CN111235124A - 珠子参糖基转移酶UGTPjm2及其在制备竹节参皂苷IVa上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种珠子参糖基转移酶UGTPjm2及其在制备竹节参皂苷IVa上的应用。该珠子参糖基转移酶UGTPjm2具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明的珠子参糖基转移酶UGTPjm2能够在植物体外催化齐墩果酸‑3‑O‑β‑葡萄糖醛酸苷的C‑28位的羧基糖基化，进而生成竹节参皂苷IVa。为竹节参皂苷IVa的人工生产提供了重要的途径。

Description

珠子参糖基转移酶UGTPjm2及其在制备竹节参皂苷IVa上的 应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种珠子参糖基转移酶UGTPjm2及其在制备竹节参皂苷IVa上的应用。

背景技术

在人参属植物中，根据所含人参皂苷类型，可将人参属植物分为两大类，一类以达玛烷型皂苷含量为主，如人参(Panax.ginseng)、三七(P.notoginseng)、西洋参(P.quinquefolius)等，另一类则以齐墩果烷型皂苷为主，如珠子参(P.japonicusvar.major)、竹节参(P.japonicus)、狭叶竹节参(P.japonicus var.angustifolius)、姜状三七(P.zingiberensis)、屏边三七(P.stipuleanatus)、疙瘩七(P.japonicusvar.bipinnatifidus)等。竹节参皂苷IVa属齐墩果烷型皂苷，是珠子参、姜状三七、竹节参等人参属植物中含量最高的成分之一。在《中华人民共和国药典》2015版一部中已经明确说明，竹节参皂苷IVa是珠子参的主要活性成分。具有补肺养阴，袪瘀止痛，止血等功效。

竹节参皂苷IVa在植物中的含量低，对其提取则需要大量的原材料，且提取工艺较为复杂；此外，原材料种植周期长，对种植地块和种植技术要求较高。因此，如何去高效地获得这些有用的次生代谢物，一直都是科研究人员思考和研究的问题。

对于高附加值的天然产物，采用现代生物技术建立同源或异源表达***高效生产药用活性成分，已被广泛认为是解决今后药用资源短缺的重要技术手段。但是，建立同源或异源表达***需要先明确这些活性成分的生物合成途径，必需鉴定该生物合成途径中相关的关键基因。目前，发掘这些调控基因成为研究植物代谢产物生物合成途径的关键环节。当前，竹节参皂苷IVa的合成路径并不清晰，尚未得到验证，因此影响了竹节参皂苷IVa生物合成工作的推进。

发明内容

本申请的发明目的是提供一种珠子参糖基转移酶UGTPjm2及其在制备竹节参皂苷IVa上的应用，该珠子参糖基转移酶UGTPjm2能够在植物体外催化齐墩果酸-3-O-β-葡萄糖醛酸苷的C-28位的羧基糖基化，进而生成竹节参皂苷IVa。

为实现上述发明目的，本申请的技术方案如下：

本发明的珠子参糖基转移酶UGTPjm2具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

本发明的珠子参糖基转移酶UGTPjm2能够在植物体外催化齐墩果酸-3-O-β-葡萄糖醛酸苷的C-28位的羧基糖基化，进而生成竹节参皂苷IVa。为竹节参皂苷IVa的人工生产提供了重要的途径。

本发明还提供了上述的珠子参糖基转移酶UGTPjm2的编码基因，该编码基因具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

本发明还提供了上述珠子参糖基转移酶UGTPjm2的编码基因的重组载体。该重组载体可以是重组质粒，该重组质粒的原始质粒可以选用pET28a质粒。

本发明还提供了表达上述的珠子参糖基转移酶UGTPjm2的转基因工程菌，该转基因工程菌中，珠子参糖基转移酶UGTPjm2的编码基因可以是以重组质粒存在的，也可以直接整合至其基因组中。

即，所述的转基因工程菌可以包含有上述的含有珠子参糖基转移酶UGTPjm2的编码基因的重组载体；也可以在其基因组中整合有上述的珠子参糖基转移酶UGTPjm2的编码基因。

所述的转基因工程菌的原始菌株可以选用大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

本发明还提供了所述的珠子参糖基转移酶UGTPjm2在制备竹节参皂苷IVa上的应用，该应用包括：以齐墩果酸-3-O-β-葡萄糖醛酸苷和糖基供体UDP-葡萄糖为原料，以所述的珠子参糖基转移酶UGTPjm2为催化剂，在30-40℃下反应，获得竹节参皂苷IVa。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

本发明的珠子参糖基转移酶UGTPjm2能够在植物体外催化齐墩果酸-3-O-β-葡萄糖醛酸苷的C-28位的羧基糖基化，进而生成竹节参皂苷IVa。为竹节参皂苷IVa的人工生产提供了重要的途径。

附图说明

图1为本发明的珠子参糖基转移酶UGTPjm2催化齐墩果酸-3-O-β-葡萄糖醛酸苷生成竹节参皂苷IVa的合成路径示意图；

其中，oleanolic acid 3-O-β-glucuronide表示齐墩果酸-3-O-β-葡萄糖醛酸苷，Chikusetsusaponin-IVa表示竹节参皂苷IVa；下同；虚线圆圈处代表葡萄糖苷的连接位点。

图2为重组表达质粒pET28a-UGTPjm2的结构示意图；

图3为重组表达质粒pET28a-UGTPjm2中UGTPjm2基因片段的电泳检测结果图；

图4为工程菌表达的本发明的珠子参糖基转移酶UGTPjm2的SDS-PAGE蛋白电泳图；

其中，M表示蛋白质分子质量标准，1为诱导破碎后的上清，2为对照；黑色三角形箭头为目的蛋白珠子参糖基转移酶UGTPjm2；

图5为采用HPLC对本发明珠子参糖基转移酶UGTPjm2的酶活反应进行检测的结果图；

其中，rentention time(min)表示保留时间(分钟)；下同；

图6为采用HPLC对对照组pET28a的酶活反应进行检测的结果图；

图7为标准品竹节参皂苷IVa的HPLC检测结果图；

图8为LC-MS检测中标准品竹节参皂苷IVa的出峰时间；

其中，response vs.acquisition time(min)表示响应捕获时间(分钟)，下同；standard product表示标准品；

图9为LC-MS检测中标准品竹节参皂苷Iva的特征峰离子图；

图10为LC-MS检测中采用本发明珠子参糖基转移酶UGTPjm2催化制备的竹节参皂苷Iva的出峰时间；

其中，response vs.acquisition time(min)表示响应捕获时间(分钟)，product表示反应产物；

图11为LC-MS检测中采用本发明珠子参糖基转移酶UGTPjm2催化制备的竹节参皂苷Iva的特征峰离子图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。

实施例1珠子参糖基转移酶UGTPjm2的制备

以王不留行(Saponaria vaccaria)中鉴定的糖基转移酶UGT74M1，蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中鉴定的糖基转移酶UGT73F3，以及积雪草(Centellaasiatica(L.)Urban)中鉴定的糖基转移酶UGT73AH1为线索，将珠子参中含有的59种糖基转移酶(长度大于900bp)与上述3个糖基转移酶的氨基酸序列进行***发育树分析，***发育树构建使用MEGA 6软件。

在构建好的***进化树基础上，结合竹节参皂苷IVa含量特点、基因表达量进行综合分析，初步筛选出可能涉及竹节参皂苷IVa生物合成的候选基因。之后进行cDNA的制备、候选基因的扩增及回收、同源重组、蛋白表达、体外酶活反应，以及HPLC及LC/MS检测等一系列工作后，最终鉴定出目标候选基因UGTPjm2，该基因表达的糖基转移酶UGTPjm2可以催化齐墩果酸-3-O-β-葡萄糖醛酸苷的C-28位羧基并生成竹节参皂苷IVa(如图1所示)。

目标候选基因UGTPjm2的获取、糖基转移酶UGTPjm2的制备及竹节参皂苷IVa的制备过程如下：

(1)cDNA模板的制备

取珠子参膨大茎的鲜样，切片后液氮速冻，进行RNA提取。RNA提取采用Magen(广州美基生物科技有限公司)的HiPure Plant RNA Mini Kit试剂盒。按试剂盒的操作步骤提取RNA，经检测合格后，使用TAKARA反转录试剂盒，将RNA反转录成cDNA，-20℃保存备用。

(2)基因扩增及回收

利用引物设计软件(CE Design)v1.04，设计用于扩增基因UGTPjm2的带同源臂的引物(以便后续将该基因与大肠杆菌PET28a进行同源重组)，之后采用KOD高保真酶进行基因扩增。

基因UGTPjm2的扩增引物如下所示：

F：tggtgccgcgcggcagccatATGGAGAATGAGAAAACTTATAAAGCTC(SEQ ID No.3)；

R：gtggtggtggtggtgctcgaTTAGAGTGCCAGAATCCGAGAAA(SEQ ID No.4)。

引物中，小写字母所示的引物片段即为同源臂。当不需要同源重组时，可以仅采用大写字母所示的引物片段对UGTPjm2基因进行扩增。

PCR反应总体系为50μL，包括：10×Buffer 5μL，dNTPs 5μL，MgSO₄ 3μL，KOD plusNEO 1μL，引物F1.5μL，引物R1.5μL，cDNA 1μL，RNAfree ddH₂O32μL。

PCR反应程序为：94℃、5min；94℃、30S，62℃、50S，72℃、1min，35个循环；72℃、7min。

PCR结束后，跑胶，确认扩增成功后进行目的条带回收。基因切胶回收使用北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒进行目的基因回收。回收后在NanoReady超微量紫外可见分光光度计上测定其回收浓度，最后放-20℃冰箱中保存备用。

(3)基因重组载体的构建与鉴定

重组质粒的示意图如图2所示。

同源重组时，首先需对载体pET28a进行线性化，同源重组时则按照同源重组酶的操作说明进行组装，然后根据***片段和载体的浓度，并按照重组说明计算各组分用量；最后在冰上将各组分加入到PCR反应管中。组装后对结果检测并送公司测序，组装后的电泳检测结果见图3，表明组装成功。

(4)蛋白表达

经蛋白表达小试后确定基因UGTPjm2的蛋白诱导条件为：17℃、0.1mM的IPTG、220r/min，诱导12h；然后进行大摇，并收菌、破壁，经高速离心后获得蛋白上清，而后采用SDS-PAGE蛋白电泳检测。

检测结果见图4，表明获得了目标蛋白。

(5)酶活反应

酶活反应在1.5mL离心管中进行，并按表1中组分进行准备。

表1 UGT酶活反应体系的组分配比

按表中的顺序依次加入各组分，混匀后短暂离心收集反应液至离心管管底。将离心管放至干式恒温金属浴中，35℃下反应12h。结束后用100μL正丁醇终止反应，并充分混匀，使正丁醇充分萃取反应产物；之后短暂离心，取上清；在60℃烘箱中烘干，再用甲醇充分溶解残留物；以便进行后续的产物检测。

(6)产物检测

HPLC检测条件如下：

HPLC检测所用仪器为安捷伦1290超高效液相色谱仪，液相色谱柱为AgilentZORBAX SB-C18柱子(250mm×4.6mm，5.0μm)，流动相为：0.2％磷酸溶液(A)和乙腈(B)。

梯度洗脱程序如下：0～22min，95％A～35％A；22～24min，35％A～30％A；24～28min 30％A；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样量10μL；吸收波长为203nm。检测结果见图5、图6和图7，表明有竹节参皂苷IVa的产生。

LC-MS检测条件如下：

采用Agilent 1290UPLC/6540Q-Tof液相色谱质谱联用仪(LC/MS)进行检测，质谱条件：离子源采用的是负离子模式，电压3500V；碎裂电压:135V；锥孔电压:60V；射频电压:750V，扫描范围：100-1000m/z。色谱条件：使用的柱子是Agilent ZORBAX SB-C18柱子(250mm×4.6mm，5.0μm)，流速1mL/min。流动相是0.1％甲酸(A)和乙腈(B)，梯度是0min，A：B＝95：5；22min，A：B＝35：65；24min，A：B＝30：70；28min，A：B＝30：70。检测结果见图8、图9、图10和图11。

从检测结果中可以看出，反应产物出峰时间(图10)和特征峰(图11)与标准品竹节参皂苷IVa出峰时间(图8)和特征峰(图9)的结果相吻合，进一步确认生成的产物为竹节参皂苷IVa。

序列表

<110> 云南农业大学

<120> 珠子参糖基转移酶UGTPjm2及其在制备竹节参皂苷IVa上的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 452

<212> PRT

<213> 珠子参(Panax japonicus)

<400> 1

Met Glu Asn Glu Lys Thr Tyr Lys Ala His Ile Met Val Leu Ala Tyr

1 5 10 15

His Gly Gln Gly His Ile Asn Pro Met Val Gln Phe Ser Lys Arg Leu

20 25 30

Ala Ser Lys Gly Met Lys Ile Thr Val Thr Thr Thr Leu Ser Asn Ile

35 40 45

Lys Ala Met Lys Lys Ala Ser Ser Ser Ser Val Ile Phe Glu Ser Val

50 55 60

Tyr Asp Asp Ala Thr Glu Gly Gly Val Gly Ala Pro Gly Gly Phe Gln

65 70 75 80

Gly Phe Leu Asp Arg Phe Glu Ala Ser Gly Ser Thr Asn Leu Ala Gln

85 90 95

Leu Ile Lys Lys Gln Glu Asn Ser Gly Tyr Pro Ile Lys Cys Leu Val

100 105 110

Tyr Asp Ala Asn Ile His Trp Ala Ser Asn Ile Ala Lys Gln Phe Ala

115 120 125

Ile Pro Gly Ala Ala Phe Phe Thr Gln Ser Cys Ala Ala Ile Ala Ser

130 135 140

Tyr Tyr Pro Met His Cys Asp Leu Ser Asp Lys Ser Leu Pro Phe Pro

145 150 155 160

Ala Phe Ser Met Pro Gly Leu Pro Pro Pro Lys Leu Pro Tyr Leu Pro

165 170 175

Ser Leu Gly Ala Val Thr Gly Gln Tyr Ser Pro Ile Ile Arg Phe Ile

180 185 190

Cys Lys Gln Phe Asp Asn Ile Glu Asn Ala Glu Trp Val Leu Phe Asn

195 200 205

Ser Phe Asp Lys Leu Glu Glu Glu Val Val Lys Trp Met Ser Asn Leu

210 215 220

Trp Thr Val Arg Asn Ile Gly Pro Thr Val Pro Ser Val Tyr Leu Asp

225 230 235 240

Asn Arg Val Glu Asn Asp Asp Asp Tyr Gly Phe Asn Leu Phe Lys Pro

245 250 255

Ser Thr Glu Val Cys Met Gln Trp Leu Asn Thr Lys Glu Thr Gly Ser

260 265 270

Val Val Tyr Val Ser Phe Gly Ser Ala Ala Ser Leu Ser Ala Glu Gln

275 280 285

Met Ala Glu Met Ala Glu Ala Leu Lys Gln Ser Arg His Ser Phe Leu

290 295 300

Trp Leu Val Lys Pro Thr Glu Ile Lys Leu Pro Thr Asn Phe Val Glu

305 310 315 320

Glu Thr Ser Glu Lys Gly Leu Val Val Ala Trp Cys Pro Gln Leu Glu

325 330 335

Val Leu Ala His His Ala Val Gly Cys Phe Ile Ser His Cys Gly Trp

340 345 350

Asn Ser Thr Val Glu Ala Ile Ser Phe Gly Val Pro Val Val Ala Met

355 360 365

Pro Gln Phe Leu Asp Gln Met Thr Asn Ala Tyr Phe Val Glu Lys Val

370 375 380

Trp Gly Ile Gly Ile Gln Pro Lys Glu Ser Glu Glu Asn Val Thr Ser

385 390 395 400

Ala Glu Glu Ile Gly Arg Cys Ile Asn Gly Val Met Asn Gly Lys Glu

405 410 415

Ile Lys Lys Lys Ala Lys Gln Trp Lys Glu Leu Ala Lys Glu Ala Ile

420 425 430

Asp Glu Asn Gly Ser Ser Asp Lys Ser Ile Asp Glu Ile Ile Ser Arg

435 440 445

Ile Leu Ala Leu

450

<210> 4

<211> 1359

<212> DNA

<213> 珠子参(Panax japonicus)

<400> 4

atggagaatg agaaaactta taaagctcat atcatggtgc tagcatatca tgggcaaggt 60

cacataaatc cgatggtcca attttctaaa cgtcttgctt ctaaaggaat gaaaatcacc 120

gtaaccacca cactctccaa tatcaaggcc atgaaaaagg catcttctag ttcagttata 180

tttgaatccg tatatgatga cgccactgaa ggtggagtgg gagcacctgg aggatttcag 240

ggatttcttg acaggtttga agctagcggc tcaacaaact tagctcaact catcaagaaa 300

caagaaaact ctggataccc tattaagtgc ctcgtttatg atgctaacat acattgggct 360

tcaaatatag ccaagcagtt tgccattccc ggggctgctt tttttacgca atcatgtgct 420

gctattgcta gctactaccc aatgcattgt gatttatcag acaagtctct gccattccct 480

gctttttcca tgcctggatt gccaccgcct aagcttccat atctgccatc acttggtgct 540

gttacaggac agtactcccc aataatccgt ttcatatgca agcaattcga caatatagag 600

aatgcagagt gggtcctttt caactccttt gataaattag aagaagaggt ggtgaagtgg 660

atgtcaaatc tgtggacagt gaggaatatt ggaccgactg tgccatctgt gtacctggac 720

aatcgagtgg aaaatgacga tgattacggt ttcaatcttt ttaagccaag cactgaggtt 780

tgcatgcagt ggctcaacac aaaagagact gggtcagttg tgtacgtatc gtttggtagt 840

gctgctagtt tgagtgcaga acagatggca gaaatggccg aggccctaaa acaaagcaga 900

cacagtttct tatggttggt gaaaccaacc gagatcaagc tcccaactaa ttttgttgag 960

gagacatcag aaaagggact ggtagtggct tggtgcccac agttggaggt gttagcccat 1020

catgcagtgg gttgcttcat atcgcactgc ggatggaatt ctactgtaga ggcaataagc 1080

tttggggtgc ctgtagtggc aatgccacag tttctagacc aaatgacaaa tgcttatttt 1140

gtggaaaaag tttggggaat tggaatccaa ccaaaggaaa gcgaagaaaa tgttacaagt 1200

gctgaagaga ttgggagatg catcaatggg gtcatgaatg gaaaggagat taaaaagaaa 1260

gctaagcagt ggaaggagtt ggctaaggag gcaatagatg aaaatggaag ttcagataag 1320

tctattgatg aaattatttc tcggattctg gcactctaa 1359

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成序列(unkown)

<400> 3

tggtgccgcg cggcagccat atggagaatg agaaaactta taaagctc 48

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成序列(unkown)

<400> 4

tggtgccgcg cggcagccat atggagaatg agaaaactta taaagctc 48

Claims (9)

1.珠子参糖基转移酶UGTPjm2，其特征在于，具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的珠子参糖基转移酶UGTPjm2的编码基因，其特征在于，具有SEQID No.2所示的核苷酸序列。

3.含有如权利要求2所述珠子参糖基转移酶UGTPjm2的编码基因的重组载体。

4.表达如权利要求1所述的珠子参糖基转移酶UGTPjm2的转基因工程菌。

5.如权利要求4所述的表达珠子参糖基转移酶UGTPjm2的转基因工程菌，其特征在于，包含有如权利要求3所述的含有珠子参糖基转移酶UGTPjm2的编码基因的重组载体。

6.如权利要求4所述的表达珠子参糖基转移酶UGTPjm2的转基因工程菌，其特征在于，基因组中整合有如权利要求2所述的珠子参糖基转移酶UGTPjm2的编码基因。

7.如权利要求1所述的珠子参糖基转移酶UGTPjm2在制备竹节参皂苷IVa上的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，包括：以齐墩果酸-3-O-β-葡萄糖醛酸苷和糖基供体UDP-葡萄糖为原料，以所述的珠子参糖基转移酶UGTPjm2为催化剂，在30-40℃下反应，获得竹节参皂苷IVa。

9.如权利要求2所述的珠子参糖基转移酶UGTPjm2的编码基因在作为珠子参辅助育种分子标记中的应用。

Images