CN111225682A

CN111225682A - 合胞素用于将药物和基因靶向递送至肺组织的用途

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Publication number: CN111225682A
Application number: CN201880067674.XA
Authority: CN
Inventors: A·嘉利; Y·可坎; M·费兰德
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Genethon; Universite D'Evry Val D'Essonne
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Genethon; Universite D'Evry Val D'Essonne
Priority date: 2017-10-20
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2020-06-02
Also published as: JP7208231B2; WO2019077150A1; EP3697430A1; CA3078103A1; JP2021500341A; IL273923A; US20210198636A1; IL273923B1

Abstract

本发明涉及将药物递送(包括基因递送)靶向至肺组织的药物组合物，该组合物至少包含与合胞素蛋白相关的治疗性药物或基因，及其在预防和/或治疗肌肉损伤或疾病，特别是在使用合胞素蛋白假型化的慢病毒载体颗粒或慢病毒样颗粒基因治疗所述疾病中的用途。

Description

合胞素用于将药物和基因靶向递送至肺组织的用途

技术领域

本发明涉及用于靶向肺组织的药物组合物及其在预防和/或治疗肺病中的用途。更特别地，本发明涉及合胞素用于将药物靶向递送(包括基因递送)至肺的用途。

背景技术

靶向治疗有望治疗肺病，例如囊性纤维化。但是，靶向药物递送(包括基因递送)的临床相关性在于特异性靶向药物或药物载体以最小化源自药物的全身毒性作用，特别是最小化肝脏毒性的能力。

已开发出基于质粒、腺病毒、腺相关病毒和逆转录病毒的载体用于靶向治疗，但这些载体由于基因转移的效率差、针对病毒载体的宿主免疫应答或增殖细胞进行转导的要求而受到限制。

天然存在的病毒的趋向性是由于一个或若干个分子决定簇赋予了结合细胞并进入这些细胞以感染它们的特定能力。病毒趋向性的分子决定簇可用于产生基因递送的新工具。在包膜病毒(例如逆转录病毒)的情况下，这称为假型化(pseudotyping)，通常通过将外源蛋白锚定在其脂质包膜中而与逆转录病毒或慢病毒(典型地基于HIV-1)载体一起使用。假型通常能够结合细胞受体并使载体膜与靶细胞膜融合以使其进入。

作为大小约为120nm的包膜RNA颗粒的慢病毒载体(LV)是有效的药物递送工具，特别是基因递送工具。LV通过赋予其假型的包膜蛋白结合并进入靶细胞。一旦LV进入细胞，它释放衣壳成分并经历慢病毒RNA的逆转录，然后将前病毒DNA整合到靶细胞的基因组中。非整合型慢病毒载体已通过改变载体整合机制的特性而产生，并且可用于瞬时基因表达。缺乏前病毒的病毒样颗粒也已产生，并且可用于递送蛋白质或信使RNA。例如，LV可以用于基因添加、RNA干扰、外显子跳跃或基因编辑。所有这些途径都可以经由LV的假型通过LV的组织或细胞靶向来实现。

常见的假型化蛋白是水泡性口炎病毒糖蛋白(VSVg)，已知其赋予广泛的趋向性、颗粒稳定性和高滴度。但是，体内VSVg结合补体，并且当在体内使用时，其将转基因靶向递送至肝脏并且具有免疫原性(Ciréet al.Plos One,9,e101644,2014)。因而，体内基因递送需要新的假型。

因此，需要提供至少包含用于预防和/或治疗肺病的药物的组合物，其靶向肺组织并且其没有肝毒性(即，其不靶向肝)。

特别地，提供稳定的病毒或病毒载体以改进将药物(特别是基因)递送入肺组织将是高度相关的。这种病毒或病毒载体必须是完全耐受的，对肺组织具有特异性，并且对于***施用是足够的。

合胞素是具有促融合特性的内源性逆转录病毒(ERV合胞素)包膜糖蛋白(Dupressoir et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America,2005,102,725-730；Lavialle et al.,Phil.Trans.R.Soc.B.,2013,368:20120507)。专利申请EP2385058已经描述了由ERVW-1基因(ENSG00000242950；也称为合胞素-1或HERV-W)编码的人内源性逆转录病毒包膜糖蛋白的促融合特性。所述申请描述了其通过形成合胞体在癌症治疗中的用途。鼠合胞素包括鼠合胞素-A(即：家鼠(mus musculus)合胞素-A，synA)和鼠合胞素-B(即：家鼠合胞素-B，synB)。

但是，已经表明合胞素A的候选受体Ly6e在小鼠成年组织中相当普遍地表达(Bacquin et al.,J.Virol.Doi:10.1128/JVI.00832-17，仅于2017年7月5日发表)。更特别地，发现小鼠肝中Ly6e的转录水平为成年肺中达到的最大水平的60％以上。此外，若干器官(如大脑、甲状腺和唾液腺)表达在肺中观察到的最大水平的至少50％。基于这些结果可以预期，使用靶向Ly6e受体的***进行基因递送将是相当普遍的，并且特别是其靶向肺和肝以及许多其他器官的效率几乎相同。这种缺乏特异性可能会在其中应避免肝靶向的临床情况中带来潜在的困难。

此外，据报道，合胞素不会产生功能性假型，这可能是由于不当地掺入病毒颗粒所致(Bacquin et al.,J.Virol.Doi:10.1128/JVI.00832-17,仅于2017年7月5日发表)。

发明概述

出乎意料并且与现有技术所期望的相反，作者发现合胞素可用于假型LV，因此可用于在肺组织中靶向递送基因而没有肝毒性的风险。实际上，鼠合胞素-A糖蛋白已用于假型化编码萤光素酶LucII的HIV-1衍生的慢病毒载体。将假型化LV静脉内注入小鼠，并在肺实质细胞中长期(至少3周)可再现地获得高水平的转基因表达，而在肝脏中几乎没有表达。在单次静脉注射LV-SynA载体3周后，在小鼠肺中检测到转基因盒，表明可以实现稳定的整合基因转移，特别是在肺泡细胞中。与用VSVg假型化的LV相比，向小鼠静脉内施用LV-SynA载体导致更少和非常低的抗转基因免疫应答。除鼠合胞素A外，人合胞素2可用于假型化慢病毒载体，以有效地转导人肺细胞，包括人原代肺上皮细胞。报道为鼠合胞素A的受体的mLy6e的细胞系表达无法预测通过用SynA假型化LV来转导细胞的能力。此外，人Ly6e受体表达mRNA水平与用LV-SynA转导之间没有相关性。

这些结果提供了概念证明，即合胞素可以可靠地用于治疗药物向肺的靶向递送，所述治疗药物包括治疗基因或编码治疗药物的基因。合胞素，特别是用合胞素假型化的LV，可用于***施用后在肺泡细胞中递送包括转基因的药物。这开辟了治疗诸如囊性纤维化的肺病的新方法，其中气道阻塞性粘液阻止了包括基因递送载体的药物进入肺上皮细胞，特别是肺泡细胞。

因此，本发明涉及靶向肺组织的药物组合物用于预防和/或治疗肺病的用途，所述药物组合物至少包含与合胞素蛋白结合的药物。

发明详述

根据本发明的合胞素(也称为ERV合胞素)是指来自真哺乳亚纲哺乳动物的高度促融合包膜糖蛋白，其属于内源性逆转录病毒(ERV)家族。这些蛋白质由在胎盘中显示优先表达并在引入培养细胞时诱导形成合胞体的基因编码(Lavialle et al.,Phil.Trans.R.Soc.B.,2013,368:20120507)。

根据本发明的合胞素可以选自人合胞素(例如：HERV-W和HERV-FRD)、鼠合胞素(例如：合胞素-A和合胞素-B)、合胞素-Ory1、合胞素-Car1、合胞素-Rum1或它们的功能性直系同源物(Dupressoir et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America,2005,102,725-730；Lavialle et al.,Phil.Trans.R.Soc.B.,2013,368:20120507)以及至少包含受体结合结构域的其功能性片段(对应于合胞素-1的残基117-144)。

功能性直系同源物意指由直系同源基因编码的并且表现出促融合特性的直系同源蛋白。如Dupressoir等(PNAS 2005)所述，可以在融合测定中评估促融合特性。简言之，例如通过使用Lipofectamine(Invitrogen)转染细胞，约1-2μg DNA用于5×10⁵个细胞或磷酸钙沉淀(Invitrogen，5-20μg DNA用于5×10⁵个细胞)。通常在转染后24-48小时检查平板的细胞融合。通过使用May-Grünwald和Giemsa染色(Sigma)可以看到合胞体，并且融合指数计算为[(N-S)/T]×100，其中N是合胞体中的核数，S是合胞体数，T是计数的核总数。

人合胞素包括HERV-W和HERV-FRD。这些蛋白质的功能性直系同源物可以在人科中发现。HERV-W是指属于人内源性逆转录病毒(HERV)家族的高促融合膜糖蛋白。HERV-W是包膜糖蛋白；它也称为合胞素-1。它具有Ensembl数据库中所示的序列，对应于转录物ERVW-1-001、ENST00000493463。相应的cDNA具有SEQ ID NO：1所示的序列。HERV-FRD也指属于人内源性逆转录病毒(HERV)家族的高促融合膜糖蛋白。HERV-FRD是包膜糖蛋白，也称为合胞素-2。它具有Ensembl数据库中所示的序列，对应于转录物ERVFRD-1、ENSG00000244476。相应的cDNA具有SEQ ID NO：2所示的序列。

鼠合胞素包括鼠合胞素-A(即：家鼠合胞素-A，synA)和鼠合胞素-B(即：家鼠合胞素-B，synB)。这些蛋白质的功能性直系同源物可以在鼠科家族中找到。鼠合胞素-A由合胞素-A基因编码。合胞素-A具有如Ensembl数据库Syna ENSMUSG00000085957中所示的序列。相应的cDNA具有SEQ ID NO：3所示的序列。鼠合胞素-B由合胞素-B基因编码。合胞素-B具有Ensembl数据库Synb ENSMUSG00000047977中所示的序列。相应的cDNA具有SEQ ID NO：4所示的序列。

合胞素-Ory1由合胞素-Ory1基因编码。合胞素-Ory1的功能性直系同源物可以在兔科家族(典型地是兔子和野兔)中找到。

合胞素-Car1由合胞素-Car1基因编码。合胞素-Car1的功能性直系同源物可以在来自劳亚兽总目的食肉动物哺乳动物中找到(Cornelis et al.,Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,2013,110,E828–E837；Lavialle et al.,Phil.Trans.R.Soc.B.,2013,368:20120507)，

合胞素-Rum1由合胞素-Rum1基因编码。合胞素Rum-1的功能性直系同源物可以在反刍哺乳动物中找到。

在本发明的各种实施方案中，根据本发明的合胞素可以典型地选自下组：HERV-W(合胞素-1)、HERV-FRD(合胞素-2)、合胞素-A、合胞素-B、合胞素-Ory1、合胞素-Car1和合胞素-Rum1及它们的功能性直系同源物；优选地，ERV合胞素选自下组：HERV-W、HERV-FRD、鼠合胞素-A、鼠合胞素-B及它们的功能性直系同源物，更优选地，ERV合胞素选自下组：HERV-W、HERV-FRD、鼠合胞素-A和鼠合胞素-B。

在本发明的各种实施方案中，使用本领域已知的标准偶联方法，通过共价或非共价偶联或键合，将治疗药物直接或间接地与合胞素蛋白结合。

在一些实施方案中，将药物共价偶联至合胞素蛋白。例如，药物可以与合胞素缀合。可以通过在合胞素蛋白中掺入反应性基团，然后使用该基团将药物共价连接来实现药物与合胞素的共价偶联。或者，可以将作为蛋白质的药物与合胞素融合以形成融合蛋白，其中合胞素和药物氨基酸序列直接连接或通过肽间隔子或接头连接。

在一些其他实施方案中，将药物和合胞素蛋白掺入药物递送载体，例如基于聚合物或基于颗粒的递送载体，包括但不限于胶束、脂质体、外泌体、树状聚合物、微粒、纳米颗粒、病毒颗粒、病毒样颗粒等。

如本文所用，术语“病毒载体”是指工程化以用于将遗传物质递送到细胞中的非复制性、非致病性病毒。在病毒载体中，复制和毒力必不可少的病毒基因已被异源目标基因取代。

如本文所用，术语“重组病毒”是指通过重组DNA技术产生的病毒，特别是病毒载体。

如本文所用，术语“病毒颗粒”或“病毒性颗粒”旨在表示非病原性病毒的胞外形式，特别是病毒载体，其由从DNA或RNA制成的遗传物质组成，并被蛋白外壳(称为衣壳)包围，在某些情况下被源自宿主细胞膜的一部分并且包括病毒糖蛋白的包膜包围。

如本文所用，术语“病毒样颗粒”或“VLP”是指自组装、非复制、非致病性、无基因组的颗粒，其大小和构型与完整的感染性病毒颗粒相似。

在一些优选的实施方案中，将药物和合胞素蛋白掺入颗粒中，例如脂质体、外泌体、微粒、纳米颗粒、病毒颗粒和病毒样颗粒。颗粒有利地选自下组：脂质体、外泌体、病毒颗粒和病毒样颗粒。病毒颗粒和病毒样颗粒包括病毒衣壳和包膜病毒或病毒样颗粒。包膜病毒或病毒样颗粒包括假型化病毒或病毒样颗粒。病毒或病毒样颗粒优选来自逆转录病毒，更优选来自慢病毒。病毒颗粒有利地来自病毒载体，优选慢病毒载体。

逆转录病毒特别包括γ逆转录病毒、泡沫病毒和慢病毒。慢病毒特别包括人免疫缺陷病毒，例如1型HIV(HIV1)和2型HIV(HIV2)和马传染性贫血病毒(EIAV)。

例如，慢病毒样颗粒描述于Muratori et al.,Methods Mol.Biol.,2010,614,111-24；Burney et al.,Curr.HIV Res.,2006,4,475-484；Kaczmarczyk et al.,ProcNatl Acad Sci USA.,2011,108,16998–17003；Aoki et al.,Gene Therapy,2011,18,936-941。慢病毒样颗粒的实例是通过在生产者细胞中共表达产生的VLP，即具有gag融合蛋白的合胞素蛋白(与目标基因融合的Gag)。

药物和/或合胞素可以呈现在颗粒的表面上，或包封(包装)入颗粒中。合胞素蛋白有利地呈现在颗粒的表面上，例如与颗粒偶联或掺入病毒颗粒或病毒样颗粒的包膜中(包被)以形成假型化包膜病毒颗粒或病毒样颗粒。将药物与颗粒偶联或包装入颗粒中。例如，将药物与病毒衣壳偶联或包装入病毒衣壳中，其中所述病毒衣壳可进一步包含包膜，优选用合胞素假型化。在一些优选的实施方案中，将药物包装入用合胞素蛋白假型化的颗粒中。包装入颗粒的药物有利地是异源目标基因，其被包装入病毒载体颗粒中，优选逆转录病毒载体颗粒中，更优选慢病毒载体颗粒中。

在一些更优选的实施方案中，颗粒是包膜病毒颗粒或病毒样颗粒，优选用合胞素蛋白假型化的包膜病毒颗粒或病毒样颗粒，甚至更优选用合胞素蛋白假型化的慢病毒载体颗粒或用合胞素蛋白假型化的慢病毒样颗粒。用合胞素蛋白假型化的包膜病毒颗粒，优选用合胞素蛋白假型化的慢病毒载体颗粒有利地包装了(异源)目标基因。

在本发明的各种实施方案中，药物是通过靶向递送至肺组织的细胞，特别是肺实质细胞(如肺上皮细胞)来治疗肺病的任何目标药物。这些药物包括但不限于：抗感染药，例如抗细菌、病毒、真菌或寄生虫药；抗炎药；抗癌药；免疫治疗药，包括免疫调节药、免疫抑制药；抗组胺药、抗过敏药或免疫刺激药；治疗性蛋白质，包括治疗性抗体或抗体片段和基因组编辑酶、治疗性肽、治疗性RNA和用于治疗的目标基因，包括治疗性基因和编码上述治疗性蛋白质、治疗性肽和/或治疗性RNA的基因。在一些实施方案中，药物不包括抗癌药。药物可以是天然、合成或重组的分子或试剂，例如核酸、肽核酸(PNA)、蛋白质(包括抗体和抗体片段)、肽、脂质(包括磷脂、脂蛋白和磷脂蛋白)、糖、小分子、其他分子或试剂，或其混合物。免疫抑制药物包括例如白介素10(IL10)、CTLA4-Ig和其他免疫抑制蛋白或肽。脂蛋白复合物特别包括肺表面活性剂。蛋白质包括表面活性剂特异性蛋白质，例如蛋白质A(SP-A)、SP-B、SP-C和SP-D，特别是SP-B和SP-C。治疗性核酸(例如治疗性RNA)包括能够外显子跳跃的反义RNA(例如修饰的小核RNA(snRNA))、向导RNA或用于基因组编辑的模板，以及干扰RNA(例如shRNA和microRNA)。

“用于治疗的目标基因”、“治疗目标基因”、“目标基因”或“异源目标基因”是指治疗性基因或编码用于治疗肺病的治疗性蛋白质、肽或RNA的基因。

治疗性基因可以是基因或其片段的功能版本。功能版本是指所述基因的野生型版本，属于相同家族的变体基因或保留编码蛋白的功能的截短版本。基因的功能版本可用于替代或加性基因治疗，以替代患者的缺乏或无功能的基因。基因功能版本的片段可用作与基因组编辑酶结合使用的重组模板。

或者，目标基因可以编码包括治疗性抗体或抗体片段、基因组编辑酶或治疗性RNA的治疗性蛋白质。目标基因是能够在肺组织的细胞，特别是肺实质细胞(如肺上皮细胞)中产生编码的蛋白质、肽或RNA的功能性基因。治疗性蛋白可以是如上定义的任何药物，例如抗感染、抗炎、抗癌和免疫治疗药物。

治疗性RNA有利地与靶DNA或RNA序列互补。例如，治疗性RNA是干扰RNA，例如shRNA、microRNA、与Cas酶或类似酶组合用于基因组编辑的向导RNA(gRNA)、或能够外显子跳跃的反义RNA，例如修饰的小核RNA(snRNA)。干扰RNA或microRNA可用于调节参与肺病的靶基因的表达。与Cas酶或类似酶组合用于基因组编辑的向导RNA可用于修饰靶基因序列，特别是用于校正突变/缺陷基因的序列，或修饰参与肺病的靶基因的表达。能够外显子跳跃的反义RNA特别用于校正阅读框并恢复具有破坏的阅读框的缺陷基因的表达。

根据本发明的基因组编辑酶是在靶基因组位点处诱导遗传修饰的酶或酶复合物。基因组编辑酶有利地是工程化核酸酶，其在靶基因组基因座中产生双链断裂(DSB)，例如但不限于，大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子基核酸酶(TALEN)、来自簇状规则间隔回文重复序列(CRISPR)-Cas***的Cas酶和类似的酶。基因组编辑酶，特别是工程化核酸酶，通常但不必定与通过双链断裂(DSB)诱导的同源重组修饰靶基因组基因座的同源重组(HR)基质或模板(也称为DNA供体模板)结合使用。特别地，HR模板可以将目标转基因引入靶基因组基因座中或修复靶基因组基因座中的突变，优选在引起肺病的异常或缺陷基因中。

有利地，将目标基因包装入用合胞素蛋白假型化的包膜病毒载体颗粒中，优选用合胞素蛋白假型化的慢病毒载体颗粒中。病毒载体包含为可在肺细胞中表达的形式的目标基因。特别地，目标基因与在肺细胞中起作用的普遍存在的、组织特异性的或可诱导的启动子，特别是与人EF1-α启动子结合的强启动子(例如人CMV增强子)可操作地连接。

在本发明的一些优选实施方案中，包括用于治疗肺病的目标基因的目标药物对肺病是特异性的，因为它靶向在肺细胞中特异性表达的参与肺病的基因或基因产物(蛋白质/肽)。特别地，与其他细胞类型相比，靶基因或基因产物在肺细胞中高度表达。靶基因或基因产物还包括来自肺病原体(例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、呼吸道合胞病毒(RSV)等)的基因和基因产物。

本发明涵盖包含两种或多种与合胞素蛋白相关的药物的药物组合物，和/或其中至少两种不同的合胞素蛋白与一种或多种药物相关的组合物。

在本发明的各种实施方案中，药物组合物，特别是包含如前所定义的在其表面上呈现合胞素的颗粒的组合物，甚至更优选地，用合胞素假型化的包装包括目标基因的目标药物的慢病毒颗粒通过转导肺组织的细胞，例如特别是肺实质细胞如(肺上皮细胞)而用于肺病的任何靶向治疗。

肺部包含呼吸道及其内层，其终止于肺泡、其间的肺组织(肺实质)以及静脉、动脉、神经和***。

下呼吸道始于气管和支气管。这些结构衬有具有纤毛、小叶状突起的柱状上皮细胞。散布在上皮细胞中的是产生粘液的上皮杯状细胞，以及作用类似于巨噬细胞的俱乐部细胞。气管和支气管周围是软骨环，其有助于维持稳定性。细支气管具有相同的柱状上皮衬里，但不被软骨环包围。相反，它们被一层平滑肌包围。呼吸道终止于小叶。这些由呼吸性细支气管组成，其分支成肺泡管和肺泡囊，肺泡囊又分成肺泡。

贯穿呼吸道的上皮细胞分泌上皮衬里液(ELF)，其组成受到严格调节，并决定了粘膜纤毛清除的效果，其依次涂有一层表面活性剂。

肺泡由两种类型的肺泡细胞和肺泡巨噬细胞组成。两种类型的细胞称为I型和II型肺泡细胞(也称为肺细胞)。I型和II型组成壁和肺泡隔。I型细胞提供每个肺泡表面积的95％，而II型细胞通常聚集在肺泡的角落。I型是构成肺泡壁结构的鳞状上皮细胞。它们的壁非常薄，可以轻松进行气体交换。这些I型细胞还构成分隔每个肺泡的肺泡隔。间隔由上皮衬里和相关的基底膜组成。I型细胞不能***，因此依赖于从II型细胞分化。II型上皮细胞更大，它们排列在肺泡内并产生和分泌上皮衬里液和肺表面活性剂。II型细胞能够***并分化为1型细胞。本发明的组合物允许靶向递送至肺组织的细胞。典型地，组合物允许靶向递送至肺实质细胞，例如肺上皮细胞。

在本发明的一些实施方案中，本发明的药物组合物，特别是包含如前所定义的在其表面上呈现合胞素的颗粒的组合物，甚至更优选地，用合胞素假型化的包装目标药物或基因(优选目标基因)的慢病毒载体颗粒用于肺病的(靶向)基因治疗。

基因疗法可以通过以下进行：基因转移、基因编辑、外显子跳跃、RNA干扰、顺式剪切，或细胞中任何编码或调控序列，包括在细胞核、线粒体中含有的那些或作为共生核酸(例如但不限于细胞中含有的病毒序列)的任何其他遗传修饰。

两种主要的基因疗法如下：

-旨在为缺陷/异常基因提供功能性替代基因的疗法：这是替代或加性基因疗法；

-旨在基因或基因编辑的疗法：这种情况下，目的是为细胞提供必要工具以纠正序列或修饰缺陷/异常基因的表达或调控，从而表达功能性基因：这是基因编辑疗法。

在加性基因疗法中，目标基因可以是患者中缺陷或突变的基因的功能性版本，例如在遗传疾病中就是这种情况。在这种情况下，目标基因将恢复功能性基因的表达。更优选地，在这种实施方案中，本发明的组合物优选包含编码目标基因的病毒载体。甚至更优选地，病毒载体是整合病毒载体，例如逆转录病毒，特别是如前所述的慢病毒。

基因或基因组编辑使用一种或多种目标基因，例如：(i)编码如上定义的治疗性RNA的基因，例如干扰RNA(如shRNA或microRNA)；与Cas酶或类似酶组合使用的向导RNA(gRNA)；或能够外显子跳跃的反义RNA，例如修饰的小核RNA(snRNA)；(ii)编码如上定义的基因组编辑酶的基因，例如工程化核酸酶，例如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应物基核酸酶(TALEN)、Cas酶或类似的酶；或这些基因的组合，以及最终还有如上所定义的用作重组模板的基因的功能性版本的片段。可以使用非整合型病毒载体，例如非整合型慢病毒载体来进行基因编辑。

特别令人感兴趣的是表现出肺病的患者的缺陷或突变基因，一旦在肺组织细胞中进行纠正，则会改进患者的疾病或症状。肺组织细胞优选为肺实质细胞，例如呼吸道上皮细胞或肺泡细胞。影响肺部的遗传疾病中的突变基因的实例如下：

-与家族形式的慢性阻塞性肺疾病(COPD)有关的基因，例如(参见Seifart C,Plagens A.Genetics of chronic obstructive pulmonary disease.InternationalJournal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease.2007；2(4):541-550)：

-编码α1-抗胰蛋白酶(A1AT)的基因SERPINA1，其缺陷是经证实的COPD遗传危险因素之一。A1AT是分泌的并且是丝氨酸蛋白酶抑制剂，其靶标包括弹性蛋白酶、纤溶酶、凝血酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和纤溶酶原激活剂。A1AT是可对中性粒细胞弹性蛋白酶提供主要防御作用的急性期蛋白。该基因的缺陷可引起肺气肿或肝病。已发现该基因的几个编码相同蛋白质的转录物变体，

-编码α1-抗胰凝乳蛋白酶(SERPINA3)的基因SERPINA3能够以可逆方式抑制组织蛋白酶G和肥大细胞糜酶。在SERPINA3基因中，两个功能性SNP与低水平的α1-抗胰凝乳蛋白酶和COPD相关；

-编码基质金属蛋白酶(MMP)的基因，例如MMP9、MMP1和MMP2。

-CFTR基因，其编码排列在肺和其他器官的上皮细胞表面发现的氯化物转运蛋白。CFTR基因缺陷导致囊性纤维化(CF)，这是特征在于支气管扩张的最常见的致命性遗传病之一。它导致机体产生阻塞肺部的粘稠的粘液，导致感染，并阻塞胰腺，阻止消化酶到达需要消化食物的肠道。在该基因中发现数百种突变，所有这些突变均导致上皮细胞转运氯化物，其次是钠。结果，机体分泌物中氯化钠(盐)的量增加。CF的疾病症状的严重性与患者已经遗传的特定突变的特征作用直接相关。

–参与具有原发性肺病的疾病(例如肺间质性肺病(ILD)和弥散性实质性肺疾病(DLPD，一种影响肺泡周围组织和空间的数百种不同肺部疾病的异质集合))的缺陷基因。若干突变与原发性肺病或包括肺的多种器官疾病有关(参见Devine MS,Garcia CK.GeneticInterstitial Lung Disease.Clinics in Chest Medicine.2012；33(1):95-110,或Steele MP,Brown KK.Genetic Predisposition to Respiratory Diseases:Infiltrative Lung Diseases.Respiration；international review of thoracicdiseases.2007；74(6):601-608,以及Selman M,et al.Surfactant protein A and Bgenetic variants predispose to idiopathic pulmonary fibrosis.Hum Genet.2003；113:542–550或Nogee LM,et al.Allelic heterogeneity in hereditary surfactantprotein B(SP-B)deficiency.Am J Respir Crit Care Med.2000；161:973–981)，如：

与表面活性剂功能障碍有关的基因：

-SFTPB基因，其突变与SP-B缺失有关，并在表面活性剂代谢功能障碍1(一种新生儿和婴儿的严重呼吸窘迫)患者中被发现；

-SFTPC基因，其突变与SP-C缺失和ER应激有关，并在表面活性剂代谢功能障碍2(一种新生儿和婴儿的严重呼吸窘迫)患者中被发现；

-SFTPA2基因，其突变与肺泡上皮的ER应激有关，并在家族性肺纤维化患者中被发现；

-SFTPD基因，其突变与哮喘中的COPD和特应性反应有关(Fakih et al.,Respirology,2017Sep 28.doi/10.1111/resp.13193)；

-ABCA3基因，其突变与磷脂进入层状体的缺陷转运有关，并在表面活性剂代谢功能障碍3(一种新生儿和婴儿的严重呼吸窘迫)患者中被发现；

-CSF2RA基因(其突变与GM-CSF信号缺陷有关)，CSF2RA在表面活性剂代谢功能障碍4(一种新生儿和婴儿的严重呼吸窘迫)患者中被发现；

-SLC34A2基因，其突变与肺泡空间中磷酸盐清除率降低有关，并在肺泡微结石症患者中被发现。

尽管这种蛋白可以在机体的若干器官和组织中被发现，但它主要位于肺中数百万个小气囊(肺泡)中，特别是在产生表面活性剂的II型肺泡细胞中。

其他目标基因：

-TERT基因，其突变与端粒缩短有关，并在家族性肺纤维化患者中被发现；

-TERC基因，其突变在家族性肺纤维化患者中被发现；

-DKC1、TERC、TERT、TINF2，其突变与端粒缩短有关并涉及先天性角化不全；

-NF1基因，其突变与I型神经纤维瘤病患者的肿瘤抑制功能丧失有关；

-TSC1基因(其突变与与LAM细胞增殖有关)和TSC2，其突变在结节性硬化症/LAM患者中被发现；

-FLCN基因，其突变与卵泡蛋白的丧失有关，并在Birt-Hogg-Dubé综合征患者中被发现；

-HPS1基因，其突变与细胞质细胞器的缺陷有关和HSP4基因，其突变在Hermansky-Pudlak综合征患者中被发现；

-GBA基因，其突变与酸性β-葡萄糖苷酶缺乏有关，并在I型Gaucher病患者中被发现；

-SMPD1基因，其突变与酸性鞘磷脂酶缺乏有关，并在B型Niemann-Pick病患者中被发现；

-SLC7A7基因，其突变与阳离子氨基酸转运缺陷有关，并在赖氨酸尿酸蛋白耐受不良的患者中被发现；

-参与原发性肺动脉高压，导致肺动脉高压、血管重塑和过早死亡的缺陷基因，例如：

-编码SMAD家族成员的SMAD9基因，其转导来自TGF-β家族成员的信号。编码的蛋白被骨形态发生蛋白激活，并与SMAD4相互作用。在原发性肺动脉高压-2(PPH2)患者中鉴定了SMAD9基因的杂合截短突变(R294X)。

-编码4-跨膜/2孔结构域超家族中的pH敏感性钾通道的KCNK3基因。在原发性肺动脉高压-4(PPH4)患者中鉴定了在高度保守的残基上存在若干取代，包括E182K、V221L、G97R和G203D。

-CAV1基因，其突变与原发性肺动脉高压-3(PPH3)相关。

这些基因可以在替代基因疗法中在肺组织中被靶向，其中目标基因是缺陷或突变基因的功能性版本。

或者，这些基因可用作基因编辑的靶标。基因编辑的一个具体实例将是治疗囊性纤维化：在这种疾病中，在一些患者群中观察到CFTR基因的点缺失(F508Del)或点突变(如G551D、G542X(L265P))。因此，通过在患病的患者中编辑该基因的正确版本的基因，这可能有助于针对该疾病的有效治疗。可以使用相同的原理通过基因编辑来治疗以上所列其他遗传性肺病。

具有原发性肺病或具有多种器官病理(包括严重肺病)的遗传性疾病中的突变基因的实例，特别是在肺上皮细胞中表达的导致无功能的上皮衬里液或肺表面活性剂的产生，可以通过表达或纠正上皮细胞中的因果基因来治疗的突变基因的实例如下：SERPINA3、SERPINA1、MMP(尤其是MMP1、MMP2和MMP9)、CFTR、SFTPB、SFTPC、ABCA3、CSF2RA、TERT、TERC、SFTPA2、SLC34A2、DKC1、TERC、TERT、TINF2、NF1、TSC1、FLCN、STAT3、HPS1、GBA、SMPD1、SLC7A7、SMAD9、KCNK3和CAV1。

更优选地，目标基因可选自下组：SERPINA3、SERPINA1、MMP、CFTR、SFTPB、SFTPC、ABCA3、CSF2RA、TERT、TERC、SFTPA2、SLC34A2、SMAD9、KCNK3和CAV1，它们与影响肺的疾病尤其相关，包括囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、各种间质性肺疾病(ILD)或弥漫性实质性肺疾病和原发性肺动脉高压。

选自下组的基因与影响包括肺的多个器官的遗传性疾病有关：DKC1、TERC、TERT、TINF2、NF1、TSC1、FLCN、STAT3、HPS1、GBA、SMPD1和SLC7A7。

在一个实施方案中，目标基因还可以选自在肺中特异性表达的基因，例如更特别地，选自下组：SERPINA3、SERPINA1、CFTR、SFTPB、SFTPC、SFTPA2和ABCA3。

基因疗法也可用于治疗哮喘，通过纠正引起哮喘中的COPD和特应性反应的表面活性剂蛋白D基因突变(Fakih et al.,Respirology2017)或通过表达诸如抗体或抗体片段的分子，阻断肺中的IL4、IL-13IL-23或表达调节肺中的嗜酸性粒细胞、肥大细胞或Th2炎症的分子。

替代或加性基因疗法也可以用于治疗癌症，尤其是肺癌。癌症中目标基因可以调节肿瘤细胞的细胞周期或代谢和迁移，或诱导肿瘤细胞死亡。例如，诱导型胱天蛋白酶-9可以在肺组织的上皮细胞中表达以触发细胞死亡，优选在联合疗法中引起持久的抗肿瘤免疫应答。

在基因疗法中，通过转导所述细胞，可能可以使用如前所述的本发明组合物，更具体地，将根据本发明的用合胞素假型化的稳定的慢病毒颗粒用于肺组织工程，优选内源性肺干细胞工程的治疗中(Nichols JE,Niles JA,Cortiella J.Design and developmentof tissue engineered lung:Progress and challenges.Organogenesis.2009,5,57-61)。

也可以***有利于基因剪接、表达或调控或基因编辑的序列。工具(如CRISPR/Cas9)可用于此目的。在自身免疫或癌症的情况下，它可用于修饰肺实质细胞(如肺上皮细胞)中的基因表达，或扰乱病毒在此类细胞中的周期。在这种情况下，优选地，异源目标基因选自编码向导RNA(gRNA)、位点特异性核酸内切酶(TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、Cas核酸酶)、DNA模板和RNAi成分(例如shRNA和microRNA)的那些。

为了治疗感染性肺病，目标基因也可以靶向肺病原体生命周期的必要成分。例如，目标基因可以编码能够特异性识别肺病原体并阻断其生命周期或其作用的抗体或抗体样分子。

“感染性疾病”是指由病原微生物(如细菌、病毒、寄生虫或真菌)引起的疾病；该疾病可以直接或间接地从一个人传播到另一个人。

可以将根据本发明的包含稳定的假型化慢病毒颗粒的药物组合物一起或顺次用于靶向相同的细胞。这在其中需要将基因编辑平台的多种成分添加到细胞中的策略(例如基因编辑)中可能是一个优势。

在本发明的一些其他实施方案中，包含与合胞素蛋白相关的药物的本发明药物组合物，特别是包含如前所定义的在其表面上呈现合胞素的颗粒的组合物，甚至更优选地用合胞素假型化的包装目标药物或目标基因(优选目标基因)的慢病毒颗粒用于免疫调节或调节肺移植耐受性。特别地，将组合物施用于肺移植供体以预防肺移植排斥。对于这些用途，该药物特别是免疫抑制药物，例如IL-10、CTLA4-Ig或其他免疫抑制肽或改进***生成的VEGF突变体(Cui et al.J.Clin.Invest.2015,Nov 2；125(11):4255-68.)，并且目标基因是编码所述免疫抑制药物或VEGF突变体的基因。

在本发明的一些其他实施方案中，包含与合胞素蛋白相关的药物的本发明药物组合物，特别是包含如前所定义的在其表面上呈现合胞素的颗粒的组合物，甚至更优选地用合胞素假型化的包装目标药物或目标基因(优选目标基因)的慢病毒颗粒用于与竞争蛋白一起治疗纤维化或淀粉样变性。

在一些其他实施方案中，将本发明的包含由含合胞素的病毒样颗粒递送的肺表面活性剂或表面活性剂复合物的药物组合物以表面活性剂替代疗法向新生儿或早产婴儿施，用以预防肺部问题或疾病(例如，参见Poulain FR,Clements JA.Pulmonary surfactanttherapy.Western Journal of Medicine.1995；162,43-50)。特别地，药物组合物包含包装入在其表面上呈现合胞素的包膜的慢病毒样颗粒中的表面活性剂蛋白或编码表面活性剂蛋白的RNA。

在本发明的各种实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的与合胞素蛋白相关的药物。

在本发明的上下文中，如本文所用，术语“治疗”是指逆转、缓解或抑制该术语所适用的疾病或病症的发展，或逆转、缓解或抑制该术语所适用的疾病或病症的一种或多种症状的发展。

同样，治疗有效量是指足以逆转、缓解或抑制该术语所适用的疾病或病症的发展，或逆转、缓解或抑制该术语所适用的疾病或病症的一种或多种症状的发展的剂量。

有效剂量的确定和调节取决于各种因素，例如所使用的组合物、施用途径、所考虑的个体的身体特征(例如性别、年龄和体重)、同时用药以及医学领域将认可的其他因素。

在本发明的各种实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体和/或介质。

“药学上可接受的载体”是指当适当地施用于哺乳动物，尤其是人时不产生有害、过敏或其他不良反应的介质。药学上可接受的载体或赋形剂是指无毒的固体、半固体或液体填料、稀释剂、包封材料或任何类型的制剂助剂。

优选地，药物组合物含有对于能够注射的制剂而言是药学上可接受的介质。这些可以特别是等渗无菌盐水溶液(磷酸二氢钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干燥的(尤其是冷冻干燥)的组合物，其在添加无菌水或生理盐水(取决于情况)时，允许构成可注射溶液。

适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体。溶液或悬浮液可以包含添加剂，该添加剂与包膜病毒相容且不阻止病毒进入靶细胞。在所有情况下，该形式必须是无菌的并且必须是以易于注射的程度流动的。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。合适的溶液的实例是缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

本发明还提供了一种治疗肺病的方法，包括：向患者施用治疗有效量的如上所述的药物组合物。预期用合胞素假型化的LV的较低的免疫原性将通过重复施用药物组合物在来自肺组织的细胞中允许长期基因表达。

如本文所用，术语“患者”或“个体”表示哺乳动物。优选地，根据本发明的患者或个体是人。

通常根据已知方法，以有效诱导患者治疗效果的剂量和时间段施用本发明的药物组合物，特别是包含如前所定义的在其表面上呈现合胞素的颗粒的组合物，甚至更优选地用合胞素假型化的包装目标药物(包括目标基因)的慢病毒颗粒。

施用可以通过注射、口服或局部(呼吸)施用。注射剂可以是皮下(SC)、肌内(IM)、静脉内(IV)、腹膜内(IP)、皮内(ID)或其他。优选地，通过注射、吸入或支气管肺泡灌洗进行施用。优选地，注射是静脉内的。吸入有利地通过雾化完成。

在本发明的各种实施方案中，肺病可以有利地选自下组：影响肺的遗传性疾病，例如典型的囊性纤维化和α-1抗胰蛋白酶缺乏；影响肺的感染性疾病，例如肺结核、呼吸道合胞病毒(RSV)感染或其他肺炎(例如间质性肺炎)；肺部的躯体和炎性疾病，例如癌症(更特别是肺癌和肺转移)、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化、水肿、肺气肿或高血压、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、尘肺病(例如来自石棉暴露)、肺部自身免疫性疾病(例如非特异性间质性肺炎)、任何其他间质性肺病(ILD)或弥漫性实质性肺病(DLPD)、预防肺移植排斥以及预防新生儿和早产儿的肺部问题或疾病。在一些实施方案中，肺病不包括癌症。在一些实施方案中，合胞素A，优选用合胞素A假型化的包装目标药物或基因(优选目标基因)的慢病毒载体颗粒用于治疗肺癌。在一些优选实施方案中，肺病选自下组：影响肺的遗传性疾病；影响肺的感染性疾病；肺的炎性或自身免疫性疾病；哮喘；慢性阻塞性肺疾病；肺纤维化；水肿；肺气肿或高血压；急性呼吸窘迫综合征；尘肺；间质性肺病或弥散性实质性肺病；预防肺移植排斥和预防新生儿和早产儿的肺部问题或疾病。

本发明还涉及包含与合胞素蛋白相关的药物的本发明药物组合物，特别是包含如前所定义的在其表面上呈现合胞素的颗粒的组合物，甚至更优选地用合胞素假型化的包装目标药物或基因(优选目标基因)的慢病毒颗粒用于非治疗目的的用途。非治疗目的包括增加健康受试者的肺活量，特别在水下呼吸。

本发明还涉及本发明的组合物用于制备肺移植或肺组织的死后保存的用途。在这种实施方案中，药物可以例如选自抗氧化剂。

本发明还涉及使肺组织成像的体内或离体方法，包括向个体施用与成像剂相关的合胞素蛋白。有利地，所述与成像剂相关的合胞素蛋白是掺入成像剂的用合胞素假型化的慢病毒颗粒。更优选地，所述成像剂偶联至病毒衣壳或包封在所述病毒衣壳中。

本发明还涉及如上所定义的用于靶向肺病的药物组合物，其包含特异于与合胞素蛋白相关的肺病的目标药物，其中包括目标基因的目标药物靶向如上文所定义的在肺细胞中特异性表达的参与一种或多种肺病的基因或基因产物(蛋白质/肽)。

在一些优选实施方案中，药物组合物包含用于肺病的基因治疗的目标基因。优选地，目标基因靶向负责影响肺的遗传性疾病的基因，例如，所述遗传性疾病特别选自下组：囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、间质性肺疾病(ILD)、弥散性实质性肺病和原发性肺动脉高压。负责遗传性疾病的靶基因可以选自与影响肺的疾病特别相关的下组：SERPINA3、SERPINA1、MMP、CFTR、SFTPB、SFTPC、ABCA3、CSF2RA、TERT、TERC、SFTPA2、SLC34A2、SMAD9、KCNK3和CAV1，尤其选自在肺中特异性表达的下组：SERPINA3、SERPINA1、CFTR、SFTPB、SFTPC、SFTPA2和ABCA3。如上所述，目标基因适合于通过基因替代或基因编辑基因治疗所述遗传性疾病。

在一些其他的优选实施方案中，药物组合物包含靶向肺病原体的必需基因的目标基因。病原体可以选自下组：结核分枝杆菌、呼吸道合胞病毒(RSV)等。

在各种实施方案中，药物组合物优选包含在其表面上呈现合胞素的颗粒，甚至更优选地，用合胞素假型化的包装目标基因的慢病毒颗粒通过特异性地靶向肺中表达的基因来基因治疗肺病。

除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的常规技术。文献中充分解释了这种技术。

在各种实施方案中，可以使用标准重组DNA技术产生病毒颗粒，特别是病毒载体颗粒和病毒样颗粒。

特别地，可以通过包括以下步骤的方法获得用于本发明的包括异源目标基因的稳定的假型化慢病毒颗粒：

a)在合适的细胞系中转染至少一种质粒，其中所述至少一种质粒包含所述异源目标基因、逆转录病毒rev、gag和pol基因和编码ERV合胞素的核酸；

b)孵育a)中获得的转染细胞，使得它们产生分别用ERV合胞素假型化且包装有所述异源目标基因的稳定的慢病毒颗粒；和

c)收获并浓缩b)中获得的稳定的慢病毒颗粒。

所述方法允许获得高物理滴度以及高感染性滴度的包含异源目标基因的稳定的假型化慢病毒颗粒。优选地，所述方法的步骤c)包括从上清液收获、浓缩和/或纯化步骤b)中产生的稳定的慢病毒颗粒。因此，优选地，步骤c)的浓缩包括离心和/或纯化步骤b)中获得的收获的稳定的慢病毒颗粒。所述收获可以根据本领域熟知的方法进行。优选地，在与转染细胞融合之前，更优选转染后20-72小时，优选24小时后收获慢病毒载体。优选地，收获步骤是优选在转染后20-72小时，优选转染后20-30小时，更优选24小时后进行的单次慢病毒收获。

在步骤a)中，用至少一种质粒转染合适的细胞系。优选地，所述转染是瞬时转染。优选地，用至少一个、两个、三个或四个质粒转染合适的细胞系。这些细胞类型包括支持慢病毒生命周期的任何真核动物细胞。优选地，合适的细胞系是稳定细胞系或对于合胞素的促融合作用的灾难性后果不起反应的细胞系，从而在产生颗粒的同时继续生长。所述合适的细胞系是哺乳动物细胞系，优选人细胞系。此类细胞的代表性实例包括人胚肾(HEK)293细胞及其衍生物、HEK293 T细胞，以及根据其作为贴壁细胞生长或适于在无血清条件下悬浮生长的能力而选择的细胞子集。这种细胞是高度可转染的。

合适的细胞系可以已经表达了五个序列中的至少一个，并且至多四个，所述五个序列是异源目标基因、逆转录病毒rev、gag和pol基因，以及编码ERV合胞素(例如HERV-W、HERV-FRD或鼠合胞素A)的核酸，优选为诱导型。在这种情况下，步骤a)包括用至少一种质粒转染所述细胞系，所述质粒包含至少一个尚未在所述细胞系中表达的序列。选择质粒混合物或单个质粒(如果仅使用一种质粒)，使得当在步骤a)中转染到所述细胞系中时，所述细胞系表达上述所有五个序列。例如，如果合适的细胞系表达逆转录病毒rev、gag和pol基因，待转染的质粒或质粒混合物包含待表达的剩余序列，即异源目标基因和编码ERV合胞素(例如HERV-W、HERV-FRD或鼠合胞素A)的核酸。

当使用单个质粒时，它包含所有5个目标序列，即：

-异源目标基因，

-rev、gag和pol基因，和

-如之前所述的编码ERV合胞素(尤其是编码HERV-W、HERV-FRD或鼠合胞素A)的核酸。

当使用两种或三种质粒时(质粒混合物)，每一种包含之前段落中所列的一些目标序列，使得质粒混合物包含所有上述目标序列。

优选使用四种质粒，四转染包含以下：

-第一种质粒包含目标基因，

-第二种质粒包含rev基因，

-第三种质粒包含gag和pol基因，和

-第四种质粒包含如之前所述的编码ERV合胞素(尤其是编码HERV-W、HERV-FRD或鼠合胞素A)的核酸。

优选用特定比例的四种质粒进行所述四转染。可以调节不同质粒之间的摩尔比以优化放大生产。本领域技术人员能够使该参数适应于其用于产生目标慢病毒的特定质粒。具体地，第一、第二、第三、第四质粒的重量比优选为(0.8-1.2):(0.1-0.4):(0.5-0.8):(0.8-1.2),更优选为约1:0.25:0.65:0.9。

rev、gag和pol基因是逆转录病毒的，优选慢病毒。优选地，它们是HIV基因，优选HIV-1基因，但也可以是EIAV(马传染性贫血病毒)、SIV(猴免疫缺陷病毒)、泡沫病毒或MLV(鼠白血病病毒)的病毒基因。

编码ERV合胞素，例如之前定义的ERV合胞素，更优选编码HERV-W、HERV-FRD或鼠合胞素A的核酸是DNA或cDNA序列。优选地，它对应于SEQ ID NO：1、2或3中分别列出的cDNA序列，或对应于分别与所述SEQ ID NO：1、2或3具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％同一性的序列。优选地，步骤a)包括转染至少一种质粒，所述质粒包含SEQ ID NO：5或6所列的cDNA序列，优选由SEQ ID NO：5或6所列的序列组成。

术语“同一性”是指两个多肽分子之间或两个核酸分子之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或相同的氨基酸残基占据时，则相应分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比对应于两个序列共有的匹配位置数除以比较的位置数并乘以100。通常，当比对两个序列以给出最大同一性时进行比较。例如，可以使用GCG(遗传学计算机组，Program Manual for the GCG Package,Version 7,Madison,Wisconsin)堆积程序或任何序列比较算法(例如BLAST、FASTA或CLUSTALW)通过比对来计算同一性。

可以使用的编码包膜糖蛋白的质粒是本领域技术人员已知的，例如可商购的pCDNA3、使用相似表达***的骨架或任何其他质粒盒，例如使用CMV启动子，例如，如Merten等(Human gene therapy,2011,22,343-356)所述的pKG质粒。

根据步骤a)，可以使用本领域已知的各种技术将核酸分子引入细胞。这种技术包括使用化合物(例如磷酸钙)、阳离子脂质、阳离子聚合物的化学促进转染、脂质体介导的转染(例如阳离子脂质体，如Lipofectamine(Lipofectamine 2000 or 3000))、聚乙烯亚胺(PEI)、非化学方法(例如电穿孔、粒子轰击或微注射)。优选用磷酸钙进行步骤a)的转染。

典型地，可以在磷酸钙存在下，用4种质粒(四转染)瞬时转染293T细胞进行步骤a)。所述4种质粒优选：表达HIV-1gag和pol基因的PKL质粒、表达HIV-1rev基因的pK质粒、表达在细胞启动子(例如人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子)控制下的异源目标基因的PCCL质粒和从CMV启动子表达ERV合胞素(例如之前定义的ERV合胞素，更优选表达HERV-W(合胞素-1)、HERV-FRD(合胞素-2)或鼠合胞素-A(合胞素-A)糖蛋白)的PCDNA3质粒。

然后，步骤a)之后，该方法包括孵育在a)中获得的转染细胞的步骤b)，使得其优选在上清液中产生包含异源目标基因的用ERV合胞素，例如之前定义的ERV合胞素假型化，更优选用HERV-W、HERV-FRD或鼠合胞素-A假型化的慢病毒颗粒。实际上，一旦进行步骤a)，就进行所获得细胞的孵育。这导致在上清液中产生稳定的慢病毒颗粒，其用ERV合胞素，例如之前定义的ERV合胞素假型化，更优选用HERV-W、HERV-FRD或鼠合胞素-A假型化且其包含异源目标基因。

因此，转染后，允许转染细胞生长一段时间，其可以包含转染后20-72小时，特别是24小时后。

用于培养细胞的培养基可以是经典培养基，例如包含糖(如葡萄糖)的DMEM。优选地，培养基是无血清培养基。可以在适于悬浮培养细胞的很多培养装置，例如多层***或生物反应器中进行培养。生物反应器可以是单次使用(一次性)或可重复使用的生物反应器。例如，生物反应器可以选自培养瓶或袋或罐式反应器。非限制性的代表性生物反应器包括玻璃生物反应器(例如

2L-10L,Sartorius)、使用运动搅拌的单次使用的生物反应器(如波式生物反应器(例如Cultibag

10L-25L,Sartorius))、单次使用的搅拌罐式生物反应器(Cultibag

50L,Sartorius)或不锈钢罐式生物反应器。

孵育后，收集并浓缩获得的稳定的慢病毒颗粒；这是步骤c)。优选地，在与转染细胞融合之前，更优选转染后24小时收获步骤b)中获得的稳定的慢病毒颗粒。优选的，将步骤b)中获得的上清液中存在的稳定的慢病毒颗粒离心和/或纯化。可使用本领域任何已知的方法进行所述离心步骤c)，例如通过离心、超滤/渗滤和/或色谱法。

于1-5℃下以40000-60000g的速度离心上清液1-3h，以获得稳定的假型化病毒颗粒的离心物。优选地，于2-5℃(优选约4℃)下以45000-55000g的速度进行离心1.5-2.5小时。在该步骤结束后，以离心物的形式浓缩颗粒，其可被使用。

步骤c)可以是色谱法，例如阴离子交换色谱或亲和色谱。可以在超滤步骤(特别是超滤/渗滤，包括切向流过滤)之前或之后进行阴离子交换色谱。例如，阴离子交换色谱法是弱阴离子交换色谱法(包括DEAE(D)-二乙基氨基乙基，PI-聚乙烯亚胺)。

现在将通过以下非限制性的实施例举例说明本发明。参照附图，其中：

附图说明

图1：SynA-LV Luc2递送后的生物发光分析。

将注射有表达LucII的载体的小鼠的生物发光与注射有用合胞素A(SyA)或VSVg与对照PBS假型化的载体的小鼠的生物发光比较。每组两只代表性小鼠。向小鼠1和2注射PBS，向小鼠10和11注射LV-SyA-LucII，并向小鼠12和15注射LV-VSVg-LucII。在IV注射后第16天用IVIS Lumina仪器进行生物发光分析。全身发光以光子/秒测量。使用动物的轮廓面具在小鼠的正面和背面测量生物发光。

–PBS组：小鼠1(S1)来自背面的信号为3.531.10⁵个光子/秒，来自正面的信号为1.446.10⁴个光子/秒。对于小鼠2(S2)，来自背面的信号为3.351.10⁵个光子/秒，来自正面的信号为1.163.10⁴个光子/秒。

–LV-SyA-LucII组：对于小鼠10(S10)，来自背面的信号为3.952.10⁷个光子/秒，来自正面的信号为1.019.10⁷个光子/秒。对于小鼠11(S11)，来自背面的信号为4.344.10⁷个光子/秒，来自正面的信号为3,573.10⁷个光子/秒。

–LV-VSVg-LucII组：对于小鼠12(S12)，来自背面的信号为3.052.10⁸个光子/秒，来自正面的信号为6.636.10⁸个光子/秒。对于小鼠15(S15)，来自背面的信号为5.478.10⁸个光子/秒，来自正面的信号为8,311.10⁸个光子/秒。

图2：合胞素A-LV LucII全身递送后肺中生物发光信号的定量。

将LV-合胞素A或编码LucII转基因的-VSVg(LV-SynA(n＝20)或LV-VSVg(n＝4))以5x10⁵ig(感染基因组)/小鼠的剂量静脉内注入白化病C57Bl/6小鼠中，注射PBS作为对照(n＝11)。在注射后第7天、第14天和第21天(背部暴露时)，随时间在各小鼠的肺中测量生物发光信号(光子/秒)。每个点代表一个小鼠。

图3：合胞素A介导的基因递送后基因转移的生物分布。将编码LucII转基因的LV-合胞素A(LV-SA-LucII；n＝6)静脉内注入白化病C57Bl/6小鼠中(3x 10⁵ng p24/小鼠)。使用编码相同转基因的LV-VSVg(LV-VSVg-LucII；n＝4)以及PBS(n＝3)作为对照。通过qPCR测量在第3周处死小鼠时回收的不同器官中每个二倍体细胞的载体拷贝数(VCN)。灰色区域表示该技术定量的极限。

图4：注射单剂量LV-SynA载体的小鼠肺中整合的前病毒的围绕PSI序列的PCR

将LV-合胞素A或编码LucII转基因的-VSVg(LV-SynA(n＝6)或LV-VSVg(n＝4))以5x10⁵ig(感染基因组)/小鼠的剂量静脉内注入白化病C57Bl/6小鼠中，注射PBS作为对照(n＝2)。注射后3周从总肺细胞提取基因组DNA。对这些gDNA进行PCR，扩增整合的前病毒的PSI序列，预期的PSI片段为489bp。

图5：合胞素A介导的基因递送后肺中荧光素酶的代表性免疫组织染色。

A-将编码LucII转基因的LV-合胞素A(LV-SA-LucII；n＝6)静脉内注入白化病C57Bl/6小鼠中(3x 10⁵ng p24/小鼠)。使用PBS(n＝3)作为对照。用抗萤光素酶抗体对冷冻的肺切片(代表以这种方式测试的3只小鼠)进行染色，并用与AlexaFluor 594偶联的第二抗体显色。用DAPI对细胞核进行复染。用共聚焦显微镜Leica SP8观察切片。图5A的顶图对应于来自PBS处理的对照动物的肺切片，而底图对应于来自LV-SYnA-Luc2处理的小鼠的肺切片。图5A的左图显示萤光素酶的免疫染色，右图显示用DAPI染色的相同切片，该切片显示了该切片上的所有细胞核。

B-C将编码LucII转基因的LV-合胞素A(LV-SA-LucII)静脉内注入白化病C57Bl/6小鼠中(5x 10⁵IG/小鼠)。注射后三周，处死小鼠，固定肺，石蜡包埋并切片以进行免疫染色。(B)和(C)中的图像代表以这种方式测试的8只小鼠。肺切片用DAPI(B)染色以检测定义肺泡的存在的所有细胞核；以及用抗荧光素酶抗体染色，并用与AlexaFluor 594偶联的第二抗体显色，以检测表达荧光素酶的细胞，特别是肺泡内排列的上皮细胞(C)。对照包括在相同条件下注射PBS的小鼠(n＝11只小鼠)。PBS注射小鼠的肺的免疫染色显示没有可检测的荧光素酶的DAPI+细胞(数据未显示)。

图6：如使用Elispot抗IFNg和CBA所测量的，与LV-VSVg相比，使用LV-SynA全身递送后针对转基因的免疫应答降低。

将PBS，7.5.10⁵ig(感染性基因组)/小鼠的LV-SynA_GFP-HY或LV-VSVg_GFP-HY载体静脉(IV)注入六周龄C57BL/6小鼠的尾静脉。

(A)21天后，收获脾细胞以测量体外肽刺激后通过γIFN-ELISPOT的Dby特异性CD4+T细胞和Uty特异性CD8+T细胞的应答。数据代表一个实验，每组包括3只小鼠。

(B)用于滴定由T细胞分泌的细胞因子。免疫三周后，用Dby、Uty肽或伴刀豆球蛋白A(conA)作为阳性对照，体外再刺激总脾细胞。培养36小时后，去除上清液并滴定指示的细胞因子(3只小鼠/组/实验)。每个点代表一个单独的测量，其中每只小鼠测量至少2次。

图7：用LV-SynA转导人肺MRC5和WI26VA4细胞(n＝2个实验)。

用合胞素-A假型化的LV转导浓度升高的两种细胞系(10⁵,5x10⁵感染性基因组(ig)/mL)后，通过qPCR测定每个细胞的载体拷贝数。作为阳性对照，用10⁶个感染单位/mL的用VSVg假型化的LV转导细胞。阴性对照由未转导的细胞组成。两次实验的结果。

图8：转导后7天用LV合胞素(-A、-B、-1或-2)转导人肺MRC5细胞(n＝3个实验)。

在

(12μg/mL)存在下，用浓度为10⁵IG/mL的合胞素(-1、-2、-A或-B)假型化的LV转导MRC5细胞后，在转导后第7天通过qPCR测定每个细胞的载体拷贝数。作为阳性对照，用10⁶IG/mL的用VSVg假型化的LV转导细胞。阴性对照由未转导的细胞组成。LV-SynB、LV-Syn1和LV-Syn2的两个实验的结果，或LV-SynA和LV-VSVg的三个实验的结果。

图9：转导后7天用LV合胞素(-A、-1或-2)转导人小气道上皮细胞(n＝5个实验)。

在

(12μg/mL)存在下，用浓度为10⁵ig/mL的合胞素(-A、-1或-2)假型化的LV转导人小气道上皮细胞(原代人小气道上皮细胞；Normal,Human(

PCS301010^TM))后，在转导后第7天通过qPCR测定每个细胞的载体拷贝数。作为阳性对照，用10⁶IG/mL的用VSVg假型化的LV转导细胞，并验证转导这些细胞(发现每个细胞0.75个载体拷贝)和检测这些细胞中的转基因的能力(数据未显示)。阴性对照由未转导的细胞组成(无载体)。结果是LV-SynA的5个实验的平均值，以及LV-Syn1、LV-Syn2(和LV-VSVg)的三个实验的平均值。

图10：不同细胞系上mLy6e mRNA表达水平和转导水平的比较。

(A)从不同细胞系(A20IIA、C2C12、NIH/3T3)提取mRNA并转化为cDNA以使用PO作为管家基因在mLy6e上进行qRT-PCR。通过公式丰度＝2^-ΔCt计算相对水平。通过测试来自C57BL/6小鼠的肺、脾或骨髓中的总细胞来验证qRT-PCR，其证实了mLy6e表达水平在肺细胞中最高，如Bacquin等人2017年所发表(数据未显示)。

(B)以10⁵IG/mL的剂量用编码ΔNGFR的LV-合胞素A载体转导与图10(A)相同的细胞系。在转导后7天通过流式细胞仪分析转导水平。

图11：不同细胞系上hLy6e mRNA表达水平和转导水平的比较。

(A)从不同细胞系(HEK293T、HCT116、HT1080、WI26VA4、Jurkat、RAJI和MRC5)提取mRNA并转化为cDNA以使用PO作为管家基因在hLy6e上进行qRT-PCR。通过公式丰度＝2^-ΔCt计算相对水平。条形图上所示数字是mRNA表达的实际值。

具体实施方式

实施例1：生产稳定且感染性的LV-SynA颗粒

材料和方法

细胞系

将人胚胎肾脏293T细胞在37℃、5％CO2下于补充有10％的热灭活胎牛血清(FCS)(Life Technologies)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM+glutamax)(LifeTechnologies,St-Aubin,France)中培养。

合胞素A的克隆和LV-Syn A的生产

a.表达鼠合胞素-A的质粒的产生。

使用标准技术将鼠合胞素-A cDNA克隆到pCDNA3质粒中。

b.Syn-A假型化的慢病毒载体的生产

使用磷酸钙将HEK293T细胞与以下4个质粒共转染(每烧瓶定量)：表达HIV-1gagpol基因的pKLgagpol(14.6μg)、表达HIV-1rev序列的pKRev(5.6μg)、pcDNA3.1SynA(20μg)和基因转移质粒，在脾病灶形成病毒(SFFV)启动子的控制下表达荧光素酶2转基因的PRRL-SFFV LucII或在脾病灶形成病毒(SFFV)(22.5μg)的控制下表达双顺反子盒中的荧光素酶2转基因和神经生长受体(NGFR)转基因的截短形式的pRRL-SFFV-LucII-2A-ΔNGFR-WPRE。24小时后，洗涤细胞并添加新鲜培养基。第二天，收获培养基，通过1500rpm离心5分钟来澄清并过滤0.45μm，然后在12℃下以50000g超离心2h来浓缩，并在-80℃下储存直至使用。据报道，通过瞬时转染也生产了VSVg-假型化颗粒(Merten et al,Human genetherapy,2011,22,343-356)。

c.合胞素-A-假型化LV的滴定

通过p24 ELISA(

HIV-1Elisa kit,Perkin-Elmer,Villebon/Yvette,France)测定物理滴度，然后计算作为物理颗粒(pp)的滴度，假设1fg p24对应于12pp LV(Farson et al,Hum Gene Ther.2001,20,981-97)，如之前报道的其他类型的LV(Charrieret al,Gene therapy,2011,18,479-487)。使用鼠淋巴瘤细胞系A20将感染性滴度测定为感染性基因组滴度(IG/mL)。在

(12μg/μL)存在下，将载体的系列稀释液添加到A20细胞中6小时。更新培养基，并将细胞孵育7天，并在带引物的iCycler 7900HT(Applied Biosystems)上使用双重qPCR获得基因组DNA以测量每个细胞的载体拷贝数：PSI正向5’CAGGACTCGGCTTGCTGAAG3’(SEQ ID NO:7),PSI反向5’TCCCCCGCTTAATACTGACG3’(SEQID NO:8)，以及用FAM(6-羧基荧光素)标记的PSI探针5’CGCACGGCAAGAGGCGAGG3’(SEQ IDNO:9),肌联蛋白正向5’AAAACGAGCAGTGACGTGAGC3’(SEQ ID NO:10),肌联蛋白反向5’TTCAGTCATGCTGCTAGCGC3’(SEQ ID NO:11)以及用VIC标记的肌联蛋白探针5’TGCACGGAAGCGTCTCGTCTCAGTC3’(SEQ ID NO:12)。

结果

研究鼠合胞素作为体内应用HIV-1衍生LV的可能的新假型。合胞素A是非同源的，但功能上类似于人合胞素-1和-2的鼠对应物(Dupressoir et al,Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,2005,102,725-730)。

将鼠SynA克隆到表达质粒中并用于在293T细胞中产生慢病毒载体颗粒。发现合胞素A可以成功地将rHIV衍生的LV假型化。优化用于转染步骤的合胞素A质粒的量提高培养基中基于p24水平的LV颗粒的产生。在规定的条件下(20μg DNA/板，仅一次收获；参见材料和方法)，可以产生用鼠合胞素假型化的稳定且感染性的颗粒。使用与用于VSVg假型化颗粒相同的条件，通过超速离心可以成功浓缩用这种包膜假型化的慢病毒颗粒(Charrier et al,Gene therapy,2011,18,479-487)。将浓缩的储液在-80℃下冷冻保存，并稳定数月。在存在Vectofusin-1(VF1)的情况下，LV-Syn A在转导鼠A20 B淋巴瘤细胞系方面非常有效。A20细胞系用于产生合胞素-A假型化LV的感染性滴度。

实施例2：使用LV-SynA颗粒体内基因递送至肺

材料和方法

动物

对雄性或雌性6周龄的C57/Bl6 albinos小鼠在尾静脉内注射100μL LV-SynA(相当于3.10⁵ng p24)或对对照小鼠在尾静脉内注射100μL PBS。在不同时间点通过生物发光分析小鼠，并在注射后第21天通过宫颈伸长处死小鼠。处死后，去除肺。使用新鲜右肺以分选细胞并实现qPCR。将左肺在异戊烷中冷冻，并于-80℃保存以进行低温切片和免疫组织染色。

体内荧光素酶成像

将C57BL/6小鼠用***(120mg/kg)和甲苯噻嗪(6mg/kg)麻醉，并腹膜内施用100μL(150μg/mL)D-荧光素(Interchim,ref.FP-M1224D)，并于10min后用CCD相机ISO14N4191(IVIS Lumina,Xenogen,MA,USA)成像。使用10cm视野、分档(分辨率)因子4、1/f挡光和开放式滤光片获得3分钟的生物发光图像。手动定义目标区域(ROI)(在每种情况下使用标准面积)，使用实时图像3.2软件(Xenogen)计算信号强度，并表示为光子/秒。从在没有施用载体的对照小鼠上绘制的ROI定义背景光子通量。

肺细胞分选

用胶原酶IV(1mg/mL,Invitrogen)和DNase I(50μg/mL,Roche)灌注肺，然后在37℃下孵育45分钟。添加EDTA(100mM)终止反应。然后，通过剥离分离细胞。肺细胞用抗CD45-FITC抗体(BD Pharmingen,ref.553080)和抗CD31-BV510抗体(BD Horizon,ref.563089)染色。然后，在

Astrios(Beckman Coulter)上分选细胞。

qPCR

使用

基因组DNA纯化试剂盒(Promega,ref.A1125)从细胞提取基因组DNA。用肌联蛋白Mex5作为标准化基因，在PSI前病毒序列或WPRE前病毒序列上进行多重qPCR。以0.1μM的浓度使用如下引物和探针：

使用的qPCR混合物是ABsolute qPCR ROX混合物(Thermo Scientific,ref.CM-205/A)。用SDS 2.4软件在iCycler 7900HT(Applied Biosystems)上进行分析。

PCR

使用Taq Phusion(Thermo Scientific,ref.F-549S)对来自肺的gDNA进行PCR。以0.1μM的浓度使用如下引物：

Psi-F:5’AGCCTCAATAAAGCTTGCC 3’(SEQ ID NO:19)

RRE-R:5’TCTGATCCTGTCGTAAGGG 3’(SEQ ID NO:20)

PCR步骤为98℃ 30s-->(98℃ 10s,61℃ 30s,72℃ 45s)x35-->72℃ 5min。将PCR产物置于2％琼脂糖凝胶上进行电泳，预期的条带为489bp。

肺切片上的免疫组织染色

在10分钟内将小鼠肺(12μm)的冷冻切片固定在4％多聚甲醛溶液中，然后在PBS1X中洗涤3次。然后，用以1/100稀释作为一抗的多克隆抗体抗萤光素酶(Promega,ref.G7451)和以1/1000稀释作为二抗的驴抗山羊AlexaFluor 594(Invitrogen,ref.A11058)染色切片。

将一抗在湿度箱中于4℃孵育过夜并将二抗在湿度箱中孵育2h。

结果

目的是在静脉内全身递送后，测定合胞素-A-假型化的LV的生物分布。之所以使用转基因荧光素酶，是因为它具有生物发光性，并且能够随时间动态检测。在四种不同的小鼠体内方案中测试了两种编码Luc2的不同LV。一种LV仅编码Luc2转基因(LV-SA-LucII)，另一种LV在双顺反子盒中编码Luc2和dNGFR(LV-SA-LucII2AdNGFR)。双顺反子载体表达Luc2的效力要低得多。因此，双顺反子载体可用于通过qPCR证实器官的转导，但是通过生物发光的转基因表达不是优化的，因此不能定量。作为对照，使用LV-VSVG Luc2。在小鼠中进行四种不同的体内方案以注射载体并测量随时间的转导。载体的剂量是可在100μL注射体积中使用的最大剂量，相当于每只小鼠约3x10⁵ng p24或5x10⁵IG。通过体内生物发光测量在不同时间点(注射后1、2和3周)在小鼠中测量转基因表达，并使用不同技术证实转基因表达，注射后3周对一些小鼠进行荧光素酶免疫组织化学检测。注射后3周通过qPCR测量转导。

图1显示了在第2周在代表性小鼠中的生物发光分析。在合胞素A LV递送后，在脾和肺中观察到清晰的信号。与VSVG相反，合胞素A不转导肝。

随时间(在背部暴露时)对单个小鼠进行肺信号定量。如图2B所示，使用LV-SA获得的信号很强并且随时间持续存在。这些结果表明，如用生物发光转基因所检测的，向小鼠单次静脉内施用LV-SynA载体可在肺中提供显著、稳定和持久的基因转移。

通过qPCR测量在第3周处死小鼠时回收的不同器官中载体的量。结果显示，当施用合胞素A-LV时，优先在肺和脾中发现载体拷贝，而当施用VSVG-LV时，优先在肺和肝中发现载体拷贝(图3)。在单次静脉内注射LV-SynA载体3周后，围绕整合的前病毒PSI序列的PCR证实在小鼠肺中检测到了转基因盒，表明可以实现稳定的整合基因转移(图4)。

总体而言，通过测量肺、脾和肝中的转导和转基因表达，很明显，合胞素-A-LV具有独特的转导特征。基于qPCR，合胞素A-LV可以非常有效地转导肺和脾，但不能转导肝。生物发光信号证实合胞素-A对肺和脾的转导。虽然在肝区域获得了平均信号，可能部分是由于脾中的相邻信号，但与用VSVg获得的信号相比，其水平要弱得多(表I)。如qPCR和生物发光所示，VSVg假型化LV非常有效地转导肝。

表I.合胞素-A和VSVg假型化LV的不同趋向性

表I(A-B)图例：在肺、脾和肝中定量了生物发光转基因荧光素酶的转导水平和表达。在4种不同的方案中获得平均值、SD和测试小鼠数(n)(取决于测试载体，从1到4)。A.注射载体3周后通过qPCR测量转导。B.注射载体2周后测量生物发光。通过绘制掩膜以基于通过最高信号检测到的最大面积定义器官面积来进行定量。将相同的掩膜应用于来自相同方案的所有小鼠。在小鼠的背部测量肺的信号。在小鼠的正面测量脾和肝的信号。没有表明用双顺反子LV-SA LucII-dNGFR载体比LV-SA LucII获得弱得多的生物发光信号。

更详细地检查肺细胞的转导。肺是复杂组织，包含由单层鳞状上皮细胞组成的肺泡。肺泡通过***彼此分隔，与大量毛细血管和浸润细胞(例如巨噬细胞)交织。通过两种技术证明转基因Luc2(LucII)存在于肺上皮细胞中。首先，用胶原酶DNA酶的混合物消化肺，并用CD45抗体染色细胞以识别和分选造血***来源的CD45+细胞和非造血***来源的CD45-细胞，即肺实质或间质。提取分选的细胞DNA，并通过qPCR分析。结果显示仅在CD45-肺细胞中存在载体拷贝，而在造血***部分中不存在载体拷贝(表II)。转导的水平与观察到的广泛而清晰的生物发光信号一致。

表II.肺***的转导

在冷冻的肺切片上进行Luc2的免疫组织化学染色。结果表明，Luc2在整个器官的肺上皮细胞中表达(图5)。在石蜡包埋的肺上进行的染色显示，排列于肺泡内的上皮细胞正在表达转基因(图5B)。在一些实验中，对F4/80巨噬细胞进行双重染色，并且在巨噬细胞中未显示任何Luc2，因此证实了qPCR结果。另外，对CD31+肺内皮细胞进行染色并且不对应于用Luc2获得的标记。

结果表明合胞素-A-LV的生物分布与VSVg-LV的生物分布有很大差异。与VSVg相反，合胞素A不转导肝脏，而是相反，以高水平转导小鼠的脾和肺。因此，合胞素A LV可用作肺上皮(包括肺基因治疗)的药物和基因递送工具。

实施例3：与LV-VSVg相比，使用LV-SynA全身递送后针对转基因的免疫应答降低

材料和方法：

用ELISPOT测定免疫应答

通过在存在或不存在1μMDby或Uty肽的情况下，在IFN-γ酶联免疫斑点板(MAHAS45,Millipore,Molsheim,France)中每孔培养10⁶个脾细胞，进行IFN-γ酶联免疫斑点测定(ELISPOT)。作为阳性对照，用伴刀豆球蛋白A(Sigma,Lyon,France)(5μg/ml)刺激细胞。在+37℃下培养24小时后，洗涤板，并用生物素化的抗IFNγ抗体(eBiosciences)、链霉亲和素碱性磷酸酶(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)和BCIP/NBT(Mabtech,LesUlis,France)显示IFNγ的分泌。使用AID读取器(Cepheid Benelux,Louven,Belgium)和AID ELISpot Reader v6.0软件对点进行计数。减去由非脉冲脾细胞获得的背景值后代表斑点形成单位(SFU)。

通过细胞计数珠阵列滴定细胞因子

铺板刺激培养基[培养基、Uty(2μg/mL)、Dby(2μg/mL)或伴刀豆球蛋白A(5μg/mL)]，并添加10⁶个脾细胞/孔。在+37℃下培养36小时后，将上清液在-80℃下冷冻直至滴定。用BD Biosciences flex试剂盒(IL-6、IFN-γ、TNFα和RANTES)进行细胞计数珠阵列。简言之，将具有不同荧光强度并且包被有细胞因子特异性捕获抗体的捕获珠群体混合在一起。接下来，分配25μL的珠混合物，并添加25μL的每种样品(上清液)。在室温下孵育1小时后，将细胞因子特异性PE抗体混合在一起，并添加25μL这种混合物。在室温下孵育1小时后，用1mL洗涤缓冲液洗涤珠，并使用LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)采集数据。使用FCAP软件(BD Biosciences)进行分析。

结果

在用VSVg(LV-VSVg)假型化的LV的比较测定中，测试到全身施用后LV-SynA的免疫原性降低。在这些研究中，所使用的转基因是GFP-HY，其编码由雄性HY基因序列标记的GFP组成的融合蛋白。当抗原呈递细胞呈递转基因时，Dby和Uty肽会呈递给CD4和CD8 T细胞，从而能够检测转基因特异性免疫应答。结果表明，与LV-VSVg比较，向小鼠全身静脉内(IV)施用编码GFP-HY的LV-SynA载体导致较低水平和非常低水平的抗转基因CD4和CD8 T细胞免疫应答(图6A)，以及较低水平的细胞因子(图6B)。这些结果与在用合胞素-假型化载体递送基因后在肺中实现转基因长期表达的可能性一致。结果还表明，用这些载体可以实现重复施用转基因。结果还表明，合胞素-假型化载体可以在炎症条件下安全使用，而不会引起高水平的额外免疫应答或炎症。

实施例4：用LV-合胞素转导人和鼠肺细胞系

该研究的第一目标是评估人肺细胞是否可以用人或鼠合胞素(合胞素-A、-B、-1或-2)假型化的慢病毒载体转导。该研究的第二目标是确定用合胞素A假型化的慢病毒载体转导不同的人和鼠细胞系和鼠原代细胞是否与靶细胞上Ly6e表达相关。

材料和方法

用LV-Syn转导人原代小气道上皮细胞和人肺细胞系

这些实验使用编码Luc2或ΔNGFR以及用Syn-A、-B、-1或-2假型化的慢病毒载体。在12μg/mL of

(Miltenyi Biotec,ref.130-111-163)存在下，用一种浓度或两种浓度的LV-SynA慢病毒颗粒(1x10⁵或1x10⁵和5x10⁵感染性基因组(IG)/mL(A20细胞上定义的感染性基因组单位))在37℃下培养1x10⁵个MRC5细胞(人肺胎儿细胞,ECACC,ref.84101801)、WI26VA4细胞(SV40转化的人肺细胞,ATCC,ref.CCL-95.1)或人小气道上皮细胞(原代小气道上皮细胞；Normal,Human(

PCS301010TM))来测试载体。作为阳性对照，还在Vectofusin-1存在下，将细胞与1x10⁶ IG(HCT116细胞/mL上定义的感染性基因组单位)的LV-VSVg一起平行培养。在37℃转导6小时后，通过更换培养基并向细胞添加新鲜培养基(DMEM+10％胎牛血清+1％青霉素-链霉素+1％谷氨酰胺)来终止感染。

转导后三或七天，使用

基因组DNA纯化试剂盒(Promega,ref.A1125)提取细胞的基因组DNA。使用PSI前病毒序列的扩增和白蛋白作为标准化基因进行多重qPCR以测定每个细胞的载体拷贝数。以0.1μM的浓度使用如下引物和探针：

PSI F	5’CAGGACTCGGCTTGCTGAAG 3’(SEQ ID NO:7)
		PSI R	5’TCCCCCGCTTAATACTGACG 3’(SEQ ID NO:8)
PSI探针(FAM)	5’CGCACGGCAAGAGGCGAGG 3’(SEQ ID NO:9)

白蛋白F	5’GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT 3’(SEQ ID NO:16)
		白蛋白R	5’ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC 3’(SEQ ID NO:17)
白蛋白探针(VIC)	5’CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC 3’(SEQ ID NO:18)

所用的qPCR混合物是ABsolute qPCR ROX混合物(Thermo Scientific,ref.CM-205/A)。用SDS 2.4软件在iCycler 7900HT(Applied Biosystems)上进行分析，或者用

480SW 1.5.1软件在LightCycler480(Roche)上进行分析。

不同的人和鼠细胞系以及鼠原代细胞上Ly6e mRNA的表达。

使用来自Qiagen的

mini试剂盒提取来自不同人细胞系(HEK293T、HCT116、HT1080、WI26VA4、Jurkat和RAJI)、鼠细胞系(A20IIA、C2C12、NIH/3T3)和来自C57BL/6小鼠肺、脾和骨髓总细胞的mRNA。使用来自Thermofischer的Verso cDNA合成试剂盒进行mRNA的逆转录。使用以下引物对cDNA进行qPCR：mLy6e正向引物5’CGGGCTTTGGGAATGTCAAC 3’(SEQ ID NO:21),mLy6e反向引物5’GTGGGATACTGGCACGAAGT 3’(SEQ ID NO:22),hLy6e正向引物5’AGACCTGTTCCC CGGCC 3’(SEQ ID NO:23),hLy6e反向引物5’CAGCTGATGCCCATGGAAG 3’(SEQ ID NO:24),PO反向引物5’CTCCAAGCAGATGCAGCAGA 3’(SEQ ID NO:25)和PO正向引物5’ACCATGATGCGCAAGGCCAT 3’(SEQ ID NO:26)。PO用作仓库基因。用公式丰度＝2-ΔCt计算丰度。

结果

用LV-Syn(-A、-B、-1、-2)转导人原代小气道上皮细胞和人肺细胞系

在两个独立的转导实验中测量了用鼠合胞素A(LV-SynA)假型化的慢病毒载体感染后MRC5和WI26VA4细胞的转导水平。还在两个或三个独立的转导实验中测量了用鼠合胞素A(LV-SynA)、鼠合胞素B(LV-SynB)、人合胞素1(LV-Syn1)或人合胞素2(LV-Syn2)感染后MRC5细胞的转导水平。用VSVg假型化并以高浓度使用的对照慢病毒载体(LV-VSVg)证实，可以在所用的实验条件下转导细胞。

此外，在五个(SynA)或三个(Syn1、Syn2)独立的转导实验中测量了用鼠合胞素A(LV-SynA)、人合胞素1(LV-Syn1)或人合胞素2(LV-Syn2)假型化的慢病毒载体感染后人小气道上皮细胞的转导水平。

在所有实验中，使用特异性引物用qPCR证实了细胞中前病毒的整合。结果显示在图7-9中。

图7表示在2个实验中，用鼠合胞素A(LV-SynA)假型化的慢病毒载体转导MRC5和WI26VA4细胞的平均水平。使用两种浓度的载体(1E+05和5E+05ig/mL)，显示出剂量依赖性作用。显然，用LV-SynA载体转导MRC5细胞要比转导WI26V4细胞更有效，但两种细胞类型都是允许的。作为阳性对照，用VSVg假型化的载体以更高的浓度使用。总之，合胞素A假型可用于转导人肺细胞。

图8显示，除了鼠SynA外，人Syn2也可以转导人肺细胞，从而支持合胞素2-假型化的慢病毒载体用于在肺中的治疗应用。合胞素-2假型非常有效，因为它达到了至少与以10倍高浓度使用的VSvg阳性对照一样高的水平。

图9显示鼠合胞素A和人合胞素2可用于假型化慢病毒载体以有效转导人原代肺上皮细胞。这些结果进一步证明，合胞素假型化的颗粒可用于治疗肺病，特别是涉及肺上皮的疾病，并且在全身施用后，人合胞素假型化的载体有望在肺中递送转基因。

不同细胞系中Ly6e mRNA表达水平和转导水平的比较。

比较了在不同细胞系中mLy6e和hLy6e mRNA的表达水平以及编码ΔNGFR的LV-合胞素A载体的转导水平。

结果表明，报道为鼠合胞素A受体的mLy6e在细胞系上的表达无法预测用SynA假型化的LV转导细胞的能力(图10)。C2C12细胞表达相对丰富的Ly6e水平，但不被转导。表达最高水平的Ly6emRNA的A20IIA细胞被转导，这可能表明存在阈值。

小鼠SynA的受体是小鼠Ly6e。尚不清楚人Ly6e是否为任何合胞素的受体。结果表明，人Ly6e受体表达mRNA水平与用LV-SynA转导之间没有关联(图11)。结肠癌细胞HCT116表达hLy6e mRNA，但不被转导。Raji细胞不表达人Ly6e-mRNA，但可以被转导。

Claims

1.靶向肺组织的药物组合物用于预防和/或治疗肺病的用途，所述药物组合物至少包含与合胞素蛋白结合的治疗药物。

2.根据权利要求1所述的药物组合物的用途，其中所述合胞素蛋白是人或鼠合胞素，优选地，所述合胞素选自下组：人合胞素-1、人合胞素-2、鼠合胞素-A和鼠合胞素-B。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物的用途，其中将所述治疗药物和所述合胞素蛋白掺入颗粒中，优选地，所述颗粒选自下组：脂质体、外泌体、病毒颗粒和病毒样颗粒。

4.根据权利要求3所述的药物组合物的用途，其中所述合胞素蛋白呈现在所述颗粒的表面上。

5.根据权利要求4所述的药物组合物的用途，其中所述颗粒是用合胞素蛋白假型化的慢病毒或慢病毒样颗粒。

6.根据权利要求1-5任一项所述的药物组合物的用途，其中所述药物选自下组：用于治疗的目标基因，包括治疗基因和编码治疗性蛋白质或肽的基因，例如编码治疗性抗体或抗体片段和基因组编辑酶的基因，以及治疗性RNA，例如干扰RNA、用于基因组编辑的向导RNA和能够外显子跳跃的反义RNA；抗感染药物，例如抗菌、抗病毒、抗真菌或抗寄生虫药物；抗炎药；和免疫治疗药物，例如免疫调节、免疫抑制、抗过敏、抗组胺和免疫刺激药物。

7.根据权利要求3-6任一项所述的药物组合物的用途，其中所述药物是包装入病毒载体颗粒中的目标基因。

8.根据权利要求7所述的药物组合物的用途，其中将所述目标基因包装入用合胞素蛋白假型化的慢病毒载体颗粒中。

9.根据权利要求1-8任一项所述的药物组合物的用途，其中所述肺病选自下组：影响肺的遗传性疾病；影响肺的感染性疾病；肺的炎性或自身免疫性疾病；哮喘；慢性阻塞性肺疾病；肺纤维化；水肿；肺气肿或高血压；急性呼吸窘迫综合征；尘肺；间质性肺病或弥散性实质性肺病；预防肺移植排斥和预防新生儿和早产儿的肺部问题或疾病。

10.根据权利要求1-9任一项所述的药物组合物的用途，其用于肺病的基因治疗。

11.根据权利要求6-10任一项所述的药物组合物的用途，其中所述目标基因选自下组：SERPINA3、SERPINA1、MMP，特别是MMP1、MMP2和MMP9、CFTR、SFTPB、SFTPC、ABCA3、CSF2RA、TERT、TERC、SFTPA2、SLC34A2、DKC1、TERC、TERT、TINF2、NF1、TSC1、FLCN、STAT3、HPS1、GBA、SMPD1、SLC7A7、SMAD9、KCNK3和CAV1基因及其功能性变体。

12.根据权利要求1-11任一项所述的药物组合物的用途，其用于通过注射、吸入或支气管肺泡灌洗施用。

13.用于靶向肺组织的药物组合物，包含用合胞素蛋白假型化的病毒颗粒，所述病毒颗粒包装选自下组的目标基因：基因SERPINA3、SERPINA1、MMP，特别是MMP1、MMP2和MMP9、CFTR、SFTPB、SFTPC、ABCA3、CSF2RA、TERT、TERC、SFTPA2、SLC34A2、DKC1、TERC、TERT、TINF2、NF1、TSC1、FLCN、STAT3、HPS1、GBA、SMPD1、SLC7A7、SMAD9、KCNK3、CAV1及其功能性变体，以及编码治疗性RNA，例如干扰RNA、用于基因组编辑的向导RNA和能够外显子跳跃的反义RNA的基因；其中所述治疗性RNA靶向上述基因。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述病毒颗粒是慢病毒载体颗粒。

15.用于靶向肺组织的药物组合物，包含用合胞素蛋白假型化的病毒样颗粒，优选慢病毒样颗粒，所述病毒样颗粒包装治疗性RNA，例如干扰RNA、用于基因组编辑的向导RNA和能够外显子跳跃的反义RNA，所述靶向目标基因的治疗性RNA选自下组：SERPINA3、SERPINA1、MMP，特别是MMP1、MMP2和MMP9、CFTR、SFTPB、SFTPC、ABCA3、CSF2RA、TERT、TERC、SFTPA2、SLC34A2、DKC1、TERC、TERT、TINF2、NF1、TSC1、FLCN、STAT3、HPS1、GBA、SMPD1、SLC7A7、SMAD9、KCNK3和CAV1。