CN111218509A - 乳腺癌的新诊断标志物ppef1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肿瘤标志物，具体涉及一种乳腺癌相关的的新生物标志物及其应用，该乳腺癌新肿瘤标志物为蛋白磷酸酶PPEF1。本发明通过生物信息学分析、细胞实验及临床验证，探究证实了PPEF1与乳腺癌具有很好的相关性，可作为乳腺癌诊断及预后的一种标志物，具有重要临床意义。

Description

乳腺癌的新诊断标志物PPEF1及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术以及肿瘤诊断技术领域，具体涉及蛋白磷酸酶PPEF1作为乳腺癌生物标志物及其应用。

背景技术

乳腺癌是女性发病率及死亡率最高的恶性肿瘤，也是全世界癌症死亡的主要因素。目前为止，乳腺癌的风险因素仍不确定，但已被指出与生殖，激素，肥胖，饮酒和其他许多潜在因素的复杂作用及异质性等相关。近年来，对乳腺癌的研究尽管在早期临床诊断、手术技术提升、抗癌药物研发及靶向治疗策略等方面取得了进展，但由于肿瘤复发和转移，乳腺癌患者的长期存活率仍然很差。

肿瘤标志物可提示肿瘤的性质，对肿瘤的诊断、预后以及复发等做出判断，但现有的乳腺癌肿瘤标志物存在敏感度和特异性无法达到期望值，单一标志物诊断有限等问题。因此，寻找一种特异性高、灵敏度好、可用于乳腺癌诊断和预后判断的新标志物，具有极大的临床价值和研究意义。

PPEF1是编码蛋白质丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶的基因。以往有报道显示，某些蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的表达与细胞的过度增殖有关。现有研究发现，PPEF1在肺癌发展中可抑制癌细胞的死亡，是具有致癌能力的癌基因；在淋巴瘤的诊断中，研究认为PPEF1可能是具有诊断或治疗价值的潜在靶标。而PPEF1在乳腺癌发生发展中的作用尚未有报道。

本发明有创意地提出应用一个多学科(肿瘤生物学，生物信息学，基础医学和临床医学相结合的转化医学)交叉的研究手段，从分子、细胞和临床患者的不同层面，来探讨最新发现的PPEF1在乳腺癌发生发展过程中的作用、分子机制及诊断和预后等方面的作用，有望为乳腺癌的诊断和治疗提供新的策略。此项研究不仅富有科学创意，还有着近期和长远的社会经济意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供PPEF1作为乳腺癌分子标志物的应用。

PPEF1序列如下：

MGCSSSSTKTRRSDTSLRAALIIQNWYRGYKARLKARQHYALTIFQSIEYADEQGQMQLSTFFSFMLENYTHIHKEELELRNQSLESEQDMRDRWDYVDSIDVPDSYNGPRLQFPLTCTDIDLLLEAFKEQQILHAHYVLEVLFETKKVLKQMPNFTHIQTSPSKEVTICGDLHGKLDDLFLIFYKNGLPSERNPYVFNGDFVDRGKNSIEILMILCVSFLVYPNDLHLNRGNHEDFMMNLRYGFTKEILHKYKLHGKRILQILEEFYAWLPIGTIVDNEILVIHGGISETTDLNLLHRVERNKMKSVLIPPTETNRDHDTDSKHNKVGVTFNAHGRIKTNGSPTEHLTEHEWEQIIDILWSDPRGKNGCFPNTCRGGGCYFGPDVTSKILNKYQLKMLIRSHECKPEGYEICHDGKVVTIFSASNYYEEGSNRGAYIKLCSGTTPRFFQYQVTKATCFQPLRQRVDTMENSAIKILRERVISRKSDLTRAFQLQDHRKSGKLSVSQWAFCMENILGLNLPWRSLSSNLVNIDQNGNVEYMSSFQNIRIEKPVQEAHSTLVETLYRYRSDLEIIFNAIDTDHSGLISVEEFRAMWKLFSSHYNVHIDDSQVNKLANIMDLNKDGSIDFNEFLKAFYVVHRYEDLMKPDVTNLG(SEQ ID No.1)。

为了实现上述技术目的，本发明首先利用生物信息学方法对PPEF1在乳腺癌及正常组织中的表达进行研究，发现PPEF1在乳腺癌组织中的表达高于正常组织。

进一步利用KM生存分析及COX回归分析，发现PPEF1可作为乳腺癌患者的独立预后因素。

进一步对PPEF1表达谱的变化进行研究，发现PPEF1高表达组中，TGF-β信号通路、上皮间质转化(EMT)以及血管生成等特征显著变化。

进一步，通过细胞实验验证乳腺癌细胞与正常乳腺细胞中PPEF1的差异及基因功能。与正常乳腺细胞MCF 10A相比，PPEF1在乳腺癌细胞MCF7和SK-BR-3中异常高表达，且构建乳腺癌细胞下调PPEF1模型可抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力。PPEF1的高表达具有显著促进肿瘤进程和迁移侵袭的作用，即PPEF1可作为促癌基因，参与乳腺癌的发生发展。如前述，PPEF1可用于检测乳腺癌细胞迁移和侵袭能力检测中的应用。

进一步，为验证PPEF1的临床意义，采用免疫组化检测乳腺癌石蜡组织切片中PPEF1蛋白表达量，发现显著高于癌旁组织；ELISA验证血清样本发现，与正常人相比，乳腺癌患者血清中的PPEF1含量显著升高，较常规肿瘤标志物CEA、CA125和CA153指标有更高的敏感度和特异性。且PPEF1与传统肿瘤标志物联合后能显著提高诊断效率，根据以上研究，可初步将PPEF1作为乳腺癌可靠的生物标志物，用于乳腺癌的诊断和/或预后预测。

本发明的另一目的在于提供PPEF1制备乳腺癌诊断、预后预测及癌细胞迁移侵袭能力检测产品中的应用，所述产品包括上述检测PPEF1表达水平的试剂，包括实时荧光定量PCR、ELISA相应试剂，实时荧光定量PCR检测PPEF1表达的试剂包括SYBR Green、PCR扩增引物。

在本发明的实施例中，所述PCR扩增引物包括正向引物F和反向引物R，所述正向引物F具有如SEQ ID No.1所示的序列，所述反向引物R具有如SEQ ID No.2所示的序列。

一种快速判断乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物在制备用于检测乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的试剂盒中的应用。

一种基于检测目的，研究或检测PPEF1蛋白表达情况的免疫组化检测方法及试剂在制备试剂盒中的应用。

一种基于无创的联合诊断目的，PPEF1联合CEA、CA125、CA153制备乳腺癌联合诊断试剂盒中的的应用。

因此，PPEF1很可能在早期诊断、预防与治疗乳腺癌疾病中作为新的肿瘤标志物，可用于临床诊断、预防及预后检测，具有很好的实际应用价值。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明发现了一种对乳腺癌进行诊断和预后判断的分子标记物PPEF1，具有高特异性、高灵敏度，使用该分子标记物可以对乳腺癌的发生、预后效果和迁移侵袭能力进行判断，同时联合其它肿瘤标志物可为乳腺癌的诊断和治疗提供新的策略。

附图说明

图1为PPEF1在乳腺癌中的表达分析图；其中，A图为Oncomine数据分析，PPEF1在乳腺癌中显著上调；B图为GEPIA数据显示，PPEF1在乳腺癌组织的表达水平高于正常组织；C图为PPEF1在乳腺癌及旁癌组织中的表达结果分析图；

图2为PPEF1在乳腺癌中的预后及诊断价值分析图；其中，A为利用Kaplan–Meier分析TCGA数据展示PPEF1的表达对乳腺癌患者总生存率的影响；B、C图为bc-GenExMiner数据分析高PPEF1表达和低PPEF1表达的乳腺癌患者总生存率曲线和无转移复发生存率曲线；D图为乳腺癌患者PPEF1表达与总体生存率相关性的多因素分析；E图为TCGA数据分析PPEF1mRNA数据的受试者工作曲线(ROC)；

图3为PPEF1的相关Hallmark效应基因集分析；

图4为PPEF1对乳腺癌细胞生物学行为的影响实验结果分析图；A图为正常乳腺细胞MCF 10A与乳腺癌细胞MCF7和SK-BR-3的PPEF1表达差异分析；B图为干扰siRNA在mRNA水平上对PPEF1的沉默效果；C图为沉默PPEF1后利用Transwell实验验证MCF7细胞迁移及侵袭结果分析图；

图5为PPEF1在乳腺癌患者中的临床价值分析图；A图为乳腺癌病人癌旁及肿瘤组织抗PPEF1抗体免疫组化检测结果示意图；B图为ELISA检测乳腺癌血清和健康人血清中蛋白磷酸酶PPEF1浓度散点图；C图为血清PPEF1含量在乳腺癌患者与健康人群中的ROC曲线分析；D图为血清PPEF1、CEA、CA125和CA153的联合诊断ROC曲线分析。

具体实施方式

下面将结合本发明实施实例及参考附图，对本发明的技术方案、特征和性能方面进行清楚完整地描述，但本发明的实施方式不限于此。若无特别说明，本发明采用的原材料、试剂和方法为技术领域内常规原材料、试剂和方法。

实施例1分析PPEF1基因在Oncomine、GEPIA及TCGA数据库中的表达情况

1.Oncomine数据库分析

利用Oncomine数据库(https://www.oncomine.org/)中不同种类乳腺癌的临床标本与正常病人的数据集进行比较，分析几个乳腺癌数据集中PPEF1基因的表达水平。为降低错误率，选择P<0.0001，Fold Change>2和基因排名前10％作为筛选阈值，并对结果进行进一步分析。

2.GEPIA数据库分析

GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)是基于GTEx及TCGA数据整合的可视化网站，包含癌症与非癌症之间的差异基因表达。在GEPIA中搜索'PPEF1'和'BRCA'的关键词以检索在乳腺癌和正常乳腺组织中PPEF1的差异表达数据。

3.分析PPEF1基因在TCGA数据库中的表达情况

从TCGA数据库中收集1108例乳腺癌组织与112例癌旁组织的PPEF1表达谱数据，采用edgeR法进行质控及均一化，并利用edgeR法进行PPEF1在乳腺癌组织与癌旁组织中的差异分析；绘制点状图。

4.结果

PPEF1的表达水平如图1所示，相比对照组PPEF1在乳腺癌组织中的表达显著上调。

本发明上述实施例的研究发现PPEF1基因在乳腺癌患者癌组织和癌旁正常组织中存在差异表达，PPEF1在乳腺癌组织的表达与癌旁组织相比显著升高。

通过生物信息学的方法比对多个数据库交叉验证了PPEF1在乳腺癌中的差异表达。PPEF1是编码蛋白质丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶的基因，本发明首次发现了PPEF1基因表达与乳腺癌相关。

实施例2分析PPEF1基因的预后及诊断价值

1.分析TCGA和bc-GenExMiner数据库中的PPEF1表达量与乳腺癌预后的关系

整理TCGA数据获得PPEF1在乳腺癌患者中的mRNA表达数据及对应的临床数据，根据表达差异分为低表达组和高表达组，对这两组进行十年生存率分析，并对PPEF1表达量和乳腺癌患者总体生存率进行单变量和多变量的COX回归分析。

利用乳腺癌数据库bc-GenExMiner对2002年-2019年的多个基因芯片结果进行整合分析，验证PPEF1高表达与预后的关系。

2.分析TCGA数据中PPEF1对乳腺癌的诊断价值

利用TCGA乳腺癌的mRNA表达数据，采用kmplotter分析对PPEF1诊断乳腺癌进行受试者工作曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)的效能评价。

3.结果

结果显示了以下几点：①乳腺癌患者PPEF1的高表达与更低的总体生存率及无转移复发生存率有关；②单变量和多变量Cox分析显示PPEF1表达可作为乳腺癌患者总体生存率的独立危险因素(HR＝1.001，P＝0.012)；③PPEF1 mRNA表达对乳腺癌的具有良好的诊断效果，ROC曲线下面积AUC(area under the ROC curve)＝0.903，灵敏度可达93.1％，特异性可达82.3％。

综上所述，通过检测受试者乳腺组织中PPEF1的表达，可以判断受试者是否患有乳腺癌、或者判断受试者是否存在患有乳腺癌的风险。

实施例3PPEF1的Hallmark效应富集分析

①将TCGA数据集均一化；

②按PPEF1的mRNA表达量分为PPEF1 high与PPEF1 low两组；

③通过使用clusterProfiler进行Hallmark效应基因集富集分析。

④基因集富集结果显示PPEF1高表达组富集的前三的效应基因集为上皮细胞间质转化(EMT)、血管生成、转化生长因子-β(TGF-β)信号传导，PPEF1可能通过以上生物学过程促进肿瘤发生发展。

实施例4PPEF1对乳腺癌细胞侵袭及迁移功能影响的验证

1.细胞培养

将乳腺癌细胞系MCF7，SK-BR-3采用含10％胎牛血清、双抗(青霉素、链霉素)的DMEM高糖培养基，正常乳腺细胞系MCF 10A采用含5％马血清、20ng/mlEGF、0.5μg/ml氢化可的松、10μg/ml胰岛素、1％非必需氨基酸、双抗的F12培养基，置于5％CO2、37℃、95％湿度的细胞培养箱中分别培养。

2.细胞和组织总RNA的提取

①贴壁细胞消化收集后加入1ml的RNA裂解液吸至无酶EP管中；

②向EP管中加入200ul氯仿，剧烈震荡15sec，室温静止3min，反复3次；

③12000×g、4℃离心15min；

④将上层水相加入新的无酶的EP管，在EP管中加入等体积异丙醇，颠倒、混匀，静置10min；

⑤12000×g、4℃离心15min；

⑥弃掉EP管液体，加入75％的乙醇1ml，震荡EP管；

⑦12000×g、4℃离心5min；

⑧弃净上清后室温放置干燥；

⑨加入适量DEPC水溶解RNA；检测RNA的纯度和浓度。

3.RT-qPCR检测乳腺细胞及癌细胞中PPEF1的表达

(1)RNA逆转录

反应条件：37℃，15min；85℃，5s；4℃保存。

(2)RNA逆转录

反应条件：95℃，30s，1个循环；95℃，5s，60℃，30s，40个循环；溶解曲线：65.0℃到95℃，升温梯度为0.5℃，时间为5s；使用美国Bio-Rad公司荧光定量PCR仪进行Real-TimePCR分析。

引物序列：

PPEF1正向引物F：5'-GAAAGCGAACAGGACATGAGGGATAG-3'(SEQ ID No.2)；

PPEF1反向引物R：5'-GTGAGAGGAAATTGTAGCCGAGGAC-3'(SEQ ID No.3)。

TBP正向引物F：5'-CCGGAATCCCTATCTTTAGTCC-3'；

TBP反向引物R：5'-GCCTTTGTTGCTCTTCCAAAAT-3'。

4.siRNA干扰PPEF1在乳腺癌细胞中的表达

利用小干扰RNA沉默PPEF1后，进行Transwell细胞迁移及侵袭实验验证。

siRNAs序列：

siN.C.：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’

siPPEF1：5’-GCAUUAGUACCUACAUAUUTT-3’

4.PPEF1干扰对乳腺癌迁移及侵袭能力的影响

(1)侵袭实验准备

Matrigel胶4℃过夜后，使用DMEM培养基按1：8稀释，在每个Transwell小室的上室加入60μl混合液，将小室放入24孔板，于细胞培养箱中孵育过夜(迁移实验无需此步骤)。

(2)迁移和侵袭实验

①用无血清培养基重悬siN.C.和siPPEF1的乳腺癌细胞系MCF7细胞，按5×10⁵个/ml的细胞密度传入上室200μl(侵袭实验将细胞传入含Matrigel胶的小室，迁移实验直接将细胞传入小室)；

②每个下室均加入含血清培养基600μl。

③37℃培养箱继续培养24小时；

④取出小室，吸去培养基，PBS清洗小室3遍，以冰甲醇4℃固定30min；

⑤PBS清洗小室，加入0.1％结晶紫染色10min；

⑥清洗小室，棉签轻轻擦去小室内部细胞，光学显微镜下观察小室外层滤膜上的细胞，随机选取小室3个视野并计数。

5.结果

PPEF1在乳腺癌细胞系MCF7、SK-BR-3中显著高于正常乳腺细胞系MCF 10A；且PPEF1基因干扰后，乳腺癌细胞系MCF7的迁移能力和侵袭能力显著下降，较对照组明显降低，差异有统计学意义。

实施例5PPEF1的mRNA及蛋白含量用于临床诊断及预后评估应用价值的验证

1.抗PPEF1多克隆抗体应用免疫组化方法辅助诊断乳腺癌

①玻片处理

烤片：石蜡切片56℃烘烤2h以上；透明：二甲苯脱蜡20mins；水化：100％乙醇5mins，95％乙醇5mins，80％乙醇5mins，75％乙醇5mins清洗：自来水冲洗15mins，PBST液浸泡5mins；

②抗原修复

将切片放入抗原修复液置于微波炉高火煮沸6mins，停火3mins,中火5mins，自然冷却至室温；自来水冲洗切片15mins，PBST液浸泡5mins；

③除内源性酶

将切片放入保湿盒，加适量的内源性过氧化氢酶阻断剂置于室温10mins；自来水冲洗10mins，PBST液浸泡5mins，最后一次沥干水分；

④封闭

山羊血清封闭≥30mins，室温，倾去血清，勿洗。

⑤一抗孵育

稀释一抗：PPEF1一抗(GeneTex)与抗体稀释液1：250滴加至切片，在4℃孵育过夜；

⑥保湿盒取出，室温复温30mins；

⑦加适量二抗覆盖组织(生物素标记山羊抗兔IgG)，置于保湿盒中，室温，10-15mins；自来水冲洗15mins，PBST液浸泡5mins，加适量辣根酶标记链酶卵白素，室温，10-15mins，自来水冲洗15mins，PBST液浸泡5mins

⑧显色

显微镜下滴加适量DAB染液，根据显色效果决定显色时间，变色后清水冲洗立即终止显色；

⑨复染

苏木素复染2mins，自来水冲洗2mins，1％盐酸酒精3-5s，饱和碳酸锂溶液5-10s，自来水冲洗2mins；

⑩中性树脂封片，显微镜下观察结果

2.检测血清中PPEF1水平及联合传统肿瘤标志物的诊断效率验证

①纳入西南医科大学附属医院114份血清样本进行PPEF1及传统肿瘤标志物联合诊断分析，健康对照者57例，未经治疗的乳腺癌患者57例；

②通过商业酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测血清样品中的PPEF1含量(ZeyeBio)；

③通过Roche Cobas e601电化学发光***及Roche Cobas相应试剂检测CEA，CA125和CA153；

④利用受试者工作曲线(ROC)及逻辑回归(logistics regression)进行独立诊断及联合诊断实验结果分析。

3.结果

采用本申请使用的试剂盒检测PPEF1含量并和多种传统肿瘤标志物组合对乳腺癌进行检测及联合诊断时，能够更有效地对待测样本进行诊断指导和预测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种乳腺癌肿瘤标志物PPEF1表达的检测试剂在制备疾病诊断或/和预后预测产品中的应用，其特征在于：所述PPEF1的序列为SEQ ID No.1。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测PPEF1表达的试剂包括使用SYBRGreen检测PPEF1表达量时使用的PCR扩增引物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增引物包括正向引物F和反向引物R，所述正向引物F的序列为SEQ ID No.2，所述反向引物R的序列为SEQ ID No.3。

4.一种分子标志物在检测乳腺癌细胞迁移和侵袭能力中的应用，其特征在于：所述分子标志物包括PPEF1基因或/和PPEF1基因的表达产物。

5.一种用于无创和有创检验对乳腺癌进行诊断或/和预后判断的应用，其特征在于，蛋白磷酸酶PPEF1在确认乳腺癌患者血清和组织中其表达产物mRNA或/和蛋白的高表达。

6.PPEF1联合其它肿瘤标志物组合在制备检测乳腺癌联合诊断试剂的应用；其特征在于，所述其它乳腺癌肿瘤标志物为CEA、CA125、CA153。

7.根据权利要求6所述，其特征在于，用于乳腺癌联合诊断产品的制备。

8.一种用于迁移和侵袭能力分子标志物检测、乳腺癌诊断或/和预后预测及乳腺癌联合诊断的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求4-7中任一项所述的检测PPEF1表达水平的基因芯片、试剂盒、试纸、免疫组化或免疫荧光检测试剂盒。

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