CN111228517B - Glb1点突变小鼠模型在gm1神经节苷脂贮积症的治疗药物筛选中的应用 - Google Patents

Glb1点突变小鼠模型在gm1神经节苷脂贮积症的治疗药物筛选中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111228517B
CN111228517B CN202010071082.4A CN202010071082A CN111228517B CN 111228517 B CN111228517 B CN 111228517B CN 202010071082 A CN202010071082 A CN 202010071082A CN 111228517 B CN111228517 B CN 111228517B
Authority
CN
China
Prior art keywords
glb1
mouse
point mutation
mutation
storage disease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010071082.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111228517A (zh
Inventor
黄永兰
刘思迟
唐诚芳
冯瑜妤
唐芳
蒋翔
蒋晓玲
曾春华
刘丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Women and Childrens Medical Center
Original Assignee
Guangzhou Women and Childrens Medical Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Women and Childrens Medical Center filed Critical Guangzhou Women and Childrens Medical Center
Priority to CN202010071082.4A priority Critical patent/CN111228517B/zh
Publication of CN111228517A publication Critical patent/CN111228517A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111228517B publication Critical patent/CN111228517B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种GLB1点突变小鼠模型在GM1神经节苷脂贮积症的治疗药物筛选中的应用。经体外真核细胞质粒转染研究显示，该突变的残留酶活性为野生型酶活性的0.55％，提示严重缺乏，蛋白质结构分析提示该变异位于半乳糖结合结构域。进一步采用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了GLB1 p.G453R点突变纯合小鼠，模拟晚发型神经节苷脂贮积症。该小鼠模型表现为β半乳糖苷酶缺乏，脑组织GM1显著沉积，脑细胞及溶酶体肿大。本发明从模式动物水平上证实了新变异GLB1 p.G453R为致病性变异，明确了GLB1点突变小鼠的临床表型，为GM1神经节苷脂贮积症药物治疗筛查提供了研究平台。

Description

GLB1点突变小鼠模型在GM1神经节苷脂贮积症的治疗药物筛 选中的应用
技术领域
本发明涉及分子诊断学领域，特别是涉及一种GLB1点突变小鼠模型在GM1神经节苷脂贮积症的治疗药物筛选中的应用。
背景技术
GM1神经节苷脂贮积症(GM1 gangliosidosisis)是一种以进行性神经变性为特征的罕见溶酶体贮积病，呈常染色体隐性遗传，因GLB1基因缺陷导致溶酶体β-半乳糖苷酶(β-Gal)缺乏，GM1神经节苷脂降解障碍而沉积在溶酶体内，继而引起中枢神经变性损伤等一系列征象。临床主要表现为神经退行性变，以婴儿型及晚婴型多见，缺乏有效治疗，多在儿童期死亡。至今，溶酶体内GM1脂类物质沉积导致进行性神经损伤的病理机制仍不清楚，基于GLB1新突变建立GM1神经节苷脂贮积症小鼠模型，不仅有助明确新突变致病性，且有助于进一步了解GM1神经节苷脂贮积症的发病机理和神经损伤机制，从而寻找有效的治疗方法，对于GM1神经节苷脂贮积症的防治、诊断和治疗具有重要的研究价值和临床价值。
发明内容
基于此，有必要提供一种GLB1点突变小鼠模型在GM1神经节苷脂贮积症的治疗药物筛选中的应用。
一种具有GLB1 c.1363G>A(p.G455R)突变的小鼠模型在筛选用于治疗GM1神经节苷脂贮积症的药物中的应用。
本发明还提供了一种GM1神经节苷脂贮积症小鼠模型的制备方法，通过基因编辑技术将小鼠GLB1基因的cDNA序列第1363位的G突变为A。
本发明还提供了一种人GLB1点突变的检测剂在制备用于诊断GM1神经节苷脂贮积症的试剂盒中的应用，所述人GLB1点突变为c.1357G>A(p.G453R)。
在其中一个实施例中，所述检测剂于核酸水平进行检测。
在其中一个实施例中，所述检测剂包括适用于如下至少一种方法的试剂：
限制性片段长度多态性法、单链构象多态性法、聚合酶链反应、竞争性等位基因特异性PCR、变性梯度凝胶电泳、等位基因特异性PCR、核酸测序法、核酸分型芯片检测、飞行质谱仪检测、变性高效液相色谱法、Snapshot法、Taqman探针法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法。
在其中一个实施例中，所述检测剂于蛋白水平进行检测。
在其中一个实施例中，所述检测剂包括适用于如下至少一种方法的试剂：
生物质谱法、氨基酸测序法、电泳法以及用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括样品的处理试剂，所述样品的处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及样品核酸提取试剂中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述样品选自血液、血清、血浆、脑脊髓液、组织或组织裂解液、细胞培养上清、***以及唾液样品中的至少一种。
本发明还提供了一种突变人GLB1蛋白，所述突变人GLB1蛋白与野生型人GLB1蛋白相比，具有p.G453R突变。
本发明发现了一种新的GM1神经节苷脂贮积症相关的致病性突变，具体为GLB1c.1357G>A(p.G453R)突变。经体外真核细胞质粒转染研究显示，该突变的残留酶活性为野生型酶活性的0.55％，提示严重缺乏，蛋白质结构分析提示该变异位于半乳糖结合结构域。进一步采用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了GLB1 p.G453R点突变纯合小鼠，模拟晚发型神经节苷脂贮积症。该小鼠模型表现为β半乳糖苷酶缺乏，脑组织GM1显著沉积，脑细胞及溶酶体肿大，小胶质细胞浸润，自噬流受损。临床表型特征为8周龄运动能力下降，16周龄进一步下降，雄性小鼠肥胖，10个月左右出现震颤、运动缓慢等神经***症状。本发明从模式动物水平上证实了新变异GLB1 p.G453R为致病性变异，有助于提高GM1神经节苷脂贮积症的诊断准确性，促进GM1神经节苷脂贮积症的发病机理和神经损伤机制的研究，同时该小鼠模型的建立将为新药研究提供新的研究平台，对于GM1神经节苷脂贮积症的防治、诊断和治疗具有重要的研究价值和临床价值。
附图说明
图1为F0代小鼠的测序结果图；
图2为8周时纯和突变、杂合突变及野生型小鼠的外周血β-Gal酶活性检测结果图；
图3为8周、16周和32周时纯和突变、杂合突变及野生型小鼠的运动评估结果图；
图4为16周时纯和突变、杂合突变及野生型小鼠的HE病理切片结果图；
图5为16周时纯和突变、杂合突变及野生型小鼠的GM1免疫荧光结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明涉及一种具有GLB1 c.1363G>A(p.G455R)突变的小鼠模型在筛选用于治疗GM1神经节苷脂贮积症的药物中的应用。
本发明从模式动物水平上证实了新变异GLB1 p.G453R为致病性变异，有助于提高GM1神经节苷脂贮积症的诊断准确性，促进GM1神经节苷脂贮积症的发病机理和神经损伤机制的研究，同时该小鼠模型的建立将为新药研究提供新的研究平台，对于GM1神经节苷脂贮积症的防治、诊断和治疗具有重要的研究价值和临床价值。
本发明还提供了一种GM1神经节苷脂贮积症小鼠模型的制备方法，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术将小鼠GLB1基因的cDNA序列第1363位的G突变为A。可以理解，人GLB1(NM_000404.3)c.1357G>A(p.G453R)突变对应小鼠GLB1(NM_009752.2)c.1363G>A(p.G455R)突变，侧翼序列种间高度保守。可选地，突变是纯合的。可选地，基因编辑技术为CRISPR/Cas技术，但不限于此，任何本领域技术人员已知的基因编辑技术皆可。
GM1神经节苷脂贮积症患者神经***进行性损伤的病理机制目前仍不清楚，由于疾病罕见及患者脑组织获取困难，极大地阻碍了其研究进展。而动物模型可以完整地演绎疾病发生发展过程，且不同的模型构建方法中突变位点的不同，所构建模型的表型及病理也可能存在一定差异。因此可利用相应的动物模型来研究神经损伤病理机制，确定病理特征，探索治疗靶点，以及为新药研究提供技术平台。
本发明还涉及一种人GLB1点突变的检测剂在制备用于诊断GM1神经节苷脂贮积症的试剂盒中的应用，其中上述人GLB1点突变为c.1357G>A(p.G453R)。
鉴于GLB1基因为一种能够编码蛋白质的基因，因而其基因的突变通常也会表现在转录水平和反应水平上，本领域技术人员可以从RNA和蛋白水平对其突变进行检测以间接反映其是否发生点突变，这些都可以应用于本发明。
在一些实施方式中，检测剂于核酸水平进行检测。
核酸水平(DNA或RNA水平)的检测剂可选用本领域技术人员所公知的试剂，例如能够与该DNA或RNA杂交，且标记有荧光标记的核酸(通常为探针或引物)等。并且本领域技术人员也容易想到将mRNA反转录成cDNA后对cDNA进行检测，这些技术手段的常规置换不超出本发明的保护范围。
在一些实施方式中，检测剂包括适用于如下至少一种方法的试剂：
限制性片段长度多态性法、单链构象多态性法、聚合酶链反应、竞争性等位基因特异性PCR、变性梯度凝胶电泳、等位基因特异性PCR、核酸测序法、核酸分型芯片检测、飞行质谱仪检测、变性高效液相色谱法、Snapshot法、Taqman探针法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法。
在一些实施方式中，核酸测序法可以为转录组测序或基因组测序。在另外一些实施方案中，核酸测序法是高通量测序，也称作二代测序(NGS)。二代测序在并行的测序过程中同时产生数千至数百万条序列。NGS区别于“Sanger测序”(一代测序)，后者是基于单个测序反应中的链终止产物的电泳分离。可用于本发明的NGS测序平台是商用可得的，包括但不限于Roche/454FLX、Illumina/Solexa GenomeAnalyzer和Applied Biosystems SOLIDsystem等。转录组测序也可以通过二代测序平台快速全面地获得某一物种特定细胞或组织在某一状态下的几乎所有的转录本及基因序列，可以用于研究基因表达量、基因功能、结构、可变剪接和新转录本预测等。
在一些实施方式中，检测剂于蛋白水平进行检测。
在一些实施方式中，检测剂包括适用于如下至少一种方法的试剂：
生物质谱法、氨基酸测序法、电泳法以及用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测。
用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测的方法进一步可以为免疫沉淀、免疫共沉淀、免疫组化、ELISA以及Western Blot等。
在一些实施方式中，试剂盒还包括样品的处理试剂，样品的处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及样品核酸提取试剂中的至少一种。
在一些实施方式中，样品选自血液、血清、血浆、脑脊髓液、组织或组织裂解液、细胞培养上清、***以及唾液样品中的至少一种。
在一些实施方式中，试剂盒还包括人GLB1 c.446C>T(p.S149F)突变的检测剂，p.S149F为已知致病变异。
本发明还提供了一种突变人GLB1蛋白，该突变人GLB1蛋白与野生型人GLB1蛋白相比，具有p.G453R突变。
下面主要结合具体实施方式和附图对本发明作进一步详细的说明。
一、新变异p.G453R的致病性评估
GM1神经节苷脂贮积症患者，男，2岁1个月，因进行性精神运动倒退1年余就诊，生后9个月之前生长发育正常，会爬，会扶站。9个月之后无明显诱因出现运动发育迟缓，随后逐步倒退，1岁时不会爬。就诊时不会坐，不会笑，不能认人，双手不会取物。查体表情呆滞，四肢肌张力增高，双侧巴氏征(+)，无特殊面容、无骨骼异常，心肺无异常，肝脏轻度肿大。头颅核磁(MRI)提示双侧大脑半球白质及内囊后肢对称性、弥漫性异常信号，脑萎缩。脑核磁波谱分析提示部分病变区域NAA峰下降，提示神经元损伤。外周血白细胞β-Gal活性测定为0nmol/(mg.h)。GLB1基因突变分析发现c.446C>T(p.S149F)和c.1357G>A(p.G453R)变异，变异分别来自父母，p.S149F为已知致病变异，p.G453R为新变异，经生物信息学分析提示为可能致病性变异，结合临床、酶学及GLB1基因结果，该患儿晚婴型GM1神经节苷脂病诊断明确。新变异p.G453R经体外真核细胞质粒转染研究显示，其残留酶活性为野生型酶活性的0.55％，提示严重缺乏，蛋白质结构分析提示该变异位于半乳糖结合结构域。因此，推测新变异p.G453R为致病性变异。
二、采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建GLB1 p.G453R点突变小鼠
小鼠GLB1基因(GenBank accession number:NM_009752.2；Ensembl:ENSMUSG00000045594)位于小鼠9号染色体上。G455位于GLB1第14号外显子上，第14号外显子被选为突变目标，供体oligo中G455R(GGAto AGA)突变位点通过同源修复引入到第14号外显子中。将Cas9 mRNA、sgRNA和供体oligo共注射C57BL/6J小鼠受精卵中，再将受精卵植入***小鼠。小鼠出生后以小鼠基因组为模板，通过PCR扩增sgRNA靶向位点两侧各约200bp的序列，引物序列如下表所示。
GLB1正向引物的序列为 5’-GAAGGTTTCAAGTTCAAGGCAATCC-3’
GLB1反向引物的序列为 5’-AAGGAAAATAAACTGCATTCCTTGGTAG-3’
PCR反应体系如下所示：
Figure BDA0002377315140000061
Figure BDA0002377315140000071
PCR扩增的条件为94℃变性5min，循环周期为94℃，30s，60℃，30s，72℃，60s/kb，35个循环。PCR反应结束后将反应管放在冰上使其温度小于等于37℃。
经基因测序后，确认得到GLB1基因具有c.1363G>A(p.G455R)突变的F0代突变小鼠，部分测序结果如图1所示，突变后基因的部分序列和突变后蛋白的部分序列如下表所示。
Figure BDA0002377315140000072
然后将该小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配得到F1代小鼠，成功构建GLB1G455R/G455R基因突变纯合小鼠品系。模型小鼠生长发育评估：无胚胎致死，繁育符合孟德尔遗传模式。将得到的突变型小鼠与同窝野生型小鼠比较，进行模型鉴定。
三、酶活性比较
采用荧光底物分析法检测干血片、大脑及肝脏组织中溶酶体β-Gal活性，以α-甘露糖苷酶为参照酶。如取脑组织匀浆10μL(15μg蛋白)，加15mM 4-甲基伞形酮-β-D-吡喃型葡萄糖苷(4-MU-Glu)20μL混匀，37℃孵育30min，加0.2mol/L甘氨酸缓冲液(pH 10.5)200μL终止反应。Bio-Tek FLx 800荧光分析仪测定游离4-甲基伞形酮荧光强度，激发光波长350nm，发射光波长460nm，以4-甲基伞形酮为标准计算酶活性，实验重复3次。
于8周时分别对纯和突变(Glb1G455R/G455R)、杂合突变(Glb1G455R/+)及野生型(Glb1+/+)小鼠进行检测，结果如图2所示，可见本发明构建得到的突变模型小鼠的外周血β-Gal酶活性比野生型小鼠的酶活性显著降低。
四、动物行为学比较
(1)前肢悬吊实验(Forelimb suspension test)：将光滑金属丝置于高架上，金属丝的下方放置柔软的弹力海绵垫。将小鼠轻置于金属丝上确保小鼠前肢握住金属丝后开始计时，小鼠掉落时计时结束。每只小鼠每次实验测量3次，每次间隔至少10分钟。取最长时间记为前肢悬吊时间，截止时间设定为600S，悬吊时间超出600S的记为600S，并停止测试。
(2)转杆试验(Rotarod test)：将小鼠置于悬空大转杆上，在5分钟内转杆速度逐渐从3.5rpm加速至35rpm。正式记录前，每只小鼠至少训练3次，每次间隔至少15分钟。记录小鼠自转杆上掉落时转杆转速及小鼠在转杆上停留的时间。
通过两组实验对纯和突变(Glb1G455R/G455R)、杂合突变(Glb1G455R/+)及野生型(Glb1+/+)小鼠进行运动评估，分别于8周(8W)、16周(16W)和32周(32W)进行运动评估，结果如图3所示，发现本发明构建得到的突变模型小鼠的运动能力明显下降。
五、组织切片病理学比较
小鼠深度麻醉，心脏灌流PBS冲洗，4％多聚甲醛固定。灌流固定结束后，取出整个大脑、小脑、基底节、脊髓及肝脏，于4％多聚甲醛中再固定24小时，经常规脱水，石蜡包埋，切片5μm，HE及免疫荧光染色。显微镜下观测拍照，使用ImageJ软件进行图像分析。
HE染色：观察神经元及其突触数量及形态，结果如图4所示，发现神经元胞浆呈气球样肿胀，提示GM1沉积。
免疫荧光：取大脑组织，切片5μm，进行抗原修复后3％牛血清白蛋白(BSA)50μL室温下封闭45min，加含0.3％Tween 20的3％BSA稀释的一抗GM1后置于湿盒，4℃过夜，洗涤后加人3％BSA稀释的荧光二抗抗体50μL，孵育60min，洗涤后使用0.1μg/ml DAPI 50μL染核，室温下5min。封片剂封片后激光共聚焦显微镜下拍照。结果如图5所示，突变小鼠GM1大量沉积。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.具有Glb1 c.1363G>A(p.G455R)突变的小鼠模型在筛选用于治疗GM1神经节苷脂贮积症的药物中的应用。
2.一种GM1神经节苷脂贮积症小鼠模型的制备方法，其特征在于，通过基因编辑技术将小鼠Glb1基因的cDNA序列第1363位的G突变为A。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述基因编辑技术为CRISPR/Cas技术。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述小鼠为C57BL/6J小鼠。
CN202010071082.4A 2020-01-21 2020-01-21 Glb1点突变小鼠模型在gm1神经节苷脂贮积症的治疗药物筛选中的应用 Active CN111228517B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010071082.4A CN111228517B (zh) 2020-01-21 2020-01-21 Glb1点突变小鼠模型在gm1神经节苷脂贮积症的治疗药物筛选中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010071082.4A CN111228517B (zh) 2020-01-21 2020-01-21 Glb1点突变小鼠模型在gm1神经节苷脂贮积症的治疗药物筛选中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111228517A CN111228517A (zh) 2020-06-05
CN111228517B true CN111228517B (zh) 2022-04-19

Family

ID=70869120

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010071082.4A Active CN111228517B (zh) 2020-01-21 2020-01-21 Glb1点突变小鼠模型在gm1神经节苷脂贮积症的治疗药物筛选中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111228517B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106282231A (zh) * 2016-09-06 2017-01-04 陕西慧康生物科技有限责任公司 粘多糖贮积症ii型动物模型的构建方法及应用
US10113163B2 (en) * 2016-08-03 2018-10-30 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10113163B2 (en) * 2016-08-03 2018-10-30 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
CN106282231A (zh) * 2016-09-06 2017-01-04 陕西慧康生物科技有限责任公司 粘多糖贮积症ii型动物模型的构建方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Clinical and molecular characteristics of 11 Chinese probands with GM1 gangliosidosis;Yuyu Feng等;《Metabolic Brain Disease》;20180928;第33卷;第2051-2057页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111228517A (zh) 2020-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kovach et al. Clinical delineation and localization to chromosome 9p13. 3–p12 of a unique dominant disorder in four families: hereditary inclusion body myopathy, Paget disease of bone, and frontotemporal dementia
Kumar et al. Genetics of autism spectrum disorders
Mougou‐Zerelli et al. CC2D2A mutations in Meckel and Joubert syndromes indicate a genotype–phenotype correlation
Kunz et al. Confirmation of a non-synonymous SNP in PNPLA8 as a candidate causal mutation for Weaver syndrome in Brown Swiss cattle
Gilliam et al. A homozygous KCNJ10 mutation in Jack Russell Terriers and related breeds with spinocerebellar ataxia with myokymia, seizures, or both
Haddick et al. A common variant of IL-6R is associated with elevated IL-6 pathway activity in Alzheimer’s disease brains
Goldstein et al. IQCB1 and PDE6B mutations cause similar early onset retinal degenerations in two closely related terrier dog breeds
Giedraitis et al. Genetic analysis of Alzheimer’s disease in the Uppsala Longitudinal Study of Adult Men
Kolicheski et al. Australian cattle dogs with neuronal ceroid lipofuscinosis are homozygous for a CLN5 nonsense mutation previously identified in border collies
Downs et al. A novel mutation in TTC8 is associated with progressive retinal atrophy in the golden retriever
Wiedmer et al. A RAB3GAP1 SINE insertion in Alaskan huskies with polyneuropathy, ocular abnormalities, and neuronal vacuolation (POANV) resembling human Warburg micro syndrome 1 (WARBM1)
Faller et al. The Chihuahua dog: A new animal model for neuronal ceroid lipofuscinosis CLN7 disease?
Auslender et al. A common founder mutation of CERKL underlies autosomal recessive retinal degeneration with early macular involvement among Yemenite Jews
Katsumata et al. Translating Alzheimer's disease–associated polymorphisms into functional candidates: a survey of IGAP genes and SNPs
Wada et al. Establishment of an improved mouse model for infantile neuroaxonal dystrophy that shows early disease onset and bears a point mutation in Pla2g6
Blue et al. Genetic variation in genes underlying diverse dementias may explain a small proportion of cases in the Alzheimer’s Disease Sequencing Project
Drögemüller et al. Identification of a missense mutation in the bovine ATP2A1 gene in congenital pseudomyotonia of Chianina cattle: an animal model of human Brody disease
Al Tuwaijri et al. Novel homozygous pathogenic mitochondrial DNAJC19 variant in a patient with dilated cardiomyopathy and global developmental delay
CN111228517B (zh) Glb1点突变小鼠模型在gm1神经节苷脂贮积症的治疗药物筛选中的应用
Christen et al. Mitochondrial fission factor (MFF) frameshift variant in Bullmastiffs with mitochondrial fission encephalopathy
He et al. Inherited motor neuron disease in domestic cats: a model of spinal muscular atrophy
Cahill et al. Structural Variant in Mitochondrial-Associated Gene (MRPL3) induces adult-onset neurodegeneration with memory impairment in the mouse
RU2380423C2 (ru) Способ обнаружения болезни альцгеймера
US20220307085A1 (en) Method and Kit for Determining Neuromuscular Disease in Subject
Nacmias et al. FDG PET and the genetics of dementia

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant