CN111263771A - 用于治疗干燥综合征的抗cd40抗体 - Google Patents
用于治疗干燥综合征的抗cd40抗体 Download PDFInfo
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Abstract
本公开涉及通过使用抗CD40抗体来治疗干燥综合征的方法、治疗方案、用途、试剂盒和疗法。
Description
先前的申请
本申请要求2017年11月3日提交的美国临时申请号62/581212和2018年3月19日提交的美国临时申请号62/644939的优先权，将这两个临时申请的内容以其全文包括在此。
技术领域
本公开涉及通过使用抗CD40抗体(如CFZ533)来治疗干燥综合征(
syndrome)(如原发性干燥综合征或继发性干燥综合征)的方法、治疗方案、用途、试剂盒和疗法。
背景技术
干燥综合征(SS)(如原发性干燥综合征(pSS)或继发性干燥综合征(sSS))是一种病因不明的常见慢性自身免疫性疾病。
原发性和继发性SS患者的疾病标志均包括抗Ro和抗La自身抗体以及唾液腺和泪腺中的单核细胞浸润物的存在(Bombardieri等人2012)。在一些情况下，这些T淋巴细胞和B淋巴细胞的积聚形成了组织良好的结构，称为异位***构(ELS)，该异位***构与GC具有形态学和功能相似性(Voulgarelis等人2008)。先前的研究已经报道了来自SS患者的和来自该疾病的临床前模型的唾液腺中的ELS的证据以及持续亲和力成熟的证据(Jacobi等人2002；Stott等人1998；Bombardieri等人2012)，这暗示这些结构与疾病病理学有关(Bombardieri等人2017)。
这种疾病对生活质量(QoL)测量的影响是实质性的，并且比较性研究表明pSS QoL的量化评分比充血性心力衰竭或许多癌症更差(Segal等人2009；Kuenstner等人2002；Komaroff等人1996)。此外，SS中B细胞活性的增加导致5％的SS患者发生淋巴瘤发展的恶性转化的风险增加。对SS患者的治疗仅限于对黏膜体征和症状进行对症护理，而且迄今为止，针对SS患者，尚无循证全身治疗。
糖皮质激素类和典型的病情改善性抗风湿药(DMARD)大多无效，并且尚无药物干预能够有效对抗严重的致残性疲劳。尽管缺乏令人信服的疗效证据并且基于轶事证据以及类似自身免疫性疾病(如全身性红斑狼疮)的经验，有时使用抗疟药(Tishler等人2008)、甲氨蝶呤(Winzer和Aringer 2010)或硫唑嘌呤(Kaufman等人1999)，特别是用于治疗诸如肾脏或关节受累等的腺外症状。
尽管使用B细胞耗竭剂利妥昔单抗的小型试验已经证明了一定程度的治疗效果，但没有适当的大型随机对照试验显示出对于腺外和腺体疾病表现的明显疗效。预防分泌腺破坏和解决腺外疾病表现的病情改善剂将提出用于治疗SS(如慢性pSS)的颠覆性进展。
CFZ533是针对人CD40的人单克隆抗体。它属于IgG1同种型亚类并包含Fc沉默突变(N297A)，该突变消除FcγR结合和相关的效应子功能(如ADCC和CDC)。CFZ533在US8828396和US9221913中公开，将这两个文献通过引用并入本文。
发明内容
已经发现具有沉默的ADCC活性的人抗CD40单克隆抗体适用于治疗干燥综合征。特别地，抗体CFZ533在概念验证研究中显示在临床活性pSS方面有提供新治疗模式的希望。
根据本发明的第一方面，提供了用于治疗干燥综合征的抗CD40抗体。在一个实施例中，干燥综合征是原发性干燥综合征。
抗体可以选自由以下组成的组：
a.抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域；
b.抗CD40抗体，其包含含有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的高变区的免疫球蛋白VH结构域以及含有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的高变区的免疫球蛋白VL结构域；
c.抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域、以及SEQ ID NO:13的Fc区；
d.抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域、以及SEQ ID NO:14的Fc区；以及
e.抗CD40抗体，其包含Fc IgG1沉默区。
抗体可以包含SEQ ID NO:9的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:10的轻链氨基酸序列；或包含SEQ ID NO:11的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:12的轻链氨基酸序列。
在一个实施例中，提供了药物组合物，其包含治疗有效量的用于根据第一方面使用的抗体和一种或多种药学上可接受的载体。
在一个实施例中，施用途径是皮下或静脉内、或皮下或静脉内的组合施用根据第一方面的抗体。
剂量可以是约3mg至约30mg活性成分/千克人受试者。可以每周一次、每两周一次或每四周一次给予剂量。
在一个实施例中，剂量是约10mg活性成分/千克人受试者。
在一个实施例中，剂量是约150mg至约600mg活性成分。可以每周一次、每两周一次或每四周一次给予剂量。
在一个实施例中，剂量是约300mg活性成分。
在一个优选的实施例中，剂量是150mg活性成分。在另一个优选的实施例中，剂量是300mg活性成分。在又另一个优选的实施例中，剂量是600mg活性成分。
在一个实施例中，通过负荷给药和维持给药来施用抗体。
在一个实施例中，经由皮下注射第一剂量来施用负荷给药，并且经由皮下注射第二剂量来施用维持给药。第一剂量可以与第二剂量相同或高于第二剂量。
在一个实施例中，第一剂量在约150mg与约600mg活性成分之间，如约300mg活性成分，并且第二剂量在约150mg与约600mg活性成分之间，如约300mg活性成分。
在一个实施例中，第一剂量是150mg、300mg或600mg活性成分，并且第二剂量是150mg、300mg或600mg活性成分。
在一个实施例中，负荷给药包括至少两次皮下注射，并且维持给药由每周一次(Q1W)、每两周一次(Q2W)或每月一次(Q4W)皮下注射组成。在一个实施例中，负荷给药由两次皮下注射组成。在另一个实施例中，负荷给药由三次皮下注射组成。
在一个实施例中，负荷给药的多次皮下注射具有不同的剂量。在另一个实施例中，负荷给药的多次皮下注射具有相同的剂量。
根据第二方面，提供了治疗人受试者中的干燥综合征的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的抗CD40抗体。在一个优选的实施例中，干燥综合征是原发性干燥综合征。
在一个实施例中，抗体选自下由以下组成的组：
a.抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域；
b.抗CD40抗体，其包含含有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的高变区的免疫球蛋白VH结构域以及含有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的高变区的免疫球蛋白VL结构域；
c.抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域、以及SEQ ID NO:13的Fc区；
d.抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域、以及SEQ ID NO:14的Fc区；以及
e.抗CD40抗体，其包含Fc IgG1沉默区。
在一个实施例中，抗体可以包含SEQ ID NO:9的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:10的轻链氨基酸序列；或包含SEQ ID NO:11的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:12的轻链氨基酸序列。
在一个实施例中，抗体与一种或多种药学上可接受的载体一起施用。
在一个实施例中，经皮下或经静脉内、或经皮下或经静脉内的组合施用抗体。
在一个实施例中，以约3mg至约30mg活性成分/千克人受试者的剂量施用抗体。
在一个实施例中，剂量是约10mg活性成分/千克人受试者。
在一个实施例中，以约150mg至约600mg活性成分(如300mg活性成分)的剂量施用抗体。
在一个优选的实施例中，剂量是150mg活性成分。在另一个优选的实施例中，剂量是300mg活性成分。在又另一个优选的实施例中，剂量是600mg活性成分。
在一个实施例中，以负荷给药和维持给药施用抗体。
在一个实施例中，经由皮下注射第一剂量来施用负荷给药，并且经由皮下注射第二剂量来施用维持给药。
第一剂量可以与第二剂量相同或高于第二剂量。
在一个实施例中，第一剂量在约150mg与约600mg活性成分之间，如约300mg活性成分，并且第二剂量在约150mg与约600mg活性成分之间，如约300mg活性成分。
在一个实施例中，第一剂量是150mg、300mg或600mg活性成分，并且第二剂量是150mg、300mg或600mg活性成分。
在一个实施例中，负荷给药包括至少两次皮下注射，并且维持给药由每周一次(Q1W)、每两周一次(Q2W)或每月一次(Q4W)皮下注射组成。
在一个实施例中，负荷给药由两次皮下注射组成。在另一个实施例中，负荷给药由三次皮下注射组成。
在一个实施例中，负荷给药的多次皮下注射具有不同的剂量。在另一个实施例中，负荷给药的多次皮下注射具有相同的剂量。
根据第三方面，提供了包含抗CD40抗体、缓冲剂、稳定剂和增溶剂的液体药物组合物以及用于将抗CD40抗体经皮下施用至患有干燥综合征的患者的装置用于制造治疗干燥综合征的药物的用途，其中将该抗CD40抗体：
a.以第一负荷给药经皮下施用；和
b.此后，以第二维持给药经皮下施用，其中所述抗CD40抗体选自由以下组成的组：
i.抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域；
ii.抗CD40抗体，其包含含有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的高变区的免疫球蛋白VH结构域以及含有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的高变区的免疫球蛋白VL结构域；
iii.抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域、以及SEQ ID NO:13的Fc区；
iv.抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域、以及SEQ ID NO:14的Fc区；
v.抗CD40抗体，其包含Fc IgG1沉默区；和
vi.抗CD40抗体，其包含SEQ ID NO:9的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:10的轻链氨基酸序列；或包含SEQ ID NO:11的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:12的轻链氨基酸序列。
在一个优选的实施例中，干燥综合征是原发性干燥综合征。
附图说明
图1是pSS患者中CFZ533的概念验证研究(CCFZ533X2203)的第一和第二群组的研究设计的示意图。
图2是pSS患者中CFZ533的概念验证研究(CCFZ533X2203)的第三群组的研究设计的示意图。
图3是显示概念验证研究CCFZ533X2203开始之前初步模拟的药物代谢动力学曲线的图。
图4是显示静脉内施用后的药物代谢动力学曲线的图(研究CCFZ533X2203的群组2；中期分析)。
图5是显示静脉内施用后的临床评分(ESSDAI)的图(群组2；研究CCFZ533X2203)。
图6是显示静脉内施用后的生物标志物水平(CXCL13)的图(群组2；研究CCFZ533X2203)。
图7是显示静脉内施用后不同临床终点的治疗结果的示意图(群组2；研究CCFZ533X2203)。
图8是显示药物效应动力学曲线的图(静脉内施用后血浆中的总可溶性CD40；群组2；研究CCFZ533X2203)。
图9是显示皮下施用后的临床评分(ESSDAI)的图(群组1；研究CCFZ533X2203)。
图10是显示皮下施用后的药物代谢动力学曲线的图(群组1；研究CCFZ533X2203)。
图11是显示皮下施用后的药物效应动力学曲线(总可溶性CD40)的图(群组1；研究CCFZ533X2203)。
图12是显示皮下施用后的临床评分(ESSPRI)的图(群组1；研究CCFZ533X2203)。
图13是显示静脉内施用后的临床评分(ESSPRI)的图(群组2；研究CCFZ533X2203)。
图14是显示静脉内施用后的生物标志物水平(CXCL13)的图(群组2；研究CCFZ533X2203)。
图15是显示静脉内施用后的临床评分(ESSDAI)的图(群组2；研究CCFZ533X2203)。
图16是显示静脉内施用后的ICAM和B细胞水平的图(群组2；研究CCFZ533X2203)。
图17是显示不同临床终点的治疗结果的示意图(静脉内和皮下施用；研究CCFZ533X2203)。
图18是显示体外CFZ533抑制rCD154诱导的途径激活的图。
图19是显示体外CFZ533最小刺激活性的图。
图20是显示CFZ533在体外不介导细胞耗竭的图。
图21是各个RI-1B细胞的代表性图像，其显示被recCD154或CFZ533结合后CD40受体的内化。
图22是显示在非人灵长类动物中CFZ533的药物代谢动力学和药物效应动力学(靶标接合；无B细胞耗竭)特性的图。
图23A是非人灵长类动物中PK/PD和疫苗接种研究的实验设计示意图。图23B是显示抗KLH IgG(免疫应答)和血浆CFZ533水平(药物代谢动力学)的图。图23C显示了生发中心的组织学分析结果。
图24A、图24B和图24C是皮下给予的活性成分的可能每周一次负荷剂量，然后是活性成分的每两周一次的维持方案(皮下)的图示。
图25A是皮下给予的活性成分的可能每周一次负荷剂量然后是每4周施用活性成分(皮下)的图示，并且图25B是皮下给予的活性成分的可能每周一次负荷剂量然后是每周施用活性成分(皮下)的图示。
图26显示实验结果；在用MR1处理10周后，唾液腺中的ELS中的CD40标记和NOD小鼠唾液腺中的三级淋巴器官的减少。
图27显示实验结果；用抗CD154处理10周后，NOD小鼠唾液腺中AQP-5阳性细胞的百分比增加。
具体实施方式
CD40-CD154(CD154是CD40L)途径被认为在干燥综合征(SS)的发病机制中起着重要作用。
因此，任何能够阻断CD40-CD154信号传导的抗CD40单克隆抗体(如具有沉默的ADCC活性的抗CD40抗体)都适用于治疗SS(如原发性干燥综合征(pSS))。
不希望受理论束缚，诸位发明人已经确定在维持方案期间至少约40μg/mL的CFZ533抗体的持续血浆浓度对于阻断SS患者(如pSS患者)的靶组织中的CD40-CD40L途径是必需的。而且，由于CFZ533进行靶标介导的分布(与靶标转换和表达相关)以及SS患者在体内呈现高CD40表达，因此在治疗开始时需要负载方案以使CD40受体在这些患者中在其中CD40水平增加的条件下完全饱和，这在治疗开始时需要更高剂量或更频繁的方案。因此，负荷给药方案在治疗开始时(2至3周)提供CD40受体的快速饱和，然后维持给药方案在整个治疗期间提供至少40μg/mL或至少100μg/mL的持续血浆浓度，在其中受影响组织中的CD40表达增强(病症的严重程度)的情况下，考虑治疗效果。在稳定状态下观察到的最大血浆浓度在约300与400μg/mL之间(群组3；研究CCFZ533X2203)并且通常是安全且耐受良好的，没有主要信号表明感染风险增加。未观察到血栓栓塞事件。
适当的剂量将根据以下而变化：例如使用的具体CD40途径拮抗剂，例如抗CD40抗体或其抗原结合片段(例如mAb1(本文也称为CFZ533)、mAb2、ASKP1240)或者抗CD40L抗体(例如BIIB063)或其抗原结合片段，治疗的受试者，施用方式和所治疗病症的性质和严重程度，以及患者所经历的先前治疗的性质。最终，主治医疗服务人员将决定治疗各名个体患者的CD40途径拮抗剂的量。在一些实施例中，主治医疗服务人员可施用低剂量的CD40途径拮抗剂且观察患者的应答。在其他实施例中，施用至患者的CD40途径拮抗剂的一个或多个初始剂量较高，接着向下调整直至出现复发迹象为止。可施用较大剂量的CD40途径拮抗剂，直至患者获得最佳治疗效果为止，且该剂量一般不会进一步增加。
在实践本公开的一些治疗方法或用途时，将治疗有效量的CD40途径拮抗剂，例如抗CD40抗体或其抗原结合片段(例如mAb1(本文也称为CFZ533)、mAb2、ASKP1240)或者抗CD40L抗体或其抗原结合片段施用至患者，例如哺乳动物(例如人)。虽然应当理解所公开的方法提供了使用CD40途径拮抗剂(例如，mAb1/CFZ533、mAb2、ASKP1240)治疗SS患者，但这并不排除如果患者最终用CD40途径拮抗剂治疗，则这种CD40途径拮抗剂疗法必然是单一疗法。实际上，如果选择患者进行CD40途径拮抗剂治疗，那么CD40途径拮抗剂(例如，mAb1/CFZ533、mAb2、ASKP1240)可以根据本公开的方法单独施用或与其他药剂和疗法组合施用。
应当理解，方案改变可能适合于某些SS患者，例如pSS患者，例如对使用的CD40途径拮抗剂(例如抗CD40抗体或其抗原结合片段(例如mAb1(本文也称为CFZ533)、mAb2、ASKP1240)，或抗CD40L抗体或其抗原结合片段)的治疗显示出不充分应答的患者。因此，施用(例如mAb1/CFZ533或mAb2)可能比每月给药更频繁，例如每两周一次给药(每隔两周)或每周一次给药。
一些患者可以受益于负荷方案(例如，每周一次施用持续数周[例如1至4周，例如在第0周、第1周、第2周和/或第3周给药，如2周，在第0周和第1周负荷给药方案])然后是维持方案，例如在第3周或第4周开始，其中CFZ533可以每周、每两周或每4周一次施用持续数周。
例如，针对mAb1/CFZ533或mAb2的适当方案可以是每周一次持续数周[例如1至4周，例如在第0周、第1周、第2周和第3周给药]，然后是每月一次的维持方案。
在另一个实例中，针对mAb1/CFZ533或mAb2的适当方案是每周一次持续数周(例如2至8周，如3周，例如在第0周、第1周、第2周给药)，然后是每两周一次的维持方案。
还应当理解，施用(例如对于mAb1/CFZ533或mAb2的施用)可以不如每月给药那么频繁，例如，每6周、每8周(每两个月)、每季度(每三个月)等给药。
应当理解，基于疾病的严重程度，剂量递增可能适合于某些SS患者，例如pSS患者，例如对使用的CD40途径拮抗剂(例如抗CD40抗体或其抗原结合片段(例如mAb1(本文也称为CFZ533)、mAb2、ASKP1240)，或者抗CD40L抗体或其抗原结合片段)的治疗显示出不充分应答的患者。因此，皮下(s.c.)剂量(负荷或持续剂量)可大于皮下约150mg至约900mg，例如约75mg、约100mg、约125mg、约175mg、约200mg、约250mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约600mg等；类似地，静脉内(i.v.)剂量可大于约10mg/kg，例如约11mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg等。还应当理解，剂量降低还可能适合于某些SS患者，例如pSS患者，例如对CD40途径拮抗剂(例如抗CD40抗体或其抗原结合片段(例如mAb1(本文也称为CFZ533)、mAb2、ASKP1240)，或抗CD40L抗体或其抗原结合片段)的治疗显示不良事件或不良应答的患者。因此，CD40途径拮抗剂(例如抗CD40抗体或其抗原结合片段(例如mAb1(本文也称为CFZ533)、mAb2、ASKP1240)，或抗CD40L抗体或其抗原结合片段)的剂量可以少于皮下约150mg至约900mg，例如约25mg、约50mg、约75mg、约100mg、约125mg、约175mg、约200mg、约250mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约600mg等。
在一些实施例中，可以按皮下递送的600mg的初始剂量向患者施用CD40拮抗剂，例如抗CD40抗体或其抗原结合片段(例如mAb1(本文也称为CFZ533)、mAb2、ASKP1240)或抗CD40L抗体或其抗原结合片段，然后如果需要，可以如医师所确定的将剂量调节至皮下递送的150mg或300mg。
在一些实施例中，可以按静脉内递送的10mg/kg的初始剂量向患者施用CD40拮抗剂，例如抗CD40抗体或其抗原结合片段(例如mAb1(本文也称为CFZ533)、mAb2、ASKP1240)或抗CD40L抗体或其抗原结合片段，然后如果需要，可以如医师所确定的将剂量调节至皮下递送的150mg或300mg。
在一个具体实施例中，在第1天(D1)、第15天(D15)、D29、D57、D85、D99、D113和D141皮下施用3mg/kg CFZ533。
在另一个具体实施例中，在D1、D15、D29、D57、D85、D99、D113和D141静脉内施用10mg/kg CFZ533。
在又另一个具体实施例中，每周一次(Q1W)皮下施用包括四个单位剂量的600mgCFZ533的负荷剂量，即在D1、D8、D15和D22皮下施用600mg CFZ533，然后每周一次(Q1W)皮下施用包括300mg单位剂量的维持剂量，即从D29至D85每周一次皮下施用300mg CFZ533。
在另一个具体实施例中，在第1天静脉内施用一次包括一个剂量的10mg CFZ533/kg受试者的负荷剂量，然后每周一次(Q1W)皮下施用包括300mg单位剂量的维持剂量，即从D8至D85每周一次皮下施用300mg CFZ533。
CFZ533可以每季度、每月、每周或每两周施用一次，例如通过皮下注射，以约75mg至约600mg或约150mg至约300mg的剂量皮下施用，以约75mg、约150mg、约300mg、约450mg或约600mg的单位剂量施用。
可以通过皮下注射每周一次施用CFZ533，负荷剂量为约150mg至约600mg，其中负荷剂量在1至4周内施用。
负荷剂量也可以是约10mg/kg至约30mg/kg的静脉内施用。而且，可以每周或每两周一次经皮下施用负荷剂量，剂量为约150mg、300mg和/或600mg的活性成分。
优选地进行CFZ533的负荷方案或给药(例如150/300/600mg，每周或每两周一次)，随后进行维持方案或给药，每周、每两周或每月(每四周)施用一次。优选地维持剂量为每周或每两周一次皮下300mg，或每两周一次600mg或每4周600mg。
抗CD40抗体或其抗原结合片段可以是CFZ533、其功能衍生物或其生物仿制药。
如本文所定义的，“单位剂量”是指皮下剂量，其可包含在约75mg至900mg之间，例如约150mg至约600mg、例如约150mg至约600mg、例如约300mg至约600mg、或例如约150mg至约300mg。例如，单位皮下剂量是约75mg、约150mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg。
定义
如本文所使用的，CD40是指分化簇40，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员5。除非另有描述，术语CD40是指人CD40，例如如SEQ ID NO:19中所定义的。
与数值x相关的术语“约”意指例如+/-10％。当在数字范围或数字列表前使用时，术语“约”适用于系列中的每个数字，例如短语“约1-5”应理解为“约1-约5”，或者，例如短语“约1、2、3、4”应理解为“约1、约2、约3、约4等”。
词语“基本上”不排除“完全”，例如，“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。在必要的情况下，可以从本公开的定义中省略词语“基本上”。
术语“包含”涵盖“包括”以及“由…组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其他物质，例如X+Y。
AUC0-t表示从时间零到时间‘t’在血浆浓度-时间曲线下的面积，其中t是施用后的确定时间点[质量x时间/体积]。
AUCtx-ty表示从时间‘x’到时间‘y’在血浆浓度-时间曲线下的面积，其中‘时间x’和‘时间y’是施用后定义的时间点。
Cmax是药物施用后观察到的最大血浆浓度[质量/体积]。
Cmin是药物施用后观察到的最小血浆浓度。
C谷是正好在给药间隔开始之前或结束时观察到的血浆浓度。
Tmax是药物施用后达到最大浓度的时间[时间]。
ss(下标)表示在稳定状态下定义参数。
如本文所使用的术语“抗体”或“抗CD40抗体”等是指与CD40相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的完整抗体。天然存在的“抗体”是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，即CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，即CL。VH和VL区可以被进一步细分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其间插有称为框架区(FR)的更加保守的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。这些抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体***的第一组分(Clq))的结合。术语“抗体”包括例如单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼抗体、或合成抗体。这些抗体可以属于任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类，优选IgG并且最优选IgG1。示例性抗体包括CFZ533(本文也称为mAb1)和mAb2，如表1所示。
可以将轻链和重链二者分成结构和功能同源性区域。术语“恒定”和“可变”是在功能上使用。在这点上，应当理解轻链(VL)和重链(VH)部分的可变结构域均决定抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要生物特性如分泌、经胎盘移动性(transplacental mobility)、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域离抗体的抗原结合位点或者氨基末端越远，它的编号越大。N-末端是可变区，并且C-末端是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。特别地，术语“抗体”具体包括IgG-scFv形式。
如本文所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗原部分”)是指保留了与抗原或表位(例如，CD40的一部分)特异性结合能力的全长抗体或抗体的一个或多个片段，如蛋白质。
“互补决定区”(“CDR”)是其边界使用许多熟知的方案中的任一种确定的氨基酸序列，这些方案包括以下描述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白质序列]”,第5版.Public Health Service[公共卫生服务],美国国立卫生研究院(National Institutes of Health),贝塞斯达(Bethesda),马里兰州(MD)(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)以及ImMunoGenTics(IMGT)编号(Lefranc,M.-P.,TheImmunologist[免疫学家],7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.[发育与比较免疫学],27,55-77(2003)(“IMGT”编号方案)。在IMGT下，可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定抗体的CDR区。
如本文所使用的术语“表位”是指能以高亲和力与免疫球蛋白结合的任何决定簇。表位是特异性靶向抗原的抗体结合的抗原的区域，并且当抗原是蛋白质时，所述表位包括直接接触抗体的特定氨基酸。大多数情况下，表位存在于蛋白质上，但在一些情况中，它可以存在于其他类型的分子，例如核酸上。表位决定簇可以包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或者磺酰基基团，并且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由不同的基因所编码，但是可使用重组方法通过合成的接头将它们连接起来，所述接头使得它们变成为单一的蛋白质链，其中VL区和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426；以及Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。
如本文所使用的，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合CD40的分离抗体基本上不含特异性结合非CD40的抗原的抗体)。然而，特异性结合CD40的分离的抗体可以与其他抗原，例如来自其他物种的CD40分子具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学品。如本文所使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有单一分子组成的抗体分子的制剂。如本文所使用的，术语“人抗体”意在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区二者都源自人来源的序列。“人抗体”无需由人、人组织或人细胞产生。本公开的人抗体可包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变引入的突变，通过抗体基因重组期间在体内连接处的N-核苷酸添加，或通过体内体细胞突变)。
关于天然多肽与其功能性衍生物的“同一性”在本文中定义为，在将序列比对及必要时引入空位以实现最大百分比同一性，且不考虑任何保守性取代为序列同一性部分之后，候选序列中与相应天然多肽的残基相同的氨基酸残基的百分比。N-末端或C-末端延伸与***均不应解释为降低同一性。用于比对的方法及计算机程序是熟知的。百分比同一性可通过标准比对算法来确定，例如Altshul等人描述的基本局部比对搜索工具(BLAST)((1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],215:403 410)；Needleman等人的算法((1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],48:444453)；或Meyers等人的算法((1988)Comput.Appl.Biosci.[生物科学中的计算机应用],4:11 17)。一组参数可以是具有空位罚分12、空位延伸罚分4、以及移码空位罚分5的Blosum 62评分矩阵。也可使用已经整合到ALIGN程序(版本2.0)中的E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS,4:11-17)的算法，使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4测定两个氨基酸或核苷酸序列之间的百分比同一性。
“一个或多个氨基酸”是指例如所有天然存在的L-α-氨基酸且包括D-氨基酸。短语“氨基酸序列变体”是指当与根据本公开的序列相比时其氨基酸序列具有一些差异的分子。根据本公开的抗体(例如指定序列)的氨基酸序列变体仍具有结合人CD40的能力。氨基酸序列变体包括取代性变体(去除至少一个氨基酸残基且在根据本公开的多肽中的相同位置***不同氨基酸的那些变体)、***性变体(紧邻根据本公开的多肽中的特定位置处的氨基酸***一个或多个氨基酸的那些变体)以及缺失性变体(在根据本公开的多肽中去除一个或多个氨基酸的那些变体)。
如本文所使用的术语“Fc区”是指包含抗体的CH3、CH2和恒定结构域的铰链区的至少一部分的多肽。任选地，Fc区可以包含在一些抗体种类中存在的CH4结构域。Fc区可以包含抗体恒定区的整个铰链区。在一个实施例中，本发明包括抗体的Fc区和CH1区。在一个实施例中，本发明包括抗体的Fc区和CH3区。在另一个实施例中，本发明包括来自抗体恒定区的Fc区、CH1区和Cκ/λ区。在一个实施例中，本发明的结合分子包含恒定区，例如重链恒定区。在一个实施例中，与野生型恒定区相比，这类恒定区是经修饰的。即，本文公开的本发明的多肽可以包含对三个重链恒定结构域(CH1、CH2或CH3)中的一个或多个和/或对轻链恒定区结构域(CL)的改变或修饰。实例修饰包括在一个或多个结构域中添加、缺失或取代一个或多个氨基酸。可以包括此类改变，以优化效应子功能、半衰期等。
如本文所使用的，术语“亲和力”是指在单一抗原位点上抗体与抗原之间的相互作用强度。在每一抗原位点内，抗体“臂”的可变区通过弱的非共价力与抗原在多个位点相互作用；相互作用越强，亲和力越强。如本文所使用的，针对IgG抗体或其片段(例如Fab片段)的术语“高亲和力”是指对靶抗原具有10-8M或更小、10-9M或更小、或10-10M、或10-11M或更小、或10-12M或更小、或10-13M或更小的KD的抗体。然而，对于其他抗体同种型，高亲和力结合可以变化。例如，对于IgM同种型的高亲和力结合是指具有10-7M或更小、或10-8M或更小的KD的抗体。
如本文所使用的，“特异性结合CD40多肽”的抗体或蛋白质意在是指以100nM或更小、10nM或更小、1nM或更小的KD结合人CD40多肽的抗体或蛋白质。
“与不是CD40的抗原交叉反应”的抗体意在是指以1μM或更小、100nM或更小、10nM或更小、1nM或更小的KD结合该抗原的抗体。“不与特定抗原交叉反应”的抗体意在是指以100nM或更大的KD、或1μM或更大的KD、或10μM或更大的KD结合该抗原的抗体。在某些实施例中，不与所述抗原交叉反应的此类抗体在标准结合测定中显示出对这些蛋白质的基本上检测不到的结合。
如本文所使用的术语“Kassoc”或“Ka”意在是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而如本文所使用的术语“Kdis”或“Kd”意在是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。
如本文所使用的，术语“KD”意在是指解离常数，其获得自Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)并且表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域良好建立的方法测定抗体的KD值。用于测定抗体的KD的方法是通过使用表面等离子共振，或者使用生物传感器***，如
***。
如本文所使用的，术语“ADCC”或“抗体依赖性细胞毒性”活性是指细胞耗竭活性。ADCC活性可以通过如本领域技术人员所熟知的ADCC测定来测量。
如本文所使用的，术语“沉默”抗体是指不显示或显示出低的ADCC活性的抗体，如在ADCC测定中所测量的。
在一个实施例中，术语“无ADCC活性或低ADCC活性”意指沉默抗体表现出低于50％的特异性细胞裂解(例如低于10％的特异性细胞裂解)的ADCC活性，如在标准ADCC测定中所测量的。无ADCC活性意指沉默抗体表现出低于1％的ADCC活性(特异性细胞裂解)。
沉默的效应子功能可以通过在抗体的Fc区中进行突变而获得并已经在本领域中进行了描述：LALA和N297A(Strohl,W.,2009,Curr.Opin.Biotechnol.[生物技术新见]卷20(6):685-691)；以及D265A(Baudino等人,2008,J.Immunol.[免疫学杂志]181:6664-69；Strohl,W.,同上)。沉默Fc IgG1抗体的实例包含所谓的LALA突变体，该突变体在IgG1 Fc氨基酸序列中包含L234A和L235A突变。沉默IgG1抗体的另一个实例包含D265A突变。另一个沉默IgG1抗体包含N297A突变，该突变导致无糖基化/非糖基化的抗体。
术语“治疗(treatment/treat)”在本文中定义为向受试者应用或施用根据本发明的抗CD40抗体或蛋白质，例如mAb1或mAb2抗体，或向来自受试者的分离的组织或细胞系应用或施用包含本发明的所述抗CD40抗体或蛋白质的药物组合物，其中该受试者具有自身免疫性疾病和/或炎性疾病、与自身免疫性疾病和/或炎性疾病相关的症状、或发展自身免疫性疾病和/或炎性疾病的倾向，其目的是缓解、减轻或改善自身免疫性疾病和/或炎性疾病、自身免疫性疾病和/或炎性疾病的任何相关症状、或发展自身免疫性疾病和/或炎性疾病的倾向。
“治疗”还旨在向受试者应用或施用包含本发明的抗CD40抗体或蛋白质(例如mAb1或mAb2抗体)的药物组合物，或向来自受试者的分离的组织或细胞系应用或施用包含本发明的所述抗CD40抗体或蛋白质的药物组合物，其中该受试者具有自身免疫性疾病和/或炎性疾病、与自身免疫性疾病和/或炎性疾病相关的症状、或发展自身免疫性疾病和/或炎性疾病的倾向，其目的是缓解、减轻或改善自身免疫性疾病和/或炎性疾病、自身免疫性疾病和/或炎性疾病的任何相关症状、或发展自身免疫性疾病和/或炎性疾病的倾向。
术语“预防(prevent/preventing)”是指预防性(prophylactic/preventative)处理；其关注的是延迟或防止与之相关的疾病、障碍和/或症状的发作。
如本文所使用的，如果受试者将在生物学上、在医学上或在生活质量上从治疗中获益，则这类受试者是“需要”这种治疗的。
术语“药学上可接受的”意指不干扰一种或多种活性成分的生物活性的有效性的无毒性物质。
如本文所使用的，术语“施用(administration/administering)”主题化合物意指向需要治疗的受试者提供本发明的化合物及其前药。与一或多种其他治疗剂“组合”施用包括以任何顺序和任何施用途径同时(并行)施用和连续施用。一次施用可以是单次注射、或者彼此联合递送的多次注射，这取决于需要施用多少药物物质来实现治疗效果。
如本文所使用的，“治疗有效量”是指抗CD40抗体或其抗原结合片段(例如mAb1)在以单剂量或多剂量向患者(例如人类)施用时有效地治疗、预防、防止发病、治愈、延迟、降低严重程度、减轻障碍或复发障碍的至少一种症状、或延长患者的存活期超出无此治疗存在时所预期存活期的量。当应用于单独施用的单个活性成分(例如抗CD40抗体，例如mAb1)时，该术语是指单独的该成分。当应用于组合时，该术语是指产生治疗作用的活性成分(无论连续还是同时组合施用)的组合量。
短语“治疗方案”意指用于治疗疾病的方案，例如在SS(如pSS)治疗期间使用的给药方案。治疗方案可以包括负荷方案(或负荷给药)，然后是维持方案(或维持给药)。
短语“负荷方案”或“负荷期”是指用于疾病初始治疗的治疗方案(或治疗方案的部分)。在一些实施例中，所公开的方法、用途、试剂盒、过程和方案(例如治疗SS的方法)都采用负荷方案(或负荷给药)。在一些情况下，负荷期是直至达到最大功效的时间段。负荷方案的总体目标是在治疗方案初始阶段向患者提供高水平药物。负荷方案可包括施用比医师在维持方案期间会采用的更高剂量的药物，比医师在维持方案期间施用药物更频繁地施用该药物，或两者兼有。剂量递增可在负荷方案期间或之后发生。
短语“维持方案”或“维持期”是指疾病治疗期间用于维持患者的治疗方案(或治疗方案的部分)，例如保持患者在负荷方案或负荷期之后长时段(数月或数年)处于缓解状态。在一些实施例中，所公开的方法、用途和方案采用维持方案。维持方案可采用连续疗法(例如以常规间隔施用药物，例如每周、每两周或每月(每4周)、每年等)或间歇疗法(例如中断治疗、间断性治疗、复发时治疗、或达到具体预定标准[例如疼痛、疾病表现等]后的治疗)。剂量递增可以发生在维持方案期间。
短语“施用装置”用于表示向患者全身性地施用药物的任何可用器具，包括但不限于预填充注射器、小瓶及注射器、注射笔、自动注射器、静脉内滴注器和袋、泵、贴片泵等。使用这些物品，患者可自施用药物(即自行施用药物)，或医师可施用药物。
实例1.抗CD40抗体
具有沉默的ADCC活性的抗CD40 mAb已在专利US8828396和US9221913中公开，将这两个专利通过引用以其全文并入本文。预测具有沉默的ADCC活性的抗CD40 mAb相对于其他抗CD40抗体具有改善的安全特性，并且特别地可能更适合于非肿瘤适应症，如干燥综合征(SS)，尤其是原发性干燥综合征(pSS)。
根据诸位发明人的非结合性假设，来自专利US8828396和US9221913的两种mAb(称为mAb1和mAb2)被认为是用于治疗SS的合适化合物。抗体mAb1(也称为CFZ533)是特别优选的。
mAb1抑制体外CD154诱导的活化以及体内T细胞依赖性抗体的形成和生发中心的形成。在患有pSS的患者中，已经显示用mAb1进行的CD40阻断提供了新的治疗方式(实例7)。
为了使本领域技术人员能够实践本发明，mAb1和mAb2的氨基酸和核苷酸序列提供于下表1中。
本领域已知的另一种抗CD40 mAb是来自安斯泰来制药(Astellas Pharma)/协和发酵麒麟株式会社(Kyowa Hakko Kirin Co)的ASKP1240，如在US8568725B2(通过引用并入本文)中所描述的。
本领域已知的又另一种抗CD40 mAb是来自勃林格殷格翰公司(BoehringerIngelheim)的BI655064，如在US8591900(通过引用并入本文)中所描述的。
本领域已知的另一种抗CD40 mAb是快进制药公司(Fast ForwardPharmaceuticals)的FFP104，如在US8669352(通过引用并入本文)中所描述的。
另一种治疗方式可以是来自阿斯利康公司(AstraZeneca)的MEDI4920(其是抗CD40L-Tn3融合蛋白)，或是来自百健公司(Biogen)的抗CD40L抗体BIIB063。
如本领域技术人员将理解的，本公开还涵盖具有与上述抗体相同的作用模式的抗体(即所谓的生物仿制药)。
表1.序列表
在一个实施例中，提供了抗CD40抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域。
在一个实施例中，提供了抗CD40抗体，所述抗体包含含有如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示的高变区的免疫球蛋白VH结构域以及含有如SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示的高变区的免疫球蛋白VL结构域。
在一个实施例中，提供了抗CD40抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域、以及SEQ ID NO:13的Fc区。
在一个实施例中，提供了抗CD40抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域、以及SEQ ID NO:14的Fc区。
在一个实施例中，提供了抗CD40抗体，所述抗体包含Fc IgG1沉默区。
在一个优选的实施例中，提供了命名为mAb1的抗CD40抗体。具体地，mAb1包含SEQID NO:9的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:10的轻链氨基酸序列；并且mAb2包含SEQ ID NO:11的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:12的轻链氨基酸序列。
1.表达***
对于轻链和重链的表达，通过标准技术将编码重链和轻链的一个或多个表达载体转染到宿主细胞。不同形式的术语“转染”旨在涵盖多种通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。在理论上可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体。讨论了抗体在真核细胞，例如哺乳动物宿主细胞、酵母或丝状真菌中的表达，因为此类真核细胞，尤其哺乳动物细胞，比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠的和有免疫活性的抗体。
特别地，克隆或表达载体可以包含以下与合适的启动子序列可操作地连接的编码序列(a)-(b)中的至少一种：
(a)分别编码mAb1的全长重链和轻链的SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；或
(b)分别编码mAb2的全长重链和轻链的SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18。
用于表达本发明的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin,1980Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77:4216-4220中，所述细胞与DH FR可选择标记一起使用，例如在R.J.Kaufman和P.A.Sharp,1982Mol.Biol.[分子生物学]159:601-621中描述的)、CHOK1 dhfr+细胞系、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。具体地，为使用NSO骨髓瘤细胞，另一种表达***是示于PCT公开WO 87/04462，WO 89/01036和EP 0338841中的GS基因表达***。
当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过培养这些宿主细胞持续足够允许抗体在这些宿主细胞中表达或者抗体分泌到这些宿主细胞所生长的培养基中的一段时间来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基回收抗体(参见，例如Abhinav等人2007,Journal of Chromatography[色谱杂志]848:28-37)。
可以在合适的条件下培养宿主细胞以表达和产生mAb1或mAb2。
2.药物组合物
治疗性抗体通常被配制成水性形式以备施用或者配制成冻干物以在施用前与合适的稀释剂重构。抗CD40抗体可以被配制成冻干物，或配制成水性组合物，例如在预填充注射器中。该制剂也称为药物产品(DP)。
合适的制剂可以提供水性药物组合物或冻干物，该冻干物可以重构以给出具有高浓度的抗体活性成分和低水平的抗体聚集的溶液用于递送至患者。高浓度的抗体之所以有用，是因为高浓度降低了必须被递送给患者的物质含量。降低的给药体积使得向患者递送固定剂量所花费的时间降至最低。具有高浓度抗CD40抗体的本发明的水性组合物特别适合皮下施用。
因此，本发明提供了适用于在受试者中施用(例如用于皮下施用)的水性药物组合物，该水性药物组合物包含抗CD40抗体，如mAb1或mAb2。
抗CD40抗体当与药学上可接受的载体组合时可以用作药物组合物。此类组合物除抗CD40抗体(如mAb1或mAb2)之外还可以含有载体、多种稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂及本领域熟知的其他物质。载体的特征将取决于施用途径。用于所公开的方法中的药物组合物还可以含有用于治疗特定靶向障碍的其他治疗剂。
在一个具体实施例中，该组合物(也称为药物产品(DP))是由pH为6.0的水性制剂制备的冻干制剂，并且包含：
(i)150mg/mL mAb1或mAb2
(ii)270mM蔗糖作为稳定剂，
(iii)30mM L-组氨酸作为缓冲剂，和
(iv)0.06％聚山梨醇酯20作为表面活性剂。
在另一具体实施例中，该药物组合物(也称为药物产品(DP))是pH为6.0的水性药物组合物，并且包含：
(i)150mg/mL mAb1或mAb2
(ii)270mM蔗糖作为稳定剂，
(iii)30mM L-组氨酸作为缓冲剂，和
(iv)0.06％聚山梨醇酯20作为表面活性剂。
3.施用途径
通常，例如通过静脉内、腹膜内或皮下注射来施用抗体或蛋白质。完成此施用的方法是本领域普通技术人员已知的。还可能获得可以局部或口服施用的组合物，或者能够透过黏膜传递的组合物。如本领域技术人员所理解的，可以使用任何合适的施用方式，如适合于特定的所选施用途径。
可能的施用途径的实例包括肠胃外(例如，静脉内(I.V.或IV)、肌内(IM)、真皮内、皮下(S.C.或SC)、或输注)、口服和肺(例如吸入)、经鼻、经皮(局部)、经黏膜、以及直肠施用。被用于胃肠外、真皮内、或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱调节pH，如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可以被封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
可以通过向需要抗CD40疗法的受试者施用本发明的抗体或蛋白质的负载方案或负荷给药来启动抗CD40疗法。“负荷剂量”意指向受试者施用一次或数次的本发明的抗CD40抗体或蛋白质的初始剂量，其中施用的本发明的抗体或蛋白质的剂量落入更高的给药范围(即，约10mg/kg至约50mg/kg，如约30mg/kg静脉内，或约600mg、或约300mg或约150mg每周一次、每两周一次持续多达4周)。“负荷方案”可以按单次施用或多次施用来施用，例如单次或多次静脉内输注，或者按组合在“负荷给药”方案中的多次皮下施用来施用，这取决于疾病的严重程度)。施用“负荷方案”后，再向受试者施用一个或多个另外的治疗有效剂量的本发明的抗CD40抗体或蛋白质。可以根据每周给药方案、或者每两周一次(每两周一次地)、每三周一次或每四周一次施用后续治疗有效剂量。在此类实施例中，后续治疗有效剂量通常落在较低给药范围内(即，约0.003mg/kg至约30mg/kg，如约10mg/kg，例如10mg/kg静脉内，或每周、每两周或每4周皮下施用约150mg、约300mg或约600mg)。
可替代地，在一些实施方式中，在“负荷方案”后，根据“维持方案”施用后续治疗有效剂量的本发明的抗CD40抗体或蛋白质，其中施用所述治疗有效剂量的本发明的抗体或蛋白质每月一次、每6周一次、每两个月一次、每10周一次、每三个月一次、每14周一次、每四个月一次、每18周一次、每五个月一次、每22周一次、每六个月一次、每7个月一次、每8个月一次、每9个月一次、每10个月一次、每11个月一次或者每12个月一次。在这类实施例中，本发明的抗CD40抗体或蛋白质的治疗有效剂量落在较低给药范围内(即，约0.003mg/kg至约30mg/kg，如约10mg/kg，例如10mg/kg)，特别是以较高频率间隔(例如每周一次、每两周一次至每四周一次)施用后续剂量时，或者落在较高给药范围内(即，10mg/kg至约50mg/kg，如30mg/kg)，特别是以较低频率间隔施用后续剂量时，例如，在间隔一个月至12个月施用后续剂量的情况下。
给药时机一般自活性化合物(例如mAb1)的第一剂量当天(也称为“基线”)测量。然而，不同的医疗服务人员使用不同的命名惯例。
值得注意的是，一些医疗服务人员可能称第零周为第1周，而一些医疗服务人员可能称第零天为第一天。因此，有可能不同医师将指明剂量例如在第3周/在第21天期间、在第3周/在第22天期间、第4周/在第21天期间、第4周/在第22天期间给予，而指的是相同给药时间表。为了一致性，给药的第一周将在本文中称为第0周，而给药的第一天将被称为第1天。然而，本领域技术人员应理解，此命名惯例仅为求一致性而使用且不应理解为具有限制性，即，每周给药是提供抗CD40抗体(例如mAb1)的每周剂量，不论医师将特定周称为“第1周”还是“第2周”。如本文所述的剂量方案的实例见图1和图2。应理解，无需在精确时间点提供剂量，例如大约预定在第29天的剂量可例如在第24天至第34天(例如第30天)提供，只要提供在适当的星期中即可。
如本文所使用的，短语“具有足够量的抗CD40抗体以允许递送[指定剂量]的容器”用于表示可以用于提供所需剂量的、已在其中布置抗CD40抗体(例如，作为药物组合物的一部分)体积的给定容器(例如小瓶、笔、注射器)。例如，如果所需剂量为500mg，那么临床医生可以从含有浓度为250mg/ml的抗CD40抗体制剂的容器中使用2ml，从含有浓度为500mg/ml的抗CD40抗体制剂的容器中使用1ml，从含有浓度为1000mg/ml的抗CD40抗体制剂的容器中使用0.5ml等。在每种这样的情况下，这些容器具有足够量的抗CD40抗体，以允许递送所需的500mg剂量。
如本文所使用的，短语“以允许[施用途径]递送[指定剂量]的剂量配制”用于表示给定的药物组合物可用于通过指定的施用途径(例如皮下或静脉内)提供所需剂量的抗CD40抗体(例如mAb1)。例如，如果所需的皮下剂量是500mg，那么临床医生可以使用2ml浓度为250mg/ml的抗CD40抗体制剂，1ml浓度为500mg/ml的抗CD40抗体制剂，0.5ml浓度为1000mg/ml的抗CD40抗体制剂等。在每种这样的情况下，这些抗CD40抗体制剂的浓度足以允许皮下递送抗CD40抗体。皮下递送通常需要递送小于约2ml的体积，优选约1ml或更小的体积。然而，可以使用例如贴片/泵机制随时间递送更高的体积。
本文公开了抗CD40抗体(例如mAb1)用于制造治疗患者中的干燥综合征的药物的用途，其中该药物被配制成包含容器，每个容器具有足够量的抗CD40抗体以允许每单位剂量递送至少约75mg、150mg、300mg或600mg的抗CD40抗体或其抗原结合片段(例如mAb1)。
本文公开了抗CD40抗体(例如mAb1)用于制造治疗患者中的干燥综合征的药物的用途，其中该药物以一定剂量被配制以允许每单位剂量全身递送(例如，静脉内或皮下递送)75mg、150mg、300mg或600mg的抗CD40抗体或其抗原结合片段(例如mAb1)。
4.试剂盒
本公开还涵盖用抗CD40抗体或其抗原结合片段(例如mAb1)治疗患有干燥综合征的患者(视情况而定)的试剂盒。此类试剂盒包含抗CD40抗体或其抗原结合片段(例如mAb1)(例如，以液体或冻干形式)或含有抗CD40抗体(如上所述)的药物组合物。另外，此类试剂盒可包含用于施用抗CD40抗体的装置(例如注射器和小瓶、预填充注射器、预填充笔、贴片/泵)及使用说明书。说明书可以公开将抗CD40抗体(例如mAb1)作为特定给药方案的一部分提供给患者。这些试剂盒还可以含有用于治疗银屑病，例如用于与所装入的抗CD40抗体(例如mAb1)组合递送的其他治疗剂(如上所述)。
短语“施用装置”用于表示向患者全身性地施用药物的任何可用器具，包括但不限于预填充注射器、小瓶及注射器、注射笔、自动注射器、静脉内滴注器和袋、泵、贴片/泵等。使用这些物品，患者可自施用药物(也即自行施用药物)，或者护理给予者或医师可施用药物。
本文公开了用于治疗患有干燥综合征的患者的试剂盒，这些试剂盒包含：a)药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的抗CD40抗体或其抗原结合片段；b)用于向患者施用抗CD40抗体或其抗原结合片段的装置；和c)说明书，该说明书提供了以约3至约30mg活性成分/千克人受试者的剂量向有需要的患者皮下施用抗CD40抗体或其抗原结合片段三次，每隔一周一次，然后每月给药约3至约30mg(如10mg)活性成分/千克人受试者，或在维持方案期间以约150mg、约300mg或约600mg施用，每周一次、每两周一次或每月一次。
在一个具体实施例中，提供了a)包含抗CD40抗体、缓冲剂、稳定剂和增溶剂的液体药物组合物，以及b)用于将抗CD40抗体经皮下施用至患有干燥综合征的患者的装置用于制造治疗干燥综合征的药物的用途，其中将该抗CD40抗体：
i)以约3至约30mg(如10mg)活性成分/千克人受试者的剂量静脉内施用至患者三次，每隔一周一次；和
ii)此后，以约3至约30mg(如10mg)活性成分/千克人受试者的每月剂量静脉内施用至患者，其中所述抗CD40抗体选自由以下组成的组：
a)抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域；
b)抗CD40抗体，其包含含有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的高变区的免疫球蛋白VH结构域以及含有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的高变区的免疫球蛋白VL结构域；
c)抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域、以及SEQ ID NO:13的Fc区；
d)抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域、以及SEQ ID NO:14的Fc区；
e)抗CD40抗体，其包含Fc IgG1沉默区；和
f)抗CD40抗体，其包含SEQ ID NO:9的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:10的轻链氨基酸序列；或包含SEQ ID NO:11的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:12的轻链氨基酸序列。
在另一个具体实施例中，提供了a)包含抗CD40抗体、缓冲剂、稳定剂和增溶剂的液体药物组合物，以及b)用于将抗CD40抗体经皮下施用至患有干燥综合征的患者的装置用于制造治疗干燥综合征的药物的用途，其中将该抗CD40抗体：
i)以约150mg活性物质、约300mg活性物质或约600mg活性物质的剂量经皮下施用至患者(每周一次或每两周一次)；和
ii)此后，以约150mg活性物质、约300mg活性物质或约600mg活性物质的每周、每两周或每月(每四周)剂量经皮下施用至患者，其中所述抗CD40抗体选自由以下组成的组：
a)抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域；
b)抗CD40抗体，其包含含有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的高变区的免疫球蛋白VH结构域以及含有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的高变区的免疫球蛋白VL结构域；
c)抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域、以及SEQ ID NO:13的Fc区；
d)抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域、以及SEQ ID NO:14的Fc区；
e)抗CD40抗体，其包含Fc IgG1沉默区；和
f)抗CD40抗体，其包含SEQ ID NO:9的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:10的轻链氨基酸序列；或包含SEQ ID NO:11的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:12的轻链氨基酸序列。
实例2.药理学
1.主要药理学
mAb1以高亲和力(Kd为0.3nM)结合人CD40。然而，它不结合Fcγ受体(包括CD16)或介导抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性。mAb1抑制重组体CD154(rCD154)诱导的人白细胞活化，但不诱导PBMC增殖或由单核细胞源树突细胞(DC)造成的细胞因子产生。mAb1以非常相似的亲和力结合人和非人灵长类动物CD40。
在体内，mAb1阻断原发性和继发性T细胞依赖性抗体应答(TDAR)，并且可以延长非人灵长类动物中肾同种异体移植物的存活(Cordoba等人2015)。另外，mAb1可以破坏体内已建立的生发中心(GC)。
使用人全血培养物在体外同时评估CD40受体占用和功能活性。通过CD154诱导的CD20阳性细胞(B细胞)上的CD69(活化标志物)的表达来定量功能活性，并使用荧光标记的mAb1监测CD40占用。CD40几乎完全被mAb1占用是完全抑制rCD154诱导的CD69表达所必需的。
2.次要药理学
研究了mAb1对血小板功能和血液止血的影响，表明mAb1不诱导血小板聚集应答，而是在高浓度下对血小板聚集表现出某些轻度抑制作用。
实例3.非临床毒理学和安全药理学
用mAb1进行的毒理学研究未揭露任何显著的器官毒性，包括无血栓栓塞事件的证据，如用抗CD154 mAb进行的临床试验中所报道的(Kawai等人2000)。在13周的GLP恒河猴研究(以10、50和150mg/kg每周一次给药)中，注意到5/22的动物中淋巴细胞性增加(这被认为是由于持续感染)，这一观察结果与mAb1的药理学一致。在50mg/kg下注意到2只动物的肾和肺中的炎性病变，并且在这两只动物中的一只中，还注意到眼睛和气管中的病变。虽然不能排除mAb1对肾和肺的直接影响，但证据的份量(包括机会致病菌的证实)表明这些发现可能继发于mAb1介导的免疫抑制并且是传染源。鉴于这些炎症发现，13周毒性研究的最大无毒性反应剂量(NOAEL)设定为10mg/kg。在食蟹猴中的26周慢性毒性研究中，没有发现与mAb1相关的不良结果。基于这些数据，NOAEL设定为150mg/kg(26周)。在每周一次皮下施用1、50和150(NOAEL)mg/kg下，平均(所有动物)Cmax,ss分别为44、3235和9690μg/mL。源自26周食蟹猴研究的NOAEL被认为与支持临床给药方案的相关度最高。
验尸组织学和免疫组织学评估揭露了脾脏和淋巴组织的皮质B细胞区域中的GC减少。复原动物显示一些***细胞性增加的病例，伴随T细胞面积正常和B细胞面积增加，这与停药后重建GC相一致。在mAb1的血液水平降至低于完全受体占用所需的水平之后，复原动物能够立即对钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)产生初级TDAR。
由于完全抑制T细胞依赖性抗体应答(TDAR)，KLH，预计不会形成针对mAb1的抗药物抗体(ADA)，因此当将mAb1浓度持续保持在药理学水平时，ADA相关的副作用被认为不太可能。
组织交叉反应性研究揭露了CD40不仅存在于免疫细胞中，还存在于各种组织中。这主要是由于其在内皮细胞和上皮细胞上的表达，其中CD40参与信号传导，如响应伤口愈合过程、病毒防御的上调和炎症相关的介体。预期拮抗性抗CD40单克隆抗体如mAb1不会有助于炎症过程，这通过使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的体外研究而证实。
迄今尚未进行完全符合指南的生殖毒性研究。然而，已经进行了兔的剂量范围发现、胚胎-胎儿发育(EFD)研究，以确认兔是相关的生殖毒理学物种。没有观察到对胚胎-胎儿发育的影响，并且在任何组中都没有与治疗相关的胎儿外部畸形。
总之，非临床数据支持原发性干燥综合征患者中的首次多剂量研究。实例4.非临 床药物代谢动力学和药物效应动力学
1.药物代谢动力学(PK)
对于IgG免疫球蛋白而言典型地，消除mAb1的主要途径可能是通过蛋白水解分解代谢(发生在与血浆平衡的位点)。另外，mAb1-CD40复合物的结合和内化导致快速和可饱和的清除途径。这通过非线性mAb1血清浓度-时间曲线来说明，其显示在约10-20μg/mL处的拐点。CD40介导的清除对总体清除的贡献取决于mAb1浓度、以及CD40表达水平、内化和受体转换率。对于mAb1>10-20μg/mL的血清浓度，预期线性动力学，而在较低浓度下出现非线性动力学。
2.药物效应动力学(PD)
在食蟹猴的PK/PD研究中，PK曲线中的拐点(约10μg/mL)与CD40饱和度下降相关，如在独立性淋巴细胞靶标饱和度测定中所确定的。因此，这个拐点被视为CD40饱和水平的标志物，并且是靶标接合的证据。
在用KLH免疫的恒河猴中进一步证明了CD40占用和药物效应动力学活性之间的联系。将猴子用KLH进行三次免疫(第一次是在给药前约3周，第二次是在施用mAb1后2周，并且第三次是在完全洗去mAb1后)。在第二次KLH疫苗接种时，在血浆浓度>40μg/mL下，CD40被mAb1占用完全阻止了强化(recall)抗体应答。一旦mAb1被清除，所有动物都对第三次KLH产生完全记忆抗体应答。这些结果表明，预先存在的记忆B细胞的功能不受影响。在完全消除mAb1后，用破伤风类毒素(TTx)进行免疫导致与未处理的动物相似的抗TTx-IgG/IgM滴度，并证明在mAb1消除后恢复完整的TDAR。
3.免疫原性
正如对免疫抑制药物所预期的，恒河猴(单剂量)中的免疫原性数据与KLH-TDAR体验的结果一致，并证实在CD40完全被mAb1占用下不能产生针对mAb1的免疫应答。
4.治疗方案
基于mAb1的药物代谢动力学和药物效应动力学曲线、以及mAb1的临床前研究和临床研究的结果，可以使用以下治疗方案。
在一个实施例中(参见图24A，1)，mAb1治疗方案由负荷给药和维持给药组成，所述负荷给药由两个剂量的600mg mAb1组成，在这两个剂量之间的一周施用，然后所述维持给药由多个剂量的600mg mAb1组成，每隔2周(Q2W)施用。优选皮下施用600mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)2次。
在另一个实施例中(参见图24A，2)，mAb1治疗方案由负荷给药和维持给药组成，所述负荷给药由600mg mAb1的第一剂量和300mg mAb1的第二剂量组成，其中在第一剂量后一周施用第二剂量，然后所述维持给药由600mg mAb1的多个剂量组成，每隔2周(Q2W)施用。优选皮下施用300mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)1次。优选皮下施用600mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)2次。
在又另一个实施例中(参见图24A，3)，mAb1治疗方案由负荷给药和维持给药组成，所述负荷给药由600mg mAb1的第一剂量和150mg mAb1的第二剂量组成，其中在第一剂量后一周施用第二剂量，然后所述维持给药由600mg mAb1的多个剂量组成，每隔2周(Q2W)施用。优选皮下施用150mg剂量；通过注射1mL药物产品(150mg/mL)1次，可替代地通过注射2mL稀释1/2倍(75mg/mL)的药物产品1次。优选皮下施用600mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)2次。
在一个实施例中(参见图24B，1)，mAb1治疗方案由负荷给药和维持给药组成，所述负荷给药由两个剂量的600mg mAb1组成，在这两个剂量之间的一周施用，然后所述维持给药由多个剂量的300mg mAb1组成，每隔2周(Q2W)施用。优选皮下施用600mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)2次。优选皮下施用300mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)1次。
在另一个实施例中(参见图24B，2)，mAb1治疗方案由负荷给药和维持给药组成，所述负荷给药由600mg mAb1的第一剂量和300mg mAb1的第二剂量组成，其中在第一剂量后一周施用第二剂量，然后所述维持给药由300mg mAb1的多个剂量组成，每隔2周(Q2W)施用。优选皮下施用300mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)1次。优选皮下施用600mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)2次。
在又另一个实施例中(参见图24B，3)，mAb1治疗方案由负荷给药和维持给药组成，所述负荷给药由600mg mAb1的第一剂量和150mg mAb1的第二剂量组成，其中在第一剂量后一周施用第二剂量，然后所述维持给药由300mg mAb1的多个剂量组成，每隔2周(Q2W)施用。优选皮下施用150mg剂量；通过注射1mL药物产品(150mg/mL)1次，可替代地通过注射2mL稀释1/2倍(75mg/mL)的药物产品1次。优选皮下施用600mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)2次。优选皮下施用300mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)1次。
在一个实施例中(参见图24C，1)，mAb1治疗方案由负荷给药和维持给药组成，所述负荷给药由两个剂量的600mg mAb1组成，在这两个剂量之间的一周施用，然后所述维持给药由多个剂量的150mg mAb1组成，每隔2周(Q2W)施用。优选皮下施用600mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)2次。优选皮下施用150mg剂量；通过注射1mL药物产品(150mg/mL)1次，可替代地通过注射2mL稀释1/2倍(75mg/mL)的药物产品1次。
在另一个实施例中(参见图24C，2)，mAb1治疗方案由负荷给药和维持给药组成，所述负荷给药由600mg mAb1的第一剂量和300mg mAb1的第二剂量组成，其中在第一剂量后一周施用第二剂量，然后所述维持给药由150mg mAb1的多个剂量组成，每隔2周(Q2W)施用。优选皮下施用300mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)1次。优选皮下施用600mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)2次。优选皮下施用150mg剂量；通过注射1mL药物产品(150mg/mL)1次，可替代地通过注射2mL稀释1/2倍(75mg/mL)的药物产品1次。
在又另一个实施例中(参见图24C，3)，mAb1治疗方案由负荷给药和维持给药组成，所述负荷给药由600mg mAb1的第一剂量和150mg mAb1的第二剂量组成，其中在第一剂量后一周施用第二剂量，然后所述维持给药由150mg mAb1的多个剂量组成，每隔2周(Q2W)施用。优选皮下施用150mg剂量；通过注射1mL药物产品(150mg/mL)1次，可替代地通过注射2mL稀释1/2倍(75mg/mL)的药物产品1次。优选皮下施用600mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)2次。优选皮下施用300mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)1次。
在另一个实施例中(参见图25A，1)，mAb1治疗方案由负荷给药和维持给药组成，所述负荷给药由两个剂量的600mg mAb1组成，在这两个剂量之间的一周施用，然后所述维持给药由多个剂量的600mg mAb1组成，每隔4周(Q4W)施用。优选皮下施用600mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)2次。
在另一个实施例中(参见图25A，2)，mAb1治疗方案由负荷给药和维持给药组成，所述负荷给药由600mg mAb1的第一剂量和300mg mAb1的第二剂量组成，其中在第一剂量后一周施用第二剂量，然后所述维持给药由600mg mAb1的多个剂量组成，每隔4周(Q4W)施用。优选皮下施用300mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)1次。优选皮下施用600mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)2次。
在又另一个实施例中(参见图25A，3)，mAb1治疗方案由负荷给药和维持给药组成，所述负荷给药由600mg mAb1的第一剂量和150mg mAb1的第二剂量组成，其中在第一剂量后一周施用第二剂量，然后所述维持给药由600mg mAb1的多个剂量组成，每隔4周(Q4W)施用。优选皮下施用150mg剂量；通过注射1mL药物产品(150mg/mL)1次，可替代地通过注射2mL稀释1/2倍(75mg/mL)的药物产品1次。优选皮下施用600mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)2次。
在另一个实施例中(参见图25B，1)，mAb1治疗方案由负荷给药和维持给药组成，所述负荷给药由两个剂量的600mg mAb1组成，在这两个剂量之间的一周施用，然后所述维持给药由多个剂量的300mg mAb1组成，每周一次(Q1W)施用。优选皮下施用600mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)2次。优选皮下施用300mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)1次。
在另一个实施例中(参见图25B，2)，mAb1治疗方案由负荷给药和维持给药组成，所述负荷给药由600mg mAb1的第一剂量和300mg mAb1的第二剂量组成，其中在第一剂量后一周施用第二剂量，然后所述维持给药由300mg mAb1的多个剂量组成，每周一次(Q1W)施用。优选皮下施用300mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)1次。优选皮下施用600mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)2次。
在又另一个实施例中(参见图25B，3)，mAb1治疗方案由负荷给药和维持给药组成，所述负荷给药由600mg mAb1的第一剂量和150mg mAb1的第二剂量组成，其中在第一剂量后一周施用第二剂量，然后所述维持给药由300mg mAb1的多个剂量组成，每周一次(Q1W)施用。优选皮下施用150mg剂量；通过注射1mL药物产品(150mg/mL)1次，可替代地通过注射2mL稀释1/2倍(75mg/mL)的药物产品1次。优选皮下施用300mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)1次。优选皮下施用600mg剂量；通过注射2mL药物产品(150mg/mL)2次。
将治疗方案分为负荷给药部分和维持给药部分的优点是它允许最佳治疗效果。
对于本文所述的所有治疗方案，负荷给药的目的是实现目标饱和度(血浆浓度接近40μg/mL)并因此起始治疗效果，并且维持给药给药的目的是维持功效。
实例5.人体安全性和耐受性数据
mAb1的安全性、耐受性、PK和PD活性正在健康受试者和类风湿性关节炎(RA)患者中的mAb1的持续、随机、双盲、安慰剂对照、单次递增剂量研究中进行评估。总共有48名受试者报名：36名健康受试者接受单剂量mAb1至3mg/kg静脉内或皮下；以及12名RA患者，其中6名接受单剂量的10mg/kg静脉内mAb1。总体而言，健康志愿者中高达3mg/kg mAb1的单剂量和RA患者中单次的10mg/kg mAb1是安全且耐受良好的，并且未发生疑似严重不良事件(SAE)。在RA患者中进行30mg/kg静脉内剂量的研究。由于该研究仍在进行中，所有临床数据实际上都是初步的，并且基于在RA患者中进行的高达10mg/kg剂量的中期分析。
实例6.人体药物代谢动力学和药物效应动力学(健康志愿者和类风湿性关节炎患
者)
在健康受试者以及类风湿性关节炎患者中，单次静脉内或皮下施用后，CFZ533 PK曲线与靶标介导的分布一致，所述靶标介导的分布导致非线性PK曲线和当CD40受体占用降至约90％以下时更快清除。
尽管来自中国受试者的PK曲线存在一些个体间可变性，但中国受试者中CFZ533的分布通常与非中国受试者的情况相似，并且在3mg/kg静脉内CFZ533后，靶标接合也相似(约4周)。在该剂量水平，通过血浆中的游离CFZ533曲线、测量游离CD40和总CD40的外周B细胞上的CD40占用、以及血浆中的总sCD40浓度证明了类似的PK/PD曲线。
在健康受试者中皮下施用后，CFZ533被快速吸收并分散，这与人体中典型的IgG1抗体的预期一致。在3mg/kg皮下时，CFZ533通常在给药后3天达到峰值(2名受试者为7天)，并且给药后1周血浆浓度与静脉内施用后的血浆浓度范围相同。在3mg/kg皮下时，靶标接合的持续时间也是约4周。
在10mg/kg静脉内下的类风湿性关节炎患者中，如通过全血B细胞上的游离CD40与平均给药前和血浆中的总sCD40曲线相比所测量的，完全CD40占用通常维持8周。在30mg/kg静脉内时，血浆中的PK和总sCD40曲线与16周的靶标接合持续时间一致。
在健康受试者中，CD40被CFZ533结合通常导致外周B细胞上的总CD40减少约50％(追踪B细胞上的CD40占用，如通过B细胞上的游离CD40所测量的)。这可能是由于与CFZ533结合之后膜结合的CD40的内化和/或脱落所致。在类风湿性关节炎患者中，未证实外周B细胞上的总CD40减少。
定义了血浆中的CFZ533与全血B细胞上的CD40占用(B细胞上的游离CD40)之间的关系，并且0.3-0.4μg/mL的CFZ533浓度与全血B细胞上的完全(定义为≥90％)CD40占用相关。
更一般地，已经鉴定了CFZ533的非特异性和特异性消除途径。由FcRn受体介导的非特异性和高容量途径通常由内源IgG共享。特异性靶标介导的CFZ533的分布导致CFZ533-CD40复合物的形成，所述复合物部分内化(随后溶酶体降解)和/或从膜上脱落。靶标介导的过程导致CFZ533的可饱和以及非线性分布。CFZ533-CD40复合物的形成是剂量/浓度依赖性的，其中在高浓度的CFZ533条件下发生饱和。
总体而言，CFZ533的分布取决于特异性(靶标介导的)和非特异性消除途径对CFZ533的总体清除的相对贡献。当CFZ533浓度低于靶标的浓度时，观察到非线性PK表现，而在CD40受体饱和的较高浓度下，非特异性途径占优势并且CFZ533的消除是线性的。
如对于靶向膜结合受体的和表明靶标介导的分布的典型IgG1抗体所预期的，CFZ533的暴露程度(AUClast)的增加超过剂量增加(超比例)。因此，预计这与较高剂量的CFZ533的分布量和清除量的减少有关。
在CFZ533血浆浓度低于定量限并且明确地太低而不能阻断组织中任何CD40途径相关效应之后6周，1mg/kg静脉内CFZ533(1周完全CD40占用)的一名受试者产生针对检测的CFZ533的特异性抗体。这名受试者中抗药物抗体(ADA)的存在并未危害暴露，并且与免疫相关的安全性信号无关。这对应于本研究中ADA发生率为2％。
单剂量的3mg/kg(静脉内和皮下)的CFZ533瞬时抑制对第一次KLH免疫的抗KLH应答，CFZ533浓度对应于完全(≥90％)受体占用(约3-4周)。在所有受试者中检测到对CFZ533浓度的抗KLH初级应答，并伴随受体占用下降。所有受试者都能够对第二次KLH免疫(在预期受体占用损失后进行施用)产生强化应答。
数据表明CD40被CFZ533结合阻止了重组体人CD154(rCD154)介导的B细胞在人全血中的活化。B细胞上的rCD154诱导的CD69表达通常在对应于B细胞上完全CD40占用的时间段期间被抑制。当CD40占用不完全时，rCD154的功能活性得以恢复。
没有证据表明CFZ533对免疫分型数据有任何影响。
实例7.一项多中心、随机、双盲、安慰剂对照、平行组研究，用于评估CFZ533在原发
性干燥综合征患者中的安全性、耐受性、药物代谢动力学和初步疗效
为了评估在治疗干燥综合征中利用具有沉默的ADCC活性的人抗CD40单克隆抗体的适合性，使用抗体CFZ533(本文也称为mAb1)设计并进行了临床研究。
干燥综合征(SS)可以是原发性的或通常与其他自身免疫性疾病(如全身性红斑狼疮(SLE)或类风湿性关节炎(RA))相关。在这种情况下，SS称为继发性的。继发性干燥综合征患者已被排除在CFZ533临床试验之外，因为原发性疾病(例如RA或SLE)及其伴随的治疗会显著地干扰评估原发性SS。例如，RA中的关节受累/损伤将使得ESSDAI的关节痛区域不可解释，或者抗TNF治疗将与CFZ533的使用不相容。然而，由于继发性SS的发病机制由与pSS相同的病理生物学事件(如由CD40-CD154途径的异常活化介导的生发中心形成和自身抗体形成)驱动，所以预期用CFZ533进行的治疗在继发性SS中有益(保证专用的临床试验)。
原发性干燥综合征(pSS)是一种全身性、进行性自身免疫性疾病，其被表征为在外分泌腺和分泌腺功能障碍中形成异位生发中心。一个亚组的患者也发展出腺外表现。CFZ533是一种有效地和选择性地阻断CD40的新型单克隆抗体，CD40是生发中心反应和pSS发病机制中涉及的其他免疫介导的功能所必需的共刺激途径受体。进行一项随机、双盲、安慰剂对照、多中心、部分交叉IIa期概念验证(PoC)研究来评估CFZ533在pSS患者中的安全性、耐受性和疗效。
若干条证据表明，由CD40-CD154途径驱动的或与CD40-CD154途径密切相关的疾病病理在pSS中是必不可少的。pSS的标志诊断特征包括B细胞高反应性，例如在唾液腺中生发中心样结构(在18％-59％的患者中观察到)的形成和自身抗体的形成(
等人2012)。在pSS病变中，活化的T细胞占优势并且能够引起B细胞过度活跃、Ig分泌和促进腺体的破坏(Manganelli和Fietta 2003)。另外，这些患者的唾液腺中的T细胞和B细胞浸润物显示出CD40和CD154的上调。CD40-CD154介导的组织炎症也可能有助于pSS发病机制。
此外，CD40-CD154介导的组织炎症也可能有助于Pss发病机制。源自pSS患者的上皮细胞系具有组成型上调的表面CD40(Dimitriou等人2002)。在pSS血清中已经报道了源自血小板以及源自白细胞的微粒的水平增加以及sCD154浓度升高(Sellam等人2009)。
1.SS中概念验证研究CCFZ533X2203的设计
这是一个双盲然后是开放标签、随机、安慰剂对照、平行组、非验证性研究，以评估多个剂量的CFZ533在以下群组1和2中的安全性、耐受性、药物代谢动力学和初步临床疗效：
·群组1：在双盲和安慰剂对照方式然后开放标签的治疗中，在pSS患者中皮下施用3mg/kg CFZ533；
·群组2：在双盲和安慰剂对照方式然后开放标签的治疗中，在pSS患者中通过静脉内输注施用10mg/kg CFZ533。
这些群组之后是群组3的一个开放标签、随机、平行组、非验证性部分：
·群组3：在治疗组1中，每周4次以600mg皮下给予CFZ533(负荷方案)，然后每周9次以300mg皮下给予(维持方案，在研究第29天开始)。
在治疗组2中，该负荷方案是单次静脉内剂量10mg/kg CFZ533(在研究第1天)，然后每周12次300mg皮下施用(维持方案，在研究第8天开始)。
在群组1和2中，随机化将根据口服皮质类固醇(是/否)的基线摄入量进行分层。群组3中将不会有分级。
该研究包括群组1和群组2的三个时期：
1.安慰剂对照期(从第1周第1天到第13周第85天的预剂量评估完成)，在此期间，在治疗pSS所必需的标准护理疗法(例如，低剂量的皮质类固醇)之上施用4个剂量的CFZ533或安慰剂；
2.开放标签期(从第13周第85天的给药至第25周第169天的评估完成)，即当所有患者接受4个剂量的开放标签CFZ533治疗时，
3.随访期(第25-32周)，即在不研究药物的情况下，随访患者。
图1是群组1和2的研究设计的示意图。
群组3包括两个时期：
1.开放标签治疗期(从第1周第1天的给药至最后一次剂量和第13周第85天完成评估)，
2.随访期(从最后一次剂量完成后第13周至第21周第141天)，即在不研究药物的情况下，随访患者8周。
在开放标签治疗期，治疗组1给药以CFZ533 600mg皮下开始，每周一次，持续4周；在治疗组2中，在第1天以CFZ533 10mg/kg静脉内开始给药。
然后，分别以每周一次CFZ533 300mg皮下持续给药4周(治疗组1)和9周(治疗组2)。
图2是群组3的研究设计的示意图。
群组1
这个群组随机分配了大约12名患者。对于每位患者，从第28天到第2天都有筛选期。筛选时满足合格标准的患者准予进行基线评估。基线评估从第6天开始，以允许在第1天治疗之前的第1天完成评估。
在给药和满足合格标准之前，所有基线安全性评估结果均可用。合格的患者在第1天(第1周)进入安慰剂对照期，并以2:1的比例随机化以接受CFZ533或安慰剂的治疗。在第1天，通过皮下注射(s.c.)施用3mg/kg CFZ533或安慰剂的剂量，然后进行PK、药物效应动力学(PD)和安全性评估长达6小时。患者在完成所有评估后的同一天从现场出院，条件是没有安全性问题。
患者返回研究中心以分别在第15天(第3周)、第29天(第5周)和第57天(第9周)接受三个皮下剂量的CFZ533或安慰剂(与第1天时接受的相同)。在这些访视中进行安全性和功效评估，收集PK和生物标志物样品。
在第85天(第13周)，在安全性评估和安慰剂对照期结束时的其他评估之后，所有患者进入开放标签期并接受3mg/kg CFZ533的开放标签皮下剂量。这之后分别在第99天(第15周)、第113天(第17周)和第141天(第21周)施用三个开放标签皮下剂量的CFZ533(每个3mg/kg)。在这些访视中进行安全性和功效评估，收集PK和生物标志物样品。对于研究者和患者，维持对照期的看不见直到研究结束。
在第169天(第25周)，对患者进行开放标签期结束时的评估，并使其在未施用研究药物的情况下进入随访期。在此期间，患者返回研究中心进行安全性监测。
研究访视的结束发生在第225天(第33周)，其包括完成研究评估然后从研究中解脱出来。
群组2
当大约12名受试者进入群组1中时，群组2开始登记以随机化大约30名患者以使大约24名患者完成12周的治疗。群组2的研究设计与群组1相同，除了给药方案之外，该给药方案包括多次静脉内给药10mg/kg CFZ533，然后在输注结束时进行PK、药物效应动力学(PD)和安全性评估长达2小时。另外，在每次给药访视时测量体重以根据受试者的实际体重计算药物剂量(在群组1中，在整个研究中使用受试者的基线体重)。
群组3
群组3随机化大约24名患者以使大约20名患者(治疗组1中10名，治疗组2中10名)完成12周的治疗。
患者可以保持其标准护理疗法，条件是这些治疗在研究期间保持在恒定水平。
安全性评估包括身体调查、ECG、生命体征、标准临床实验室评价(血液学、血液化学、尿液分析、妊娠试验、血液凝固)、不良事件和严重不良事件监测。
所有皮下注射和静脉内输注都在受监控的设施中进行。在群组1中皮下注射后至少6小时，在群组2中静脉内输注完成后2小时，密切监测患者。在群组3中，在静脉内输注完成后至少1小时和皮下注射后30分钟对患者进行监测，或者由研究者自行决定是否更长时间监测生命体征、以及不良事件(包括注射反应的发展)的体征或症状。在群组1中皮下注射后进行药物代谢动力学、药物效应动力学和安全性评估长达6小时，在群组2中静脉内输注完成后进行所述评估长达2小时，或在群组3中在静脉内输注完成后进行所述评估长达1小时和在皮下注射后进行所述评估长达30分钟。在对安全性数据进行满意的调查之后，在研究者自行决定后，受试者在这些评估后出院。
PK评估包括血浆中游离CFZ533的测量。
并发的PD标志物：在患者的血浆中测量外周血B细胞上的CD40饱和度(B细胞上的游离CD40和总CD40，仅群组1和2)、总可溶性CD40和总可溶性CD154(任选，仅群组1和2)以允许PK/PD建模。另外，研究了自身抗体以及一些探索性生物标志物。通过抗CFZ533抗体的准定量分析来评估免疫原性。
在群组1和群组2中，在基线处和安慰剂对照期结束时(第13周第85天)进行任选的唇活检。
进行中期分析(第一次IA)，包括在群组1中已完成12周治疗期的约12名患者。对于这些患者，评估关键的安全性和耐受性数据以及初步疗效。
进行进一步的安全性和疗效中期分析以支持一般关于当前临床研究、赞助商的临床开发项目或假使任何安全问题做出的决策。
2.研究设计的基本原理
群组1和2
在两个单独的群组中评估两种不同剂量(3mg/kg皮下和10mg/kg静脉内)的CFZ533。
在pSS患者的该第一项探索性研究中，使用随机、安慰剂对照、双盲方法来消除报告安全性和临床疗效数据中的潜在偏差。
将患者以2:1的比例随机分配给CFZ533或安慰剂，为了使对安慰剂的暴露最小化并收集更多关于CFZ533的数据。进行分层随机化以限制活性组和安慰剂组之间在口服皮质类固醇的基线摄入中的不平衡。
开放标签期对所有患者(包括在安慰剂对照期中施用了安慰剂的患者)施用CFZ533。这为这些患者提供了潜在的治疗益处，并收集了pSS患者中有关CFZ533的进一步安全性和疗效数据。在开放标签期后，患者进入随访期，其中选择8周的持续时间(最后一次给药CFZ533后的12周)，以便有足够的时间来监测安全性并探索应答持续时间。
除安全性外，由欧洲抗风湿病联盟(EULAR)干燥综合征疾病活动指数(ESSDAI)估计的疗效被选为该研究的关键终点。该ESSDAI度量是本领域技术人员熟知的(参见例如Seror等人2011a)。在关于利妥昔单抗的随机对照试验的回顾性分析中，已显示ESSDAI具有反应性，并且其被认为是评估利妥昔单抗治疗疗效的敏感工具(Moerman等人2014)。诸位作者报道，与安慰剂组相比，利妥昔单抗组在第12周和第24周显著降低了ESSDAI，这证明在该小型研究中在降低疾病活动方面有一定效力。
同样地，EULAR干燥综合征患者报告指数(ESSPRI)用于该研究中(参见例如Seror等人2011b)。
群组3
由于该群组的关键目标，不需要安慰剂对照，并且开放标签治疗是合理的。在群组3中，执行两个治疗组以评估是否设置两种负荷方案(治疗组1中的多个皮下剂量，或治疗组2中的单次静脉内施用和随后的维持方案(多个皮下剂量，两个组)为12周(第1天至第85天)，以建立血浆中一定水平的CFZ533浓度的稳态条件，该水平与群组2中观察到的谷浓度相似(10mg/kg静脉内方案)。
随访期设置为8周(第85天至第141天)，
(i)在靶标完全饱和(缓慢消除)的条件下以及在不完全CD40饱和(快速消除)条件下，以跟踪CFZ533的消除；以及
(ii)以表征在12周治疗后靶标介导的CFZ533的消除途径的能力。3.剂量/方案的基本原理，治疗持续时间
在人类原发性干燥综合征中不存在使用抗CD40阻断剂的先前经验。然而，证据指出CD40依赖性免疫过程参与疾病的病理生理学，所述病理生理学包括受影响个体的唾液腺中存在淋巴聚集体和生发中心样结构、疾病特异性自身抗体以及CD40及其配体的腺体表达。临床前和首次人体研究结果表明，需要完全CD40受体占用来完全抑制T细胞依赖性B细胞功能以及阻断实质性CD40相关功能，并且完全CD40受体占用将是达到最大治疗效益所需的。例如，26周的毒性研究的结果表明，在每周1mg/kg CFZ533下，测量外周B细胞上的完全CD40占用，但在一些动物(3/6)中观察到不完全的药理学作用，表现为生发中心的部分减少。
这表明，将需要大于1mg/kg(每周)CFZ533的剂量来完全抑制组织中的CD40-CD154相互作用和随后的信号传导事件。
群组1(皮下，3mg/kg)
已在健康志愿者中测试的CFZ533的最高皮下剂量目前为3mg/kg，并且证明作为单剂量对于健康志愿者而言是安全且耐受良好的。1和3mg/kg静脉内剂量分别与外周血B细胞上1周和4周的完全(定义为>90％)CD40占用相关。此外，使用来自已接受3mg/kg CFZ533静脉内的健康志愿者的PBMC，离体CD154诱导的CD69表达被抑制约4周。在3mg/kg CFZ533的单次皮下剂量后4周，CD40占用为90％(平均n＝6；范围73％-97％)。
总之，对于本群组1选择3mg/kg皮下，因为该给药在健康志愿者中是安全且耐受良好的并且可以产生所需的药理学和药物效应动力学效果。
开始时的2周的给药间隔意味着确保皮下施用后外周B细胞上的完全CD40饱和以及组织中CD40-CD154相互作用的完全抑制。到12周的治疗期结束时，预期会发生主要终点以及其他关键功效和生物标志物读数的临床上有意义的变化。基于使用单循环的利妥昔单抗公布的结果，早在第5周就可以检测到pSS患者的显著临床应答，最大效果显示在第12周(Meijer等人2010)。在另外的12周开放标签延长期期间，收集了关于CFZ533的长期疗效和安全性的进一步数据。
群组2(静脉内，10mg/kg)
引入10mg/kg静脉内方案以在整个治疗期期间提供更高的血浆暴露，以确保在可能较高CD40表达的条件下在靶组织中的完全和持续的CD40途径阻断。该方案得到以下支持：人类中的安全性数据，来自临床前毒理学研究的足够安全性比率，非人灵长类动物组织中的相关PD效应，以及来自ASKP1240的最近公布的数据。
在人类中确认的安全性和耐受性：完成了第1阶段研究(CCFZ533X2101)，其测试了单次递增剂量(0.03至30mg/kg)的CFZ533静脉内和3mg/kg皮下，并且直到测试的最高剂量(10mg/kg静脉内)其仍未揭露出重大安全性问题。基于迄今为止的临床经验，预期10mg/kg静脉内给药方案在pSS患者中是安全和可耐受的。
来自临床前毒理学研究的足够安全界限：迄今为止，GLP毒理学研究测试了CFZ533，(i)在恒河猴中以10、50和150mg/kg(皮下和静脉内)每周皮下给药13周，和(ii)在食蟹猴中以1、50和150mg/kg每周皮下给药26周。这些研究未揭露任何可阻止CFZ533在提出的静脉内方案下使用12周或24周的重大发现。在食蟹猴中的26周毒性研究中，在稳定状态下，在每周给药150mg/kg(NOAEL)后获得平均浓度8300μg/mL(Cav,ss)。1-月内相应的全身暴露(AUC，稳态条件)将为232400天*μg/mL，其比第一个月内预测的全身血浆暴露高约57倍(AUC0-28天；图3)。在26周的毒理学研究中，在NOAEL下，Cmax,ss为9495μg/mL，其比在pSS患者中提出的静脉内方案的预期Cmax(约400μg/mL)高24倍(图3)。
图3显示了以10mg/kg静脉内给予的CFZ533的预测的平均血浆浓度-时间曲线(群组2)。平均PK曲线模拟10mg/kg静脉内。在研究第1天、第15天、第29天和第57天(安慰剂对照期)以及研究第85天、第99天、第113天和第141天(开放标签期)给予CFZ533。应用了使用如下参数的Michaelis-Menten模型，这些参数获得自对来自健康受试者中的FIH研究CCFZ533X2101的群组5(3mg/kg静脉内)PK数据进行基于初步模型的群体分析。以前在人类pSS中不存在使用抗CD40阻断剂的经验，并且CD40生物学(表达、转换)在健康受试者和pSS患者之间的任何潜在差异都是未知的。所提出的静脉内方案预期在整个治疗期期间提供高于40μg/mL的持续血浆浓度，以预测pSS患者中的靶组织中CD40表达的增加。40μg/mL的水平点线表示血浆浓度，高于该血浆浓度，预期靶组织中的完全CD40占用和途径阻断(基于来自食蟹猴-剂量组1mg/kg中的26周毒理学研究的PD数据)。第一个月的预期全身暴露(更高的给药频率)为4087天*μg/mL(比在食蟹猴-NOAEL为每周150mg/kg中的26周毒理学研究中，在稳定状态下在一个月内观察到的全身血浆暴露低57倍)，预期的Cmax约为400μg/mL。
非人灵长类动物组织中的相关PD效应：在26周的毒理学研究(1mg/kg剂量组)中，平均稳态血浆浓度≥38μg/mL的动物完全抑制了***的皮质B细胞区域中的生发中心。预计10mg/kg静脉内方案在整个治疗期期间(安慰剂对照和开放标签，参见图3)提供高于40μg/mL的持续血浆浓度，以预测pSS患者中的较高CD40表达，并且由于靶标饱和度的损失，靶组织中的PD效应不完全。
来自ASKP1240(一种阻断CD40的单克隆抗体)的数据：最近对来自实体器官移植中的安斯泰来公司(Astellas)抗CD40抗体ASKP1240的公开的PK/疗效数据的分析(Harland等人2015)表明，组织中有效的靶标介导的抗体清除可导致CD40阻断的损失以及可能的疗效损失，由于靶组织中靶标表达的显著增加。所提出的静脉内方案目标在于贯穿整个治疗期使CD40消除途径在可能较高CD40表达的条件下达到饱和。内部数据表明，CD40在从原发性干燥综合征患者获得的组织中过表达(原始数据)，并且在这些条件下，最初的皮下方案可能并不在靶组织中提供完整和持续的CD40途径阻断。
群组3
基于群组1和2的结果，pSS患者中的有效给药方案被认为需要负荷方案(静脉内或皮下)，所述负荷方案提供早期完全CD40饱和和最小靶标介导的分布(TMDD)，然后需要皮下维持方案。
在群组3中，设定治疗组1和治疗组2中的剂量/方案以评估负荷方案(静脉内或皮下)然后皮下维持方案是否能够提供与群组2中测试的静脉内方案类似的稳态血浆浓度，并且所述剂量/方案具有克服靶标介导的CFZ533(经由皮下途径)分布的能力。
治疗组1：每周4次(负荷)以600mg皮下(4次注射1mL)给予CFZ533，然后每周9次(维持；在研究第29天开始)以300mg皮下(2次注射1mL)给予。在负荷阶段期间，CD40池的饱和速率以及皮下剂量的生物利用度是未知的。然而，预计在第1个月(直到第29天)内2700mg的累积剂量具有克服TMDD的能力(在第29天在群组1和群组2中的累积剂量分别为630和2100mg)。预计每周600mg的负荷方案然后每周300mg的维持方案到第85天提供稳态条件，因为当达到目标饱和度时，关于健康的志愿者的皮下剂量的生物利用度预计≥75％。在治疗组1中，直到第85天的累积剂量(最后一次剂量)将是5100mg，而在群组1和群组2中分别为1050和3500mg。
治疗组2：负荷方案由单次静脉内剂量的10mg/kg CFZ533(在研究第1天)然后每周12次的300mg皮下(维持方案，在研究第8天开始)组成。在群组3治疗组2中，如群组2静脉内中已经证实的，预期单次静脉内剂量10mg/kg(第1天)到研究第8天(维持方案的开始)提供血浆浓度≥100μg/mL和完整CD40饱和条件。在治疗组2中，在不存在显著的靶标介导的分布和首过效应(皮下途径)的情况下，评估每周皮下维持方案。
在群组3中，所有皮下施用(每周300mg或600mg)以固定剂量(未根据体重调节)给予以促进施用和改善便利性，因为每个药物产品小瓶提供150mg/mL CFZ533。
在群组1(3mg/kg皮下方案)中，在中期分析下，平均体重为70.7kg(范围50.0-91.1kg)，这对应于212.2mg的固定剂量(范围150-273.3mg)。在群组2(10mg/kg静脉内方案)中，平均体重为72.6kg(范围50.0-107.2kg)，这对应于726mg固定剂量(范围500-1072mg)。在群组3中，每次300mg或600mg的皮下剂量在已应用于群组1和2中的剂量范围内，并且不太可能对安全性和耐受性产生影响。体重影响CFZ533的分布的方式尚未完全表征，但对于这两个组，在整个治疗期期间，预计平均最大血浆浓度(Cmax)将低于约300μg/mL(出于安全性考虑，假设所有皮下剂量均具有100％生物有效性，且pSS患者的平均体重为70kg)，且预计不会超过群组2中观察到的平均Cmax(约386μg/mL，在群组2安慰剂对照期1的第85天的第五剂量)。这将比在NOAEL(每周150mg/kg皮下)处在食蟹猴中的26周毒理学研究中的Cmax值(平均值为9495μg/mL)低32倍。
在治疗期和随访期期间评估PK/PD和免疫原性终点。表2提供了该研究的方案概要。
表2.方案概要
4.结果
群组1和2
招募了四十四名患者：群组1中的8名患者接受3mg/kg皮下CFZ533和4名患者接受安慰剂，群组2中的21名患者接受10mg/kg静脉内CFZ533和11名患者接受安慰剂。虽然PK/PD正如CFZ533 10mg/kg静脉内群组中所预期的，但基于人体试验中第一次的数据，CFZ533暴露表现出低于在3mg/kg皮下群组中所预期的，这可能是由于在CD40表达可能已经增强的条件下有效的靶标介导的分布(首过效应)。总体而言，CFZ533是安全且耐受良好的，并且大多数AE是轻度或中度的。在3mg/kg皮下群组中存在与研究药物无关的单一严重AE(细菌性结膜炎)。在群组1中，观察到ESSDAI在安慰剂组和3mg/kg皮下组中均从约12的平均基线评分提高约2分，因此没有治疗差异的证据(ΔESSDAI＝0.68，95％CI＝-4.71-6.46)。然而，在群组2中，观察到在10mg/kg静脉内组中ESSDAI从约11的平均基线提高6.35，而在安慰剂组中其为1.27，其中在ΔESSDAI＝5.2的组之间的建模差异(95％CI＝1.02-10.58)强烈支持CFZ533静脉内治疗。其他措施(如ESSPRI、MFI、医师整体评估和患者整体评估)的改进以及生发中心相关血清生物标志物CXCL13的减少也在10mg/kg静脉内CFZ533组中观察到。
图4是显示CFZ533-10 mg/kg静脉内的药物代谢动力学的图。静脉内方案提供靶组织中的完全靶标饱和以及完全CD40途径阻断。预期血浆浓度>40μg/mL的组织中的CD40途径阻断(抑制GC发展和T细胞依赖性抗原应答)，图中的点线。在12/24周的治疗后，在一些pSS患者中出现CD40表达下调的迹象。
图5显示了基线调节的ESSDAI总分-10mg/kg静脉内。上线是安慰剂静脉内，下线是CFZ533 10mg/kg静脉内。可以看出，CFZ533组与安慰剂相比有明显改善(到第12周平均Δ＝5.6)。
图6显示了基线调节的CXCL13-10 mg/kg静脉内。上线是安慰剂静脉内，而下线是CFZ533 10mg/kg静脉内。
图7显示了在第13周(在12周的治疗-第1期之后)10mg/kg CFZ533与安慰剂的不同终点的治疗组差异。
可以得出结论，ESSDAI和医师整体评估(VAS)都有明显改善。而且，大多数次级终点的趋势支持CFZ533。ESSDAI在开放标签期中持续变化。当切换至10mg/kg静脉内CFZ533时，安慰剂组有一些改善，伴随在相同模式后CXCL13水平显著降低。
在这项概念验证研究中，首次在干燥综合征中测试阻断性、非耗竭性抗CD40抗体，结果表明CFZ533可以在临床活性pSS中提供一种新的治疗方式。
另外，图8显示了药物效应动力学/靶标接合(10mg/kg静脉内)。在治疗和随访期期间血浆中总可溶性CD40-持续的靶标接合。在12/24周的治疗后，在一些pSS患者出现了CD40表达下调的迹象。
图9显示了ESSDAI总评分-群组1：3mg/kg皮下的曲线图。
图10显示了药物代谢动力学：游离CFZ533-群组1：3mg/kg皮下。可以看出，存在有效的***前靶标介导的清除(首过效应；这可能是由于CD40表达升高)-组织中的CD40途径阻断未实现(CFZ533<40μg/mL)。
图11显示了药物效应动力学/靶标接合：血浆中总可溶性CD40-群组1：3mg/kg皮下。可以看出，由于在CD40表达可能增强的条件下靶标介导的消除，靶标接合不能持续。
图12显示了ESSPRI总评分-群组1：3mg/kg皮下的曲线图。
图13显示了ESSPRI总评分的谱图-群组2：10mg/kg静脉内的曲线图。
图14显示了CXCL13(pg/mL)-群组2：10mg/kg静脉内的曲线图。
图15显示了10mg/kg CFZ533群组中ESSDAI总评分的曲线图。
图16显示了ICAM+B细胞(％)-群组2：10mg/kg静脉内的曲线图。
图17显示了在第13周(在12周的治疗-第1期之后)CFZ533与安慰剂的不同终点的治疗组差异。
CD40信号传导与自身免疫性疾病(AD)的发病机理有关，并且患有全身性AD(包括pSS)的患者通常表现出CD40表达增加和血清/血浆sCD40水平升高。在来自原发性干燥综合征患者的唾液腺活检中，CD40由淋巴细胞、导管上皮细胞和内皮细胞组成型表达(Dimitriou等人,2002)，这与研究CCFZ533X2203中记下的基线血浆水平升高一致。
CFZ533经历靶标介导的分布(TMD)，所述靶标介导的分布是如下过程：其中显著比例的CFZ533(相对于剂量)以高亲和力结合CD40，使得该相互作用反映在CFZ533的PK曲线中。在这种情况下，考虑用于定义治疗pSS患者的适当剂量学的其他因素包括体内CD40表达水平、CD40合成和降解(靶标的生物学)以及CFZ533-CD40结合动力学。
以前在健康志愿者、类风湿性关节炎、原发性干燥综合征、肾移植、格雷夫氏病和重症肌无力患者中使用CFZ533的临床经验表明，CD40表达升高与CFZ533的高消除(清除)率、靶组织中靶标接合的损失和CD40途径阻断的损失(如果CD40未完全饱和)有关。在完全CD40占用下，CD40对CFZ533整体清除的贡献是最小的，并且CFZ533的分布主要是CFZ533与FcRn受体(通过再循环/补救而负责IgG内稳态的高容量受体)结合的结果。
从药物代谢动力学/药物效应动力学视角和剂量发现策略的数据可以看出，pSS患者中的适当的剂量学可能包括负荷方案，然后是维持方案。
可能在第一个月期间通过静脉内或皮下施用的负荷方案是合理的，因为CFZ533经受CD40介导的消除。如果CD40在治疗开始时未完全饱和，则在CD40表达升高的条件下，CFZ533的高消除(清除)率可能与靶组织中靶标接合的损失和CD40途径阻断的损失相关。在负荷期后，并且基于使用pSS患者中正在进行的研究CCFZ533X2203的PK数据进行的初步建模，将选择皮下维持方案以确保靶组织中的完全CD40途径阻断。
群组3
在群组3中从基线到第12周的ESSDAI的减少在两个给药组中显示与群组2中相似的模式，因此支持CFZ533的两种静脉内/皮下或皮下/皮下给药方案的疗效。然而，由于群组3是开放标签的且没有安慰剂对照，因此疗效数据仅是探索性的且应谨慎解释。
实例8.CD40-CD154途径相互作用的阻断抑制异位生发中心并抑制干燥综合征的
NOD/ShiLtJ小鼠模型的病理学
干燥综合征(SS)是一种慢性自身免疫性疾病，其特征为涎腺炎和外分泌腺功能障碍。干燥综合征是RA后最常见的风湿性全身性自身免疫性疾病之一，成年群体患病率为0.3％-0.5％。临床表现包括疲劳、干燥性角膜结膜炎、口干症、鼻子干燥、***干燥、气管干燥、皮肤干燥、关节痛/关节炎、雷诺氏病(Raynaud's)、***病、间质性肺炎、血管炎(通常为皮肤炎)、肾炎和淋巴瘤。
EULAR干燥综合征疾病活动指数(ESSDAI)旨在测量原发性SS患者中的疾病活动。ESSDAI是HA接受的SS的主要结果亮度，并且旨在补充患者报告结果(ESSPRI)。
原发性和继发性SS患者中的该疾病的特异性表现都包括抗Ro和抗La自身抗体以及唾液腺和泪腺中的单核细胞浸润物的存在(Bombardieri等人,2012)。在一些情况下，这些T和B淋巴细胞的积聚形成了组织良好的结构，称为异位***构(ELS)，该异位***构与GC具有形态学和功能相似性(Voulgarelis等人,2008)。先前的研究已经报道了来自SS患者的和来自该疾病的临床前模型的唾液腺中的ELS的证据以及持续亲和力成熟的证据(Jacobi等人,2002；Stott等人,1998；Bombardieri等人,2012)，这暗示这些结构与疾病病理学有关(Bombardieri等人,2017)。
关于各种免疫共刺激途径在ELS形成和功能中的作用的公开数据相对较少，尽管明确的数据支持CD40-CD154(CD40配体)等途径在GC生物学中的重要作用(Laman等人,1996)。如果此类相互作用在ELS形成和功能中发挥作用，则预测途径阻断将消除受影响的组织中已建立的结构并可能改善器官功能。为了检验这一假设，我们检测了在继发性SS的非肥胖糖尿病(NOD/ShiLtJ)小鼠模型中治疗性施用抗CD154单克隆抗体的效果(Humphreys-Beher等人,1996)，并监测了唾液腺ELS、抗体分泌细胞以及acquaporin-5(AQP-5，分泌细胞功能所必需的一种蛋白质)的表达(Delporte等人,2006)。
1.材料和方法
唾液腺中CD40途径基因标记
将来自未处理的NOD/ShiLtJ小鼠(查尔斯河公司(Charles River)，德国)的唾液腺的冷冻切片用于通过微阵列进行的基因表达谱分析。应用激光捕获显微切割来富集ELS。
继发性SS的NOD/ShiLtJ小鼠模型
该NOD/ShiLtJ菌株除SS样疾病外还发展1型糖尿病样疾病，因此可被视为继发性SS的模型(Humphreys-Beher等人,1994)。12周龄雌性NOD/ShiLtJ被随机分为2个治疗组(每组n＝15，两次实验)：MR1(亚美尼亚仓鼠抗小鼠CD154 IgG)和同种型对照(IC，仓鼠抗小鼠IgG，BioXcell公司)，15mg/kg，腹膜内(i.p.)，2次/周，持续10周。所有程序均根据瑞士动物保护法进行，并经瑞士巴塞尔市的州立兽医办公室(Cantonal Veterinary Office inBasel,Switzerland)(动物许可证号BS-2482)批准。
来自NOD/ShiLtJ小鼠的脾脏和唾液腺的组织病理学和免疫组织化学
将左侧唾液腺的3-μm厚的石蜡切片用苏木精和伊红(HE)染色。在VentanaDiscovery XT免疫染色器(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics)，瑞士)上进行CD3、CD45R、CD138、Iba-1、Ki-67和AQP-5的自动化免疫组织化学染色。将来自NOD小鼠的脾脏用Ki-67染色。
抗体分泌细胞(ASC)的ELISPOT测定
制备来自唾液腺和脾脏的单细胞悬浮液(在线补充文件)，并将新鲜的CD45+细胞添加到预先包被的ELISPOT平板中，并在黑暗中在37℃孵育20小时。通过添加TMB底物溶液显示ASC结合到平板上，并且用EliSpot读数器“经典型AID”测量斑点的密度。
抗Ro ELISA
根据制造商的说明，使用目录号为5710的ELISA试剂盒(阿尔法诊断国际公司(Alpha Diagnostic International,Inc.)，美国)在血清中评估小鼠抗SSA/Ro60。
2.结果
在唾液腺中B细胞CD40基因标记的上调
在对原代人CD19pos B细胞进行rCD154刺激之后，使用微阵列分析来鉴定B细胞中CD40下游的基因，其中43个基因可以映射成鼠基因。然后调查这些基因的表达是否在来自12周龄和24周龄NOD小鼠的唾液腺(SG)组织中被调节。与这两个时间点的全唾液腺(WS)组织相比，显微切割的ELS中的十四个基因(包括Cd40、Cd80和Aicda)显著上调，这表明慢性途径激活(图26A)。Ingenuity Pathway Analysis[创新途径分析软件]还表明，CD40和CD154(CD40LG)在第12周和第24周均位于最上游调控子之中(图26B)，并且有可能证明在来自NOD/ShiLtJ小鼠和来自pSS患者的SG中上调的CD40途径基因之间存在重叠(Horvath等人,2012)。
CD40-CD154相互作用对于ELS形成是必需的NOD/ShiLtJ小鼠在8-12周龄时在SG中发生局灶性细胞浸润，其发生率在SG功能下降之前为100％(Jonsson等人2012)。以上数据表明了NOD SG组织中的慢性CD40途径信号传导，并且这得到炎症灶中CD40被单核细胞表达的证据的支持(Roescher等人2012)。因此，选择通过在12周龄开始以15mg/kg每两周给药抗CD154 mAb MR1，持续十周，来测试治疗性CD40-CD154阻断的效果。
图26B显示在NOD/ShiLtJ小鼠中进行的10周的MR1慢性给药导致唾液腺中ELS显著降低，如通过Ki67阳性细胞簇所定义的。另外，SG驻留的B细胞和T细胞以及巨噬细胞的百分比大幅下降。组织学图像表明MR1在给药开始后十周能够抑制ELS(图26C)。
CD40-CD154相互作用的阻断抑制ASC形成和自身抗体产生
MR1施用还导致脾脏、SG和骨髓中的总IgG(而不是IgM)ASC减少(图26B)以及脾脏GC的完全抑制。抗CD154处理的小鼠也表现出血清抗-Ro IgG水平的显著降低，尽管唾液腺中Ro特异性ASC的频率似乎没有显著受到影响(图26C)。
CD40-CD154相互作用的阻断防止AQP-5阳性细胞的损失
虽然可以评估小鼠中受刺激的唾液流量，但这种分析的取样需要禁食、麻醉和匹鲁卡品(Jonsson等人2006)、影响动物福利的因素以及对读数的解释。因此，选择监测AQP-5的表达，AQP-5是参与调节唾液和泪液产生的水通道蛋白(Delporte等人,2006)，其已被认为参与SS中的分泌功能(Yoshimura等人,2016)。对AQP-5阳性(如通过IHC染色所评估)的评价(图27)显示与对照动物相比，MR1处理的动物中的AQP-5阳性细胞的百分比更高，这表明CD40-CD154阻断可以预防或延迟唾液腺分泌细胞功能的损失。
3.讨论
亲和力成熟和唾液腺ELS中自身反应性B细胞的存在的证据表明这些结构在SS病理学中的潜在作用(Stott等人,1998)。鉴于ELS和GC之间的功能相似性，假设GC生物学中涉及的免疫共刺激途径可能在ELS中起类似作用。CD40或CD154的缺乏阻止了GC的形成，并且配体或受体的药理学阻断也破坏了已建立的GC(Ristov等人,2018；Kim等人2014)。CD40-CD154相互作用还涉及ELS生物学，因为已经在来自pSS患者以及NOD小鼠的SG腺体中的浸润细胞上观察到CD40表达(Roescher等人2012；Ohlsson等人2002)。加上来自NOD小鼠以及来自pSS患者的SG活检的ELS中的CD40下游基因的持续上调，这些数据表明该共刺激途径在浸润性唾液腺白细胞中具有活性。
另外，已证明CD40-CD154相互作用的治疗性阻断导致ELS的消除、浸润性白细胞的极大减少以及血清抗Ro自身抗体水平的降低，CD40-CD154阻断似乎还防止表达AQP-5(分泌细胞功能所必需的一种蛋白质)的细胞的损失(Delporte等人,2006)，虽然对唾液产生进行的评估将是更直接的SG功能的量度。先前的数据表明，在年轻的NOD小鼠(4-5周龄；涎腺炎迹象之前的1-2个月)中预防性施用单剂量MR1可预防涎腺炎的发生并降低抗Ro自身抗体的水平(Mahmoud等人,2016)，这与CD40缺陷的NOD小鼠的结果一致。然而，先前未显示CD40-CD154相互作用的治疗性阻断可消除SG炎症、ELS并降低该模型中的自身抗体水平。
该数据与先前的研究形成对比，在先前的研究中，NOD小鼠的SG中可溶性CD40-Ig融合蛋白的腺相关病毒表达未能减少涎腺炎(Roescher等人,2012)。因为诸位作者报道SG中没有融合蛋白表达的证据，所以所述浓度的药物可能不足以实现完全CD40-CD154途径阻断。相比之下，这项研究可以清楚地证明脾脏GC的消除，这表明MR1暴露足以在组织中产生完整的、途径相关的PD效应。总的来说，数据表明用生物制品如抗CD40抗体mAb1对CD40-CD154共刺激途径的治疗性阻断可以在SS患者中提供有益的治疗效果(Ristov等人,2018)。
实例9.CFZ533(阻断性和非耗竭性抗CD40单克隆抗体)的体外和体内特性的表征
1.方法
表面等离子共振分析CFZ533对CD40的亲和力
在25℃用HBS-EP+作为运行缓冲液进行重组体CFZ533的结合分析。典型的结合分析周期包括以下三个步骤：(i)通过固定在芯片表面上的蛋白A捕获抗体，(ii)CD40抗原与捕获的抗CD40抗体结合，和(iii)蛋白A表面的再生。为了确定抗原-抗体结合相互作用的动力学速率常数，处理结合数据，用来自空白注射的应答进行双重参考。使用Biacore T100评估软件的1:1相互作用模型局部拟合结合曲线以确定动力学速率常数。平衡解离常数(KD)的值计算为速率常数kd/ka的比率。所有结合测量均在两个独立实验中进行。
表面等离子共振分析CFZ533对FcγRIIIA的亲和力
通过Geneart合成用4-氨基酸纯化标签(4APP；诺华公司(Novartis))和Avi生物素化标签(GLNDIFEAQKIEWHE；Avidity公司)标记的人FcγRIIIA的细胞外结构域人FcγRIIIA(CD16a)158V(Uniprot:P08637,17-199)和人FcγRIIIA 158F(Uniprot:P08637,17-199)，将其在HEK293细胞中表达，并用抗4APP亲和色谱进行纯化。将受体用与链霉亲和素传感器芯片(通用电气公司(General Electric))结合的BirA(Avidity公司)进行定点生物素化，并且通过如(Warncke等人2012)所述的表面等离子共振(T100，通用电气公司)来分析不同Ab的平衡结合水平。通过1:1模型来计算平衡解离常数(KD)。
人白细胞培养
全血血沉棕黄层获自健康志愿者(Blutspendezentrum，巴塞尔，瑞士)或从健康志愿者收集的全血，条件是根据瑞士人类研究法案获得知情同意，并获得责任伦理委员会(Ethikkommission Nordwest-und Zentralschweiz；EKNZ)的批准。人扁桃体样品获自Ergolz Klinik公司(利斯塔尔(Liestal)，瑞士)(研究方案号1000244v.03；由Ethikkommission beider Basel(EKBB)批准)和Kantonspital公司(利斯塔尔，瑞士)(研究方案号TRI0149 v.01；由EKNZ批准)。对于体外培养实验，请参阅补充材料了解详细方法。简言之，将全血分离的PBMC、体外衍生的单核细胞DC或人扁桃体B细胞与单一浓度或剂量调整的CFZ533或相关对照抗体一起孵育。对于途径阻断实验，这些培养物还包括EC80浓度的重组人CD154(5μg/ml)和IL-4(75ng/ml)。用于体外测定的读数包括通过掺入胸苷(3H-TdR)评估的增殖，基于流式细胞术的对B细胞上的活化分子CD69的表达的评估，以及通过ELISA评估的细胞因子分泌。类似的测定用于NHP全血和PBMC。在一些人全血实验中，还通过使用荧光标记的CFZ533调查CD40受体占用。在适当的情况下，使用GraphPad
软件中的基于线性回归的曲线拟合来估计IC50值。
体外细胞耗竭测定
有关详细方法，请参阅补充材料。简言之，与B细胞耗竭性抗体利妥昔单抗相比，在三天的时间内在人全血中监测CFZ533介导CD20pos B细胞耗竭的能力。对于CDC，在存在或不存在兔补体的情况下将CFZ533或利妥昔单抗与RAJI B细胞一起孵育，并通过发光评估细胞裂解。
CFZ533的内化
使用人B细胞系RI-1在体外评估荧光标记的CFZ533和rCD154的内化(Th’ng等人,1987)。使用CD40敲除RI-1细胞系评估CFZ533内化的CD40依赖性。使用
图像流式细胞仪(默克集团(Merck KHaA)，达姆施塔特市(Darmstadt))，根据制造商的说明来评估内化，并使用
软件分析数据。
体内研究
单剂量药物代谢动力学/药物效应动力学(PK/PD)研究利用生物制品治疗7.5-8.5岁(6.5±2.6kg)的初试食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))和来自菲律宾的人工饲养的食蟹猴(Siconbrec，马卡蒂市(Makati City)，菲律宾)。根据瑞士联邦动物保护法(动物许可证BS#1900、BS#1495)进行动物处理、护理、药物治疗和血液采样。对于强化免疫实验，我们利用来自德国明斯特(Muenster)的科文斯实验室股份有限公司(CovanceLaboratories GmbH)进行的毒理学研究中的动物(手稿在制备中)。该研究是根据授权的研究方案和当地标准操作程序进行的，严格遵守有关动物福利法和公认的动物福利标准的国家法律规定。
在PK研究中，将CFZ533以计算的单剂量16.2(5532)、18.5(5531)和20(5530)mg/kg施用三只动物。对血液进行取样以分析CFZ533血清浓度、外周T和B淋巴细胞的数量、以及外周B细胞上的CD40被CFZ533占用。对于强化TDAR实验，分别在研究第8天(引发)和第43天(强化；在CFZ533治疗期间)用在明矾中的钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)对动物进行免疫。在引发免疫和强化免疫前一天以及在引发免疫和强化免疫后的第7天、第14天和第21天对血清取样。使用食蟹猴抗KLH IgM/IgG参考血清作为标准，用夹心ELISA测定KLH特异性IgM/IgG滴度。如上所述进行PK评估。有关PK和TDAR实验的更多详细信息，请参阅补充材料。
生发中心的组织学分析
将***固定的、包埋在石蜡(FFPE)中的脾脏和***(腋窝、下颌和肠系膜)切片用苏木精和伊红以及具有以下标志物的间接免疫过氧化物酶法(来自达科公司(Dako)的HRP+DAB)染色：抗CD20抗体(M0755，达科公司)、抗CD8抗体(RM-9116-SO，Medac公司)和Ki67(M7240，达科公司)。评估所有载玻片并根据染色强度(阴性至强烈)进行分级。另外，还描述了组织内任何免疫组织化学染色的细胞的染色模式和分布。
2.结果
CFZ533结合人CD40并抑制rCD154诱导的多种表达CD40的细胞类型的活化
表3表明，CFZ533对重组人CD40的KD通过表面等离子共振测定为0.3nM，因此这与其亲本抗体HCD122(CFZ533的野生型IgG1形式)非常相似。
表3.HCD122和CFZ533对人CD40的结合亲和力(KD)和动力学。
| HCD122 | CFZ533 | |
| K<sub>D</sub>[M] | 4.67±1.00x 10<sup>-10</sup> | 3.05±0.26x 10<sup>-10</sup> |
| k<sub>a</sub>[1/Ms] | 2.84±0.67x 10<sup>5</sup> | 3.13±0.73x 10<sup>5</sup> |
| k<sub>d</sub>[1/s] | 1.26±0.03x 10<sup>-4</sup> | 0.93±0.14x 10<sup>-4</sup> |
| Chi<sup>2</sup>[RU<sup>2</sup>] | 0.17-0.19 | 0.10-0.15 |
图18A显示CFZ533对rCD154和IL-4介导的来自多个供体(分别为5、32和6个供体)的人全血培养物、PBMC和分离的扁桃体B细胞的增殖(3H-TdR)的影响。数据表示为标准化的cpm(rCD154+IL-4＝100；点线)。图18B显示在过夜培养后，CFZ533抑制由rCD154刺激的moDC进行的TNF-α产生。图18C显示CFZ533的延迟添加抑制了rCD154+IL-4介导的人PBMC增殖。在用rCD154+IL-4刺激之前一小时、同时、或之后两小时和六小时，将CFZ533添加到人PBMC中，并在随后的四天培养之后评估增殖(3H-TdR)(点线和虚线表示rCD154+IL-4和细胞加培养基对照)。对于所有数据，将rCD154诱导的刺激的读数的平均值和SD绘制为对数转换的CFZ533浓度的函数。在适当的情况下，使用基于线性回归的曲线拟合来确定IC50值。图18D显示由CFZ533进行的CD40占用和途径阻断之间的关系。在剂量调整的CFZ533存在下，将来自10个供体的人全血用rCD154培养过夜。评估了途径活化程度(B细胞上的％CD69pos)和CD40占用程度(用AlexaFlour 488标记的CFZ533染色)。空心圆和实心圆表示被CFZ533占用的CD40的百分比和CD20pos B细胞上表达CD69pos的细胞百分比，分别作为对数转换的CFZ533浓度的函数(显示平均值和SD)。点线和虚线表示在所有供体中标准化的rCD154诱导的CD69表达和细胞加培养基对照培养物。
图18A表明CFZ533完全抑制来自多个供体的rCD154诱导的人全血培养物、PBMC以及纯化的扁桃体B细胞的增殖，其效力(IC50值)分别为0.024μg/ml(0.16nM)、0.017μg/ml(0.12nM)和0.071μg/ml(0.47nM)。另外，我们可以证明CFZ533完全阻断了由原代单核细胞源树突细胞(moDC)进行的rCD154诱导的TNF产生，IC50为0.04μg/ml(0.27nM)(图18B)。
如先前公布的，CFZ533抑制rCD154诱导的来自食蟹猴的PBMC的增殖(Cordoba等人,2015)。CFZ533以相似的效力抑制rCD154诱导的来自人、恒河猴和食蟹猴的PBMC的增殖(IC50分别为0.02、0.03和0.01μg/ml)，并且还能以约0.2μg/ml的EC50值结合来自这些物种的B细胞上的CD40，参见表4。
表4.CFZ533在人和NHP中的细胞结合和功能特性。
以上细胞数据来源于在rCD154之前或同时添加CFZ533的实验，表明抗体可以阻止内源配体的结合。我们还可以证明在启动含有rCD154的白细胞培养后长达6小时添加CFZ533导致细胞活化的完全抑制而效力损失最小，表明CFZ533可以从CD40置换内源配体(图18C)。
我们还想评估CFZ533的CD40占用程度与途径抑制程度之间的关系。为此，我们同时评估了来自多个供体的全血中由CFZ533进行的CD40受体占用和rCD154诱导的CD69。图18D表明由CFZ533进行的至少90％CD40受体占用是完全阻断CD40途径活化所必需的。使用CD23和CD54作为CD40途径活化的读数，还观察到受体占用和途径抑制之间的类似关系(数据未显示)。
CFZ533在体外表现出最小的刺激潜力
使用全血中B细胞上的活化分子CD69的增殖和上调来评估CFZ533刺激人白细胞活化的能力。图19A显示了以下的数据：i.将来自多个供体(n＝13)的人全血与剂量调整的CFZ533一起孵育，并在培养三天后评估增殖(3H-TdR)；ii.将来自多个供体(n＝26)的人PBMC与剂量调整的CFZ533一起孵育，并在培养三天后评估增殖(3H-TdR)。对于这两个图，数据表示为标准化cpm的平均值和SD，作为对数转换的CFZ533浓度的函数(rCD154+IL-4＝100，点线；细胞加培养基＝0，虚线)。图19B显示CFZ533在另外的刺激存在下不诱导人PBMC增殖。在IL-4(i)或抗IgM F(ab’)2(ii)存在下，用剂量调整的CFZ533对人PBMC进行刺激3天。3H-TdR(cpm)的平均值和SD显示为对数转换的CFZ533浓度的函数。在图19C中，显示了如何将人全血(41个供体)用无刺激、CFZ533、同种型对照或rCD154培养过夜，并通过FACS评估B细胞上的CD69表达。每个点代表来自单个供体的数据，其中平均％CD69值由水平红线表示。
图19A显示与rCD154相比，CFZ533不能诱导经由人全血(1:10稀释)或PBMC的胸苷掺入。CFZ533无法诱导增殖的能力不受添加额外的共刺激(如IL-4或抗IgM)的影响(图19B)。我们还可以证明CFZ533不能诱导来自多个供体的全血中的B细胞上CD69的上调，这再次与rCD154相反(图19C)。最后，CFZ533不能通过表达CD40的单核细胞源DC或人脐静脉内皮细胞(HUVEC)诱导细胞因子产生(数据未显示)。
CFZ533不介导细胞耗竭
CFZ533被工程化为含有N297A突变(之前已证明其消除FcγR结合)，导致不能介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。与HCD122(野生型IgG1)相比，CFZ533不能结合FcγRIIIA(表5)，并且我们想要调查这种结合的缺乏如何影响CFZ533介导细胞耗竭的能力。
表5.HCD122和CFZ533对人FcγRIIIA的结合亲和力(ka[1/M])
| FcγR种类 | HCD122(野生型IgG1) | CFZ533(N297A IgG1) |
| 人FcγRIIIA 158V | 1.72x 106 | n.d. |
| 人FcγRIIIA 158F | 6.99x 105 | n.d. |
n.d.未检出
图20A显示在剂量调整的CFZ533或50μg/ml利妥昔单抗存在下，来自孵育72小时的人全血培养物的数据。基于落入淋巴细胞FSC/SSC门内的CD45pos和CD19pos事件确定B细胞数。各个抗体浓度的结果计算为参照未处理样品的剩余B细胞百分比，并作为对数转换的抗体浓度的函数绘图(调节至100％并显示为点线)。数据表示八个独立供体的平均值和SD。图20B显示了用不同浓度的利妥昔单抗或CFZ533和固定浓度的兔补体孵育的Raji B细胞的结果。2小时后分析Raji细胞的浓度依赖性杀伤，其中通过使用荧光素酶测定每个孔中的ATP浓度来测量细胞的存活力。结果表示为同种型对照标准化的相对荧光素酶单位(RLU)，作为对数转换的抗体浓度的函数。
图20A表明，耗尽的抗CD20抗体利妥昔单抗能够消除人全血中约80％的B细胞，而CFZ533不能介导任何细胞耗竭。另外，与利妥昔单抗相比，CFZ533不能介导Raji B细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)(图20B)。
CFZ533以CD40依赖性方式被B细胞内化
我们接下来想要调查CFZ533是否可以被表达CD40的人B细胞系RI-1内化。图21A表明，与非允许条件(4℃)相比，rCD154在允许条件(37℃)下被内化，其中可以在质膜上观察到rCD154的弱染色。CFZ533也被内化，尽管在37℃确实存在残留的膜染色。图21B表明rCD154的内化程度似乎大于对CFZ533观察到的内化程度。使用CD40敲除RI-1B细胞系，我们可以证明CFZ533(图21C)和rCD154(数据未显示)的结合和内化是CD40依赖性的。
图21A显示用AlexaFlour 488标记的rCD154或CFZ533在37℃或4℃培养3小时的各个RI-1B细胞的代表性图像。图21B.在允许条件下CFZ533和rCD154的相对内化侵蚀(减去非允许性侵蚀值)。每个点代表来自单个实验的数据，并且总体平均值表示为水平红线。图21C.用Alexa488标记的CFZ533在37℃培养3小时的各个表达CD40的细胞或CD40敲除RI-1细胞的代表性图像。在所有实验中，将细胞用AlexaFlour647标记的CD45进行共染色以标记细胞膜。
CFZ533在非人灵长类动物中的药物代谢动力学特性
图22A.以16.2(5532)、18.5(5531)和20(5530)mg/kg静脉内的计算剂量施用单剂量后，三只食蟹猴中CFZ533的血清浓度。图22B.CD40占用：可用CD40百分比(i)和总CD40百分比(ii)。C.外周B/T细胞：单次剂量后外周血B细胞的百分比。第0天是施用CFZ533的时间。
以上数据表明CFZ533结合NHP CD40，并且能以相似的效力抑制rCD154诱导的NHPB细胞的活化。这表明食蟹猴和恒河猴是调查CFZ533 PK和PD之间关系的体内研究的合适物种。图22A中的数据显示单次静脉内剂量的CFZ533(计算的剂量为16.2、18.5和20mg/kg)后三只食蟹猴的PK曲线。对于靶向内化膜结合抗原的单克隆抗体而言典型的(Mager等人2006和Ng等人2006)，CFZ533浓度的时间进程表现出明显的靶标介导的分布，这导致非线性PK曲线以及浓度依赖性清除率和半衰期。在PK曲线中观察到的拐点是靶标接合的标志，并且其与CD40对CFZ533的总体清除的贡献增加以及更短的半衰期相关。此外，PK曲线中的拐点与观察到CD40饱和度下降的时间一致(图22B，i)。当CFZ533进行更快速消除时，这发生在约10-20μg/ml。在所有动物中，细胞上没有损失CD40受体表达(图22B，ii)。此外，尽管在整个研究中观察到一些变化，但CFZ533没有耗尽外周血B细胞(图22C)或T细胞(数据未显示)。
CFZ533抑制强化T细胞依赖性抗体产生
图23A显示了用于评估CFZ533对强化TDAR的影响的实验设计示意图。x轴下方的箭头突出显示初级和次级KLH免疫。单剂量10mg/kg CFZ533的计时如上所示。星号表示测量抗KLH IgG和/或CFZ533水平的时间点。图23B.每个图显示个体动物的抗KLH IgG(实心符号)和血浆CFZ533水平(对数标度；完整线)。出于比较性目的，将来自对照动物的平均抗KLHIgG水平(空心符号)覆盖在每个图上。图23C.使用CFZ533，对来自1mg/kg/周皮下多剂量的26周研究中的恒河猴的mLN中的生发中心(Ki67染色)进行组织学分析。显示了来自六只动物的代表性mLN切片：(i)以及对照图像(ii)。iii.在治疗期结束时，来自个体动物的给药间隔内的平均稳态CFZ533血清浓度。
CD40阻断的预期中靶的PD效应是对TDAR的抑制(Kawabe等人1994)。CFZ533抑制NHP和人的初级TDAR，而且我们也想调查这种抗体对强化TDAR的影响。该实验设计概括于图23A中。简言之，在研究第28天(引发)用在明矾中的KLH对四只恒河猴进行免疫，之后是在研究第1天单次静脉内剂量的CFZ533 10mg/kg，然后在研究第15天进行第二次KLH免疫。
图23B显示了与来自免疫对照(无CFZ533)的数据相比，CFZ533对四只个体动物中的抗KLH IgG强化应答的影响。在CFZ533的PK曲线中存在动物间可变性，在动物#1和#3中观察到更快速的CFZ533消除。在动物#2和#4中观察到更长时间的较高血浆浓度。有趣的是，这些动物在研究第15天表现出对抗KLH IgG(和IgM；数据未显示)强化应答的完全抑制(注意到所有动物都产生对KLH的初级TDAR)。相比之下，在更快清除CFZ533的动物中观察到抗KLHIgG应答(尽管有一些延迟)(与动物#1相比，动物#3的延迟更高)，特别是在第二次KLH免疫时血清CFZ533水平低于约40μg/ml时。如先前用CFZ533在移植的(Cordoba等人2015)和未移植的动物(图22B)的体内实验所观察到的，未观察到外周B细胞耗竭(数据未显示)。
以上结果表明高于约40μg/ml的CFZ533血清浓度是完全抑制NHP中强化TDAR所必需的。我们想进一步调查CFZ533暴露与CD40途径相关的组织药物效应动力学效应之间的关系。在26周的毒理学研究结束时，在皮下1mg/kg/周CFZ533下，我们对肠系膜***(mLN)中的GC进行组织学和分子分析。图23C(i)表明在给药的六只动物中，我们可以观察到三个个体中对GC的完全抑制，而在剩余动物的mLN中仍然可以观察到GC。图23C(iii)表明至少38μg/mL的血清浓度(给药间隔内的平均稳态浓度)与***皮质B细胞区域中的GC发育的完全抑制相关，而在低于20μg/mL的血清浓度下观察到对GC的不完全抑制(动物26842)或无抑制(动物26772和26837)，尽管观察到全血CD20pos B细胞上的完全CD40占用(动物26842和26772；数据未显示)。没有证据表明外周B细胞耗竭(数据未显示)。
讨论
正在开发CFZ533作为实体器官移植和与CD40-CD154共刺激途径调节异常相关的自身免疫性疾病的潜在疗法。在这里，我们描述了CFZ533在CD40途径相关的体外和体内模型***中的功能特性的表征，并且研究了CFZ533暴露与PD效应之间的关系。
CFZ533能够结合CD40并完全阻止rCD154诱导的途径对不同的人免疫细胞类型(包括B细胞和DC)的活化。另外，似乎CFZ533需要超过90％的CD40占用以完全阻断全血中的途径活化。总的来说，这些数据表明CFZ533具有阻断CD40途径依赖性效应子功能的潜力，而与细胞类型无关，假设获得了足够的受体占用。我们的数据还表明，在PBMC中，CFZ533能够从CD40置换预先结合的rCD154，这表明mAb和生理配体的表位可能重叠；这一想法正在结构研究中进行调查。
在体内，在单剂量PK研究中观察到CFZ533的浓度依赖性清除率和半衰期。该PK曲线表明CD40受体表达影响CFZ533的消除。在低CFZ533浓度(即不完全的靶标饱和度)下，CD40对CFZ533总体清除率的贡献升高，并且半衰期比通常观察到的IgG1型抗体的半衰期略短。在对应于完全靶标饱和度(和完全功能途径抑制)的较高浓度下，该受体对CFZ533的总体清除率的贡献是有限的并且半衰期增加。CFZ533的靶标介导的清除是与体外观察到的CD40介导的CFZ533的内化一致的，这之后可能是复合物的溶酶体降解。
来自PK/PD研究的另一个发现证实了CFZ533不能在体内消耗外周B细胞(Cordoba等人2015)。正如所述，CFZ533不能消耗表达CD40的细胞是由于抗体中存在N297A突变(该突变导致铰链区中不存在N-连接的糖基化)造成的，使其不能结合FcγRIIIA或介导ADCC或CDC。进行CFZ533的Fc沉默以防止表达CD40的细胞类型的消耗；鉴于该受体在免疫和非免疫细胞类型上的广泛组织分布(特别是在炎性条件下)，这是特别令人关注的。
除了在NHP肾移植中的疗效(Cordoba等人2015)，本文的结果还表明CFZ533完全抑制了强化TDAR。该结果表明记忆B细胞对T细胞依赖性抗原的应答完全依赖于CD40-CD154相互作用。强化应答的抑制程度似乎与CFZ533的浓度有关，其中完全抑制抗原特异性抗体应答需要超过30-40μg/ml的血清水平(在加强后持续至少一周)。当调查CFZ533对肠系膜***GC的影响时，血清浓度与CD40途径相关的组织PD读数之间的这种关系也得以保持，其中完全抑制GC需要平均稳态血清CFZ533浓度的最小阈值。这些数据指出了在外周药物暴露与组织中靶标相关性PD效应之间建立关系的重要性，以便为给药策略提供信息。正在开发针对各种自身免疫性疾病的几种靶向CD40-CD154共刺激途径的生物制品。除了CFZ533等抗CD40 mAb以外，抗CD154 mAb仍处在临床阶段，尽管存在血栓栓塞事件的潜在风险(Boumpas等人,2003)。最近的结果表明，Fc沉默的和聚乙二醇化的F(ab’)2方法可以消除靶向CD154的抗体的血栓栓塞危险，但是有报道称Fc沉默的抗CD154 mAb可能不太有效。迄今为止，没有证据表明在临床前模型或临床中有与施用多种抗CD40抗体相关的血栓栓塞事件。
总之，我们的数据表明CFZ533是具有最小激动性质的途径阻断性、非耗竭性抗CD40抗体。在足够的药理学相关暴露下，CFZ533能够完全抑制强化TDAR并且抑制生发中心，而不消耗表达CD40的细胞类型。这些数据与肾移植的临床前疗效相结合，为CFZ533在选择性自身免疫性疾病和实体器官移植中的潜在临床应用提供了坚实的科学依据。
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Claims (34)
1.一种抗CD40抗体，用于在干燥综合征的治疗中使用。
2.根据权利要求1所述使用的抗体，其中干燥综合征是原发性干燥综合征。
3.根据权利要求1或2所述使用的抗体，其中所述抗体选自由以下组成的组：
a.抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域；
b.抗CD40抗体，其包含含有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的高变区的免疫球蛋白VH结构域以及含有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的高变区的免疫球蛋白VL结构域；
c.抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域、以及SEQ ID NO:13的Fc区；
d.抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域、以及SEQ ID NO:14的Fc区；和
e.抗CD40抗体，其包含Fc IgG1沉默区。
4.根据权利要求3所述使用的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:9的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:10的轻链氨基酸序列；或包含SEQ ID NO:11的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:12的轻链氨基酸序列。
5.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1至4中任一项所述使用的抗体以及一种或多种药学上可接受的载体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述使用的抗体，其中施用途径是皮下或静脉内，或皮下或静脉内的组合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述使用的抗体，其中剂量为约3mg至约30mg活性成分/千克人受试者。
8.根据权利要求7所述使用的抗体化合物，其中所述剂量为约10mg活性成分/千克人受试者。
9.根据权利要求1至6中任一项所述使用的抗体，其中剂量为约150mg至约600mg活性成分，如约300mg活性成分。
10.根据权利要求9所述使用的抗体化合物，其中所述剂量为150mg活性成分、300mg活性成分或600mg活性成分。
11.根据权利要求1至10中任一项所述使用的抗体，其中通过负荷给药和维持给药来施用所述抗体。
12.根据权利要求11所述使用的抗体，其中经由皮下注射第一剂量来施用所述负荷给药，并且经由皮下注射第二剂量来施用所述维持给药。
13.根据权利要求12所述使用的抗体，其中所述第一剂量在约150mg与约600mg活性成分之间，如约300mg活性成分，并且所述第二剂量在约150mg与约600mg活性成分之间，如约300mg活性成分。
14.根据权利要求12或13所述使用的抗体，其中所述第一剂量是150mg、300mg或600mg活性成分，并且所述第二剂量是150mg、300mg或600mg活性成分。
15.根据权利要求11至14中任一项所述使用的抗体，其中所述负荷给药包括至少两次皮下注射，并且所述维持给药由每周一次(Q1W)、每两周一次(Q2W)或每月一次(Q4W)皮下注射组成。
16.根据权利要求15所述使用的抗体，其中所述负荷给药的至少两次皮下注射具有不同的剂量。
17.一种治疗人受试者中的干燥综合征的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的抗CD40抗体。
18.根据权利要求17所述的方法，其中干燥综合征是原发性干燥综合征。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述抗体选自由以下组成的组：
a.抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域；
b.抗CD40抗体，其包含含有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的高变区的免疫球蛋白VH结构域以及含有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的高变区的免疫球蛋白VL结构域；
c.抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域、以及SEQ ID NO:13的Fc区；
d.抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域、以及SEQ ID NO:14的Fc区；和
e.抗CD40抗体，其包含Fc IgG1沉默区。
20.根据权利要求19所述的治疗方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO:9的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:10的轻链氨基酸序列；或包含SEQ ID NO:11的重链氨基酸序列和SEQ IDNO:12的轻链氨基酸序列。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述抗体与一种或多种药学上可接受的载体一起施用。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的方法，其中经皮下或经静脉内、或者经皮下或静脉内的组合施用所述抗体。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的方法，其中以约3mg至约30mg活性成分/千克人受试者的剂量施用所述抗体。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述剂量为约10mg活性成分/千克人受试者。
25.根据权利要求17至22中任一项所述的方法，其中以约150mg至约600mg活性成分，如约300mg活性成分的剂量施用所述抗体。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述剂量为150mg活性成分、300mg活性成分或600mg活性成分。
27.根据权利要求17至26中任一项所述的方法，其中以负荷给药和维持给药来施用所述抗体。
28.根据权利要求27所述的方法，其中经由皮下注射第一剂量来施用所述负荷给药，并且经由皮下注射第二剂量来施用所述维持给药。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一剂量在约150mg与约600mg活性成分之间，如约300mg活性成分，并且所述第二剂量在约150mg与约600mg活性成分之间，如约300mg活性成分。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述第一剂量是150mg、300mg或600mg活性成分，并且所述第二剂量是150mg、300mg或600mg活性成分。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中所述负荷给药包括至少两次皮下注射，并且所述维持给药由每周一次(Q1W)、每两周一次(Q2W)或每月一次(Q4W)皮下注射组成。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述负荷给药的至少两次皮下注射具有不同的剂量。
33.包含抗CD40抗体、缓冲剂、稳定剂和增溶剂的液体药物组合物以及用于将所述抗CD40抗体经皮下施用至患有干燥综合征的患者的装置用于制造治疗干燥综合征的药物的用途，其中将所述抗CD40抗体：
a.以第一负荷给药经皮下施用；和
b.此后，以第二维持给药经皮下施用，其中所述抗CD40抗体选自由以下组成的组：
i.抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域；
ii.抗CD40抗体，其包含含有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的高变区的免疫球蛋白VH结构域以及含有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的高变区的免疫球蛋白VL结构域；
iii.抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域、以及SEQ ID NO:13的Fc区；
iv.抗CD40抗体，其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域、以及SEQ ID NO:14的Fc区；
v.抗CD40抗体，其包含Fc IgG1沉默区；和
vi.抗CD40抗体，其包含SEQ ID NO:9的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:10的轻链氨基酸序列；或包含SEQ ID NO:11的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:12的轻链氨基酸序列。
34.根据权利要求33所述的用途，其中干燥综合征是原发性干燥综合征。
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