ 220rpm振荡培养2小时。将菌液涂布于含相应抗生素的平板，28℃培养48小时。

黄单胞菌***失活突变体构建

(1)克隆上下游片段：PCR扩增并用凝胶回收试剂纯化回收目的基因的一段DNA片段，再将其分别与pGEM T-easy载体连接，转化至DH5α超级感受态细胞，挑取单菌落于LB液体培养基中摇菌后测序，从测序正确的单克隆中提取重组的质粒，并且进行双酶切分别回收上下游片段。

(2)连接***载体：同时将回收的上下游片段与同样进行双酶切处理并回收的***载体的pK18mob载体片段连接，热击转化DH5α感受态细胞，选择阳性克隆结果的菌落摇菌提取重组质粒，进行双酶切验证。

(3)一次交换：用验证正确后的敲除载体转化至黄单胞菌感受态细胞，涂布于相应含抗生素的平板上，28℃培养两天后，进行PCR验证，未扩出条带的即为阳性克隆菌株。

(4)验证：将所认为的阳性克隆菌株摇菌后提DNA，进行PCR扩增，如果未扩出条带，即为正确验证。

黄单胞菌突变菌株和互补菌株的构建

(1)克隆上下游片段：PCR扩增并用凝胶回收试剂纯化回收目的基因的一段DNA片段，再将其分别与pGEM T-easy载体连接，转化至DH5α超级感受态细胞，挑取单菌落于LB液体培养基中摇菌后测序，从测序正确的单克隆中提取重组的质粒，并且进行双酶切分别回收上下游片段。

(2)连接***载体：同时将回收的上下游片段与同样进行双酶切处理并回收的***载体的pK18mob载体片段连接，热击转化DH5α感受态细胞，选择阳性克隆结果的菌落摇菌提取重组质粒，进行双酶切验证。

(3)一次交换：用验证正确后的敲除载体转化至黄单胞菌感受态细胞，涂布于相应含抗生素的平板上，28℃培养两天后，进行菌落PCR，挑选未扩出的菌落。

(4)二次交换：挑取验证确实未扩出的菌落，用NYG培养基摇2小时进行二次交换，之后涂于NYG+10％平板上，28℃培养48小时。

(5)对挑：将NYG+10％蔗糖板子上生长的单菌落分别在NYG和NYG+kanamycin的板子上进行对挑，28℃培养24小时。

(6)选取在NYG上能够生长的，而在含有kanamycin的抗性板上不能生长的单菌落进行菌落PCR，用外侧引物进行扩增，条带大小应该是野生型大小减去删除部分的大小，切胶送测序确定是否为正确菌株。

互补菌株的构建是将框内删除或者***失活基因的全长序列扩增后，侯建到载体pHM1(Innes et al.，1988)上，菌落PCR及酶切验证正确后电击转化到黄单胞菌突变体的感受态中，提质粒酶切验证阳性克隆。

植物致病力、金属离子和渗透性胁迫等表型的检测

野油菜黄单胞菌致病力分析

野油菜黄单胞菌XCC8004对于寄主甘蓝((Brassica oleracea cv.Jingfeng 1)的致病力是通过对剪叶子的方法来进行观测的(Dow et al.，1990)。

(1)将所需要的菌株，用牙签取单菌落过夜培养后，用10mM灭菌后的MgCl₂重悬两次菌体，调OD₆₀₀＝0.4±0.05。

(2)挑选生长良好的甘蓝，并用75％的酒精将剪刀消毒后，蘸取菌液，使剪刀刀片处沾满菌液，从距甘蓝叶片顶端1/3处向中间主叶脉剪，剪刀在叶片上停留5s后，叶片一边接种野生型，另一边接种其他菌株，以方便观察差异。将接种好的甘蓝放入培养箱，湿度保持在100％，日照时间12小时。28℃培养10天左右观察病斑的大小，并根据病斑发病的程度进行打分，每个菌株至少8个重复。

野油菜黄单胞菌植物体内生长分析(in-planta growth)

(1)将所需要的菌株，用牙签取单菌落过夜培养后，用10mM灭菌后的MgCl₂重悬两次菌体，调OD₆₀₀＝0.4±0.05。

(2)将调好的菌液稀释1000倍后，挑选生长好的甘蓝，用1ml注射器吸取菌液后，将其注入到叶脉之间。在同一片叶子上，接种不同菌株，可以减少该实验的误差。将接种好的甘蓝放入培养箱，湿度保持在100％，日照时间12小时，28℃培养。

(3)在第0天、2天、4天、6天、8天的时候取样，每次取样用200μl黄色枪头，以注射中心区域为中心，取下含有菌的叶盘。每个1.5ml EP管中放2个叶盘，每个菌做4次重复，即每天需要8个叶盘。

(4)研磨时，取1ml 10mM MgCl₂将两个叶盘在研磨器中研磨充分后，将菌液收集到1.5ml的EP管中，充分震荡混匀后，稀释溶液到10^-3和10^-4级，涂NYG平板，每个200μl，涂好后的平板倒置于28℃培养箱中，培养48小时后计数。

黄单胞菌金属离子胁迫耐受性表性分析

(1)将所需要的菌株，用牙签取单菌落过夜培养后，调OD₆₀₀＝0.4±0.05。

(2)提前将含有不同浓度的金属离子的NYG平板配好，所需含量如下：2.5mM FeSO₄+0.5mM抗坏血酸、0.4mM CuSO₄、0.3mM ZnSO₄。

(3)将菌液梯度稀释到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，依次取1.5μl点接于平板上，置于28℃培养2-3天后观察实验结果，并且拍照记录。

黄单胞菌高盐胁迫耐受性的表性分析

(1)将所需要的菌株，用牙签取单菌落过夜培养后，调OD₆₀₀＝0.4±0.05。

(2)提前将含有3％NaCl和3％KCl的NYG平板准备好后，将菌液梯度稀释到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，依次取1.5μl点接于平板上，置于28℃培养2-3天后观察实验结果，并且拍照记录。

黄单胞菌胞外酶表型分析

胞外纤维素酶活性检测

(1)将所需要的菌株，用牙签取单菌落过夜培养后，调OD₆₀₀＝0.4±0.05。

(2)提前准备好含有0.5％羧甲基纤维素(carboxymethyl-cellulose，CMC，Sigma公司)的NYG平板。

(3)取1.5μl菌液接种在平板上，置于28℃，培养48小时。

(4)在培养基中加入20ml 0.1％刚果红溶液染色30min。

(5)用清水将培养基中的刚果红洗净后，加入1M NaCl溶液脱色两次，每次脱色30min，此时，我们可以观测到由纤维素酶产生的透明圈，此时用尺子测量无色透明圈的大小，并且与野生型菌株做对比，每个实验3次重复。

胞外淀粉酶活性检测

(1)将所需要的菌株，用牙签取单菌落过夜培养后，调OD₆₀₀＝0.4±0.05。

(2)提前准备好含有0.1％可溶性淀粉的NYG平板。

(3)取1.5μl菌液接种在平板上，置于28℃，培养48小时。

(4)在培养基中加入1∶100I₂/KI(0.08M I₂，3.2M KI)溶液染色15分钟。

(5)用清水将培养基中的染色液洗净后，我们可以观测到由淀粉酶产生的透明圈，此时用尺子测量无色透明圈的大小，并且与野生型菌株做对比，每个实验3次重复。

胞外蛋白酶活性检测

(1)将所需要的菌株，用牙签取单菌落过夜培养后，调OD₆₀₀＝0.4±0.05。

(2)提前准备好含有2％脱脂奶粉的NYG平板。

(3)取1.5μl菌液接种在平板上，置于28℃，培养48小时后可以观测到由蛋白酶产生的透明圈，此时用尺子测量无色透明圈的大小，并且与野生型菌株做对比，每个实验3次重复。

黄单胞菌过氧化氢(SDS)胁迫耐受性的表性分析

(1)所需要的菌株，用牙签取单菌落过夜培养后，调OD₆₀₀＝0.4±0.05。

(2)在40ml融化了的NYG固体培养基中加入500μl调好的菌液，充分混匀。此时培养基的温度必须低于40℃，否则培养液中的菌体会由于温度过高被烫死。充分混匀后，倒入平板中。

(3)待平板充分凝固后，用镊子夹取提前灭好菌的圆形滤纸片，放在平板上，轻轻按压，使滤纸片保证平整且都覆盖在培养基上。

(4)在滤纸片上点5μl的1％H₂O₂或10％SDS，置于28℃，培养48小时后即可观察透明圈的大小，用尺子测量透明圈的大小并且拍照记录，每个实验重复三次。

黄单胞菌渗透胁迫的表型分析

(1)将所需要的菌株，用牙签取单菌落过夜培养后，调OD₆₀₀＝0.4±0.05。

(2)提前准备好含有18％山梨醇(sorbitol)的NYG平板，将菌液梯度稀释到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，依次取1.5μl点接于平板上，置于28℃培养2-3天后，观察菌落生长并拍照记录。

黄单胞菌NYG及MMX生长表型分析

培养基上生长表型

(1)将所需要的菌株，用牙签取单菌落过夜培养后，调OD₆₀₀＝0.4±0.05。

(2)NYG和MMX培养基配制如实验材料。

(3)含有全部氨基酸的MMX培养基，氨基酸含量终浓度为0.5g/L，即在MMX培养基中分别加入等浓度的不同氨基酸后过滤即可。

去除缬氨酸和异亮氨酸的培养基与全部氨基酸培养基类似。

单独氨基酸MMX培养基，即在MMX培养基中分别加入100mM的各种氨基酸，过滤后即可。

配置好的培养基均为固体培养基，倒平板待用。

(4)将不同的菌株梯度稀释到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，依次取1.5μl点接于平板上，置于28℃培养2-3天，MMX培养基生长时间为3-5天，观察菌落生长并拍照记录。

总RNA的制备、RT-PCR以及qRT-PCR

黄单胞菌总RNA提取

(1)将所要提取RNA的菌株过夜培养至OD₆₀₀为0.4后，取菌液至进口灭菌后的EP管中，12,000×rpm，离心收集沉淀。

(2)加入1ml Trizol(invitrogen)，立即用移液枪轻轻吹散菌体，静置5min。

(3)在1ml Trizol中加入200μl氯仿，剧烈震荡使其混合均匀后，室温放置3min使其自然分相后，放入提前预冷的离心机中，12,000×g，离心15min。

(4)离心后的溶液小心吸取上层无色水相到新的EP管中，加入等体积提前预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后室温放置10min后，4℃，10,000×g，离心10min。

(5)用移液枪吸出上清弃之，加入提前预冷的1ml75％乙醇(用RNase-free水配制而成)，温和翻转EP管，使白色沉淀悬浮，4℃，10,000×g，离心5min。

(6)重复步骤(5)

(7)将上清小心吸出后弃之，随即再次高速离心，再次吸出剩余上清后，将沉淀放置风机下室温干燥5min。

(8)待沉淀至无液体，并且白色沉淀变为无色后，加入20μlRNase-free水，轻弹管壁，迅速离心，以充分溶解RNA。

(9)用Nanodrop定量后，计算1μg RNA需要多少的样品后，配制10μl消化体系，包含1μl 10×Dnase I Buffer和1μl DNase I(RNase-free)，剩余体积用RNse-free水补齐，进行消化，反应程序如下：孵育37℃1小时，灭活DNase 70℃反应10min。

RT-PCR(Reverse Transcription PCR)

(1)消化后的体系中加入1μl Random Primer 70℃5min后，立即离心后放在冰上至少10min。

(2)在Nuclease free的EP管中配制20μL反应体系：

4μL 25mM MgCl₂，2μL Reverse Transcription10×Buffer，2μ L10mM dNTPMixture，0.5μL Recombinant

Ribonuclease Inhibitor，1μg已去除DNA污染的RNA，0.5μL反转录酶，Nuclease-Free Water补足至20μL，混匀后进行反转，反转PCR程序如下：42℃1h进行cDNA的合成，70℃反应15min。

qRT-PCR

(3)以反转后的cDNA为模板加入1μl到qRT-PCR专用排管中，可以根据实验最后的起峰的温度来调整加入的模板量，一般15-22个循环内起峰模板量合适，过高应该增加模板量，过低应该减少模板量。

(4)加入qRT-PCR Mix和0.2μM的引物，再计入少量的DMSO后，用Nuclease freewater补足体积至20μl，所采用的引物序列见附表2。

(5)小心的盖上排管的盖子，注意不要讲盖子弄脏，以影响实验，将体系混匀后加入到仪器中，反应程序如下：

(6)50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s；60℃，30s；72℃，30s；读板；82℃，1s(此温度根据实际情况调整)；读板；从步骤3开始重复40个循环；72℃，3min；生成熔解曲线，从65℃到95℃，每0.3℃读一次板，停留1秒；结束。

蛋白的原核表达及纯化

蛋白表达菌株的构建

(1)将所要表达的序列设计引物，引物设计见表1。

(2)扩增目的片段，连接pGEM T-easy载体，转化DH5d感受态细胞

(3)做菌落PCR验证，正确的菌落摇菌酶切正确后送测序。

(4)测序正确后，酶切片段和重组质粒PET30a，连接转化至DH5α感受态中。

(5)进行菌落PCR验证，摇菌后进行酶切验证。

(6)将正确的重组表达质粒电击转化BL21感受态中，涂板，挑取生长的单菌落进行摇菌，提质粒，并且酶切验证。

(7)正确的菌株即为构建好的带有His₆标签的融合蛋白表达菌株。

(8)若需构建点突变蛋白表达菌株，只需在(4)之前，以测序验证完全正确的重组质粒为模板，用全式金公司的Easy Mutagenesis Systems Kit试剂盒及特异性点突变引物扩增点突变载体，并转化DMT感受态细胞，测序验证完全正确的点突变重组质粒连接相应的表达载体，后续操作完全相同。

外源蛋白在大肠杆菌中的表达

(1)将构建好的融合蛋白表达菌株在含有Kana抗生素的LB培养基中，37℃摇床中培养5-6小时。

(2)按照1％的接种比例接种至500ml含有kana抗生素的LB培养基中，在37℃摇床中培养至OD₆₀₀为0.4-0.6，加入终浓度为1mM的IPTG

(3)根据不同的蛋白，诱导温度和时间可能会不同，所以要搜索条件。首次表达时分别用温度37℃、28℃和16℃，诱导时间分别为3h，6h和16h小批量的诱导摸索出可以最大量表达蛋白的条件。

(4)在最适合的表达条件下诱导蛋白的表达，4℃离心收菌，菌体可在4℃条件下短时间保存，但是可能影响纯化效果。

带His6标签的融合蛋白纯化

(1)将表达的大量菌体收集后，加入3ml1×Ni-NTA结合缓冲液(50mM磷酸缓冲液，pH 8.0，300mM NaCl，20mM咪唑)的比例重悬。

(2)加入总浓度1mM的PMSF和0.2mg/ml的溶菌酶，消除气泡混合均匀后，在冰上超声，完全破碎细胞。

(3)超声至菌体透光后，用4℃，10,000×g，30分钟，收集上清，即可溶性蛋白提取物。

(4)亲和树脂预处理：按5-10mg融合蛋白ml-1Ni-NTAHis·Bind(Novagen)树脂的量加入树脂悬液至手动装好的层析柱中，用5-10倍柱体积的1×Ni-NTA结合缓冲液平衡树脂。

(5)将离心后的上清加入到平衡好的树脂中，4℃结合2-3小时。

(6)带有标签的融合蛋白以及其他的非特异性结合的杂蛋白已经结合在树脂上，打开下方的封闭盖子，将上清滤下，收集。加入1ml1×Ni-NTA漂洗缓冲液(50mM磷酸缓冲液，pH 8.0，300mM NaCl，45mM咪唑)洗涤树脂4次，每次取出少量液体加入到蛋白检测试剂(Bio-Rad)中，检验是否将杂蛋白去除干净，待检测时几乎没有蓝色时，换低浓度咪唑的缓冲液冲洗，此时洗脱下来的即为所结合的蛋白。每步样品都收集，以备后续的检测。

(7)将收集的每步样品各取10μl，分别加入10μl的1×SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE胶)电泳，考马斯亮蓝R-250染色，跑胶检验每步的纯化结果。

(8)收集有所需蛋白条带的样品，加入到相应大小的浓缩柱中，待浓缩到少量时，加入Storage缓冲液50mM Tris-HCl，pH 8.0，0.5mMEDTA，pH 8.0，50mM NaCl和5％甘油)，加入的原则是少量多次。

(9)浓缩到一定程度时，用蛋白检测试剂(Bio-Rad)测定蛋白浓度，分装，存于-80℃即可。

染色质免疫共沉淀及测序分析(ChIP-seq)

(1)构建ChIP所需菌株，及在染色体C端加上His₆标签后的互补片段，打入到突变体背景下，在表型不受标签影响的情况下，构建即有效。

(2)将所需的菌株分别在NYG和MMX培养基中培养至OD₆₀₀为0.4后，加入1％的甲醛，室温震荡15min使其发生交联。

(3)加入0.5M甘氨酸，继续室温震荡15min，终止交联后，将菌体收集，用提前预冷好的PBS重悬菌体，洗两次后，分装200μl一管后，4℃离心，将菌体立即放入液氮中，-80℃保存。

(4)将菌体用1.2ml Lysis Buffer重悬(10mM Tris，pH 8.0，20％蔗糖，50mMNaCl，10mM EDTA，10mg/mL溶菌酶)，加入到4.8ml IP Buffer中(50mM HEPES-KOH，pH 7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，1％Triton X-100，0.1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)中，并加入1mMPMSF，超声裂解(之前要做好预实验，摸清超声的次数，使DNA片段破碎至300-500bp为最佳)。

(5)超声后4℃高速离心，取上清，加入20μL Protein A beads/ml上清，4℃旋转10min，离心去除Protein A beads：取出部分上清作为input；

(6)在1ml上清中加入30μl Protein A agarose，1μl抗体，4℃旋转过夜结合。

(7)分别用IP Buffer、IP Buffer+500mM NaCl、Wash Buffer(10mM Tris，pH 8.0，250mM NaCl，1mM EDTA，0.5％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠)和TE Buffer(10mM Tris，pH 7.5，1mM EDTA)洗Beads，每种缓冲液洗两次。

(8)尽可能将上清吸取干净后，加入200μl Elution Buffer(50mM Tris，pH 7.5，10mM EDTA，1％SDS)，65℃水浴10min，离心

(9)吸取上清到新的EP管中，加入160μl TE Buffer，2μl RNase A(20mg/ml)，42℃水浴孵育90min后，加入20μl Proteinase K(20mg/ml)，此时Input同时平行操作，37℃孵育至少6小时。

(10)加入24∶1氯仿：异戊醇，充分震荡混匀后，13,000×rpm，4℃离心10分钟，取出上清后加入乙醇、糖原和醋酸钠，-80℃过夜沉淀。

(11)过夜沉淀的DNA用75％的乙醇洗涤两次，并且风干后，加入提前预热的20μl水中，跑胶，用过2％的胶，注意要提前清洗好全部的东西，保证干净。

(12)切下300-500bp的片段，用进口回收试剂盒回收DNA，即为样品。

(13)将样品送到基因组所进行ChIP-seq实验。

ChIP-qPCR

(1)与ChIP-seq实验相似，重复步骤(1)到步骤(10)，在除背景的时候注意此时要定量，使得每个样品的总体积和总浓度是相同的，每一步操作尽可能保持一致，以减小误差。

(2)过夜沉淀后的DNA用75％的乙醇洗涤两次风干后，加入提前预热的15μl水中。

(3)qRT-PCR：以回收得到的DNA为模板进行实时荧光定量PCR，input作为内参，引物为基因前200-300bp操纵子区域(见附表2)。

凝胶迁移阻滞实验(EMSA)

(1)引物设计为靶标基因启动子区的引物，以野油菜黄单胞菌Xcc8004基因组DNA为模板进行PCR扩增，回收得到目的片段，引物详情见表2.

(2)在40μl体系中，加入1pmol的探针，4μl PNK Buffer以及1μlPNK酶，其余部分用水补齐后，37℃标记1h。

(3)将纯化蛋白、buffer、以及适量的非竞争DNA探针混合在一起，混匀后室温反应30min。

(4)将标记好的探针，稀释到300fmol后，加2μl到20μl的反应体系中，室温反应30min。

(5)上样于5％的EMSA非变形PAGE胶，该胶需要预跑30min，电泳缓冲液为0.5×TBE，100V跑5min后，加大电压到120V，跑1h左右。

(6)将胶块置于滤纸上，放入到透明袋中，置于磷屏上，压3h左右后扫描检测。

微量热涌动实验(MST)

(1)将所需的蛋白按照Monolith NT^TM Protein Labeling Kit RED-NHS(Cat Nr：L001)试剂盒的方法标记纯化蛋白。

(2)用MST Buffer成倍稀释标记好的蛋白，使荧光值在800-1200之间。

(3)准备16个小离心管，除第一管不加东西外，剩下每个管子中加入10μl MSTBuffer，每次需要换枪头

(4)取小分子或者是受体蛋白等配体10μl加入到第一个管子中，再取10μl到第二个管子中，轻轻吸打混匀后梯度稀释，直到最后一个管子中吸打混匀后，吸出10μl弃之。

(5)在每个管子中加入10μl稀释好的标记蛋白，每次需要更换枪头。

(6)将每个管子中的溶液混匀，避免产生气泡后，用毛细管吸取液体，上级测量Monolith NT.Label Free(Nano Temper Technologies GMBH，Germany)，LED power根据蛋白的荧光值调整，MST power为80％。

扫描结束后，用Nano Temper Analysis Software对实验结果进行分析，导出数据并作图即可。

表1：引物列表及说明

表2：菌株和质粒

Claims (13)

1.一种基因工程改造的野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)，其中所述野油菜黄单胞菌具有降低或缺失表达的缬氨酸感受器基因，其中所述基因是SEQ ID NO:2所示的多核苷酸编码的基因。

2.一种营养缺陷型野油菜黄单胞菌细胞，所述细胞具有降低或缺失表达的缬氨酸感受器基因，其中所述基因是SEQ ID NO:2所示的多核苷酸编码的基因，所述细胞包含：1)编码目标重组蛋白的多核苷酸或其表达载体，和2)编码将营养缺陷型细胞回复为原养型的蛋白质的多核苷酸。

3.一种生产目标重组蛋白的方法，所述方法包括使权利要求2的野油菜黄单胞菌细胞在缺乏缬氨酸的培养基上生长。

4.一种鉴定含有重组标记基因的细胞和/或鉴定已经消除该重组标记基因的细胞的方法，其中所述细胞是野油菜黄单胞菌细胞，其中所述标记基因由SEQ ID NO:2所示的多核苷酸编码，其中1)所述细胞是营养缺陷型的，在所述重组标记缺失时缺乏功能性缬氨酸感受器，并且其中将重组标记导入营养缺陷的宿主细胞中，随后在无缬氨酸但补充有缬氨酸合成底物的生长培养基中培养所述细胞，其中只有含有重组标记的细胞能够生长，其中该标记用作选择标记；或者2)其中细胞是营养缺陷型的且含有编码功能性的缬氨酸感受器的重组标记基因，并且其中将标记基因随后从该细胞中消除，在无缬氨酸生长培养基中培养该细胞，其中只有消除标记基因的细胞被抑制，其中所述标记用作筛选标记。

5.一种调节微生物营养感受和/或微生物致病性的方法，其中所述微生物是野油菜黄单胞菌，所述方法包括1)在不具备内源性或缺失内源性缬氨酸感受器的微生物中，外源引入缬氨酸感受器基因，或者2)降低或缺失内源性缬氨酸感受器基因的表达，所述缬氨酸感受器基因是SEQ ID NO:2所示的多核苷酸编码的基因。

6.野油菜黄单胞菌蛋白质的用途，其中所述蛋白质的序列为SEQ ID NO:1所示的序列，其中所述用途为下述一种或多种用途：1)感受环境中缬氨酸的含量，2)结合缬氨酸，3)调节缬氨酸的含量，4)调节缬氨酸的合成，5)调节参与缬氨酸合成的基因表达，6)结合参与缬氨酸合成的基因的启动子，和/或7)调节野油菜黄单胞菌致病性。

7.权利要求6所述的用途，其中调节野油菜黄单胞菌致病性是降低致病性。

8.野油菜黄单胞菌多核苷酸的用途，其中所述多核苷酸的序列为SEQ ID NO:2所示的序列，其中所述用途为下述一种或多种用途：1)作为编码野油菜黄单胞菌缬氨酸感受器基因，2)调节缬氨酸的含量，3)调节缬氨酸的合成，4)调节参与缬氨酸合成的基因表达，5)调节野油菜黄单胞菌致病性，和/或6)作为一种选择标记或者一种筛选标记。

9.权利要求8所述的用途，其中调节野油菜黄单胞菌致病性是降低致病性。

10.一种试剂盒，所述试剂盒包含1)编码野油菜黄单胞菌缬氨酸感受器的基因或其载体，或者2)适合用于缺失或降低野油菜黄单胞菌缬氨酸感受器基因表达的试剂，其中所述基因是SEQ ID NO:2所示的多核苷酸编码的基因。

11.权利要求10所述的试剂盒，其中所述试剂是RNAi的试剂、利用同源重组进行基因敲除的试剂、或利用CRISPR/Cas9的基因编辑的试剂。

12.权利要求10或11所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含3)编码缬氨酸合成酶的基因，或者4)缺失缬氨酸合成酶基因或降低其表达的试剂。

13.权利要求12所述的试剂盒，其中缺失缬氨酸合成酶基因或降低其表达的试剂是RNAi的试剂、利用同源重组进行基因敲除的试剂、或利用CRISPR/Cas9的基因编辑的试剂。

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