CN111233984B

CN111233984B - 一种o型***病毒样颗粒抗原、及其疫苗组合物、制备方法和应用

Info

Publication number: CN111233984B
Application number: CN201811446135.5A
Authority: CN
Inventors: 田克恭; 张素玲; 孙进忠; 张许科
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2018-11-29
Filing date: 2018-11-29
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2038-11-29
Also published as: CN111233984A

Abstract

本发明提供了一种***病毒样颗粒抗原，该***病毒样颗粒抗原由VP0、VP1、VP3抗原蛋白组装而成，其中，该VP0抗原蛋白如Seq ID No.1或其简并序列编码，该VP1抗原蛋白如Seq ID No.3或其简并序列编码，VP3抗原蛋白如Seq ID No.2或其简并序列编码。该***病毒样颗粒抗原具有良好的免疫原性，其制备的疫苗组合物一次免疫就能对现在流行的O型Ind株进行保护，且免疫保护期长。本发明还提高了使用该***病毒样颗粒抗原制备的疫苗组合物、制备方法和疫苗的应用。

Description

一种O型***病毒样颗粒抗原、及其疫苗组合物、制备方法和应用

技术领域

本发明属于病毒性抗原及该抗原的医药配制品。具体地，本发明涉及一种O型***病毒样颗粒抗原、其制备的疫苗组合物及制备方法和应用。

背景技术

***(foot-and-mouth disease,FMD)为一种急性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疾病，是哺乳类动物中感染性最强的疾病，其中偶蹄类动物染病更会造成全球重大的经济损失。遭受***危害的动物包括牛、羊和猪。致病因子为***病毒(FMDV)，是小核糖核酸病毒属家族的一种口疮病毒。该病毒分为7个血清型(A、O、C、Asial、SAT1、SAT2和SAT3型)，其中O型***病毒流行最为广泛。疫苗免疫是控制此病、保护家畜免受危害的有效措施。但是，目前商品化的O型疫苗中没有针对O型新的Ind株流行毒株的疫苗。

然而，针对现在流行毒株的O型Ind疫苗株的自身免疫原性较弱，其制备的灭活疫苗不能诱导动物机体产生足够的免疫力。因此，如何提高该抗原的免疫原性，以针对现在的流行毒株进行预防是当务之急，也符合国家提出的有效防控重大动物疫病，保障畜牧业健康可持续发展的需要。

病毒样颗粒(VLPs)是一种在体外和/或体内表达时能够自主包装成病毒外壳结构的类病毒粒子，它们是具有病毒的相似外壳结构但不具有病毒复制能力的假病毒。VLPs疫苗能有效地激发机体产生抗感染，抗肿瘤免疫，但是没有形成稳定结构的VLPs，即不能有效发挥VLPs疫苗的免疫原性，导致疫苗免疫效果不好。目前还没有关于O型***Ind株VLPs疫苗成功的例子。

发明内容

为解决现有技术中的O型Ind株流行毒株***病毒感染无疫苗可用的问题，本发明提供了一种***病毒样颗粒抗原，其中，所述***病毒样颗粒抗原由VP0、VP1、VP3抗原蛋白组装而成，其中，所述VP0抗原蛋白如Seq ID No.1所示核苷酸序列或其简并序列编码，所述VP1抗原蛋白如Seq ID No.3所示核苷酸序列或其简并序列编码，VP3抗原蛋白如Seq ID No.2所示核苷酸序列或其简并序列编码。

所述***病毒样颗粒抗原具有良好的免疫原性，其制备的疫苗组合物仅一次免疫就能提供对现在Ind株流行***病毒的完全保护。同时所述***病毒样颗粒抗原具有良好的稳定性，在4℃下放置3个月，再通过磷钨酸负染及电镜观察仍可见病毒样颗粒依旧饱满，无聚集现象。

所述O型Ind株***病毒样颗粒抗原来源于现在的流行株，能针对现在的流行野毒株产生完全保护，弥补了现有技术中灭活疫苗不能进行免疫保护的缺陷。

本发明还提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的所述的***病毒样颗粒抗原和药学上可以接受的载体。

本发明的O型Ind株***病毒样颗粒疫苗免疫后第14日即能达到1:128以上的抗体效价，且能维持长时期高滴度抗体效价，能针对整个育肥期产生保护。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述***病毒样颗粒抗原含量为160-240μg/ml。

O型Ind株***病毒样颗粒抗原含量可选自160μg/ml、170μg/ml、180μg/ml、190μg/ml、200μg/ml、210μg/ml、220μg/ml、230μg/ml、240μg/ml。

即使当O型Ind株***病毒样颗粒抗原含量仅为160μg/ml，免疫后第14日也能达到1:128以上的抗体效价，即能产生免疫保护，且能维持长时期的高滴度的抗体效价。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述***病毒样颗粒抗原含量为200μg/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂选自：(1)白油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂***、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA206、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；优选地，所述佐剂为ISA 206佐剂。

所述佐剂含量为5％-60％V/V，优选从30％-60％V/V，更优选50％V/V。

作为本发明的一种实施方式，所述的药学上可接受的载体包括药物、免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂；所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)。

为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。

本发明还涉及一种制备所述疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)分别克隆、重组所述VP0抗原蛋白的基因、所述VP1抗原蛋白的基因和所述VP3抗原蛋白的基因到同一串联表达载体；步骤(2)转化所述步骤(1)的重组表达载体到宿主，可溶性表达VP0抗原蛋白、VP1抗原蛋白和VP3抗原蛋白，表达的VP0抗原蛋白、VP1抗原蛋白和VP3抗原蛋白自我组装为病毒样颗粒抗原；以及步骤(3)分离、纯化所述步骤(2)的病毒样颗粒抗原，加入佐剂，得到所述的疫苗组合物。

本发明通过表达O型Ind株***病毒VP0、VP3、VP1抗原蛋白，能够得到稳定的自我组装的病毒样颗粒，其免疫效果能够实现对猪只的完全保护。本发明通过串联表达O型Ind株***病毒VP0、VP3、VP1抗原蛋白，表达的活性蛋白自我组装成O型Ind株***病毒样颗粒抗原，利于后续的抗原纯化和分离。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的方法中，所述步骤(1)的串联表达载体为pET28a；所述步骤(2)的宿主为E.coli BL21(DE3)。

本发明通过选择串联表达载体和宿主菌，对VP0、VP3、VP1抗原蛋白进行串联表达，表达的可溶性蛋白具有生物活性，自我组装成为病毒样颗粒抗原，利于后续的抗原分离和纯化，简化了程序。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的方法中，所述步骤(2)中在宿主细胞扩增后，加入IPTG，诱导所述蛋白表达。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的方法中，所述步骤(3)的分离、纯化工序为破碎所述菌体后，取上清，采用硫酸铵分级沉淀法和色谱纯化所述病毒样颗粒抗原。

本发明利用大肠杆菌表达***生产***病毒样颗粒，具有产量高、生产成本低、免疫原性好、无生物安全风险等优点。本发明制备的病毒样颗粒疫苗组合物不仅能对O型Ind株***提供保护活性，并且抗体产生快，抗体产生水平高，免疫持续期长，能维持长时间的免疫保护。

本发明还涉及所述的疫苗组合物在制备预防O型***的药物中的应用。

本发明所述的制备预防和/或治疗***病毒感染的药物的施用对象包括猪。

本发明的疫苗组合物在长达133天的时间维持1:128以上的抗体效价，对猪体产生完全保护，该时长能涵盖整个育肥期。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

定义

“***病毒”属于小RNA病毒科，***病毒属，该病毒有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非***病毒1、2、3型)和Asia1(亚洲1型)7个血清型，各型之间无交叉保护反应，每个类型内又有多个亚型。在病毒的中心为一条单链的正链RNA，由大约8000个碱基组成，是感染和遗传的基础；周围包裹着蛋白质决定了病毒的抗原性、免疫性和血清学反应能力；病毒外壳为对称的20面体。***病毒是偶蹄类动物高度传染性疾病——***的病原，国际兽疫局将***列为“A类动物传染病名单”中的首位，中国把它列为“进境动物检疫一类传染病”，我国对***的防治，预防主要通过疫苗注射接种，发生***的则捕杀。

“抗原(Antigen)”是指能诱导机体发生免疫应答的物质，即能被T/B淋巴细胞表面的抗原受体(TCR/BCR)特异性识别与结合，活化T/B细胞，使之增殖分化，产生免疫应答产物(致敏淋巴细胞或抗体)，并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。

“病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)”是由一种或多种病毒结构蛋白组装成的颗粒，具有与病毒颗粒相似的外部结构和抗原性，但不含病毒基因。

“***病毒VP0、VP3、VP1抗原蛋白”：FMDV结构蛋白前体蛋白P1被蛋白酶3C催化加工成VP0、VP1和VP3，这3种蛋白质自我组装成二十面体的病毒衣壳。VP0蛋白是P1经蛋白酶3C裂解后的中间体，在病毒粒子形成的最后阶段，VP0成熟裂解为VP2和VP4。

本发明所用术语“疫苗”、“疫苗组合物”指含有***病毒样颗粒抗原的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对***的免疫反应。

术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。

术语“药学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除***病毒抗原之外的其它所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(CambridgeBiotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica PharmaceuticalsIncorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practical application of adjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,New York,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccinedesign,the Subunit and adiuvant approach》(Plenum Press,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BFGoodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂***(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括白油、铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂***、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206或Gel佐剂中的一种或几种。

“简并序列”：在分子生物学中，同一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象称为密码子的简并性(degeneracy)，这样的序列就叫简并序列。

“基因重组”：是指控制不同性状的基因重新组合。现代基因工程技术在试管内按人为的设计实施基因重组，也称为重组DNA，目的是将一个个体细胞内的遗传基因转移到另一个不同性状的个体细胞内DNA分子上，使之发生遗传变异。来自供体的目的基因被转入受体细菌后，可进行基因产物的表达，从而获得用一般方法难以获得的产品。

“转化(transformation)”是指通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。

“转导(transduction)”是指当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来、再次感染另一(受体)细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导。

术语“预防和/或治疗”在涉及***病毒感染时是指抑制***病毒的复制、抑制***病毒的传播或防止***病毒在其宿主体内定居，以及减轻***病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1 O型Ind株***病毒样颗粒的表达

1.表达载体的构建

由金唯智公司合成序列表SEQ ID NO.1所示的VP0基因片段、序列表SEQ ID NO.2所示的VP3基因片段、序列表SEQ ID NO.3所示的VP1基因片段，分别与pBLUE-T Vector载体连接，将连接成功的重组克隆分别经BamH I/EcoR I、Sac I/Sal I、Hind III/Xho I酶切消化后得到的片段，与经过相同的酶切的pET28a载体连接，得到***O型Ind株***病毒VP0、VP3、VP1基因的阳性克隆pET28a-VP0-VP3-VP1。将连接好的质粒转化到用CaCl₂制备的DH5α感受态细胞中，涂布于卡那霉素抗性的固体LB培养基上，等单克隆菌落清晰可见时，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、230转/分钟，培养12小时过夜，提取重组质粒。

2.表达菌株的构建

将上述的***O型Ind株***病毒VP0、VP3、VP1基因的阳性克隆pET28a-VP0-VP3-VP1 40μl转化以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于卡那霉素抗性的固体LB培养基，37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可见时，挑取单克隆至含4ml卡那霉素抗性的液体LB培养基的试管，37℃，230转/分振荡培养12小时，从中取1ml菌液于-80℃冻干保存。

3.蛋白的表达及鉴定

从-80℃中取出带有重组质粒pET28a-VP0-VP3-VP1的大肠杆菌菌种接种卡那霉素抗性的50ml LB液体培养基，37℃，230转/分振荡培养12小时后，转接入1L LB液体培养基中，37℃大量扩增，等OD₆₀₀值达到0.6后，加入0.1mM的IPTG，诱导蛋白表达，20℃过夜。

使用发酵罐为上海保兴生物公司50L发酵罐，配制30L培养基装入发酵罐，121℃灭菌30分钟。第二天将5L种子液接入发酵罐，培养菌液浓度达到OD₆₀₀大约10左右时，将培养温度降至25℃，加入4gIPTG诱导培养12小时。OD₆₀₀大约为40左右下罐，离心收集菌体。

重悬菌体，采用均质机以800bar压力破碎菌体4次。13500rpm，离心40min，留取上清，通过15％SDS-PAGE电泳检测，此时上清中三个串联表达的蛋白其各自表达量均在20％左右。采用硫酸铵分级沉淀法进行蛋白粗纯，随后进行色谱纯化，纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳，显示目的蛋白均得到了纯化和富集。

通过磷钨酸负染及电镜观察可见***蛋白形成了病毒样颗粒，并且形成的病毒样颗粒饱满，组装效率高，没有聚集。通过将***病毒样颗粒置于4℃下放置3个月，再通过磷钨酸负染及电镜观察可见病毒样颗粒依旧颗粒饱满，无聚集现象。说明本发明筛选的序列制备的***蛋白形成了稳定的病毒样颗粒。

实施例2 O型Ind株***病毒样颗粒疫苗组合物的制备

取实施例1制备的病毒样颗粒缓缓加入到佐剂中，加的过程不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存，即为***病毒样颗粒疫苗组合物。具体配比见表1。适用于本发明的佐剂可以为本领域技术人员公知的佐剂。在本实施例中，选用佐剂ISA 206(法国赛比克公司)。

表1 O型Ind株***病毒样颗粒疫苗组合物成分配比

组分	疫苗1	疫苗2	疫苗3
				***抗原(μg/ml)	160	200	240
ISA 206佐剂(V/V％)	50％	50％	50％

实施例3 O型Ind株***病毒样颗粒疫苗组合物的免疫原性试验

选取O型***病毒抗原、抗体均为阴性的体重40kg左右的健康易感架仔猪20头，随机分为4组，每组5头。1-3组分别为本发明实施例2制备的疫苗1、疫苗2、疫苗3免疫组，第4组为对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射2ml，对照组免疫等量的PBS。疫苗免疫前每头猪采血，免疫后分别于第7日、14日、21日、28日采血。

对采集的血清使用O型Ind株***抗体ELISA检测试剂盒进行相关抗体的检测。结果显示，疫苗免疫前所有猪只的抗体均为阴性，1次免疫后第14日均能达到1:128以上。对照组猪只抗体为阴性，无变化。具体结果见表2。

表2本发明O型Ind株***病毒样颗粒疫苗组合物免疫后ELISA抗体水平

表明本发明制备的病毒样颗粒抗原能快速形成高水平的特异性抗体，即便抗原含量仅为160μg/ml，一次免疫后第14天也能对O型Ind株***起到很好的免疫保护作用。

实施例4 O型Ind株***病毒样颗粒疫苗组合物的免疫持续期试验

选取O型***病毒抗原、抗体均为阴性的体重40kg左右的健康易感架子猪10头，随机分为2组，每组5头。第5组为本发明实施例2制备的疫苗2免疫组，第6组为对照组。第5组免疫组免疫途径为颈部肌肉注射2ml，第6组对照组免疫等量的PBS，均一次免疫，疫苗免疫前每头猪采血，免疫后21日、28日、35日、77日、105日、133日采血。

结果显示，疫苗免疫前所有猪只的抗体均为阴性，1次免疫后第21日疫苗2免疫组能达到1:128以上，1次免疫133日，依然维持较高的抗体水平。对照组猪只抗体为阴性，无变化。具体结果见表3。

表3本发明O型Ind株***病毒样颗粒疫苗组合物免疫持续期ELISA抗体水平

上述实验数据表明本发明制备的病毒样颗粒疫苗组合物不仅抗体产生快，抗体水平高，仅一次免疫就能起到很好的免疫保护作用，而且免疫持续期长，能维持长时间的免疫保护，可以涵盖整个育肥期。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 普莱柯生物工程股份有限公司

<120> 一种O型***病毒样颗粒抗原、及其疫苗组合物、制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 909

<212> DNA

<213> ***病毒Ind株(foot-and-mouth disease virus， strain Ind)

<400> 1

ggtgctggtc agtcttctcc ggctaccggt tctcagaacc agtctggtaa caccggttct 60

atcatcaaca actactacat gcagcagtac cagaactcta tggacaccca gctgggtgac 120

aacgctatct ctggtggttc taacgaaggt tctaccgaca ccacctctac ccacaccacc 180

aacacccaga acaacgactg gttctctaaa ctggcttctt ctgctttctc tggtctgttc 240

ggtgctctgc tggctgacaa aaaaaccgaa gaaaccaccc tgctggaaga ccgtatcctg 300

accacccgta acggtcacac catctctacc acccagtctt ctgttggtgt tacctacggt 360

tacgctaccg ctgaagactt cgtttctggt ccgaacacct ctggtctgga aacccgtgtt 420

gttcaggctg aacgtttctt caaaacccac ctgttcgact gggttacctc tgacccgttc 480

ggtcgttgcc acctgctgga actgccgacc gaccacaaag gtgtttacgg ttctctgacc 540

gactcttacg cttacatgcg taacggttgg gacgttgaag ttaccgctgt tggtaaccag 600

ttcaacggtg gttgcctgct ggttgctatg gttccggaac tgtgctctat ccagaaacgt 660

gaactgtacc agctgaccct gttcccgcac cagttcatca acccgcgtac caacatgacc 720

gctcacatca ccgttccgtt cgttggtgtt aaccgttacg accagtacaa agttcacaaa 780

ccgtggaccc tggttgttat ggttgttgct ccgctgaccg ttaacaccga aggtgctccg 840

cagatcaaag tttacgctaa catcgctccg accaacgttc acgttgctgg tgaattcccg 900

tctaaagaa 909

<210> 2

<211> 660

<212> DNA

<213> ***病毒Ind株(foot-and-mouth disease virus， strain Ind)

<400> 2

ggtatcttcc cggttgcttg cgctgacggt tacggtggtc tggttaccac cgacccgaaa 60

accgctgacc cggcttacgg taaagttttc aacccgccgc gtaacatgct gccgggtcgt 120

ttcaccaact tcctggacgt tgctgaagct tgcccgacct tcctgcactt cgaaggtgac 180

gttccgtacg ttaccaccaa aaccgactct gaccgtaccc tggctcagtt cgacctgtct 240

ctggctgcta aacacatgtc taacaccttc ctggctggtc tggctcagta ctacacccag 300

tactctggta ccatcaacct gcacttcatg ttcaccggtc cgaccgacgc taaagctcgt 360

tacatgatcg cttacgctcc gccgggtatg gaaccgccga aaaccccgga agctgctgct 420

cactgcatcc acgctgaatg ggacaccggt ctgaactcta aattcacctt ctctatcccg 480

tacctgtctg ctgctgacta cgcttacacc gcttctgacg ctgctgaaac caccaacgtt 540

cagggttggg tttgcctgtt ccagatcacc cacggtaaag ctgacggtga cgctctggtt 600

gttctggctt ctgctggtaa agacttcgaa ctgcgtctgc cggttgacgc tcgtacccag 660

<210> 3

<211> 633

<212> DNA

<213> ***病毒Ind株(foot-and-mouth disease virus， strain Ind)

<400> 3

accacctcta ccggtgaatc tgctgacccg gttaccacca ccgttgaaaa ctacggtggt 60

gaaacccagg ttcagcgtcg tcagcacacc gacgtttctt tcatcctgga ccgtttcgtt 120

aaagttaccc cgaaagacca gatcaacgtt ctggacctga tgcagacccc ggctcacacc 180

ctggttggtg ctctgctgcg taccgctacc tactacttcg ctgacctgga agttgctgtt 240

aaacacaaag gtaacctgac ctgggttccg aacggtgctc cggaagctgc tctggacaac 300

accaccaacc cgaccgctta ccacaaagct ccgctgaccc gtctggctct gccgtacacc 360

gctccgcacc gtgttctggc taccgtttac aacggtaact gcaaatacgg tgaatctaac 420

gttccgaacg ttcgtggtga cctgcaggtt ctggctcaga aagctgctcg tccgctgccg 480

acctctttca actacggtgc tatcaaagct acccgtgtta ccgaactgct gtaccgtatg 540

aaacgtgctg aaacctactg cccgcgtccg ctgctggcta tccacccgtc tgaagctcgt 600

cacaaacaga aaatcgttgc tccggttaaa cag 633

Claims

1.一种***病毒样颗粒抗原，其中，所述***病毒样颗粒抗原由VP0、VP1、VP3抗原蛋白组装而成，其中，所述VP0抗原蛋白如Seq ID No.1所示核苷酸序列编码，所述VP1抗原蛋白如Seq ID No.3所示核苷酸序列编码，VP3抗原蛋白如Seq ID No.2所示核苷酸序列编码。

2.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的权利要求1所述的***病毒样颗粒抗原和药学上可以接受的载体。

3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述***病毒样颗粒抗原含量为160-240μg/ml。

4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述***病毒样颗粒抗原含量为200μg/ml。

5.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂选自：（1）铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；（2）油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或（3）丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂***、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种。

6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，皂苷为Quil A、QS-21或GPI-0100。

7.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂为ISA 206佐剂。

8.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂的浓度范围为5%-60%V/V。

9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂的浓度范围为30%-60% V/V。

10.根据权利要求9所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂的浓度为50％V/V。

11.一种制备权利要求2所述疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：

步骤（1）分别克隆、重组所述VP0抗原蛋白的基因、所述VP1抗原蛋白的基因和所述VP3抗原蛋白的基因到同一串联表达载体；

步骤（2）转化所述步骤（1）的重组表达载体到宿主，可溶性表达VP0抗原蛋白、VP1抗原蛋白和VP3抗原蛋白，表达的VP0抗原蛋白、VP1抗原蛋白和VP3抗原蛋白自我组装为病毒样颗粒抗原；

步骤（3）分离、纯化所述步骤（2）的病毒样颗粒抗原，加入佐剂，得到所述的疫苗组合物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述步骤（1）的串联表达载体为pET28a；所述步骤（2）的宿主为E.coli BL21（DE3）。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述步骤（2）中在宿主细胞扩增后，加入IPTG，诱导所述蛋白表达。

14.根据权利要求11所述的方法，其中，所述步骤（3）的分离、纯化工序为破碎菌体后，取上清，采用硫酸铵分级沉淀法和色谱纯化所述病毒样颗粒抗原。

15.权利要求2~10任一项所述的疫苗组合物在制备预防O型***的药物中的应用。