CN111254152B

CN111254152B - 一种乙酰木聚糖酯酶基因、其编码产物及制备方法

Info

Publication number: CN111254152B
Application number: CN202010232020.7A
Authority: CN
Inventors: 李荷; 张梦乐
Original assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Current assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Priority date: 2020-03-27
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2040-03-27
Also published as: CN111254152A

Abstract

本发明公开了一种乙酰木聚糖酯酶基因、其编码产物及制备方法，所述乙酰木聚糖酯酶基因命名为Est1051，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明还公开了含有所述乙酰木聚糖酯酶基因的重组质粒pET28a‑Est1051，本发明还公开了乙酰木聚糖酯酶的制备方法，将所述乙酰木聚糖酯酶基因Est1051在大肠杆菌原核表达***中过量表达，该乙酰木聚糖酯酶在大肠杆菌表达体系中高效可溶性表达。同时，采用所述方法得到的乙酰木聚糖酯酶，具有较高的催化活性和热稳定性,有很大的工业化生产和应用前景。

Description

一种乙酰木聚糖酯酶基因、其编码产物及制备方法

技术领域

本发明涉及一种基因重组技术领域，尤其涉及如何获得乙酰木聚糖酯酶基因及其编码产物的技术。

背景技术

半纤维素是自然界中除纤维素以外最丰富的可再生生物资源。木聚糖是植物细胞壁中半纤维素的重要组成成分，约占植物细胞干重的15％-35％。这些木糖聚合物中广泛连接乙酰基、***糖基、阿魏酸和4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸残基等基团，形成不同的侧链基团，因而木聚糖具有多种多样的结构。木聚糖侧链上的乙酰基团的存在对木聚糖酶降解木聚糖产生了阻碍作用，进而影响底物的水解效率，产生空间障碍，限制了主链降解酶和主链的接触，降低了可及性。

乙酰木聚糖酯酶(acetyl xylan esterase，AXE)可消除乙酰化木聚糖中木糖残基C-2和C-3位的O-乙酰取代基，从而提高木聚糖酶对主链的可及性，改善细胞壁中木聚糖酶的水解效率。乙酰木聚糖酯酶是目前了解最少的植物细胞壁降解酶系之一。该酶在1985年首次发现之后，越来越多的不同类型的乙酰木聚糖酯酶被发现和研究。工业上降解木聚糖经常采用酸法或碱法，但酸、碱水解过程往往伴有副反应，产生较多的有毒物质，对于后期微生物发酵有抑制作用，且产生的酸、碱废液会造成较大的环保压力，因此，酶法降解木聚糖以其温和环保的优势将会成为未来木聚糖降解的主要方式。

乙酰木聚糖酯酶作为半纤维素酶系成员之一具有良好的应用前景。在工程菌构建方面,乙酰木聚糖酯酶的研究对于构建产量高、协同效果优异的半纤维素酶工程菌具有重要意义。在工业应用方面,乙酰木聚糖酯酶能够协同内切木聚糖酶和β-木糖苷酶将半纤维素彻底降解为木糖,进而转化为木糖醇等。另外,一些乙酰木聚糖酯酶能够作用于甲壳素的乙酰基,因此可以应用酶法制备壳聚糖,在药物、纺织、造纸、化妆品等方面具有广阔应用前景。

目前，相对于其他木质纤维素降解酶系，对乙酰木聚糖酯酶的研究还远远不够，乙酰木聚糖酯酶与其他木质纤维素降解酶系的协同作用已经得到认可，其潜在应用价值还有待开发。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种乙酰木聚糖酯酶的基因及其制备方法。

本发明的第二个目的在于提供一种乙酰木聚糖酯酶及其制备方法。

本发明的第三个目的在于提供一种乙酰木聚糖酯酶的重组质粒pET28a-Est1051。

本发明的第四个目的在于提供含有上述乙酰木聚糖酯酶的重组工程菌。

本发明的第一个目的、第三个目的、第四个目的是通过如下技术方案来实现的：一种乙酰木聚糖酯酶的基因，命名为Est1051，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

。

基因的制备步骤如下：

(1)从样品中提取总DNA，纯化总DNA，酶切总DNA；

(2)回收步骤(1)得到的酶切后的DNA片段，将DNA片段和pUC118载体连接，得到质粒；

(3)将步骤(2)所得质粒转化、文库筛选和阳性克隆子鉴定；

(4)测序，将质粒命名为pUC118-Est1051，并设计PCR引物；

(5)以质粒pUC118-Est1051为模板，PCR扩增进行基因克隆；

(6)将PCR产物纯化，得到乙酰木聚糖酯酶基因。

进一步地，所述PCR引物是：

Est1051-F：CCGGAATTCCCCGTTGCGGTGTCATTATACTGAC

(下划线部分为EcoRⅠ的酶切位点)；

Est1051-R：CCGCTCGAGGCTCCCGAAGAACCTATGAAACCAATTG

(下划线部分为XhoⅠ的酶切位点)。

进一步地，所述步骤(5)的操作是：以质粒pUC118-Est1051为模板、Est1051-F和Est1051-R为引物，采用Prime STAR^TMMax Premix进行Est1051基因片段的PCR扩增，体系如下：

PCR的反应条件是：

第一阶段：95℃变性2min；

第二阶段：95℃变性10sec，60℃退火5sec，72℃延伸5sec，共30个循环；

第三阶段：72℃延伸10min，最后于4℃保存。

本发明的第二个目的是通过如下技术方案实现的：一种乙酰木聚糖酯酶，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

。

酶的制备方法：

把权利要求1的乙酰木聚糖酯酶基因与pET-28a(+)表达载体连接，获得连接产物重组质粒pET-28a(+)-Est1051，把重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中形成重组工程菌，培养重组工程菌，破碎，得到粗酶液，纯化，得到乙酰木聚糖酯酶。

更详细地，把权利要求1的乙酰木聚糖酯酶基因与pET-28a(+)表达载体连接，获得连接产物重组质粒pET-28a(+)-Est1051，把重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中形成重组工程菌，重组工程菌接种在LB液体培养基中活化，然后把活化后菌体浓度为OD_600nm＝1.2的重组工程菌母液接种于另一LB液体培养基中，加入终浓度为0.8mM的IPTG，37℃培养10h，离心去上清，破碎，得到粗酶液，纯化，得到乙酰木聚糖酯酶。

本发明的有益效果：

①本发明从实验室前期筛选中得到一个新的乙酰木聚糖酯酶基因Est1051，Est1051为一个1051bp大小的完整乙酰木聚糖酯酶基因，利用BLAST在线比对其核苷酸序列进行同源性搜索分析表明，所述乙酰木聚糖酯酶基因Est1051与已知基因亲缘性关系远。

②通过基因工程技术对该乙酰木聚糖酯酶基因做功能研究，发现该序列在大肠杆菌BL21中高效可溶表达，经蛋白纯化及SDS-PAGE电泳，得到一条单一的蛋白条带，由于pET28a载体编码硫氧还蛋白和六联组氨酸标签等与目的蛋白融合表达，因此电泳中重组乙酰木聚糖酯酶的相对分子量约为50kDa.

③本发明将SEQ ID NO.1所示的DNA序列克隆到原核表达载体上，转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，通过对阳性克隆子的诱导表达得到重组蛋白，研究其酶学性质，结果如下：

(1)在大肠杆菌表达体系中，该重组蛋白具有高效可溶性表达。

(2)用对硝基苯酚乙酸酯为底物，所述乙酰木聚糖酯酶的最适反应温度为40℃，在温度为4～45℃之间，剩余酶活力均在50％以上，稳定性良好，表明该重组乙酰木聚糖酯酶具有耐高温及热稳定性方面优势；该重组蛋白的最适反应pH为7.0，在pH5-7.5之间，剩余酶活力均在50％以上，稳定性良好；当金属离子浓度为1mM时，Zn2+和Mn2+对酶活性有促进作用，当金属离子浓度为10mM时，Mg2+和Fe2+对酶活性有促进作用，说明该重组酶具有较高程度的耐金属离子特性。此外，1％的DMSO、甲醇能够促进酶活性，但比较特殊的是随着异丙醇和TritonX-100浓度的提高，重组乙酰木聚糖酯酶的酶活力反而提高，表明该重组乙酰木聚糖酯酶具有较高程度耐受有机溶剂的特性。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：

图1是本发明实施例1乙酰木聚糖酯酶基因Est1051 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图2是本发明实施例1重组质粒酶切电泳验证实验图；

图3是不同诱导温度对重组乙酰木聚糖酯酶表达水平影响电泳图；

图4是不同诱导时间对重组乙酰木聚糖酯酶表达水平影响电泳图；

图5是不同诱导时间对重组乙酰木聚糖酯酶酶活力的影响统计图；

图6是不同IPTG诱导浓度对重组乙酰木聚糖酯酶表达水平影响电泳图；

图7是不同IPTG诱导浓度对重组乙酰木聚糖酯酶酶活力影响统计图；

图8是不同起始菌体浓度对重组乙酰木聚糖酯酶表达水平影响电泳图；

图9是不同起始菌体浓度对重组乙酰木聚糖酯酶酶活力影响统计图；

图10是粗重组蛋白和纯化后重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图11是pNP标准曲线图；

图12是温度对重组乙酰木聚糖酯酶活性及稳定性的影响统计图；

图13是pH对重组乙酰木聚糖酯酶活性及稳定性的影响统计图；

图14是不同金属离子对重组乙酰木聚糖酯酶降解底物活性影响的统计图；

图15是不同有机溶剂对重组乙酰木聚糖酯酶降解底物活性影响统计图；

图16是重组乙酰木聚糖酯酶Est1051降解底物耐盐性统计图。

具体实施方式

下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例1乙酰木聚糖酯酶基因Est1051的克隆及重组表达质粒的构建

1.乙酰木聚糖酯酶基因Est1051的引物设计与合成

从新疆准噶尔盆地南缘的石河子南山的野生阿魏分布区土壤样品中提取总DNA，提取方法是：

(1)取12个高压灭菌后的5mL离心管，称取土壤样品，每管1.25g，分别加入DNA提取缓冲液1.5ml，在摇床上130rpm/min下，37℃活化30min。

(2)取出离心管分别加入300μL 10％的SDS。

(3)在65℃水浴锅中水浴2h，每隔15mim上下轻轻颠倒混匀。

(4)取出样品，冷却后,4℃，10000rpm/min，离心10min。

(5)取上清转移至新的5mL离心管，4℃，10000rpm/min，离心20min。

(6)取上清后，加入0.7倍体积的异丙醇轻轻混匀后，室温静置1h。

(7)4℃，10000rpm/min，离心30min。

(8)弃上清，用4℃预冷的75％乙醇洗涤沉淀1次。4℃，10000rpm/min，离心10min。室温下晾干。

(9)每管加20μL 65℃预热的TE溶液，并于65℃温浴5min，溶解基因组DNA，即得总DNA。

然后使用美国OMEGA公司Gel Extraction Kit(D2500-01)胶回收试剂盒纯化DNA，再应用1％琼脂糖凝胶电泳进行宏基因组电泳检测总DNA纯度和质量，保证纯化后DNA的A₂₆₀/A₂₈₀比值高于1.8即可，采用限制性内切酶BamH I部分酶切总DNA，采用同样方法电泳检测酶切片段，使用美国OMEGA公司Gel ExtractionKit(D2500-01)胶回收试剂盒回收片段大小在2-8kb的酶切片段，采用T4 DNA Ligase将其与pUC118载体在16℃过夜连接，得到质粒，再进行质粒转化、文库筛选和阳性克隆子鉴定；鉴定无误后，将该质粒送去测序公司进行测序，将测定的核苷酸序列经过NCBI的BLASTn软件分析比较，测序结果显示，该核苷酸序列是乙酰木聚糖酯酶基因，由1051个碱基组成，命名为Est1051，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进行测序的所述质粒命名为pUC118-Est1051；

根据乙酰木聚糖酯酶基因Est1051的基因序列设计两个PCR引物：Est1051-F和Est1051-R，并引入EcoRⅠ和XhoⅠ两个酶切位点，具体引物序列设计如下：

Est1051-F：CCGGAATTCCCCGTTGCGGTGTCATTATACTGAC

(下划线部分为EcoRⅠ的酶切位点)；

Est1051-R：CCGCTCGAGGCTCCCGAAGAACCTATGAAACCAATTG

(下划线部分为XhoⅠ的酶切位点)。

委托广州擎科生物技术有限公司合成引物。

2.乙酰木聚糖酯酶基因Est1051的克隆

以质粒pUC118-Est1051为模板、Est1051-F和Est1051-R为引物，采用PrimeSTAR^TMMax Premix进行Est1051基因片段的PCR扩增，体系如下：

PCR扩增循环反应条件如下：

第一阶段：95℃变性2min；

第三阶段：72℃延伸10min，最后于4℃保存。

3.PCR产物的纯化

取5μLPCR产物加入一定量的6×Loading Buffer，采用1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定之后用琼脂糖切胶回收法纯化PCR产物并检测纯度，放于-20℃保存。

具体步骤如下：

(1)电泳：使用含1μL EB替代物的1％的琼脂糖凝胶，180V电泳45min后于凝胶成像仪中观察，如图1所示，M为2000kb DNAmaker，1为Est1051 PCR扩增产物，2是空白对照；

(2)切胶：在凝胶成像仪中切取PCR产物琼脂糖凝胶条带，然后用去离子水冲洗，并置于2mL离心管中；

(3)纯化：使用

Gel Extraction Kit试剂盒回收PCR产物DNA，具体步骤如下：

①称取含PCR产物琼脂糖凝胶条带琼脂糖凝胶的质量；

②按照每0.1g琼脂糖凝胶对应100μLBing Buffer的比例，向离心管中加入溶液Bing Buffer；

③将含Bing Buffer凝胶的离心管置于60℃水浴锅中，每隔2-3min振荡混合，至琼脂糖凝胶完全融化；

④将HiBind DNA柱置于2mL收集管，并将步骤③所获得的溶液转移至HiBind DNA柱中，静置2min后，14,000rpm离心1min；

⑤弃滤液，把柱子重新装回收集管，加入700μL的Wash Buffer，10,000rpm离心1min，并重复此步骤；

⑥弃滤液，把柱子重新装回收集管，14,000rpm离心2min以甩干柱子基质；

⑦将HiBind DNA柱置于新的1.5mL离心管中，并向柱中央滴加超纯水，静置2min后，14,000rpm离心2min，管底液体即为纯化后的PCR产物，-20℃保存备用。

(4)检测纯度：使用核酸检测仪，取1μL纯化后产物进行检测，保证纯化后DNA的A₂₆₀/A₂₈₀比值高于1.8即可。

4.乙酰木聚糖酯酶基因Est1051与pET-28a(+)表达载体的连接

用限制性快速内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ于37℃对PCR产物双酶切30min，用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pET-28a(+)表达载体，采用TaKaRa的T4 DNALigase对双酶切处理的pET-28a及PCR产物进行连接，在16℃恒温下进行连接过夜，得到pET-28a(+)-Est1051。连接体系如下：

5.连接产物的转化

(1)从-80℃超低温冰箱中取出一管大肠杆菌(E.coli BL21(DE3))感受态细胞，置于冰上缓慢解冻。

(2)在冰上将5μL连接产物与100μL感受态细胞混匀放置30min。

(3)采用热激法将连接产物转化到感受态细胞中：将混合物在42℃恒温水浴中热处理1.5min后，***冰中冷却2min。

(4)加入500μL预热的SOC液体培养基，在37℃、180rpm条件下振荡培养45min-1h；

(5)将含pET-28a(+)-Est1051的培养物涂布于卡那青霉素抗性LB固体平板(含50μg/mL Kan和40μg/mLX-gal)，置于37℃恒温培养箱中培养过夜。

6.重组质粒的酶切验证

从转化后的平板上随机挑取白色单克隆子，提取质粒后进行双酶切，并用琼脂糖凝胶电泳验证酶切产物。验证结果如图2所示：M为15000kb DNAMaker，1为EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的重组质粒pET-28a(+)-Est1051，2为不经酶切处理的重组质粒pET-28a(+)-Est1051。可知EST1051已经被连接到表达载体pET-28a(+)中。

实施例2乙酰木聚糖酯酶基因Est1051的诱导表达优化及纯化

按照下面方法制备种子液备用：挑选重组表达菌株单菌落点在5mL LB液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜培养12h。

(1)最佳诱导温度的确定

根据不同诱导温度设置3个不同的实验组，各个实验组每个测试样品的操作均是：从备用的种子液中吸取500μL培养液至含50mL LB液体培养基中，在30℃、220rpm条件下振荡培养至菌体密度OD_600nm为1.0时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，并把各实验组的测试样品分别置于25℃、37℃和40℃恒温振荡器中，220rpm振荡诱导培养8h。14,000rpm离心2min收集不同温度条件诱导后的菌体，进行SDS-PAGE蛋白胶电泳，以确定最佳诱导温度。结果如图3所示，M是protein marker，1,2,3分别为25℃、37℃和40℃的蛋白表达，电泳显示，37℃时的蛋白量最多，说明该重组菌株在37℃温度下表达效果最好。

(2)最佳诱导时间的确定

根据不同诱导时间设置7个不同的实验组，各个实验组每个测试样品的操作均是：从备用的种子液中，吸取500μL培养液至含50mL LB液体培养基中，在30℃、220rpm条件下振荡培养至菌体密度OD_600nm为1.0时，加入终浓度为0.1mM IPTG。在37℃、220rpm条件下把各实验组的测试样品分别振荡诱导培养2h、4h、6h、8h、10h、12h和14h。14,000rpm离心2min收集不同诱导时间条件后的菌体。在相同条件下将菌体洗涤破碎，并检测其活性(以最高酶活力为100％)，同时进行SDS-PAGE蛋白胶电泳，以确定最佳诱导时间。结果如图4-5所示，M是protein marker，图4中1-7分别为培养2h、4h、6h、8h、10h、12h和14h的蛋白表达，图5中分别为培养2h、4h、6h、8h、10h、12h和14h的酶活测试，电泳及酶活测试结果综合显示10h时表达效果最好。因此，重组蛋白诱导表达的最佳时间为10h。

(3)最佳IPTG诱导浓度的确定

根据不同的IPTG诱导浓度设置6个不同的实验组，各个实验组每个测试样品的操作均是：从备用的种子液中，吸取500μL培养液至含50mL LB液体培养基中，在30℃、220rpm条件下振荡培养至菌体密度OD_600nm为1.0时，往各个实验组的测试样品中对应加入不同量IPTG使其终浓度分别为0.0mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM，在37℃、220rpm条件下振荡诱导培养10h。14,000rpm离心2min收集诱导后的菌体。在相同条件下将菌体洗涤破碎，并检测活性(以最高酶活为100％)，同时进行SDS-PAGE蛋白胶电泳，以确定最佳IPTG终浓度。结果如附图6-7所示，M是protein marker，图6中1,-6分别为诱导浓度0.0mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM的蛋白表达，图7中分别为诱导浓度0.0mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM的酶活测试，电泳及酶活测试结果综合显示诱导浓度为0.8mM时表达效果最好。因此，最佳IPTG诱导浓度为0.8mM。

(4)最佳起始菌体浓度的确定

根据不同起始菌体浓度设置5个不同的实验组，各个实验组每个测试样品的操作均是：从备用的种子液中，吸取500μL培养液至含50mL LB液体培养基中，在30℃、220rpm条件下振荡培养，直至各实验组的菌体密度OD_600nm分别为0.9、1.0、1.1、1.2、1.3时，加入终浓度为0.8mM IPTG，在37℃、220rpm条件下振荡诱导培养10h。14,000rpm离心2min收集诱导后的菌体。在相同条件下将菌体洗涤破碎，并检测活性(以最高酶活为100％)，同时进行SDS-PAGE蛋白胶电泳，以确定最佳起始菌体密度。结果如附图8-9所示，M是protein marker，图8中1-5是菌体密度OD_600nm分别为0.9、1.0、1.1、1.2、1.3时的蛋白表达，图9中菌体密度OD_600nm分别为0.9、1.0、1.1、1.2、1.3时的酶活测试，电泳及酶活测试结果综合显示最佳起始菌体浓度为OD_600nm＝1.2表达效果最好。因此，最佳起始菌体浓度为OD_600nm＝1.2。

(5)目的蛋白Est1051的诱导表达与纯化

从备用的种子液中，吸取500μL培养液至含50mL LB液体培养基中，在37℃、220rpm条件下振荡培养至菌体密度OD_600nm为1.2时，加入终浓度为0.8mM IPTG。在37℃、220rpm条件下振荡诱导培养10h。6,000rpm离心20min，弃上清，用冰预冷的无菌dd H₂O洗涤沉淀两次，再用1mL dd H₂O重悬细胞沉淀，超声波破碎菌液直至变清，即为粗酶液。

将一部分粗重组蛋白用

Purification Kit(Novagen)试剂盒的纯化方法，具体操作步骤按Novagen公司产品说明书进行。将获得的粗重组蛋白和纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，用考马斯亮蓝R-250染色，蛋白Maker估计酶蛋白的大小。如图10所示，M是protein marker，1是纯化后的酶，2是未经纯化的粗酶，SDS-PAGE电泳结果表明，通过蛋白纯化试剂盒纯化的酶蛋白，SDS-PAGE电泳得到一条单一的蛋白条带。SEQ IDNO.1所述核苷酸序列所编码的多肽在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达，初步估计重组蛋白Est1051的分子量约为50kDa(其中含15kDa左右融合标签)

该DNA编码的多肽，含312个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例3乙酰木聚糖酯酶的酶活测定

(1)酶活的测定

本发明使用对硝基苯酚酯类为底物来检测乙酰木聚糖酯酶的酶活性。反应体系为200μL，其组成为10μL含有10mM的对硝基苯酚酯类储存液，180μL PBS(pH＝6.8)缓冲液和10μL酶溶液。该反应体系在40℃下反应20min，随后于405nm波长处测定该过程中释放的对硝基苯酚的吸光度，同时做不加酶液的空白对照。根据对硝基苯酚的标准曲线确定其浓度。酶活单位定义为：在反应条件下，每分钟催化1μmol对硝基苯酚乙酸酯所需要的酶量定义为1个酶活单位。

(2)pNP标准曲线的制作

用pH6.8的PBS缓冲液配制10mM对硝基苯酚(ρ-nitrophenyl,ρNP)的母液，然后按照表1所示配制不同浓度的对硝基苯酚标准液。取不同浓度的对硝基苯酚标准液和pH6.8的PBS缓冲液共200μL至酶标板中，测定其吸光值，记录OD₄₀₅nm，如表1，并绘制标准曲线，如图11所示，标准液浓度越高，OD值越大。

表1

实施例4乙酰木聚糖酯酶基因Est1051的酶学性质研究

(1)最适温度及温度稳定性测试

设置9个实验组，每个实验组中设置1个不经加热的对照组以及三个平行的实验小组，每个测试样品均为：取10μL的酶液和190μL的对硝基苯酚乙酸酯缓冲液混合为反应液，9个实验组的三个平行组分别对应置于4℃、15℃、30℃、35℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃恒温水浴锅中反应20min后，将各实验组的反应液适度稀释后测405nm下的光吸收值。最高酶活力计为100％，以相对酶活力对温度作图，以确定最适反应温度。

设置另外的9个实验组，每个实验组中设置1个不经加热的对照组以及三个平行的实验小组，每个测试样品均为10μL的酶液；9个实验组的三个平行组酶液分别对应置于4℃、15℃、30℃、35℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃恒温水浴中，保温2h后，测定剩余酶活力。以未经热处理的酶活力计为100％，以相对酶活力对温度作图，观察其温度稳定性。

结果如图12所示，乙酰木聚糖酯酶的最适反应温度为40℃，在不同温度下2h处理后，随温度升高，酶活力逐渐下降，但在温度为4～45℃之间，剩余酶活力均在50％以上，稳定性良好，说明乙酰木聚糖酯酶常温耐受性较好。

(2)最适pH及pH稳定性测试

测定不同pH条件下的酶活力，设置12个实验组，每个实验组的每个试验样品均是10μL的酶液和190μL的对硝基苯酚乙酸酯溶液混合成反应液，不同实验组的对硝基苯酚乙酸酯溶液pH不同，分别为1.97、2.97、4.10、5.02、6.09、6.59、7.00、7.54、7.96、8.53、8.96、9.91。把各实验组反应液置于40℃恒温水浴锅中反应20min后，将反应液适度稀释后测定405nm下的光吸收值。最高酶活力计为100％，以相对酶活力对pH作图，以确定最适反应pH。

再设置12个实验组，每个实验组的每个试验样品均是10μL的酶液，将12个实验组酶液的pH分别调整为1.97、2.97、4.10、5.02、6.09、6.59、7.00、7.54、7.96、8.53、8.96、9.91，在不同的pH条件下，并在40℃保温2h后，以对硝基苯酚乙酸酯为底物，测定剩余酶活力。以放置前的酶活力计为100％，以相对酶活力对pH作图。结果如图13所示，乙酰木聚糖酯酶Est1051的最适反应pH为7.0，在pH5-7.5之间，剩余酶活力均在50％以上，稳定性良好。

(3)不同金属离子对酶活力的影响

根据不同金属离子溶液以及不同浓度的金属离子溶液，设置23个实验组，每个实验组的每个试验样品均包含10μL的酶液和190μL的对硝基苯酚乙酸酯溶液，其中1个实验组加入空白缓冲液，另外22个实验组分别加入等量的终浓度为1mM Ni²⁺缓冲液、10mM Ni²⁺缓冲液、1mM Na⁺缓冲液、10mM Na⁺缓冲液、1mM K⁺缓冲液、10mM K⁺缓冲液、1mM Mg²⁺缓冲液、10mM Mg²⁺缓冲液、1mM Zn²⁺缓冲液、10mM Zn²⁺缓冲液、1mM Fe²⁺缓冲液、10mM Fe²⁺缓冲液、1mM Mn²⁺缓冲液、10mM Mn²⁺缓冲液、1mM Li⁺缓冲液、10mM Li⁺缓冲液、1mMAg⁺缓冲液、10mMAg⁺缓冲液、1mM Co²⁺缓冲液、10mM Co²⁺缓冲液、1mM Cu²⁺缓冲液、10mM Cu²⁺缓冲液，并将上述混合液在上述实施例中测定的最适合条件下测试酶活。以对硝基苯酚乙酸酯为底物，测定剩余酶活力。以添加空白缓冲液且同等稀释比例的酶活力计为100％，以相对酶活力作图。结果如图14所示，当金属离子浓度为1mM时，Zn²⁺和Mn²⁺对酶活性有促进作用，其中Mn²⁺的促进作用最大，相对酶活达到123.85％，而其他金属离子都使其活性受到不同程度的抑制。当金属离子浓度为10mM时，Mg²⁺和Fe²⁺对酶活性有促进作用，其中Mg²⁺的促进作用最大，相对酶活达到150.46％，而其他金属离子都使其活性受到不同程度的抑制，表明重组乙酰木聚糖酯酶Est1051对金属离子有较好耐受性。

(4)不同有机溶剂对酶活力的影响

设置16个实验组，每个实验组的每个试验样品均有10μL的酶液，各实验组的酶液中分别加入空白缓冲溶液、1％DMSO、15％DMSO、30％DMSO、1％甲醇、15％甲醇、30％甲醇、1％乙醇、15％乙醇、30％乙醇、1％异丙醇、15％异丙醇、30％异丙醇、1％Triton X-100有机溶剂、15％Triton X-100有机溶剂、30％Triton X-100有机溶剂，并将上述混合液在上述实施例中测定的最适合条件下测试酶活。以对硝基苯酚乙酸酯为底物，测定剩余酶活力。以添加空白缓冲液并同等稀释比例的酶活力计为100％，以相对酶活力作图。结果如图15所示，1％DMSO、1％甲醇能够促进酶活性，其中1％甲醇的促进作用最大，相对酶活达到141.89％，1％乙醇的酶活性达到了91.01％，而其他浓度的有机溶剂均对其产生不同程度的抑制作用。但比较特殊的是随着异丙醇和Triton X-100浓度的提高，乙酰木聚糖酯酶的酶活力反而提高，在30％的异丙醇中，酶活力能够达到87.80％。

(5)盐溶液对酶的耐受性研究

设置8个实验组，每个实验组的每个试验样品均包含10μL的酶液和190μL的对硝基苯酚乙酸酯溶液，其中1个实验组加入空白缓冲液，其他7个实验组向酶液中分别加入终浓度为0M、0.5M、1M、1.5M、2.0M、2.5M、3.0M的NaCl，并将上述混合液在上述实施例中得到的最适合条件下保温2h。以对硝基苯酚乙酸酯为底物，测定剩余酶活力。以未经盐溶液处理的酶液的酶活力定义为100。测定盐浓度对酶活力的影响，结果如图16所示，酶活力随着NaCl溶液浓度的提高而逐渐下降，但NaCl溶液浓度升高至1M时，酶活力仍保持在50％以上，当NaCl溶液浓度进一步升高时，酶活力急剧下降，当NaCl溶液浓度升高至2M时，酶活力保持在42％以上，说明乙酰木聚糖酯酶对盐溶液具有一定的耐受性。

可见，本发明提供一种新型乙酰木聚糖酯酶基因Est1051，将该基因构建到质粒pET28a中,再将该重组质粒转入到大肠杆菌原核表达***中进行表达并纯化。该基因表达的产物具有较高的催化活性，具有良好的热稳定性以及金属离子耐受性，具有较大的工业化生产和应用潜力。

以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

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序列表

<110> 广东药科大学

<120> 一种乙酰木聚糖酯酶基因、其编码产物及制备方法

<130> 2020

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1051

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

cccgttgcgg tgtcattata ctgacgggga cgatcaaaag cgttggcgtt cgttaaatat 60

ttacgagtgc tgcctcatgt caaagtcaga aaaaatagta taggaggtaa catatgggat 120

ccgaacatca tcatcatcat catgaaatga aaacaatact acattgcctt ctttttcttt 180

ttattactac gcaatcgatt gctcaatttt cccagcataa aagggatagt attgacaaat 240

taagcaggat tgatcatgag ctgatgatgg agaagctggg gatttctgaa ttgagaccgg 300

gaccctcggg aaatcccgaa gctccaaatg ctgctaacag tgacgaatct aaagccaaaa 360

cctacaacag cttgcctgaa ctactggtat ttgacaatgg aaagcttgtt aaaagtgtcg 420

aagactgggc gaatcgcagg aaagagatca aaaagcattt tgacagggag atctatggaa 480

aaatgcctga agacgttccc gatgttacct gggagatggt tagtgaaagg gataccctta 540

taggagaata tccggtggtt tataaagatc ttttagggca tgtagacaat tcggaatatc 600

cagaaatcga agtagcaatc gaaatgacgc tcgtaacacc tgccgaaaag gatgaaccgg 660

tgcctgtaat gctggagttt ggctggaact ggccgccggg tatggaaatc ccgaagacgg 720

aaggtcctgc ctggcaggag cagctgcttg gaaagggatg gggctatgcc attatgatcc 780

ctacaagctt ccaggcagat aacggggcag ggctgcgcca gggaatcatc ggactggtga 840

acaagggtga accgagagat cccgaagact ggggaacatt acgtgcctgg gcctggggtg 900

caagccgtgc aattgattat ttcgaagcaa acccagatgt ggatgaaaca aaagtaggta 960

tagaaggatt atccagatat gggaaagcag caatggttgc catggcttat gaacctcgat 1020

tagcaattgg tttcataggt tcttcgggag c 1051

<210> 2

<211> 312

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Met Gly Ser Glu His His His His His His Glu Met Lys Thr Ile Leu

1 5 10 15

His Cys Leu Leu Phe Leu Phe Ile Thr Thr Gln Ser Ile Ala Gln Phe

20 25 30

Ser Gln His Lys Arg Asp Ser Ile Asp Lys Leu Ser Arg Ile Asp His

35 40 45

Glu Leu Met Met Glu Lys Leu Gly Ile Ser Glu Leu Arg Pro Gly Pro

50 55 60

Ser Gly Asn Pro Glu Ala Pro Asn Ala Ala Asn Ser Asp Glu Ser Lys

65 70 75 80

Ala Lys Thr Tyr Asn Ser Leu Pro Glu Leu Leu Val Phe Asp Asn Gly

85 90 95

Lys Leu Val Lys Ser Val Glu Asp Trp Ala Asn Arg Arg Lys Glu Ile

100 105 110

Lys Lys His Phe Asp Arg Glu Ile Tyr Gly Lys Met Pro Glu Asp Val

115 120 125

Pro Asp Val Thr Trp Glu Met Val Ser Glu Arg Asp Thr Leu Ile Gly

130 135 140

Glu Tyr Pro Val Val Tyr Lys Asp Leu Leu Gly His Val Asp Asn Ser

145 150 155 160

Glu Tyr Pro Glu Ile Glu Val Ala Ile Glu Met Thr Leu Val Thr Pro

165 170 175

Ala Glu Lys Asp Glu Pro Val Pro Val Met Leu Glu Phe Gly Trp Asn

180 185 190

Trp Pro Pro Gly Met Glu Ile Pro Lys Thr Glu Gly Pro Ala Trp Gln

195 200 205

Glu Gln Leu Leu Gly Lys Gly Trp Gly Tyr Ala Ile Met Ile Pro Thr

210 215 220

Ser Phe Gln Ala Asp Asn Gly Ala Gly Leu Arg Gln Gly Ile Ile Gly

225 230 235 240

Leu Val Asn Lys Gly Glu Pro Arg Asp Pro Glu Asp Trp Gly Thr Leu

245 250 255

Arg Ala Trp Ala Trp Gly Ala Ser Arg Ala Ile Asp Tyr Phe Glu Ala

260 265 270

Asn Pro Asp Val Asp Glu Thr Lys Val Gly Ile Glu Gly Leu Ser Arg

275 280 285

Tyr Gly Lys Ala Ala Met Val Ala Met Ala Tyr Glu Pro Arg Leu Ala

290 295 300

Ile Gly Phe Ile Gly Ser Ser Gly

305 310

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ccggaattcc ccgttgcggt gtcattatac tgac 34

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ccgctcgagg ctcccgaaga acctatgaaa ccaattg 37

Claims

1.一种包含乙酰木聚糖酯酶基因的重组工程菌，其特征在于，所述乙酰木聚糖酯酶基因，命名为Est1051，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的一种包含乙酰木聚糖酯酶基因的重组工程菌，其特征在于：

所述乙酰木聚糖酯酶基因编码的乙酰木聚糖酯酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的一种包含乙酰木聚糖酯酶基因的重组工程菌，其特征在于：

所述的乙酰木聚糖酯酶基因的制备步骤如下：

(1)从样品中提取总DNA，纯化总DNA，酶切总DNA；

(3)将步骤(2)所得质粒转化、文库筛选和阳性克隆子鉴定；

(4)测序，将质粒命名为pUC118-Est1051，并设计PCR引物；

(5)以质粒pUC118-Est1051为模板，PCR扩增进行基因克隆；

(6)将PCR产物纯化，得到乙酰木聚糖酯酶基因。

4.如权利要求3所述的一种包含乙酰木聚糖酯酶基因的重组工程菌，其特征在于：

所述PCR引物是：

Est1051-F：CCGGAATTCCCCGTTGCGGTGTCATTATACTGAC

(下划线部分为EcoRⅠ的酶切位点)；

Est1051-R：CCGCTCGAGGCTCCCGAAGAACCTATGAAACCAATTG(下划线部分为XhoⅠ的酶切位点)。

5.如权利要求3所述的一种包含乙酰木聚糖酯酶基因的重组工程菌，其特征在于：

所述步骤(5)的操作是：以质粒pUC118-Est1051为模板、Est1051-F和Est1051-R为引物，采用Prime STAR^TMMax Premix进行Est1051基因片段的PCR扩增，体系如下：

PCR的反应条件是：

第一阶段：95℃变性2min；

第三阶段：72℃延伸10min，最后于4℃保存。

6.一种应用权利要求1所述的工程菌制备乙酰木聚糖酯酶的方法，其特征在于：

把乙酰木聚糖酯酶基因与pET-28a(+)表达载体连接，获得连接产物重组质粒pET-28a(+)-Est1051，把重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中形成重组工程菌，培养重组工程菌，破碎，得到粗酶液，纯化，得到乙酰木聚糖酯酶。

7.根据权利要求6所述的制备乙酰木聚糖酯酶的方法，其特征在于：

详细操作是：把乙酰木聚糖酯酶基因与pET-28a(+)表达载体连接，获得连接产物重组质粒pET-28a(+)-Est1051，把重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中形成重组工程菌，重组工程菌接种在LB液体培养基中活化，然后把活化后菌体浓度为OD_600nm＝1.2的重组工程菌母液接种于另一LB液体培养基中，加入终浓度为0.8mM的IPTG，37℃培养10h，离心去上清，破碎，得到粗酶液，纯化，得到乙酰木聚糖酯酶。