CN111228223B - 一种促进伤口愈合的聚合物囊泡及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种促进伤口愈合的聚合物囊泡,包括由抗菌肽聚合物组装而成的囊泡以及结合在所述囊泡上的硫化氢供体,所述抗菌肽聚合物为聚己内酯‑嵌段‑聚[赖氨酸‑无规‑(S‑芳酰基肟)]及其衍生物。其制备方法为:首先利用聚己内酯与氨基酸环内酸酐(NCA)的开环聚合反应以合成抗菌肽聚合物,然后使硫化氢供体与聚合物囊泡结合,最后使聚合物自组装为兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的聚合物囊泡。本发明的聚合物囊泡对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有优异的抗菌活性,并且能够在含有半胱氨酸的水溶液中缓慢释放硫化氢达12小时。动物实验证明,相较于商业化的伤口修复喷雾剂,该囊泡显著促进了糖尿病小鼠的伤口愈合。
Description
技术领域
本发明属于高分子材料和生物医学工程领域,涉及聚合物囊泡及其制备方法和应用。
背景技术
聚合物自组装技术一直是各国科研工作者研究的热点,通过自组装技术可以得到各种各样的纳米材料,如胶束、囊泡、盘状结构、蠕虫状结构、棒状结构等。其中,聚合物囊泡由于内部具有空腔,因此具有更加广泛的应用范围。刺激响应型聚合物囊泡是指能够对某种外界刺激做出相应的响应的聚合物囊泡。这些外界刺激包括pH、温度、光、磁场和氧化还原条件等多种类型。在外界刺激条件改变的情况下,刺激响应型聚合物囊泡的形态、结构或者组成会发生相应的变化。正是这些智能响应性使得该种聚合物囊泡在很多领域有广泛的应用前景,如药物载体、微反应器、造影剂、金属纳米粒子制备模板等。
糖尿病伤口是糖尿病最危险和最常见的并发症之一,约15%的糖尿病患者会患有糖尿病伤口。在美国,每年为患有糖尿病伤口的患者花费的护理费用约为200亿美元,其中不包括造成医护人员工作约200万天的损失。与健康的人相比,糖尿病患者的伤口更难以愈合。他们的抗菌能力和白细胞功能均受到损害。因此,在糖尿病伤口处细菌感染更为频繁并反复发生。
对于糖尿病伤口的感染问题,目前,主要是通过抗生素来解决,但是过度使用抗生素将导致抗生素耐药性不断提高,对人类健康构成严重威胁,因此需开发能够抑制和杀死细菌但不会导致抗生素耐药性的新药物。例如,抗菌肽(AMPs)提供了另一种通过膜破坏机制来治疗细菌感染的方法。
许多证据表明,当内皮和表皮细胞暴露于硫化氢中时,硫化氢可以通过KATP通道和MARK途径激活并增加Akt,ERK和p38的磷酸化,从而促进角质细胞的增殖和迁移。因此,在伤口处补充外源性的硫化氢供体可作为促进伤口愈合的有效手段。
发明内容
为了解决上述问题,本发明的主要目的在于提供一种兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的聚合物囊泡,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有优异的抗菌活性,并且能够在含有半胱氨酸的水溶液中缓慢释放硫化氢达12小时。并且能够显著促进糖尿病小鼠的伤口愈合。
为达到上述目的,本发明的解决方案是:
一种促进伤口愈合的聚合物囊泡、其制备方法及其应用,该聚合物囊泡包括:由抗菌肽聚合物自组装而成的囊泡本体以及结合在囊泡本体上的硫化氢供体。其制备方法为:首先利用聚己内酯与氨基酸环内酸酐(NCA)的开环聚合反应以合成抗菌肽聚合物,然后使硫化氢供体与聚合物囊泡结合,最后使聚合物自组装为促进伤口愈合的聚合物囊泡。本发明的促进伤口愈合的聚合物囊泡对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有优异的抗菌活性,并且能够在含有半胱氨酸的水溶液中缓慢释放硫化氢达12小时。动物实验证明,相较于商业化的伤口修复喷雾剂,该囊泡显著促进了糖尿病小鼠的伤口愈合。
进一步而言,一种促进伤口愈合的聚合物囊泡,包括由抗菌肽聚合物组装而成的囊泡本体以及结合在所述囊泡本体上的硫化氢供体,所述抗菌肽聚合物结合硫化氢供体得到兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物聚己内酯-嵌段-聚[赖氨酸-无规-(S-芳酰基肟)]。
其中,促进伤口愈合的聚合物囊泡的粒径为200~400nm;或者,所述兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物的氨基与所述硫化氢供体的摩尔比为1︰(0.2~1.0)。
一种制备促进伤口愈合的聚合物囊泡的方法,包括如下步骤:
(1)抗菌肽聚合物和硫化氢供体的制备步骤
至少将聚已内酯、赖氨酸NCA单体和第一类溶剂相混合,并在室温下使用真空泵抽真空搅拌反应30~50小时,依次经过透析、抽滤、真空干燥,得到所述抗菌肽聚合物聚己内酯-嵌段-聚赖氨酸;
将S-芳酰硫基羟胺(SBTHA)、对醛基苯甲酸、三氟乙酸(TFA)、3A分子筛和第二类溶剂相混合,并将混合物在室温下密封静置1~5小时。依次经过抽滤、旋蒸、重结晶、再抽滤得白色粉末,即化合物SATO1。将SATO1、N,N-二甲基甲酰胺和二氯亚砜相混合,在60~80℃下反应12~30小时,旋蒸并真空干燥,用饱和碳酸氢钠溶液处理废液,得到硫化氢供体SATO2。
(2)兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物的制备步骤
将步骤(1)所得聚己内酯-嵌段-聚赖氨酸、硫化氢供体SATO2、三乙胺、4-二甲氨基吡啶和第一类溶剂相混合,于30~90℃反应20~40小时,依次经过旋蒸、溶解、在第三类溶剂中沉淀、离心、透析、冻干后得到聚合物粉末,即所述兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物;
(3)促进伤口愈合的聚合物囊泡的制备步骤
将步骤(2)所得兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物以0.1~1.0mg/mL的浓度溶解在第四类溶剂中,在搅拌下以12~45d/min的速度滴加1~2倍于所述第四类溶剂体积的去离子水,透析后得到促进伤口愈合的聚合物囊泡水溶液;
其中,在步骤(1)中,所述聚已内酯、所述赖氨酸NCA单体的摩尔比例为1︰(20~60);或者,
所述S-芳酰硫基羟胺(SBTHA)、所述对醛基苯甲酸、所述三氟乙酸(TFA)的摩尔比例为1︰(1.0~1.5)︰(0.1~0.4);或者,
所述SATO1、所述N,N-二甲基甲酰胺、所述二氯亚砜的摩尔比例为1︰(1.5~2.0)︰(0.01~0.04);或者,
所述第一类溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、苯甲醚和对二甲苯的一种或几种;或者,
所述第二类溶剂为二氯甲烷、二甲苯、碳酸二甲酯的一种或几种。
在步骤(2)中,所述聚己内酯-嵌段-聚赖氨酸、所述硫化氢供体SATO2、所述三乙胺、所述4-二甲氨基吡啶的摩尔比例为1︰(10~30)︰(0.05~0.2)︰(0.01~0.05);或者,
所述第一类溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、苯甲醚和对二甲苯的一种或几种;或者,
所述第三类溶剂为乙酸乙酯、四氢呋喃、异丙醇、二氧六环的一种或几种。
在步骤(3)中,所述第四类溶剂为四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和二氧六环中的任意一种或几种。
上述的促进伤口愈合的聚合物囊泡作为广谱抗菌剂的应用。
上述的促进伤口愈合的聚合物囊泡作为治疗糖尿病伤口的喷雾剂的应用。
由于采用上述方案,本发明的有益效果是:
第一、本发明的促进伤口愈合的聚合物囊泡由兼具生物相容性和生物可降解性的聚(ε-己内酯)(PCL)链段形成膜,而抗菌肽聚[赖氨酸-无规-(S-芳酰基肟)][P(Lys-stat-SATO)]链段形成冠。该囊泡能够在水溶液、PBS溶液中保持聚合物囊泡的形貌,使最终得到的聚合物囊泡具有非常好的分散性、稳定性和抗稀释能力。并且其在生物体内也有很好的稳定性和良好的生物相容性,不会引起生物体的排异反应。
第二、聚[赖氨酸-无规-(S-芳酰基肟)][P(Lys-stat-SATO)]链段为本发明的囊泡提供了正电荷和广谱的抗菌活性。使得该囊泡能够抑制并杀死细菌,可作为伤口处的杀菌剂防止伤口感染。
第三、本发明的促进伤口愈合的聚合物囊泡是由抗菌肽聚合物通过自组装而形成的,该抗菌肽聚合物含有氨基,能够与硫化氢供体(SATO2)的酰氯酰胺化反应而使其结合到囊泡冠上,而SATO(硫化氢供体部分)可以在半胱氨酸的触发下持续释放硫化氢。
第四、通过糖尿病小鼠的伤口愈合实验证明了本发明的聚合物囊泡具有促进糖尿病伤口愈合的能力,可在9天之内使伤口几乎完全闭合。因此,该囊泡在糖尿病伤口治疗领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例一中的促进伤口愈合的聚合物囊泡的TEM图。
图2为本发明实施例一中的促进伤口愈合的聚合物囊泡的动态光散射图。
图3为本发明实施例一中的促进伤口愈合的聚合物囊泡治疗糖尿病伤口后在不同时间点的伤口恢复情况图。
图4为本发明实施例一中的促进伤口愈合的聚合物囊泡治疗糖尿病伤口的结果定量分析图。
具体实施方式
本发明提供了一种促进伤口愈合的聚合物囊泡,以及该种聚合物囊泡的制备方法及其应用。
促进伤口愈合的聚合物囊泡:
一种促进伤口愈合的聚合物囊泡,其包括:囊泡本体和形成在该囊泡本体上的硫化氢供体。
其中,囊泡由兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物自组装而成,该兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物为聚己内酯-嵌段-聚[赖氨酸-无规-(S-芳酰基肟)],简称为[PCL-b-Poly(Lys-stat-SATO)]。
促进伤口愈合的聚合物囊泡的粒径为200~400nm。兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物的氨基与所述硫化氢供体的摩尔比为1︰(0.2~1.0)。
促进伤口愈合的聚合物囊泡的制备方法:
本发明的促进伤口愈合的聚合物囊泡的制备方法包括如下步骤:
(1)抗菌肽聚合物和硫化氢供体的制备步骤
将聚已内酯、赖氨酸NCA单体和第一类溶剂相混合,并在室温下使用真空泵抽真空搅拌反应30~50小时,依次经过透析、抽滤、真空干燥,得到所述抗菌肽聚合物聚己内酯-嵌段-聚赖氨酸;
将S-芳酰硫基羟胺(SBTHA)、对醛基苯甲酸、三氟乙酸(TFA)、3A分子筛和第二类溶剂相混合,并将混合物在室温下密封静置1~5小时。依次经过抽滤、旋蒸、重结晶、再抽滤得白色粉末,即化合物SATO1。将SATO1、N,N-二甲基甲酰胺和二氯亚砜相混合,在60~80℃下反应12~30小时,旋蒸并真空干燥,用饱和碳酸氢钠溶液处理废液,得到硫化氢供体SATO2。
(2)兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物的制备步骤
将步骤(1)所得聚己内酯-嵌段-聚赖氨酸、硫化氢供体SATO2、三乙胺、4-二甲氨基吡啶和第一类溶剂相混合,于30~90℃反应20~40小时,依次经过旋蒸、溶解、在第三类溶剂中沉淀、离心、透析、冻干后得到聚合物粉末,即所述兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物;
(3)促进伤口愈合的聚合物囊泡的制备步骤
将步骤(2)所得兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物以0.1~1.0mg/mL的浓度溶解在第四类溶剂中,在搅拌下以12~45d/min的速度滴加1~2倍于所述第四类溶剂体积的去离子水,透析后得到促进伤口愈合的聚合物囊泡水溶液;
其中,在步骤(1)中,所述聚已内酯、所述赖氨酸NCA单体的摩尔比例为1︰(20~60);或者,
所述S-芳酰硫基羟胺(SBTHA)、所述对醛基苯甲酸、所述三氟乙酸(THF)的摩尔比例为1︰(1.0~1.5)︰(0.1~0.4);或者,
所述SATO1、所述N,N-二甲基甲酰胺、所述二氯亚砜的摩尔比例为1︰(1.5~2.0)︰(0.01~0.04);或者,
所述第一类溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、苯甲醚和对二甲苯的一种或几种;或者,
所述第二类溶剂为二氯甲烷、二甲苯、碳酸二甲酯的一种或几种。
在步骤(2)中,所述聚己内酯-嵌段-聚赖氨酸、所述硫化氢供体SATO2、所述三乙胺、所述4-二甲氨基吡啶的摩尔比例为1︰(10~30)︰(0.05~0.2)︰(0.01~0.05);或者,
所述第一类溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、苯甲醚和对二甲苯的一种或几种;或者,
所述第三类溶剂为乙酸乙酯、四氢呋喃、异丙醇、二氧六环的一种或几种。
在步骤(3)中,所述第四类溶剂为四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和二氧六环中的任意一种或几种。
在步骤(3)中,去离子水的体积只能为第四类溶剂的体积的1~2倍,这是因为发明人经过大量的实验发现,只有在去离子水的体积为第四类溶剂的体积的1~2倍的情况下,才能形成空心并且稳定的聚合物囊泡,在其他倍数时不能形成稳定的聚合物囊泡。
促进伤口愈合的聚合物囊泡的应用:
1.本发明的促进伤口愈合的聚合物囊泡可以用作广谱抗菌剂。
糖尿病患者较高的血糖尿糖浓度,为细菌提供了营养丰富的温床,容易产生难治性伤口并反复感染,本发明的促进伤口愈合的聚合物囊泡的冠是由带有正电荷的P(Lys-stat-SATO)链段组成,其能够静电吸附到带负电的细菌膜上,通过膜破坏机理刺破细菌膜,使细菌内容物流出而杀死细菌。因此,本发明的囊泡具有广谱的抗菌活性,能够用于防止糖尿病伤口感染。
2.本发明的促进伤口愈合的聚合物囊泡还可以作为治疗糖尿病伤口的喷雾剂。
由于糖尿病患者代谢紊乱,导致多种信号分子的合成及循环水平降低。例如,信号分子硫化氢,其能够促进表皮角质形成细胞的增殖和迁移,并加速伤口愈合(再上皮化),在糖尿病患者中分泌不足,使得伤口难以愈合。而表皮角质形成细胞在受损真皮上的增殖和迁移对于伤口愈合十分重要。因此,在伤口区域补充使用外源性H2S供体是一种促进糖尿病患者难治性伤口愈合的有效治疗手段。本发明的促进伤口愈合的聚合物囊泡的冠上含有硫化氢供体S-芳酰基肟(SATO),其可被半胱氨酸触发,能够在水溶液中持续、缓慢地释放硫化氢。本发明通过小鼠的伤口愈合实验,证明了该囊泡对糖尿病伤口的治疗作用。
另外,本发明促进伤口愈合的聚合物囊泡可以制成喷雾剂,直接喷洒于伤口表面,从而促进糖尿病伤口的愈合。
以下结合附图所示实施例对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例提供了一种促进伤口愈合的聚合物囊泡的制备方法,包括如下步骤:
(1)抗菌肽聚合物PCL-b-PLys和硫化氢供体SATO2的制备步骤
a.将聚已内酯PCL-NH2(0.426g)、赖氨酸NCA单体(0.903g)和20mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)相混合,并在室温下使用真空泵抽真空搅拌反应32小时,依次经过透析、抽滤、真空干燥,得到所述抗菌肽聚合物聚己内酯-嵌段-聚赖氨酸,简称PCL-b-PLys;
b.将S-芳酰硫基羟胺(SBTHA)(100mg,0.650mmol)、对醛基苯甲酸(107mg,0.710mmol)、10μL三氟乙酸(TFA)、3A分子筛和3mL二氯甲烷(DCM)相混合,并将混合物在室温下密封静置3小时。依次经过抽滤、旋蒸、重结晶、再抽滤得白色粉末,即化合物SATO1。将SATO1(5.72g,0.020mol)、20μL N,N-二甲基甲酰胺和二氯亚砜(3.57g,0.0300mol)相混合,在70℃下反应24小时,旋蒸并真空干燥,用饱和碳酸氢钠溶液处理废液,得到硫化氢供体SATO2。
(2)兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物[PCL-b-Poly(Lys-stat-SATO)]的制备步骤
将步骤(1)所得聚己内酯-嵌段-聚赖氨酸(100mg,0.0200mmol)、硫化氢供体SATO2(150mg,0.500mmol)、三乙胺(500μL)、4-二甲氨基吡啶(10μL)和二甲基亚砜(1mL)相混合,于40℃反应24小时,依次经过旋蒸、溶解、在乙酸乙酯中沉淀、离心、透析、冻干后得到聚合物粉末,即所述兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物聚己内酯-嵌段-聚[赖氨酸-无规-(S-芳酰基肟)],简称为[PCL-b-Poly(Lys-stat-SATO)];
(3)促进伤口愈合的聚合物囊泡的制备步骤
将步骤(2)所得兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物以0.5mg/mL的浓度溶解在N,N-二甲基甲酰胺中,在搅拌下以25d/min的速度滴加1.5倍于所述N,N-二甲基甲酰胺体积的去离子水,透析后得到促进伤口愈合的聚合物囊泡水溶液。
所述抗菌肽聚合物的氨基与所述硫化氢供体的摩尔比为1︰0.65;所述聚合物囊泡的粒径约为300nm;所述的聚合物囊泡作为广谱抗菌剂,对革兰氏阳性菌(MIC=60μg/mL)和革兰氏阴性菌(MIC=80μg/mL)均具有优异的抗菌活性;所述的聚合物囊泡作为治疗糖尿病伤口的喷雾剂,具有促进伤口愈合的功效,在第9天伤口几乎完全闭合。
如图1所示,促进伤口愈合的聚合物囊泡结构清晰,呈空心结构,均匀分散。
如图2所示,嵌段共聚物组装成的纳米囊泡粒径在300nm左右,粒径非常均一(多分散系数为0.193)。
如图3和图4所示,当使用不同的喷雾剂治疗糖尿病小鼠伤口时,不同时间下的伤口恢复情况表明囊泡加半胱氨酸组伤口愈合速度最快,效果最佳。
实施例二
本实施例提供了一种促进伤口愈合的聚合物囊泡的制备方法,包括如下步骤:
(1)抗菌肽聚合物PCL-b-PLys和硫化氢供体SATO2的制备步骤
a.将聚已内酯PCL-NH2(0.426g)、赖氨酸NCA单体(1.43g)和30mL二甲基亚砜(DMSO)相混合,并在室温下使用真空泵抽真空搅拌反应50小时,依次经过透析、抽滤、真空干燥,得到所述抗菌肽聚合物聚己内酯-嵌段-聚赖氨酸,简称PCL-b-PLys;
b.将S-芳酰硫基羟胺(SBTHA)(100mg,0.650mmol)、对醛基苯甲酸(148mg,0.980mmol)、15μL三氟乙酸(TFA)、3A分子筛和5mL对二甲苯相混合,并将混合物在室温下密封静置5小时。依次经过抽滤、旋蒸、重结晶、再抽滤得白色粉末,即化合物SATO1。将SATO1(5.72g,0.0200mol)、25μL N,N-二甲基甲酰胺和二氯亚砜(4.76g,0.0400mol)相混合,在80℃下反应12小时,旋蒸并真空干燥,用饱和碳酸氢钠溶液处理废液,得到硫化氢供体SATO2。
(2)兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物[PCL-b-Poly(Lys-stat-SATO)]的制备步骤
将步骤(1)所得聚己内酯-嵌段-聚赖氨酸(180mg,0.0200mmol)、硫化氢供体SATO2(105mg,0.350mmol)、三乙胺(500μL)、4-二甲氨基吡啶(12μL)和N,N-二甲基甲酰胺(1.5mL)相混合,于90℃反应20小时,依次经过旋蒸、溶解、在乙酸乙酯中沉淀、离心、透析、冻干后得到聚合物粉末,即所述兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物聚己内酯-嵌段-聚[赖氨酸-无规-(S-芳酰基肟)],简称为[PCL-b-Poly(Lys-stat-SATO)];
(3)促进伤口愈合的聚合物囊泡的制备步骤
将步骤(2)所得兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物以1.0mg/mL的浓度溶解在N,N-二甲基甲酰胺中,在搅拌下以12d/min的速度滴加2倍于所述N,N-二甲基甲酰胺体积的去离子水,透析后得到促进伤口愈合的聚合物囊泡水溶液。
所述抗菌肽聚合物的氨基与所述硫化氢供体的摩尔比为1︰0.2;所述聚合物囊泡的粒径约为200nm;所述的聚合物囊泡作为广谱抗菌剂,对革兰氏阳性菌(MIC=30μg/mL)和革兰氏阴性菌(MIC=40μg/mL)均具有优异的抗菌活性;所述的聚合物囊泡作为治疗糖尿病伤口的喷雾剂,具有促进伤口愈合的功效,在第10天伤口几乎完全闭合。
实施例三
本实施例提供了一种促进伤口愈合的聚合物囊泡的制备方法,包括如下步骤:
(1)抗菌肽聚合物PCL-b-PLys和硫化氢供体SATO2的制备步骤
a.将聚已内酯PCL-NH2(0.426g)、赖氨酸NCA单体(0.475g)和15mL苯甲醚相混合,并在室温下使用真空泵抽真空搅拌反应30小时,依次经过透析、抽滤、真空干燥,得到所述抗菌肽聚合物聚己内酯-嵌段-聚赖氨酸,简称PCL-b-PLys;
b.将S-芳酰硫基羟胺(SBTHA)(100mg,0.650mmol)、对醛基苯甲酸(98.0mg,0.650mmol)、6μL三氟乙酸(TFA)、3A分子筛和2.5mL碳酸二甲酯相混合,并将混合物在室温下密封静置1小时。依次经过抽滤、旋蒸、重结晶、再抽滤得白色粉末,即化合物SATO1。将SATO1(5.72g,0.0200mol)、20μL N,N-二甲基甲酰胺和二氯亚砜(3.57g,0.0300mol)相混合,在60℃下反应30小时,旋蒸并真空干燥,用饱和碳酸氢钠溶液处理废液,得到硫化氢供体SATO2。
(2)兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物[PCL-b-Poly(Lys-stat-SATO)]的制备步骤
将步骤(1)所得聚己内酯-嵌段-聚赖氨酸(75.0mg,0.0200mmol)、硫化氢供体SATO2(105mg,0.350mmol)、三乙胺(300μL)、4-二甲氨基吡啶(10μL)和苯甲醚(1mL)相混合,于30℃反应40小时,依次经过旋蒸、溶解、在乙酸乙酯中沉淀、离心、透析、冻干后得到聚合物粉末,即所述兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物聚己内酯-嵌段-聚[赖氨酸-无规-(S-芳酰基肟)],简称为[PCL-b-Poly(Lys-stat-SATO)];
(3)促进伤口愈合的聚合物囊泡的制备步骤
将步骤(2)所得兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物以0.1mg/mL的浓度溶解在N,N-二甲基甲酰胺中,在搅拌下以45d/min的速度滴加1倍于所述N,N-二甲基甲酰胺体积的去离子水,透析后得到促进伤口愈合的聚合物囊泡水溶液。
所述抗菌肽聚合物的氨基与所述硫化氢供体的摩尔比为1︰1;所述聚合物囊泡的粒径约为350nm;所述的聚合物囊泡作为广谱抗菌剂,对革兰氏阳性菌(MIC=70μg/mL)和革兰氏阴性菌(MIC=100μg/mL)均具有优异的抗菌活性;所述的聚合物囊泡作为治疗糖尿病伤口的喷雾剂,具有促进伤口愈合的功效,在第11天伤口几乎完全闭合。
实施例四
本实施例提供了一种促进伤口愈合的聚合物囊泡的制备方法,包括如下步骤:
(1)抗菌肽聚合物PCL-b-PLys和硫化氢供体SATO2的制备步骤
a.将聚已内酯PCL-NH2(0.426g)、赖氨酸NCA单体(1.43g)和20mL对二甲苯相混合,并在室温下使用真空泵抽真空搅拌反应40小时,依次经过透析、抽滤、真空干燥,得到所述抗菌肽聚合物聚己内酯-嵌段-聚赖氨酸,简称PCL-b-PLys;
b.将S-芳酰硫基羟胺(SBTHA)(100mg,0.650mmol)、对醛基苯甲酸(98.0mg,0.820mmol)、10μL三氟乙酸(TFA)、3A分子筛和2.5mL二氯甲烷(DCM)相混合,并将混合物在室温下密封静置3小时。依次经过抽滤、旋蒸、重结晶、再抽滤得白色粉末,即化合物SATO1。将SATO1(5.72g,0.0200mol)、20μLN,N-二甲基甲酰胺和二氯亚砜(3.57g,0.0300mol)相混合,在70℃下反应24小时,旋蒸并真空干燥,用饱和碳酸氢钠溶液处理废液,得到硫化氢供体SATO2。
(2)兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物[PCL-b-Poly(Lys-stat-SATO)]的制备步骤
将步骤(1)所得聚己内酯-嵌段-聚赖氨酸(180mg,0.0200mmol)、硫化氢供体SATO2(270mg,0.900mmol)、三乙胺(400μL)、4-二甲氨基吡啶(11μL)和对二甲苯(1mL)相混合,于60℃反应30小时,依次经过旋蒸、溶解、在乙酸乙酯中沉淀、离心、透析、冻干后得到聚合物粉末,即所述兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物聚己内酯-嵌段-聚[赖氨酸-无规-(S-芳酰基肟)],简称为[PCL-b-Poly(Lys-stat-SATO)];
(3)促进伤口愈合的聚合物囊泡的制备步骤
将步骤(2)所得兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物以0.5mg/mL的浓度溶解在N,N-二甲基甲酰胺中,在搅拌下以35d/min的速度滴加1.5倍于所述N,N-二甲基甲酰胺体积的去离子水,透析后得到促进伤口愈合的聚合物囊泡水溶液。
所述抗菌肽聚合物的氨基与所述硫化氢供体的摩尔比为1︰1;所述聚合物囊泡的粒径约为400nm;所述的聚合物囊泡作为广谱抗菌剂,对革兰氏阳性菌(MIC=70μg/mL)和革兰氏阴性菌(MIC=90μg/mL)均具有优异的抗菌活性;所述的聚合物囊泡作为治疗糖尿病伤口的喷雾剂,具有促进伤口愈合的功效,在第10天伤口几乎完全闭合。
综上所述,本发明的制备方法是利用胺和酸酐在常温下进行开环聚合反应,所得的共聚物由硫化氢供体修饰后自组装形成分散非常均一的囊泡,制备方法十分简单。由于共聚物中有赖氨酸和含苯环的硫化氢供体无规链段的存在,使得囊泡具有抗菌肽的良好抗菌活性,能够防止伤口处细菌感染。由于囊泡中有含硫化氢供体链段,因此还可以促进糖尿病伤口愈合。这种纳米材料稳定性与生物相容性好,可以用于糖尿病伤口的治疗,在伤口愈合领域具有广泛的应用前景。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于上述实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种促进伤口愈合的聚合物囊泡,其特征在于:所述促进伤口愈合的聚合物囊泡由兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物聚己内酯-嵌段-聚[赖氨酸-无规-(S-芳酰基肟)]组装而成;
所述促进伤口愈合的聚合物囊泡的制备方法为将兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物溶解于第四类溶剂中,在搅拌下滴加1~2倍于第四类溶剂体积的去离子水,透析后得到促进伤口愈合的聚合物囊泡水溶液;
所述第四类溶剂为四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和二氧六环中的任意一种或几种。
2.根据权利要求1所述促进伤口愈合的聚合物囊泡,其特征在于:所述兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物的氨基与硫化氢供体的摩尔比为1︰(0.2~1.0)。
3.根据权利要求1所述促进伤口愈合的聚合物囊泡,其特征在于:所述促进伤口愈合的聚合物囊泡的粒径为200~400nm。
4.一种制备如权利要求1-3任一项所述的促进伤口愈合的聚合物囊泡的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)抗菌肽聚合物和硫化氢供体的制备
将聚已内酯、赖氨酸NCA单体和第一类溶剂相混合,并在室温下搅拌反应30~50小时,依次经过透析、抽滤、真空干燥,得到抗菌肽聚合物聚己内酯-嵌段-聚赖氨酸;
将S-芳酰硫基羟胺、对醛基苯甲酸、三氟乙酸、3A分子筛和第二类溶剂相混合,并将混合物在室温下密封静置1~5小时;依次经过抽滤、旋蒸、重结晶、再抽滤得白色粉末,即化合物SATO1;将SATO1、N,N-二甲基甲酰胺和二氯亚砜相混合,在60~80°C下反应12~30小时,旋蒸并真空干燥,用饱和碳酸氢钠溶液处理废液,得到硫化氢供体SATO2;
(2)兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物的制备
将步骤(1)所得抗菌肽聚合物聚己内酯-嵌段-聚赖氨酸、硫化氢供体SATO2、三乙胺、4-二甲氨基吡啶和第一类溶剂相混合,于30~90°C反应20~40小时,依次经过旋蒸、溶解、在第三类溶剂中沉淀、离心、透析、冻干后得到聚合物粉末,即所述兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物;
(3)促进伤口愈合的聚合物囊泡的制备步骤
将步骤(2)所得兼具抗菌活性和硫化氢供体功能的抗菌肽聚合物以0.1~1.0mg/mL的浓度溶解在第四类溶剂中,在搅拌下以12~45d/min的速度滴加1~2倍于所述第四类溶剂体积的去离子水,透析后得到促进伤口愈合的聚合物囊泡水溶液。
5.根据权利要求4所述的促进伤口愈合的聚合物囊泡的制备方法,其特征在于:所述制备抗菌肽聚合物和硫化氢供体的方法,在步骤(1)中,所述聚已内酯、所述赖氨酸NCA单体的摩尔比例为1︰(20~60);或者,
所述S-芳酰硫基羟胺、所述对醛基苯甲酸、所述三氟乙酸的摩尔比例为1︰(1.0~1.5)︰(0.1~0.4);或者,
所述SATO1、所述N,N-二甲基甲酰胺、所述二氯亚砜的摩尔比例为1︰(1.5~2.0)︰(0.01~0.04);或者,
所述第一类溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、苯甲醚和对二甲苯的一种或几种;或者,
所述第二类溶剂为二氯甲烷、二甲苯、碳酸二甲酯的一种或几种。
6.根据权利要求4所述促进伤口愈合的聚合物囊泡的制备方法,其特征在于:在步骤(2)中,所述抗菌肽聚合物聚己内酯-嵌段-聚赖氨酸、所述硫化氢供体SATO2、所述三乙胺、所述4-二甲氨基吡啶的摩尔比例为1︰(10~30)︰(0.05~0.2)︰(0.01~0.05);或者,
所述第一类溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、苯甲醚和对二甲苯的一种或几种;或者,
所述第三类溶剂为乙酸乙酯、四氢呋喃、异丙醇、二氧六环的一种或几种。
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