CN111239238B - 一种组织样品快速质谱成像方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种组织样品快速质谱成像方法。该方法包括S1.制备纳米印迹基材；S2.样品压印：将样品压印在所述纳米印迹基材上，使得在纳米印迹基材上获得组织样品印迹；S3.质谱成像：采用光源对组织样品印迹进行照射，并通过质量分析器进行检测，获得具有组织样品印迹表面所有化学信息的二维质谱成像图。本发明通过纳米印迹基材代替传统的印迹基材，其无需在压印后再喷涂基质，可保证成像结果真实可靠，避免了假阳性结果；所述纳米印迹基材的制备方法简单，并且可以实现原位压印和离子信号增强的效果；相对于传统压印PTFE材料，本发明所述纳米印迹基材具有广泛的普适性和应用前景，可“百搭”于市面上商品化的基于激光解吸/电离的质谱仪。

Description

一种组织样品快速质谱成像方法
技术领域
本发明涉及质谱成像领域，特别涉及一种组织样品快速质谱成像方法。
背景技术
千百年来，农业对人类社会和自然环境产生了深远的影响，而日益增长的农药使用量对生活环境、人类健康、蜜蜂存活等造成的负面影响已引起全世界的关注(Larsen,A.E.,Gaines,S.D.&Deschênes,O.Nat.Commun.2017,8,302；Woodcock,B.A.et al.Science2017,356,1393-1395；Tsvetkov,N.et al.Science 2017,356,1395-1397)。因此，深入了解农药的吸收、分布、代谢和***(absorption,distribution,metabolism andelimination，ADME)对减少农药用量和提高农药效率至关重要。由于缺少成像技术对农药分子在植物组织内的输导分布进行可视化观测，不同植物组织对农药的吸收和长距离运输的研究一直都是研究的难点，同时也阻碍了科学家们对植物自然装载和转运通道的深入理解(Clark,R.D.Pest Manag.Sci.2018,74,1992-2003；David,M.D.Pest Manag.Sci.2017,73,692-699)。因此，开发一种可快速跟踪农药分子的输导轨迹和解析农药的输导机制的可视化成像技术是目前研究的重心。
目前对植物组织内源物及农药分析主要是采用色谱、荧光光谱、同位素标记和质谱成像等方法。传统的色谱分析方法是通过对大量植物组织进行萃取并测定平均值，从而丢失农药和内源物的时空分布信息(Wu,H.et al.J.Agric.Food.Chem.2012,60,6088-6094)。而荧光光谱法和同位素标记成像技术，可用于监测农药分子在植物组织中的分布，但荧光标签的引入可能使得待测分子的分布发生改变从而影响结果的准确性(Li,D.,Li,Z.,Chen,W.&Yang,X.J.Agric.Food.Chem.2017,65,4209-4215)；同位素标记成像技术常常需要繁琐、耗时的样品预处理过程(Wang,J.et al.J.Agric.Food.Chem.2014,62,8791-8798)。作为一种无标记和非特异性检测的方法，质谱成像(MSI)已被证明是一种高灵敏度、普适性广的分析工具，可以提供植物组织内农药分子和内源物的可视化分布信息。
样品制备方法是植物或动物组织质谱成像分析的核心问题(Dong,Y.etal.Front.Plant Sci.2016,7,60)。目前，组织切片方法已被广泛用于植物的根、茎等组织的样品处理，但由于植物叶片具有蜡质层的保护、且叶片和花瓣厚度较薄，无法通过组织切片的方法来制备样品，因此针对植物花瓣和叶片的质谱成像分析发展缓慢(Bhandari,D.R.et al.Analyst 2015,140,7696-7709；Li,B.,Bhandari,D.R.,Janfelt,C.,
Figure BDA0002379406760000021
A.&Spengler,B.Plant J.2014,80,161-171)。虽然可以使用解吸电喷雾电离源(Desorption electrospray ionization，DESI)可以直接检测叶子/花瓣的农药和内源物分子，但样品表面的起伏和蜡质层保护常常出现“假阳性”的成像结果。为此，C.Janfelt课题组和T.Pradeep课题组分别提出了基于多孔聚四氟乙烯(PTFE)和薄层色谱(TLC)材料的印迹成像策略(Thunig,J.,Hansen,S.H.&Janfelt,Anal.Chem.2011,83,3256-3259；Hemalatha,R.G.&Pradeep,T.J.Agric.Food.Chem.2013,61,7477-7487)。基于激光采样技术的MSI方法因其普适性和可靠性而被广泛使用，但由于PTFE和TLC材料对激光的低吸光性和表面电荷积累效应所造成的成像假象不容忽视。
印迹成像材料除了要保留组织样品的轮廓、内源物分布之外，还要求其可以高灵敏度地检测内源物分子。上述基于PTFE和TLC的印迹材料也可在压印后再喷涂基质分子来提高电离效率，但基质分子的引入常常导致谱图在低质量数存在大量的干扰峰，同时基质的不均匀沉积亦会造成假阳性的成像结果。最近，具有纳米结构的材料也可用于提高待测分子的电离效率，但由于这类材料印迹后无法重复使用且价格昂贵，因此在质谱成像(植物/动物组织成像)中应用极少。上述的缺点都限制了现有方法无法原位、快速、高灵敏地获得植物/动物组织样品印迹和质谱成像信息。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种组织样品快速质谱成像方法。该方法无需在印迹材料上再喷涂基质分子，因此效率更高，还避免了基质不均匀沉积导致的假阳性结果。
本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：
一种组织样品快速质谱成像方法，包括以下步骤：
S1.制备纳米印迹基材：将具有吸附液相能力的材料浸泡在纳米粒子分散相中以获得所述纳米印迹基材；
S2.样品压印：将样品压印在所述纳米印迹基材上，使得在纳米印迹基材上获得组织样品印迹，所述组织样品印迹至少包括样品轮廓、样品内源物质分布的化学信息；
S3.质谱成像：采用光源对组织样品印迹进行照射，并通过质量分析器进行检测，获得具有组织样品印迹表面所有化学信息的二维质谱成像图。
本发明通过S1.的方法制备的纳米印迹基材替换传统的印迹基材，其含有的纳米粒子均匀地嵌入印迹基材的微孔结构中，纳米粒子起到了信号增强的效果，保证成像结果真实可靠，并且无需再在印迹基材的表面喷涂基质分子来辅助提高离子信号，克服了传统基质喷涂均匀性差，从而造成成像假象的弊端。
所述纳米粒子可采用任何具有增强质谱信号作用的金属和/或非金属纳米粒子，优选地，步骤S1.中，所述纳米粒子优选为Au、Ag、Cu、C、Ge或Si中的任意一种。最优选地，步骤S1.中，所述纳米粒子最优选为Au。纳米粒子的制备方法可以采用本领域技术人员所熟知的任意一种已有方法制备。最常见的纳米粒子分散相为纳米粒子的悬浮液。作为悬浮液的液相，最常见的就是水。
纳米粒子的形貌可以为任意形貌或多种形貌的组合，常见的纳米粒子的形貌为球状、棒状、星形状、纳米线状、纳米孔或纳米壁。本发明所述纳米粒子的形貌可以是上述中的任意一种或者几种的组合。
优选地，步骤S1.中，所述纳米粒子分散相中纳米粒子的直径优选为1～200nm。
更优选地，步骤S1.中，所述纳米粒子分散相中纳米粒子的平均粒径优选在20～30nm。
优选地，步骤S1.中，所述纳米粒子优选在波长为125～1064nm之间的光源有较大的吸收波长。
优选地，步骤S1.中，所述具有吸附液相能力的材料最常见易得的，就是纸。所述纸可以为普通纸、滤纸或宣纸，可以是单面或两面均具有吸附液相能力。作为一种容易实现的方式，所述具有吸附液相能力的材料更优选为滤纸，所述滤纸可以是定性或定量滤纸。进一步地，所述具有吸附液相能力的材料最优选为定量慢速滤纸。优选地，步骤S1.中，所述纳米粒子分散相的浓度优选为0.01～10g/L，浸泡时间优选为5～360min。更优选地，步骤S1.中，所述纳米粒子分散相的浓度更优选为0.1～1g/L，浸泡时间更优选为5～30min。
最优选地，步骤S1.中，所述纳米粒子分散相的浓度最优选为0.2g/L，所述浸泡时间最优选为20min。控制在此条件下，既能使待测分子浓度信号较强，且干扰峰信号强度较低。
作为一种具体的制备方法，所述纳米印迹基材可以按照如下方法制备：制备Au纳米粒子浓度为0.2g/L的悬浮液，将纸放入其中进行浸泡20min，然后取出纸张，常温干燥，即得所述纳米印迹基材。
步骤S2.中，所述样品可为微生物组织、植物组织(如叶片、球茎、花瓣等)、动物组织(脑、肌肉、肾脏等)等或固体表面的液体残渣、沉积物、胶体、离子液体等。
本发明所述质谱成像方法的原理，与常规的质谱成像方法类似，在制备了组织样品印迹后，随后光源发出的光束(包括激光或者其他光源所产生的光束)照射在组织样品印迹表面，由于光束与纳米粒子存在耦合增强效应，可提高解吸及电离效率，因此在较低光束能量下便可产生离子。当纳米粒子增强后的光束功率密度大于或等于样品的解吸(或原子化)阈值时，照射范围内的样品分子(或原子)则会由于受到输出光源所提供的能量而产生解吸(或原子化)和电离以产生离子。离子经传输进入质量分析器被分离并检测，获得样品采样点处的含有分子及原子信息的质谱图。
优选地，步骤S3.中，所述质量分析器为磁场分析器、四级杆分析器、离子阱分析器(包括线性离子阱、轨道离子阱、矩形离子阱等)、飞行时间分析器、傅里叶变换分析器。
优选地，步骤S3.中，所述质谱成像通过逐点扫描的方式获得具有组织样品印迹表面所有化学信息的二维质谱成像图。通过逐点扫描的方式就能更好地记录下样品表面微区的化学信息(分子或元素信息)。通过这种方式可获得的空间分辨率可达微米甚至是纳米尺度，并且同时可以实现分子及元素薄层的深度分析。
为了更好地进行逐点扫描，可以将组织样品印迹置于XY二维移动平台上。所述XY二维移动平台可为采用任意驱动方式的平台(手动式、电机驱动式、压电陶瓷式、压电马达式等)，控制***可采用无反馈或任意反馈形式(直读法、光栅尺、容栅尺等)进行位置控制。
另外，本发明所述质谱成像方法所处的环境可以是高气压、常压、低真空或高真空，可以有其他气体(如空气、氮气、氩气、氦气、氢气或者以上气体的混合气等)作为辅助气体，气压范围为1×10-7～1×108Pa。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过纳米印迹基材代替传统的印迹基材，其无需在压印后再喷涂基质，可保证成像结果真实可靠，避免了假阳性结果；所述纳米印迹基材的制备方法简单，并且可以实现原位压印和离子信号增强的效果；相对于传统压印PTFE材料，本发明所述纳米印迹基材具有广泛的普适性和应用前景，可“百搭”于市面上商品化的基于激光解吸/电离的质谱仪。
附图说明
图1为实现本发明所述质谱成像方法的设备示意图，各标记为：1-纳米印迹基材、2-组织样品印迹、3-光源、4-离子、5-质量分析器、6-XY二维移动平台；
图2为实施例制备的纳米分散相中，金纳米粒子的粒径分布情况；
图3为纳米印迹基材(滤纸)在纳米溶液中浸泡不同时间后用于分子信号增强的质谱图比较；
图4为纳米粒子在浸泡后滤纸上的均匀性考察，a)未浸泡前的纳米印迹基材(滤纸)表面电镜图；b)浸泡纳米粒子分散相后的纳米印迹基材(滤纸)表面电镜图；
图5为不同种类滤纸在相同条件下对分子信号增强的质谱图比较；
图6为叶片在纳米印迹基材上压印后的质谱成像结果，a)叶片光学图；b)叶片在纳米纸上的印迹光学图；c)叶片内源物的质谱成像图；
图7为黄瓜花瓣在纳米印迹基材纸上压印后的质谱成像结果，a)花瓣光学图；b)压印在纳米纸后的印记图；c-d)花瓣内源物的质谱成像图；
图8为香蕉球茎在纳米印迹基材纸上压印后的质谱成像结果，a)香蕉球茎剖面光学图；b)压印在纳米纸后的印记图；c-f)香蕉球茎多种内源物的质谱成像图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅为说明的目的而提供，并不意味着对本发明的限制。下面实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，涉及的仪器均为市售产品。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
本发明的质谱成像方法所使用的装置可以参考图1。
在制备了纳米印迹基材后，将植物组织，例如叶片(图6)压印在纳米印迹基材上，获得包括轮廓和内源物分布信息在内的组织样品印迹，随后光束3(包括激光或者其他光源所产生的光束)照射在纳米印迹基材上组织样品印迹表面的一个微区，产生离子4，实现微区采样分析。离子经传输进入质量分析器5被分离并检测，获得所测组织组织样品印迹2采样点处所含有的分子及原子信息的质谱图。随后通过XY二维移动平台6逐点扫描的方式就能原位地记录下组织组织样品印迹2表面微区的所有化学信息(分子或元素信息)，获得其表面所有化学信息的XY二维质谱成像图。通过这种方式可获得的空间分辨率可达微米甚至是纳米尺度，同时可以实现分子及元素薄层的深度分析。
实施例中，所述纳米印迹基材的制备方法具体为：
将滤纸浸泡在纳米粒子分散相中5～360min，取出并在室温下进行干燥，获得所述纳米纸。
所述纳米粒子分散相的制备方法为：制备体积浓度为0.01％的HAuCl4水溶液，然后加热至沸腾并在高速搅拌下快速加入2mL的1％质量浓度的柠檬酸钠溶液，搅拌10分钟后，冷却至室温，备用。图2为本具体实施方式中制备的纳米粒子分散相中，金纳米粒子的粒径分布情况。
图3反映，在氯虫苯甲酰胺农药样品中，滤纸在纳米粒子分散相中不同的浸泡时间，对信号峰的影响。在5min浸泡时间下，农药信号并不十分明显，如分子离子峰([M+Na]+)，农药碎片峰([M-C9H9N2OCl]+)也较弱，随着时间增加，农药分子信号逐渐增大。但当浸泡时间大于20min，谱图中会出现较明显的杂质干扰峰，谱图背景增加。综合考虑，浸泡时间在20min为最优浸泡时间。
图5反映，在氯虫苯甲酰胺农药样品中，选择不同的滤纸(图中1为定性快速滤纸，2为定性中速滤纸，3为定性慢速滤纸，4为定量快速滤纸，5为定量中速滤纸，6为定量慢速滤纸)对信号的影响。结果表明，使用定量慢速滤纸(图5中的6)作为纳米纸材料信号增强最好，可从[M+Na]+和[M-C9H9N2OCl]+质谱信号强度反映。这可能因为慢速滤纸内部孔隙更小，因此可以更好地嵌入金纳米粒子，从而提高增强效果。相比于定性滤纸，定量滤纸中所含的杂质干扰更少。
图6反映，叶片在纳米印迹基材纸上压印后的质谱成像结果。图中分别可以看出叶片轮廓甚至叶脉纹路都可以完整地印记到纳米纸上，并可获得相应内源物和农药分子的时空分布信息。
图7反映，黄瓜花瓣在纳米印迹基材纸上压印后的质谱成像结果。图中分别可以看出花瓣轮廓可以完整地印记到纳米纸上，并获得相应内源物的质谱成像图，对于上述叶片、花瓣这类无法切片进行质谱的样品体系来说，本实施例展示了该方法用于叶片和花瓣等组织样品质谱成像分析的广阔应用前景。
图8反映，香蕉球茎在纳米印迹基材纸上压印后的质谱成像结果。图中分别可以看出除了叶片和花瓣外，该方法还可以用于香蕉球茎的印记和成像分析，使其覆盖了茎、叶、花瓣等植物组织分析的范畴，证明了该方法的广谱性和普适性。结合质谱成像技术的优势，该方法可以提供在单次分析中同时提供多组分信息，大大缩短了样品制备和分析时间，对现有分析方法是个重要的补充。
上述实施例只是本发明的实施方式之一，其他任何未背离本构思的前提和原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种组织样品快速质谱成像方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.制备纳米印迹基材：将具有吸附液相能力的材料浸泡在纳米粒子分散相中以获得所述纳米印迹基材；
S2.样品压印：将组织样品压印在所述纳米印迹基材上，使得在纳米印迹基材上获得组织样品印迹，所述组织样品印迹至少包括样品轮廓、样品内源物质分布的化学信息；
S3.质谱成像：采用光源对组织样品印迹进行照射，并通过质量分析器进行检测，获得具有组织样品印迹表面所有化学信息的二维质谱成像图；
S1.中，所述纳米粒子为具有增强质谱信号作用的金属纳米粒子；
步骤S1.中，所述纳米粒子分散相的浓度为0.01～10g/L，浸泡时间为5～360min；
所述纳米粒子分散相中纳米粒子的直径分布为1～200nm。
2.根据权利要求1所述组织样品快速质谱成像方法，其特征在于，步骤S1.中，所述纳米粒子为Au、Ag或Cu任意一种。
3.根据权利要求1所述组织样品快速质谱成像方法，其特征在于，步骤S1.中，所述纳米粒子分散相的浓度为0.2g/L，所述浸泡时间为20min。
4.根据权利要求1所述组织样品快速质谱成像方法，其特征在于，步骤S1.中，所述具有吸附液相能力的材料为纸。
5.根据权利要求1所述组织样品快速质谱成像方法，其特征在于，步骤S1.中，所述纳米粒子的形貌为球状、棒状、星形状、纳米线状、纳米孔和/或纳米壁。
6.根据权利要求1所述组织样品快速质谱成像方法，其特征在于，步骤S1.中，所述纳米粒子在波长为125～1064nm之间的光源有吸收。
7.根据权利要求1所述组织样品快速质谱成像方法，其特征在于，步骤S3.中，所述质量分析器为磁场分析器、四级杆分析器、离子阱分析器、飞行时间分析器、傅里叶变换分析器。
8.根据权利要求1所述组织样品快速质谱成像方法，其特征在于，步骤S3.中，所述质谱成像通过逐点扫描的方式获得具有组织样品印迹表面所有化学信息的二维质谱成像图。
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