CN111201047B - 组织构建体、其生产和使用方法 - Google Patents

Abstract

描述了用于产生组织构建体的方法，通过该方法产生的组织构建体及其用途。所描述的制备组织构建体的方法包括提供颗粒样组织，在颗粒样组织上或颗粒样组织中沉积一根或多根纤丝，每根纤丝包含墨水，并使颗粒样组织胶凝或融合，从而产生组织构建体。

Description

组织构建体、其生产和使用方法

相关申请

本专利文件根据35 U.S.C.生的组织构建体要求于2017年9月21日提交的第62/561,477号美国临时专利申请，其通过引用并入本文。

联邦政府资助的研究或开发

本发明是在NIH CEGS(RM1HG008525)和ONR Vannevar Bush基金(N000141612823)的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

背景技术

本公开一般涉及组织工程，更具体地涉及制造例如包括嵌入的脉管***和/或小管的组织构建体。

根据需要创建三维(3D)脉管化组织的能力可在组织工程、药物筛选、毒理学、3D组织培养和器官修复中实现科学和技术的进步。为了产生模拟天然组织和最终地模拟器官的3D工程化组织构建体，可能需要以复杂的排列组装几个关键组件-细胞、胞外基质(ECM)和脉管***。这些组件中的每一个都起着至关重要的作用：细胞是所有生命***的基本单元，ECM提供结构支撑，和脉管网络提供有效的营养和废物运输、温度调节、因子递送和远程信号传导路径。在每个细胞的几百微米内没有可灌注的脉管***的情况下，三维组织可以快速形成坏死区。几十年来，无法在组织构建体中嵌入脉管网络，阻碍了3D组织工程的进展。

半个世纪前进行的典型实验证明了脊椎动物细胞的强大自组织能力。即使在完全解离之后，细胞也可以重新聚集并重建器官的原始构造。这个突出的特征被用于从组织或胚胎干细胞重建器官部分甚至完整的器官。这种干细胞衍生的三维培养物被称为类器官。因为类器官可以从人类干细胞和来源于患者的诱导性多能干细胞生长，所以它们具有模拟人类发育和疾病以及在三维生物模拟环境中进行模拟的潜力(Lancaster MA等人,Cerebralorganoids modelhuman brain devel-opment and microcephaly.Nature 501(7467):373官。这种干细胞衍生的。此外，它们有潜力用于药物测试甚至未来的器官置换策略(Lancaster等人,2013)。

需要制备适合于组织发育和疾病以及移植研究的组织构建体的新方法。

发明内容

某些实施方式涉及产生组织构建体的方法，所述方法包括提供颗粒样组织；在颗粒样组织上或颗粒样组织中沉积一根或多根纤丝，每根纤丝包含墨水；并且使颗粒样组织胶凝或融合，从而产生组织构建体。颗粒样组织包含约1,000至10亿细胞/毫升颗粒样组织。在该方法中，颗粒样组织可包括单细胞、细胞聚集体或两者的形式的细胞，其直径在约10μm至约5mm的范围内。墨水可以包括一种或多种牺牲墨水(用于脉管***/导管/小管/腺体打印)，载有细胞的墨水(用于多细胞组织的复杂构图)，结构墨水(用于支撑/机械信号/致动)，导电墨水(用于传感/致动/刺激)，光波导(用于刺激/光遗传学)。该方法可以进一步包括移除墨水以产生一个或多个开放通道或空隙，以及将一个或多个开放通道或空隙暴露于流体灌注。在该方法中，沉积步骤是在颗粒样组织上或颗粒样组织中形成功能性血管通道网络。颗粒样组织可包括一种或多种类器官、胚状体、细胞球状体和多细胞组织聚集体。颗粒样组织可进一步包括明胶、透明质酸、琼脂糖、藻酸盐、聚(乙二醇)、天然胞外基质混合物中的至少一种以充当填充剂、致孔剂、药物递送载体、传感器、致动器、光响应元件或流变改性剂。提供颗粒样组织的步骤包括生长多个细胞；收集多个细胞；并压实细胞以形成颗粒样组织。提供颗粒样组织的步骤还可包括在生长和收集步骤之后将多个细胞聚集成颗粒样组织。在该方法中，生长步骤可以在基底上或悬浮培养物中。基底是微孔阵列。提供颗粒样组织的步骤还可包括将颗粒样组织倒入任意形状的模具中。提供颗粒样组织的步骤可以进一步包括将颗粒样组织打印到基底上以对颗粒样组织进行进一步的构图。提供颗粒样组织的步骤可以进一步包括将颗粒样组织打印到支撑基质中或支撑基质上，诸如另一颗粒样组织、无细胞基质或两者的混合物，以允许颗粒样组织构建体的进一步构图。支撑的无细胞基质可包括明胶、胶原、基质胶、纤维蛋白、Carbopol、Pluronics、透明质酸、琼脂糖、藻酸盐、聚(乙二醇)、天然胞外基质混合物、聚丙烯酸充当填充剂、致孔剂、药物递送载体、传感器、致动器、光响应元件或流变改性剂。提供颗粒样组织的步骤可以进一步包括将细胞与胞外基质材料溶液混合。胞外基质材料溶液可包括能够驻留在颗粒样组织的胞外空间中的任何天然或合成溶液。胞外基质材料溶液可包括明胶、纤维蛋白、胶原和甲基丙烯酸明胶、基质胶、藻酸盐、壳聚糖、聚乙二醇、胶原酶敏感性聚乙二醇、层粘连蛋白、IV型胶原、纤连蛋白、玻连蛋白、透明质酸、琼脂糖、纤维素、羟基磷灰石、丝心蛋白及其任何修饰形式中的一种或多种。在该方法中，一个或多个纤丝、流动通道或空隙与一个或多个外部设备连通。外部设备包括泵、光导、致动器、电动机控制板、微控制器、数据采集板和现场可编程门阵列中的一个或多个。在该方法中，纤丝可以包括在颗粒样组织上或颗粒样组织中的功能性血管通道网络，所述功能性血管通道网络包括与外部泵流动连通的流动通道，用于在去除逃逸墨水(fugitive ink)后直接灌注氧气和营养物。将一个或多个纤丝暴露于流体灌注的步骤在流体剪切应力(FSS)下进行，其中FSS可为脉冲型的，以模拟常规心脏搏动期间的血压变化。该方法可以进一步包括将组织构建体暴露于一种或多种生物制剂、生物制剂梯度、压力和/或氧张力梯度。该方法可以进一步包括，在去除墨水之后，将内皮细胞的悬浮液注入一个或多个开放通道或空隙中。在该方法中，每个纤丝还可包括一个或多个同心和同轴的逃逸墨水层。同心墨水层可以布置为牺牲核心、包含平滑肌细胞的壳体和成纤维细胞外壳。或者，同心墨水层可以布置为牺牲核心、载有内皮细胞的内壳、包含平滑肌细胞的壳体和成纤维细胞外壳。去除墨水的步骤包括温热一根或多根纤丝。胶凝或融合颗粒样组织的步骤可包括温热颗粒样组织或将组织暴露于光以诱导交联。在该方法中，一个或多个纤丝可以在沉积在颗粒样组织上或颗粒样组织中之前通过单个打印头挤出。或者，一个或多个纤丝可以在沉积在颗粒样组织上或颗粒样组织中之前通过多个打印头挤出。沉积可以通过打印进行，其中打印速率可变，同时将墨水流动保持在恒定的流动速率，使血管直径平滑变化。或者，沉积可以通过打印进行，其中挤出速率可变，同时打印速率保持恒定，使血管直径平滑变化。该方法还可包括在提供颗粒样组织的步骤之前和/或与该步骤同时在基底上逐层沉积一种或多根结构纤丝形成模具。模具可以包括与通道或空隙流体连通的流动通道，用于在去除墨水之后灌注它们。模具可以3D打印有用于与泵接合的一个或多个集成的入口和出口。在该方法中，通道或空隙可以具有相同或不同的直径。

其他实施方式涉及通过以上和本文描述的方法产生的组织构建体。所述组织构建体可以是心脏、动脉、静脉***、肝脏、胆道、肾、胰腺、脾脏、***、骨骼、肌肉、脑、脊髓、神经、耳、眼、皮肤、皮下组织、***、乳腺、肌肉、肌腱、横膈膜、骨髓、淋巴、鼻、鼻咽、喉、气管、支气管、肺、口、唾液腺、舌、口咽、喉咽、食道、胃、小肠、结肠、直肠、***、泌尿生殖道、输尿管、膀胱、尿道、子宫、***、外阴、卵巢、胎盘、阴囊、***、***睾丸、精囊、垂体、松果体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺和朗格汉斯岛。

进一步的实施方式涉及通过所述方法产生的组织构建体用于缝合到体内的用途。

进一步的实施方式涉及通过所述方法产生的组织构建体用于在体外成熟的用途。

进一步的实施方式涉及通过所述方法产生的组织构建体用于药物毒性研究的用途。

进一步的实施方式涉及通过所述方法产生的组织构建体用于药物筛选应用的用途。

进一步的实施方式涉及通过所述方法产生的组织构建体用于疾病建模的用途。

进一步的实施方式涉及通过所述方法产生的组织构建体用于机理研究的用途。

附图说明

专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。包含彩色附图的本专利或专利申请公开的副本依请求并支付必要费用后由主管局提供。

图1示出了将血管网络的可缩放嵌入式直接墨水写入细胞密集的颗粒样组织中。

图2示出了血管化组织的打印、胶凝和排空。

图3示出了打印的10亿细胞灌注构建体的厚度可行性。

图4示出了胚状体制造过程。

图5描绘了通过所述方法产生的血管化构建体的照片。

图6显示在胶凝之前(无墨水)、胶凝之前(有墨水)和胶凝之后(无墨水)的颗粒样组织。

图7示出了层流和基质行为。

图8描绘了额外的流变性。

图9示出了在没有灌注的情况下的活力层。

图10示出了打印牺牲墨水以在颗粒样组织中形成层级脉管***的图像。

图11描绘了在组织灌注12h后的纵向截面和胶原染色。

图12描绘了嵌入式胚状体打印的策略，a)细胞聚集体基质模塑，随后将墨水(红色)嵌入打印到细胞聚集体基质中，b)将细胞聚集体墨水打印到刚性容器中，然后将第二种墨水(红色)嵌入打印到打印的细胞聚集体墨水中(即，第一种墨水用作第二种墨水的基质)，c)将细胞聚集体墨水嵌入打印到支撑基质(诸如Carbopol、藻酸盐、Pluronic，...)，然后将第二种墨水(红色)嵌入打印到打印的细胞聚集体墨水中(即，第一种墨水用作第二种墨水的基质)。

图13描绘了“器官”形状打印过程，其示出了图12的分图c)的第一步骤(左)和分图c)的第二步骤(右)。

图14描绘了将基于胚状体的墨水打印到基于胚状体的基质中的示例。

图15示出了模板通道内皮化。

图16描绘了灌注芯片的示例性制造方法的示意图。

具体实施方式

本文引用的所有专利、专利申请和出版物以及其他参考文献均通过引用以其整体并入本文。这些出版物的全部公开内容通过引用以其整体并入到本申请中，以便更全面地描述本领域的技术人员于本文所描述和要求保护的本发明的日期已知的本领域的技术状态。

PCT公开WO 2015/069619、WO 2016/141137、WO 2016/019087、WO2016/179242、WO2018/106704、WO 2018/106705和WO 2018/048900；和美国公开US 2016-0287756A1、US2018-0030409A1和US 2018-0110901A1都通过引用以其整体并入本文。另外，2018年7月20日提交的题为“Methods of production tubular multi-layered tissue constructs”的国际申请PCT/US18/43042通过引用以其整体并入本文。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于实施所公开的方法和组合物，但本文描述了示例性方法、组合物、设备和材料。

如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括多种这样的蛋白质，并且提及“祖细胞”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种祖细胞，等等。

工程化具有治疗潜力的器官特异性组织需要克服三个主要挑战。第一个挑战包括达到大约10亿细胞的临界规模，以便为人体提供相对于兴趣器官的分泌、代谢或过滤活动所需的水平[1]。第二个挑战包括形成具有致密和复杂组织的大块组织，其产生负责器官功能的细胞微构造，同时最小化工程化组织足迹。第三个挑战是用相关的各种完全分化的功能细胞组成和成熟新形成的组织。

前两个挑战激发了对渗滤脉管***的需求，该渗滤脉管***能够为组织提供其存活和适当功能所必需的氧和营养物质。已经采用许多技术来使组织脉管化，包括针铸(pincasting)[2]，其虽然能够以高保真度形成腔，但是不能产生对于通过组织的有效营养物分布和组织移植的可缝合性所必需的层级分支构造。或者，已经提出去细胞组织的再细胞化[3]以提供准确的化学和物理器官模板，然而将细胞重新引入支架以实现生理细胞密度和复杂性已证明具有挑战性。由于其能够生成具有临床相关数量的入口和出口的分支层级网络，生物打印可以解决血管化工程器官的挑战[4-6]。特别地，嵌入式打印，其包括在基质浴内挤出牺牲纤丝以产生自由形式的可灌注容器[7-9]，其可以使得能够在基质的主体内制造真正复杂的3D血管网络。

第二和第三个挑战要求使用诱导性多能干细胞(iPSC)衍生的类器官，其致密性和它们重现细胞复杂性、微构造和与其体内器官对应物类似的功能的潜力，使它们成为治疗性缩放器官的理想组织构建模块[10-12]。此外，大多数类器官形成测定中的共同起始结构是胚状体(EB)，其适于通用组织制造方法的开发，通常地与所选择的器官无关。虽然无血管，并且因此不可缩放，但过去的研究也已证明，形状类似于类器官的致密细胞球体可以组装成结构良好的组织[13,14]。

本文描述了打印的组织构建体，包括例如互穿的脉管***，以及使用嵌入式打印方法打印组织构建体的方法。这种嵌入式打印方法能够例如将脉管***自由形式打印到致密组织中，并且提供了在具有前所未有的缩放和细胞密度的***中维持组织活力的手段。由于细胞密度和高活力，预计这些组织在分化时将表现出显著的功能水平。具体地，本文所述的打印的组织构建体可以展示组织来自它们所衍生的细胞的许多天然特征。通过本文所述方法产生的组织构建体可用于例如移植入患者体内或用于体外测试。还考虑了通过本文描述的方法产生的组织构建体的其他用途。

在结合嵌入式3D打印和例如iPSC衍生的类器官的颗粒性质的情况下，描述了一种独特地针对产生高度细胞和可缩放功能性器官特异性组织的挑战的方法。出人意料的是，已证明紧密的胚状体或类器官(即“颗粒样组织”)组件具有流变学特性，适于用作嵌入的打印基质，在该基质中可以引导脉管***构图并随后进行灌注。同样，令人惊讶地，相同的颗粒样组织可以用作打印墨水，该墨水可以用于将细胞打印到基底上、模具中或支撑基质诸如例如另一颗粒样组织上。具体地，在某些实施方案中，压实的细胞聚集体基质或颗粒样组织也可以用作墨水，其可以直接打印以形成致密组织的纤丝，或用相同或另一种类型的压实的细胞聚集体嵌入打印(如图14所示)。

因此，某些实施方式涉及产生组织构建体的方法，包括提供颗粒样组织(以起到例如“嵌入式打印基质”的作用)；在颗粒样组织上或颗粒样组织中沉积一根或多根纤丝，每根纤丝包含墨水；并且使颗粒样组织胶凝或融合，从而产生组织构建体。本文所述的组织构建体的示例性方法的示意图如图1(a)所示。这在下面详细描述。

术语“组织构建体”通常是指任何工程化组织或器官，诸如血管，或更复杂的构建体，诸如具有互穿脉管***的肾或肠。示例性组织构建体可以是多层组织构建体(例如，管状组织构建体)，并且可以包括2至8中任意个同心和/或同轴细胞层。

所描述的方法包括提供颗粒样组织的步骤(图1a(1-6))。

在组织构建体和墨水的上下文以及本文描述的方法中，术语“颗粒样组织”是指包含具有或不具有胞外基质的细胞的材料，其中细胞是单细胞或细胞聚集体。粒度来自细胞或聚集体之间相对较弱的相互作用，如果施加足够的剪切力(大于材料的屈服应力)，则能够使它们相对于彼此移动，从而引起流动。颗粒样组织的示例性材料特性是它可以表现出屈服应力，表现为宾汉流体，并且能够围绕通过材料平移的圆柱体流动，并且在圆柱体后面自愈。低于屈服应力，储能模量将大于损耗模量，其中颗粒样组织表现为固体状。术语“颗粒样组织”还包括结构，诸如类器官、胚状体、细胞球体、多细胞组织聚集体或其组合等。通常，若干术语用于指代全面的3D组织构建体结构的培养物：类器官、球状体和球体。

颗粒样组织包括每毫升约1,000至10亿细胞(1K-1BB细胞/mL；“细胞密度”)的颗粒样组织。这相当于每毫升约100-100MM聚集体的聚集密度。颗粒样组织包括单细胞、细胞聚集体或两者的形式的细胞，其直径在约10μm至约5mm的范围内。颗粒样组织可以由异质细胞群和/或聚集体组成，并且每个聚集体可以由一种或多种细胞类型组成。

术语“类器官”是指通过在例如经历过一定程度分化的基底上培养一种或多种类型的细胞(例如人多能干细胞或多用干细胞(multipotent))而产生或合成的三维组织培养物、小器官样物。随着细胞分化，类器官进行几个发育阶段。类器官或囊泡具有类似于哺乳动物器官的解剖学特征，诸如小管结构、肾结构(例如，“肾脏类器官”或囊泡)。

术语“胚状体”是指多能干细胞的三维聚集体。包含胚状体的多能细胞类型包括

源于小鼠(mESC)、灵长类动物或人类(hESC)的来自胚胎的胚泡期的胚胎干细胞(ESCs)。另外，EB可以由通过替代技术衍生的胚胎干细胞形成，包括体细胞核移植或体细胞的重编程以产生诱导性多能干细胞(iPS)。与以单层形式培养的ESCs相似，胚状体内的ESCs沿着三种胚系进行分化和细胞特化-内胚层、外胚层和中胚层-包括所有体细胞类型。

颗粒样组织可由多种类型的细胞或多种类型的细胞聚集体组成，每种细胞聚集体具有不同的细胞组成。构成颗粒样组织的示例性细胞包括但不限于以下中的至少一种：多能干细胞(如诱导性多能干细胞(hiPSCs))、多用干细胞、胚胎干细胞(ESCs)(如人胚胎干细胞(hESCs))、祖细胞、终末分化细胞、内皮细胞、内皮祖细胞、永生化细胞系或原代细胞。

通常，存在几种用于产生颗粒样组织或器官培养物***的方法。

在示例性方法中，可以进一步用足够的营养供应和任选的特殊分化和生长因子的供应来简单地培养从干细胞培养物获得的胚状体，直到期望的量和/或期望的发育阶段实现为止。例如，期望的发育阶段可以是跳动的心肌细胞(心脏)、肾小球和荚膜形成(肾)、白蛋白表达(肝)或皮质板发育(脑)。

或者，培养发育阶段的完整有机体或其部分(例如，具有期望的结构)以及另一个发育阶段的完整的类器官体或其部分(例如，具有期望的结构)和/或衍生自它们的分化的单个细胞和/或未分化的成体干细胞可能是有利的。这可以实现例如所需细胞的更快速繁殖和/或所需结构的更快速或更具体的发育。在这种情况下，不同的类器官体或它们的一部分和/或分化的或未分化的细胞优选具有相同的来源。

在所述方法中，提供颗粒样组织的步骤包括培养多个细胞，收集多个细胞，并压实细胞以形成颗粒样组织。参见，例如，图1。通常，为了获得具有可测量的屈服应力的粘弹性颗粒样组织(即宾汉流体)，必须将聚集体在浴中压实至高密度(参考术语“压实”)。术语“高密度”是指接近体内发现的细胞密度；、即，每毫升组织高于约1亿个细胞的细胞密度可被认为是高密度的。这种压实可以通过采用聚集体的低密度悬浮液(“低密度”是指未压实的、未堆挤的聚集体组织；定量地，“低密度”可以相当于小于每毫升组织约5000万个细胞的细胞密度)并经由离心来迫使聚集体聚集在一起(“强制聚集，图1a(6))”，通过重力沉降，经由注射器、柱塞和多孔过滤器进行物理压实，干燥或在有限空间中的聚集生长来进行。在所述方法中提供颗粒样组织的步骤可以进一步包括在生长和收集步骤之后将多个细胞聚集到颗粒样组织中。术语“聚集”是指将单个细胞或小块细胞组合成更大的整体，或聚集形成细胞聚集体。聚集可以由细胞-细胞相互作用驱动，或者通过将细胞保持在一起形成聚集体的胞外基质的胶凝来驱动。将聚集体保持在一起的键通常大于聚集体间键。当细胞引入悬浮生物反应器培养物中，聚集可以通过将细胞离心成微孔(称为“强制聚集”)、悬滴法、将细胞铺板到非附着型基底(诸如未处理的细胞培养瓶)上，或通过细胞中可能发生的随机聚集而发生。生长可以在基质上，诸如微孔阵列，或在悬浮培养物中。

在某些实施方式中，该方法可以进一步包括将颗粒样组织倒入任意形状的模具中(例如，图12，左栏)。在一个示例中，模具可以由弹性体硅树脂形成，该弹性体硅树脂已知是粘弹性的、无毒的、生物相容的、并且能够形成可逆的压合密封的结构材料。除了限定组织构建体的形状之外，模具还可以具有其他功能。例如，模具可以用作在打印的组织构建体中灌注通道的界面。

或者，该方法可包括将颗粒样组织打印到基底上或模具中，以允许进一步构图颗粒样组织构建体(图12，中心栏)。

或者，该方法可包括将颗粒样组织打印到支撑基质中或支撑基质上，诸如另一颗粒样组织，无细胞基质或两者的混合物，以允许颗粒样组织构建体的进一步构图(图12，右栏)。该步骤还可以包括任意形状的模具。

支撑性无细胞基质可包括明胶、胶原、基质胶、纤维蛋白、Carbopol、Pluronics、透明质酸、琼脂糖、藻酸盐、聚(乙二醇)、天然胞外基质混合物、聚丙烯酸作为填充剂、致孔剂、药物递送载体、传感器、致动器、光响应元件或流变改性剂。这些材料可以大量使用，或经由机械混合器等使用、经由液滴微流体的应用或近经由小液滴的胶凝而制成微凝胶。

该方法可以进一步包括将细胞与胞外基质材料溶液混合(图1a(5))，其中胞外基质材料溶液可以包含能够存在于颗粒样组织的胞外空间中的任何天然或合成溶液。胞外基质材料溶液可包含例如明胶、纤维蛋白、胶原和甲基丙烯酸明胶、基质胶、藻酸盐、壳聚糖、聚乙二醇、胶原酶敏感性聚乙二醇、层粘连蛋白、IV型胶原、纤连蛋白、玻连蛋白、透明质酸、琼脂糖、纤维素、羟基磷灰石、丝心蛋白及其任何修饰形式中的一种或多种。

在一个示例性方法中，为了形成颗粒样组织，包括例如胚状体，可以使细胞生长至特定的汇合度。在某些实施方式中，优选的细胞汇合度可以是例如40-80％；50-80％，或60-80％。或者，细胞可以生长至至少例如40％，至少50％，至少60％，至少70％或至少80％的特定汇合度。还考虑了在指定范围内的其他细胞汇合度。

一旦达到所需的细胞汇合度，可以提升细胞并制备成大多数单细胞悬浮液。在几个离心和再悬浮步骤之后，可以在孔中接种细胞，可以将细胞离心以压实细胞以在微孔中形成胚状体。在下面的实施例部分中提供了制备颗粒样组织的优选方法的细节。

一旦胚状体达到例如直径为200-250μm的近似大小(在微孔培养物中通常为2-4天)，就可以收获并在合适的培养基(例如，预聚物ECM溶液)中制备胚体，形成致密的胚状体浆液，其可在后续步骤中处理和移液。

在某些实施方式中，胚状体可以在之前(在打印之前)或之后(在打印之后)分化成类器官(例如，肾、肝、心脏、脑等)。

例如，胚状体可以在打印之前，即在将一种或多种纤丝沉积在颗粒样组织上或颗粒样组织中的步骤之前分化成类器官。在某些实施方式中，一种或多种生物制剂、生物制剂梯度、压力和/或氧张力梯度可用于在打印前指导类器官从胚状胎体的发育和分化，和/或其功能化。

在某些其他实施方式中，胚状体可以在打印后，即在将一种或多种纤丝沉积在颗粒样组织上或颗粒样组织中的步骤之后分化成类器官。类似地，可以使用一种或多种生物制剂、生物制剂梯度、压力和/或氧张力梯度来指导类器官从胚状体的发育和分化和/或其功能化，但是在将一根或多根纤丝沉积在颗粒样组织上或颗粒样组织中的步骤之后。

在某些实施方式中，胚状体可以由初级、iPSC衍生的和/或胚胎干细胞组成，然后聚集成细胞球体或球状体。术语“球体”和“球状体”是指形状为球形的细胞聚集体。

在某些实施方式中，颗粒样组织还可含有以下的无细胞聚集体或颗粒，例如明胶、透明质酸、琼脂糖、藻酸盐、聚(乙二醇)、天然胞外基质混合物用作填充剂、致孔剂、药物递送载体、传感器、致动器、光响应元件或流变改性剂。术语“无细胞聚集体”是指一种生物材料，其衍生自处理人或动物组织以去除细胞并保留材料的部分。这些材料通常不含细胞。

在某些实施方式中，可以存在形成颗粒样组织的多种胚状体、类器官、球状体或其组合，其中可以例如经由诸如逃逸墨水的墨水的嵌入式的3D打印来打印纤丝例如形成脉管***。所述多种可包括例如心房和心室心脏聚集体、平滑肌和成纤维细胞聚集体、前脑和后脑聚集体、输尿管芽和中肾间充质类器官的组合。

所描述的方法还包括将一根或多根纤丝沉积在颗粒样组织上或颗粒样组织中的步骤，每根纤丝包含墨水(图1a(7))。在某些实施方式中，墨水包含一种或多种的牺牲墨水(例如，用于脉管***/管道/小管/腺体打印)，载有细胞的墨水(例如，用于多细胞组织的复杂构图)，结构墨水(例如，用于支撑/机械信号/驱动)，导电墨水(例如，用于传感/致动/刺激)，光波导(例如，用于刺激/光遗传学)或颗粒样组织。

在一个实施方式中，压实的细胞聚集体基质或颗粒样组织也可以用作可以直接打印以形成致密组织的纤丝的墨水，或者用相同或另一类型的压实细胞聚集体嵌入打印的墨水。

在某些实施方式中，沉积可以是通过打印，诸如3D打印。打印纤丝的方法是本领域已知的，并且先前描述于PCT公开WO 2015/069619中，其通过引用以其整体并入本文。3D打印方法的细节可以在PCT公开WO2014/209994和WO 2015/073944中找到，两者均通过引用以其整体并入本文。

例如，打印可以是通过在颗粒样组织上或颗粒样组织中沉积一根或多根纤丝，每根纤丝包含墨水，以形成一根或多根纤丝图案。在某些实施方式中，可以去除墨水以在颗粒样组织上或颗粒样组织中形成通道网络。

在某些实施方式中，在通过在颗粒样组织上或颗粒样组织中打印来沉积纤丝的同时，可以改变打印速率，同时将墨水流动保持在恒定的流率，使得通道/血管直径平滑变化。或者，在通过在颗粒样组织上或颗粒样组织中打印来沉积纤丝的同时，可以在保持打印速率恒定的同时改变挤出速率，使得通道/血管直径平滑变化。

每根纤丝可包括一个或多个同心和同轴的逃逸墨水层。同心墨水层可以布置为牺牲核心、包含平滑肌细胞的壳体和成纤维细胞外壳。或者，同心墨水层可以布置为牺牲核心、载有内皮细胞的内壳、包含平滑肌细胞的壳体和成纤维细胞外壳。

在某些实施方式中，一根或多根纤丝可以在沉积在颗粒样组织上或颗粒样组织中之前通过单个打印头挤出。或者，一根或多根纤丝可以在沉积在颗粒样组织上或颗粒样组织中之前通过多个打印头挤出。通过单个或多个打印头挤出纤丝的方法在本领域中是已知的。

在某些实施方式中，所述方法可以进一步包括在提供颗粒样组织的步骤之前和/或该步骤的同时在基底上逐层沉积一根或多根结构纤丝以形成模具。模具可以包括与通道或空隙流体连通的流动通道，用于在去除墨水之后灌注它们。在某些实施方式中，模具可以3D打印有用于与泵接合的一个或多个集成的入口和出口。

纤丝在颗粒样组织上或颗粒样组织中的布置可以是连续的或不连续的。在连续的布置中，示例性纤丝图案(并且包括一种或多种预定墨水类型)的纤丝可以在颗粒样组织上或颗粒样组织中形成单个互连纤丝网络。例如，包括预定墨水类型的单丝可以以单层或多层沉积以形成连续布置。或者，多个包含预定墨水类型的纤丝可以以单层或多层沉积以形成连续布置，其中每根纤丝与包含相同预定墨水类型的另一纤丝物理接触，并且可能地至少部分与另一纤丝结合。

在包含一种或多种预定墨水的纤丝的不连续布置中，在颗粒样组织上或颗粒样组织中不形成预定墨水类型的单个互连纤丝网络。相反，包含预定墨水类型的纤丝可以均匀地或不均匀地分散在颗粒样组织上和/或整个颗粒样组织中。因此，其他结构也可以均匀地或不均匀地(例如，块状)分散在整个颗粒样组织中。在该实施方式中，给定纤丝图案和墨水类型的一些、所有或没有纤丝可以与包含相同墨水类型的另一纤丝物理接触。

如上所述，在某些实施方式中，颗粒样组织可以起到“颗粒样组织基质”的作用，其由胚状体或类器官组成，并且可以包含或不包含特别添加的额外蛋白质以帮助结合细胞、胚状体和/或类器官一起形成更具粘性的嵌入式打印基质。可以添加来帮助结合细胞的示例性蛋白质或小分子包括I型胶原、IV型胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、明胶、甲基丙烯酸明胶、透明质酸、甲基丙烯酸透明质酸、软骨素、聚集蛋白聚糖、聚(乙二醇)、藻酸盐、甲基丙烯酸藻酸盐、丝心蛋白、丝、羟基磷灰石、聚(乙烯醇)、聚赖氨酸、聚鸟氨酸、琼脂糖、甲基丙烯酸琼脂糖、基底膜提取物(基质胶)或转谷氨酰胺酶。

在某些实施方式中，可以使用墨水(例如，逃逸墨水)来产生嵌入的脉管***，其可以被直接打印到颗粒样组织基质中或者被预先打印在例如基底上，然后用颗粒样组织填充。

示例性打印墨水包括：用于打印脉管***、管道、小管和/或腺体的牺牲墨水；用于打印多细胞组织的复杂构图的载有细胞的墨水；用于打印支撑、机械信号和致动的结构墨水；用于传感、致动和/或刺激的导电墨水；用于刺激和/或光遗传学的光波导墨水。

载有细胞的墨水可包括至少一种活细胞，并可包括大量活细胞。例如，每种载有细胞的墨水可具有至少约100个细胞/ml，至少约1000个细胞/ml，至少约10⁴细胞/ml，至少约10⁵细胞/ml，至少约10⁶细胞/ml，至少约10⁷个细胞/ml，或者至少约10⁸细胞/ml的细胞浓度。通常，细胞浓度不高于约10⁹个细胞/ml，或不高于约10⁸细胞/ml。

活细胞和预定细胞类型可包括选自构成哺乳动物体的细胞的任何哺乳动物细胞类型，包括生殖细胞、体细胞和干细胞。根据细胞的类型，构成哺乳动物体的细胞可以来自非常早期胚胎中的三个主要生殖细胞层之一：内胚层、外胚层或中胚层。术语“生殖细胞”是指产生配子(卵和***)的任何细胞系。术语“体细胞”是指形成多细胞生物体的任何生物细胞；除配子、生殖细胞、配子体或未分化干细胞以外的任何细胞。例如，在哺乳动物中，体细胞构成所有内部器官、皮肤、骨骼、血液和***。因此，细胞可包括从哺乳动物组织分离的任何体细胞，包括器官、皮肤、骨骼、血液和***(即基质细胞)。体细胞的示例包括成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌腱细胞、肥大细胞、游走细胞、免疫细胞、周细胞、炎症细胞、内皮细胞、肌细胞(心肌、骨骼和平滑肌细胞)、脂肪细胞(即贮脂细胞或脂肪细胞)、实质细胞(神经元和胶质细胞、肾单位细胞、肝细胞、胰腺细胞，肺实质细胞)和非实质细胞(例如，窦状肝内皮细胞，库普弗细胞和肝星状细胞)。术语“干细胞”是指能够无限期***并产生哺乳动物体的几乎所有组织的细胞，包括特化细胞。干细胞包括多能细胞，其经历进一步的特化后变成多用祖细胞，所述多用祖细胞可以产生功能性或体细胞。干细胞和祖细胞的示例包括来自骨髓的造血干细胞(成体干细胞，即成血细胞)，其产生红细胞、白细胞和血小板；来自骨髓的间充质干细胞(成体干细胞)，其产生基质细胞、脂肪细胞和骨细胞类型；上皮干细胞(祖细胞)，其产生各种类型的皮肤细胞；神经干细胞和神经祖细胞，其产生神经元和胶质细胞；和有助于分化的肌肉组织的肌肉卫星细胞(祖细胞)。

在某些实施方式中，包括用于打印支撑、机械信号和致动的结构墨水的纤丝可以3D打印以形成一种或多种未固化的结构纤丝，所述未固化的结构纤丝包含硅树脂、环氧树脂、丙烯酸酯中的一种或多种，或上面提供的一种胞外基质组合物。在打印完成后，可以将结构纤丝固化(例如通过加热或光聚合)适当的持续时间(例如，约一小时或更长)，之后模具可以表现出所需的材料特性。

所描述的制备组织构建体的方法还包括使颗粒样组织胶凝或融合的步骤。

在某些实施方式中，使颗粒样组织胶凝或融合的步骤包括温热颗粒样组织或将组织暴露于光以诱导交联。术语“胶凝”是指能够在超过其屈服应力的应力下流动的颗粒样组织变成固体弹性样组织的过程。这种增加的相互作用可以来自围绕细胞或聚集体的胞外基质的聚合，和/或通过增加的聚集体之间的细胞-细胞结合(例如，融合或使用耗尽剂以驱动静电相互作用)。胶凝的颗粒样组织不再表现为宾汉流体，并且可能显着***。因此，如果圆柱体通过材料平移，它将切割材料。

用于胶凝的一种示例性机制是细胞或细胞聚集体融合在一起(参考术语“融合”)，由此细胞间或聚集体结合增加至聚集体或细胞不再表现为单独颗粒的点，并且通常可以观察到两个先前分开的聚集体在微观上可见的合并。这种结合机制是由于细胞-细胞的相互作用，其中基质位于聚集体之间。以这种方式，融合的聚集体不能再相互流过，相反，它们表现如固体。颗粒样组织的硬度增加，且材料不再自愈。

在某些实施方式中，沉积步骤是在颗粒样组织上或颗粒样组织中形成功能性血管通道网络。为此，在某些实施方式中，所描述的方法可以进一步包括去除墨水以产生一个或多个开放通道或空隙。通道或空隙可以具有相同或不同的直径。在某些实施方式中，一个或多个开放通道或空隙可以暴露于流体灌注(图1a(8))。

使一根或多根纤丝暴露于流体灌注的步骤可以在流体剪切应力(FSS)下进行。在常规心跳期间，可以脉冲FSS以模拟血压变化。去除墨水的步骤可包括温热一根或多根纤丝。在某些实施方式中，在去除墨水后，可以将内皮细胞的悬浮液注射或沉积到一个或多个开放通道或空隙中(参见例如图16)。在某些实施方式中，墨水的去除允许整个构造在外部灌注，这允许颗粒样组织或颗粒样组织基质内的细胞保持活力。

在某些实施方式中，可以将单种或多种类型的细胞注射到血管通道中。在体内，每个直径大于毛细血管的血管包含外纤维组织层、平滑肌层和内皮细胞内层。在去除逃逸墨水后，可以将一种或多种其他类型的细胞(诸如成纤维细胞)与内皮细胞一起注射到血管通道中。而且，血管通道可以与成纤维细胞和HUVECs共同接种，两种细胞类型可以分别自组装成基质层和内皮层，模拟天然血管的解剖结构。

在某些实施方式中，内皮细胞可悬浮在牺牲墨水中，其中在所述墨水熔融时，内皮细胞将被允许粘附并涂覆由打印墨水模板化的腔的表面。

在某些实施方式中，结合所描述的制备组织构建体的方法，一个或多个纤丝、流动通道或空隙与一个或多个外部设备连通。示例性外部设备包括泵、光导、致动器、电动机控制板、微控制器、数据采集板和现场可编程门阵列中的一个或多个。还构想了其他外部设备。

在某些实施方式中，纤丝可包括在颗粒样组织上或颗粒样组织中的功能性血管通道网络，所述功能性血管通道网络包括与外部泵流体连通的流动通道，用于直接灌注氧、营养物和/或在去除逃逸墨水后的生长和分化因子。

分化因子和/或生长因子是本领域已知的，并且包括例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)用于增加心肌细胞和成纤维细胞的形成，血管内皮生长因子(VEGF)，DMSO和异丙肾上腺素，成纤维细胞生长因子4(FGF4)，肝细胞生长因子(HGF)用于增加心肌和肝细胞的形成，转化生长因子βI(TGFβI)用于增加心肌细胞形成，表皮生长因子(EGF)用于增加皮肤细胞和心肌细胞的形成，角质形成细胞生长因子(KGF)(有时与可的松一起)形成角质形成细胞，维甲酸用于增加神经细胞、心肌细胞和肾细胞形成，β神经生长因子(β-NGF)用于增加脑细胞、肝细胞、胰腺细胞和肾细胞形成，骨形态发生蛋白(BMP-4)和activin-A用于形成中胚层细胞，但不限于此。鉴于关于该主题的大量文献(参见例如“Adult Stem Cells”，编辑K.Tursen，HumanPress，2004)，本领域技术人员将能够容易地识别并且如果必要的话，使用其他合适的因素，这取决于细胞类型和/或细胞组合。

在某些实施方式中，一旦形成组织构建体，灌注芯片可用于提供流体灌注。示例性灌注芯片先前描述于PCT公开WO 2016/179016中，其全部内容通过引用并入本文。例如，所得到的组织结构可以经由单个入口和出口立即灌注营养物以及生长和分化因子，所述单个入口和出口位于芯片的与通道连接的相对端，例如血管通道或空隙，以确保细胞生存和成熟。在原理验证研究中，一厘米厚的生物打印的组织构建体，其含有被***包围并由人工内皮衬里的脉管***支撑的人骨髓MSC，允许骨生长因子的循环，并且随后诱导骨发育。

在某些其他实施方式中，所述方法可包括将组织构建体暴露于一种或多种生物制剂、生物制剂梯度、压力和/或氧张力梯度的额外步骤。示例性生物制剂包括蛋白质、生长因子、形态发生素、脂质、小分子、抗体、DNA和RNA。

在某些实施方式中，通过在颗粒样组织的细胞聚集体(例如，胚状体、类器官或细胞球体)中的受控自组装，或通过在颗粒样组织本身内引入微脉管***来将额外水平的脉管***包括在组织构建体内。

术语脉管***的“受控自组装”是指在细胞聚集体内形成功能性微血管网络的血管生成(vasculogenesis)或血管发生(angiogenesis)的过程。例如，可以经由在细胞聚集体周围或中存在或引入内皮细胞来形成微血管网络。为了形成微脉管***，可以以产生分化的内皮细胞的方式培养胚状体，所述分化的内皮细胞经由血管生成或血管发生自组装。或者，可以将内皮细胞与其他细胞类型混合以形成含有内皮细胞的细胞球体。或者，可以经由从一种细胞类型向内皮细胞的分化或转分化形成内皮细胞。可以添加支撑细胞，例如成纤维细胞、周细胞或间充质干细胞，以稳定细胞聚集体内微血管网络的形成。

在某些实施方式中，通过在颗粒样组织本身内引入微脉管***可以将脉管***的水平包括在组织构建体内。这可以使用更高分辨率、更小的喷嘴来执行，用于使用牺牲墨水直接在类器官之间书写血管网络。或者，可以将内皮细胞与ECM预聚物溶液混合，使得血管发生或血管生成可以在组织中压实细胞聚集体之间的空间中形成微脉管***。还可以将支撑细胞(诸如成纤维细胞、周细胞或间充质干细胞)添加到预聚物凝胶中以稳定所得的微脉管***。内皮细胞可以以1-4千万细胞/ml的细胞密度添加。可以以1-4千万细胞/ml的细胞密度添加支撑细胞。

在制备组织构建体的替代方法中，可以将由例如胚状体或类器官组成的颗粒样组织置入包含预先构图的纤丝(例如，脉管***)网络的任意形状或大小的模具中。

在另一种制备组织构建体的替代方法中，颗粒样组织可以用作可以将纤丝打印在其中或其上的基质。在其他替代实施方式中，颗粒样组织可用作打印墨水，其可用于将细胞打印到基底上，模具中或支撑基质(诸如另一颗粒样组织)中。

图5描绘了通过所述方法产生的血管化构建体的照片。

图6显示在胶凝(没用墨水)之前、胶凝之前(用墨水)和胶凝之后(没用墨水)的颗粒样组织。

图7示出了层流和基质行为。

图9示出了在没有灌注的情况下的活力层。

图10示出了脉管***打印。

图11描绘了组织灌注12h后的纵截面和胶原染色。

图12描绘了嵌入式胚状体打印的策略。具体地，在a)中示出了，细胞聚集体基质模塑，随后将墨水(红色)嵌入打印到细胞聚集体基质中。在b)中示出了，将细胞聚集体墨水打印到刚性容器中，然后将第二种墨水(红色)嵌入打印到打印的细胞聚集体墨水中(即，第一种墨水用作第二种墨水的基质)。在c)中示出了，将细胞聚集体墨水嵌入打印到支撑基质(诸如Carbopol、藻酸盐、Pluronic，…)，然后将第二种墨水(红色)嵌入打印到打印的细胞聚集体墨水中(即，第一种墨水用作第二种墨水的基质)。

图13描绘了“器官”形状打印过程，其示出了图12的分图c)(左)的第一步骤和分图c)(右)的第二步骤。

图14描绘了将基于胚状体的墨水打印到基于胚状体的基质中的示例。

又一个实施方式涉及通过本文描述的方法产生的组织构建体。打印的组织构建体将包含一种或多种组织图案，其中每种组织图案包含一种或多种预定细胞类型的多个活细胞。血管通道网络可以互穿一个或多个组织图案。在某些实施方式中，胞外基质组合物可以至少部分地包围一种或多种组织图案和血管通道网络。在组织构建体中“互穿”另一图案或网络的图案或网络可以被理解为包括一根或多根纤丝、通道或部分，所述纤丝、通道或部分与其他图案或网络的一跟或多根纤丝，通道或其他的部分通过部分或完全向上重叠、部分或完全地向下重叠、包围、嵌入和/或与交织来层积。“沉积在基底上”的纤丝可以被理解为直接沉积在基底上或直接沉积在先前沉积或形成在基底上的另一纤丝、通道或部分上。

通过所述方法产生的组织构建体可以是具有嵌入的脉管***的组织构建体。通过所述方法产生的组织构建体的示例包括心脏、动脉、静脉***、肝脏、胆道、肾、胰腺、脾脏、***、骨骼、肌肉、脑、脊髓、神经、耳、眼、皮肤、皮下组织、***、乳腺、肌肉、肌腱、横膈膜，骨髓、淋巴、鼻、鼻咽、喉、气管、支气管、肺、口、唾液腺、舌、口咽、喉咽、食道、胃、小肠、结肠、直肠、***、泌尿生殖道、输尿管、膀胱、尿道、子宫、***、外阴、卵巢、胎盘、阴囊、***、***睾丸、精囊、垂体、松果体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺和朗格汉斯岛。

具体地，组织构建体可以通过如下产生：提供颗粒样组织；将一根或多根纤丝沉积在颗粒样组织上或颗粒样组织中，每根纤丝包含墨水；和使颗粒样组织胶凝或融合，从而产生组织构建体，如上所述。提供颗粒样组织的步骤包括生长多个细胞；收集多个细胞；并压实细胞以形成颗粒样组织。然后可以将颗粒样组织倒入任意形状的模具中。或者，可以将颗粒样组织打印到基底上或模具中，以允许进一步构图基质。沉积步骤可以是在颗粒样组织上或颗粒样组织中形成功能性血管通道网络。

通过所述方法产生的组织构建体可包括多达n种不同的预定细胞类型。例如，n可以满足l≤n<300，2≤n≤200或2≤n≤100。更通常地，n不大于50，不大于30，或不大于20。例如，在组织构建体中可以有2个或更多个，4个或更多个，8个或更多个，16个或更多个，或者20个或更多个预定的细胞类型。

组织构建体可具有任何期望的2D或3D形状。例如，组织购建体可以具有由单层或多层装载细胞的纤丝和互穿血管网络构建的平面几何形状。这种结构可具有任何所需的高度(厚度)。通常，通过所述方法生产的组织构建体具有约100cm或更小，约10cm或更小，约1cm或更小，约1mm或更小，约500微米或更小，或约100微米或更小，且通常至少约10微米，至少约100微米，至少约200微米，或至少约1毫米的高度。

或者，通过所述方法产生的具有嵌入式脉管***的组织构建体可具有任意或依赖于应用的3D尺寸和形状。组织构建体可以具有固体结构、多孔结构和/或中空结构(例如，管状或非管状)，并且可以制造成模拟特定器官的形态和功能。例如，组织构建体可具有肾、心脏、胰腺、肝脏、膀胱、***、尿道、气管、食道、皮肤或其他身体器官的大小和形状。

如上所述，3D尺寸和形状在某些情况下可以由模具确定。模具可以在沉积纤丝的步骤期间保持颗粒样组织并且可以作为组织构建体的一部分保留，或者可以在处理之后去除。在一些实施方式中，结构纤丝可以限定基底上的组织构建体的周边以及组织构建体的三维形状的全部或至少一部分在XY平面之外构建。除了限定组织构建体的形状之外，模具还可以具有其他功能。例如，模具可以用作在打印的组织构建体中灌注通道的界面。

通过本文描述的方法产生的组织构建体可用于缝合到体内并用于体外成熟。它还可用于药物毒性研究、药物筛选应用、疾病建模和机理研究。

还考虑了其他用途。

实施例

方法：

培养基、墨水和基质配方

用于嵌入打印脉管***的明胶牺牲墨水由明胶原液制备。通过在85℃下在搅拌下将45g明胶缓慢加入到255mL不含钙或镁的PBS中来制备原液。将温度和搅拌保持12小时以完全溶解明胶，之后在搅拌下使用2NNaOH将pH调节至～7.5。将热明胶原液无菌过滤、等分，并在4℃下储存长达6个月。

为制备明胶牺牲墨水，首先将明胶原液在80℃下熔融<30分钟，然后以1:2与不含钙或镁的80℃PBS混合，并以2％vol/vol加入红色食用色素，以实现打印墨水的可视化。

用于制造组织模具和灌注芯片的硅树脂墨水通过组合10:1质量比的SE1700:交联剂(Dow Corning)，然后加入2％wt黑色硅树脂颜料(Silc-Pig，Smooth-On Inc.)来制备。然后使用速率混合器将组分在2000rpm下混合3分钟(Thinky Inc.)。

为了制备胚状体培养基(EBCM)，通过在室温在搅拌下将20gPVA(Sigma Aldrich)缓慢加入到100mL去离子水中来制备聚(乙烯醇)(PVA)的原液。接下来，在连续搅拌下，将温度升至80℃以完成PVA的溶解，且使温度回到37℃。将PVA溶液等分并在4℃下储存直至准备使用。为了制备EBCM，将mTeSRI与PVA原液以1:50混合以产生～4mg/mL溶液。

加入青霉素/链霉素至100U/mL，将溶液无菌过滤并在4℃下储存最多两周。

在收获EB之前或在收获步骤期间，立即制备ECM预聚物凝胶，如下：

首先通过向mTeSR1添加20mg/mL微生物组织转谷氨酰胺酶(TG，MooGlu)制备转谷氨酰胺酶工作溶液，并经由0.2氨酰注射器过滤器对溶液进行无菌过滤。接下来，计算在最终ECM溶液中产生4mg/mL胶原浓度(总体积y mL)所需的高浓度鼠尾胶原I型(Corning)的体积(x mL)。ECM预聚物凝胶溶液包含顺序加入的(0.825y-1.135x)mL mTeSR1、0.125ml TG工作溶液，x/10mL 10X PBS、y/100mL 250mM CaCl2、～x/40mL 1NNaOH，x mL高浓度鼠尾胶原I型和0.04y mL的基质胶。补充方法中示出了示例性配方。必要时调节NaOH的体积以达到～7.4的最终pH。加入并混合所有组分后，将凝胶在2℃下以2000合所有离心5分钟以去除气泡。将ECM预聚物凝胶储存在冰上直至使用。

表1

iPS细胞培养

将人成纤维细胞衍生的个体基因组计划I(PGP I)诱导的多能干细胞的原液储存在液氮中的CryoVials中，具有～300k PGPI细胞/小瓶，在0.5ml的1:1的2X EmbryoMax溶液(EMD Millipore)：mTeSR1中冷冻。为了解冻，将细胞温热至37℃，转移至15mL离心管中，并逐滴加入新鲜的37℃DMEM/F12+HEPES(Thermofisher Scien-tific)至12mL。将细胞以220×g离心5分钟，然后吸出上清液，将细胞重悬于2mL含有10μMROCK-抑制剂(ROCKi，Y27635)的mTeSR1(Stem Cell Technologies，Inc)中，并且在6孔板的单个基质胶涂覆(Corning)孔上铺板。24小时后，更换mTeSR1以去除ROCKi。mTeSR1随后每天更换。一旦菌落开始融合(60-80％汇合度)，用不含钙或镁的PBS冲洗细胞，并通过以1mL/10cm2组织培养区添加无酶传代溶液(ReLeSR)进行传代。立即吸出溶液，并将烧瓶在37℃、5％CO2下温育4.5-5分钟。为了移出菌落，使用血清移液管将1ml/10cm2的新鲜mTeSR1轻轻地加入烧瓶中，并移回一次，缓慢地破碎菌落。然后将细胞加入到新制备的烧瓶中，进行1:8至1:3的分流，并加入mTeSR1至总体积为2ml/10cm2组织培养区。将细胞保持在37℃/5％CO2的培养箱中。

微孔阵列的制造

使用微孔阵列板经由强制聚集产生大量(>100k)高度均匀的EB。具有400μm底面宽度的倒金字塔形的微孔以6孔板形式布置，并经由PDMS模制制造。

使用以下方法促进脱模并确保聚合物之间的浇铸相容性。简言之，将PDMS倒入市售的微孔板中，在真空室中脱气，并在80℃下固化2小时以产生微孔的阴性铸型。然后，使用Ecoflex(Smooth-On Inc.)按照类似的PDMSd的浇注、脱气和固化方法制造阳模。去除固化的Ecoflex后，将双组分聚氨酯(Smooth-On Inc.)倒在Ecoflex阳性上以形成聚氨酯阴模。接下来，将-80g以10:1比例的Sylgard-184:交联剂在行星式混合器中混合，倒入聚氨酯(Smooth-On)阴模中，在真空中脱气10分钟，并允许在室温下固化48小时。然后将固化的PDMS置于80℃的烘箱中2小时以确保完全交联，并从聚氨酯模具中取出。

胚状体形成

为了制备用于细胞培养的孔，将孔浸入异丙醇中1小时，然后浸入水中并高压灭菌1小时。在即将制备细胞之前，从孔中排出水，然后将孔装入无菌单孔盘(Omnitray，Falcon)中。接下来，每孔加入1.5ml Aggrewell冲洗液(ARS)，然后以2000×g离心孔，以从孔中去除捕获的气泡。吸出ARS，用2ml DMEM冲洗孔2次。最后，用3ml EBCM+10μM ROCKi替换DMEM，并将孔保持在室温下。

为了形成EB，使PGP1细胞在225cm2的T-225烧瓶(Falcon)中生长至60-80％汇合度。一个PGP1的T-225可用于接种约24个孔(4×6孔板)，每个微孔约500个细胞。为了从基底上剥离PGP1细胞，首先将细胞在不含钙或镁的PBS中冲洗，然后在Accutase中于37℃下温育15分钟，以产生主要为单细胞的悬浮液。将Accutase中的细胞加入预温热的DMEM/F12+HEPES中，并以220×g离心5分钟。去除上清液，将细胞以每个待被接种的孔1mL的体积重悬于mTeSR1+10μM ROCKi培养基中。使用活/死成像***对细胞进行计数，并将1mL细胞悬液接种到每个孔中。最后将孔以100x g离心3分钟以压实细胞。24小时后，用4ml新鲜的EBCM替换细胞培养基以去除ROCKi。然后每天对孔进行两次一半的培养基替换(2mlEBCM用新鲜培养基替换)。在培养基更换期间要小心，缓慢添加或移除培养基，以免干扰其微孔中的EB。

颗粒样组织形成

一旦EB测量直径为200-250μm(通常在微孔培养2-4天)，它们就准备好收获。在ECM预聚物凝胶制备之后立即或期间，经由用P1000移液管尖端在孔中上下剧烈移液来收获EB，并将含EB的培养基转移到50mL管中，每6孔一管。这些孔进一步用过量的DMEM/F12+HEPES冲洗，使用10mL血清移液管移除大部分(>90％)胚状体。将具有悬浮的EB的培养基添加至50mL离心管中，并通过在冰上温育10分钟使EB沉降。将所有进一步的细胞处理保持在冰上以防止ECM预聚物凝胶的胶凝。吸出上清液，将EB收集在冰上的单个50mL管中。为了进一步洗去单细胞，加入50mL新鲜DMEM/F12+HEPES，使EB沉降另外的10分钟，然后吸出上清液，并使用DMEM/F12+HEPES将EB重悬至15mL，并将其转移到15mL管中并使其沉降10分钟。接下来，为了压实EB，将15mL管在2℃下以100×g离心3分钟，吸出上清液，并估计组织聚集体的总体积。通过用P1000移液管移液将细胞以3倍体积重悬于ECM预聚物溶液中，然后以100×g离心并吸出上清液。最后，将EB丸粒重新悬浮在等体积的预聚物ECM溶液中，形成致密的EB浆液，其可以在随后的步骤中处理和移液。

硅树脂模具的3D打印

使用刮刀，将新混合的硅树脂膜水装入30cc注射器(Nordson EFD)中，并以>3000×g离心以去除夹带的空气。尖端内径为0.41mm的锥形喷嘴(Nordson EFD)连接到注射器的出口，且注射器固定在3D打印机上，所述3D打印机包括一个可以沿x轴、y轴和z轴平移的花岗岩安装式气浮龙门(Aerotech Inc.)。借助于Ultimus V压力控制器(Nordson EFD)产生的压力将墨水从注射器分配到下面的玻璃基底上。模具使用定制的MATLAB脚本设计，该脚本从.stl或.bmp文件或自定义几何命令获取几何输入，并为Aerobasic Editor(AerotechInc.)输出原始G代码命令以控制龙门运动和压力致动以产生硅树脂壁，以及用作管***部位的小通道用来作为流的入口或出口。打印后，将硅树脂转移至80℃持续>2小时以固化硅树脂。固化后，将新鲜的硅树脂墨水挤出到模具的顶层上(手动或经由3D打印机)，并将第二个载玻片加到顶部，使得硅树脂垫圈夹在两个载玻片之间。

对于图3中使用的模具，将透明硅树脂打印并固化到第二载玻片上，使得组装的垫圈在顶侧中间具有用于喷嘴***的狭缝(图3(b))。将模具转移至80℃以固化硅树脂。模具可在使用前在室温下储存。

另外，如图17所示，可以使用垫圈的改进形式，其中明胶可以首先在贮存器内模制并且在基质浇铸之后被移除，以努力在内侧和外部灌注血管化组织。

脉管***的嵌入式印刷

为了将脉管***打印到组织中，将新鲜制备的牺牲明胶墨水装入0.5cc玻璃注射器(Hamilton)中。必须小心去除注射器中的所有气泡。接下来，将注射器冷却至4℃持续15分钟以驱动墨水的胶凝。然后将玻璃注射器装载到安装在3D打印机上的定制注射泵上。注射泵由Arduino微控制器和步进电机驱动器供电。将注射器筒装在水冷定制温度控制器中，通过保持约20℃的墨水温度来控制明胶墨水的硬度。将长度为1.5英寸、内径为0.25mm的金属喷嘴(Nordson EFD)安装在注射器的底部。将注射器在其温度控制的外壳中温育>15分钟。

接下来，将组装的硅树脂模具高压灭菌并放置在定制的3D打印的外壳上，该外壳保持模具的开口垂直向上，并具有多孔板的覆盖区，以便能够离心组织。

首先，如果模具用于灌注目的，则将用作内径为0.83mm的入口和出口的不锈钢管***模具的入口/出口通道，和内径为1/32英寸的通用硅树脂管安装在管的外端，并用软管夹压接以密封入口和出口。

对于图3中的灌注设备，不锈钢管的一端具有切成～1mm的小缺口，以便于从打印的脉管***和管的连续连接。接下来，将熔融的明胶牺牲墨水(无红色)加入模具中，并将模具以100×g离心3分钟以去除气泡。该步骤用于润滑和防止组织粘附到模具壁的裂缝或凹痕中。离心后，吸出过量的熔融明胶，在玻璃和模具壁上留下薄膜。为了防止组织在随后的步骤中进入入口/出口，用明胶牺牲墨水(有红色)冲洗金属管，并将模具置于4℃以驱动墨水在通道中的胶凝。一旦胶凝，3D打印机可以在视觉上与金属管对齐，以确保打印的脉管***与入口和出口邻接，从而确保可灌注的网络。当模具壳体压靠在固定在打印机花岗岩上的参考L形支架上时，会发生对齐。

在对齐之后，将EB浆液装入模具中，快速进行以下步骤以确保浆液保持冷却并且ECM不经历胶凝。将EB浆液移液到模具中，并将模具及其壳体在2℃下以100×g离心3分钟以压实聚集体，形成颗粒样组织。将上清液ECM吸出至EB的压实床顶部上方～1mm。如果需要，此时可以加入更多的EB浆液、离心，吸出上清液。接下来，将模具转移到定制的水冷金属板的前面(包括金属板)，该金属板由已经用水通道研磨的丙烯酸板支撑。切割金属板和丙烯酸板以使背面照射能够促进打印过程的可视化。通过一对夹具将模具保持在水冷板上，并通过将其压靠在两个金属直角棱镜上而使其壳体保持垂直方向。

接下来，将脉管***嵌入打印，打印速率为0.5-4mm/s。设定注射泵的挤出速率以限定一定直径的纤丝。血管几何采用定制的MATLAB脚本设计，生成分支的三次样条，自动分配打印顺序以防止喷嘴切割穿过先前打印的线条，并将每条曲线线条渲染为GCode中的分段线性线段。为了改变纤丝的直径，改变打印速率，同时保持恒定的挤出速率。在每个线段之后，挤出将停止，并且为了避免搅动打印的图案，喷嘴将垂直地撤回到组织顶部的上方，平移到其新的x-和y-坐标，并通过垂直向下移动来重新***到正确的新z-坐标。

当使用垫圈的改良版本(图16)时，可以将组织模具***芯片(例如，SWIFT芯片)中并且将熔融的明胶添加到芯片中，然后冷却，一旦冷却组织模具可以去除。可以添加保持凝胶(retainer gel)，然后添加和压实组织。可以打印脉管***，如图16(7)所示。然后可以将内部明胶排空，然后排空外部明胶。

组织灌注

打印后，将模具从水冷金属板上取下，并在空气中温热至室温20分钟，以促进ECM的胶凝，同时保持打印的牺牲明胶纤丝的完整性。然后，将模具转移到37℃、5％CO2下的培养箱中20分钟，以完成组织ECM的胶凝并熔融打印的牺牲纤丝。对于经历灌注的组织，首先使用压力分配器将过量的SE1700硅树脂挤出到模具顶部的间隙中来填补，然后将其转移到定制的组织灌注壳体中，该壳体将模具垂直放置并邻近55cc培养基贮存器，其中包含预温热的mTeSR1介质和100U/mL P/S。入口销首先经由1/32英寸通用硅树脂管连接到贮存器，并调节贮存器的高度以相对于组织出口提供～1-3cm的水头以驱动流化明胶的排空，直到红色食用色素不再明显地从出口流出。接下来，恒定的重力驱动流通过经由蠕动泵(Ismatec)以250μL/min从出口贮存器到入口贮存器再循环培养基来实现。通过将无菌过滤的95％O2/5％CO2(Airgas Inc.)的混合物以

的体积流率鼓泡通过培养基来对入口贮存器进行高氧处理。

微组织形成

两种方法用于产生用于研究组织结构和活力的小规模无血管组织。

为了产生图4中所示的组织立方体，将冷EB浆液移液到离心柱中，所述离心柱包括方形孔，在底部具有网状物以捕获EB并使ECM能够穿过网状物，从而压实柱中的EB。将组织在室温下温育20分钟，然后温热至37℃持续20分钟以完成胶凝。将柱浸没在冰冷的培养基中，然后从柱中精细地移出，并经由切割的P1000移液管尖端转移到定制的灌注篮中，该灌注篮包括具有五个聚合物网壁的顶部开口的立方体以实现从立方体的所有6个侧的开放式灌注。将篮放入带有搅拌棒的100mL mTeSR1浴中，并将95％O2、5％CO2的无菌混合物鼓泡到浴中。在进行细胞活力测定之前，将组织温育12小时。

为了制造微组织以研究EB填充和用于成像ECM胶凝，将EB浆液移液到3cc注射器(Nordson EFD)中，所述注射器被预冷至-20℃。离心注射器以使细胞在底部压实，并将上清液吸出到压实的EB顶部表面上方～1mm处。然后将活塞***注射器的后部，通过用钝杆小心地推动活塞来移除压实的EBs和活塞之间的空气。接下来，将EBs从注射器(不设喷嘴)中缓慢挤出，并放到硅树脂板上，硅树脂板上具有使用活检穿孔器形成的圆柱形切口。使用剃刀刀片从模具顶部去除多余的组织。首先将组织在室温下温育20分钟，然后将其转移到37℃下的温育箱中持续20分钟以完成胶凝。胶凝后，将组织浸入培养基中，取出以备冷冻切片。

流变学

为了表征EB浆液的流变性，将浆液在3cc注射器中压实，如上所述，并直接挤出到流变仪板上，冷却至2℃。板和盘均覆有砂纸以防止滑动。测量了幅度扫描、流量曲线和频率扫描。见图8。

细胞活力测定

为了分析以不同打印速率打印的含有血管的组织(图2b，e)，在37℃下胶凝组织后，将组织转移回4C以重新凝胶明胶墨水，以帮助在组织切片期间防止血管塌陷。对于灌注的EB组织，在灌注12小时后将组织从流中移除。在所有情况下，首先将组织及其模具浸入冰冷的PBS大浴中。然后使用手术刀将组织从它们的模具中切出以去除一个载玻片。在不进一步从模具扰乱组织的情况下，使用新的手术刀将组织切片。然后经由抽吸将每个切片从冰浴转移到切割的10mL移液管中，并沉积到35mm培养皿中。培养皿的底部具有5mm厚的硅树脂压合板，和切口以配合组织并在处理和更换培养基时保护其免受流动。接下来，通过反复冲洗每次-50％体积，将PBS更换为mTeSR1培养基。然后，加入等体积的2x浓缩的Live/DEAD溶液(1μg/ml钙黄绿素、4μL/mL溴化乙锭同型二聚体)，并将组织在37℃下温育30分钟。温育后，使用5X ApoFluor物镜在共聚焦显微镜(Zeiss)上获得Live/DEAD图像。

冷冻切片和免疫染色

通过首先在4％甲醛中固定30分钟，然后在含有0.05％Tween20去污剂的PBS(PBST)中冲洗3次来冷冻切片组织。将固定的组织在4℃下在含有30％蔗糖的去离子水(蔗糖溶液)中温育过夜，然后将固定的组织转移到OCT:蔗糖溶液的1:1的溶液中1小时30分钟。接下来，将组织轻轻放入低温恒温器组织模具中，随后用100％OCT溶液填充，并在低温恒温器珀尔帖冷却器中冷冻。使用40μm切片将组织切成薄片，将其转移到超霜玻片上。将切片在免疫染色之前储存在-20℃。

通过使用PAP笔在组织切片周围形成疏水壁来制备用于免疫染色的切片。接下来，将组织在含有0.5％BSA的0.125％Triton-X溶液中渗透10分钟，在PBST中冲洗3次，并在含有3％BSA的PBS溶液中封闭30分钟。封闭后，在含有3％BSA的PBS中加入胶原蛋白I抗体(Abcam，1:200稀释)，并在4℃下温育过夜。通过在PBST中冲洗组织3x来去除第一抗体，并以1:250加入第二抗体45分钟，之后通过在PBST中进一步冲洗3次将其去除。接着，加入含有DAPI的PBST溶液5分钟，然后在PBST中冲洗3次。使用Zeiss共聚焦显微镜进行成像。

计算：

器官中的细胞数量：

肝脏：1.4亿细胞/克肝脏×1.5kg＝1400亿细胞。

胰腺：移植500,000胰岛当量＝6000-8000胰岛当量/千克受体重量。每胰岛当量具有3000细胞(150um直径簇和10um细胞)数十亿个细胞)

如果由与PNAS论文相同的载有细胞的基质制成肝脏，则其大小为：1千万细胞/毫升的1500亿细胞＝15升肝脏

实施例1：

为了产生大量均匀的组织球状体，将iPSC转移到微孔阵列中以通过强制聚集形成EB(图1a)。四天后，收获这些EB，与胶原蛋白I和基质胶凝胶的预聚物溶液混合，并经由离心压实以形成致密的组织聚集体，其包括每1mL组织包含约200,000,000个细胞(图1b)。然后将牺牲材料嵌入打印以形成三维血管网络，其可以与外部泵接合以实现氧气和营养物的直接灌注，以维持整个致密组织中的活力。

已经证明，培养放大可以产生大约5亿细胞构建体(图1bi，ii)，其颗粒样微结构(图1biii)为牺牲纤丝的打印提供了足够的支撑，但是能够在平移喷嘴前屈服并在其尾流中自愈(图1c)。这些组织样球状体可以采取胚状体或任何其他分化的聚集体的形式，诸如脑或肝类器官或心脏球状体(图1d)。

实施例2：

定量地，嵌入式打印经由聚集体组织的剪切稀化、触变、屈服应力流变(图2a)实现，能够在水平和垂直方向上支撑嵌入式3D打印(图2b)。

打印后，将组织温热以使胶原-基质胶胶凝，并且观察到基质的显著硬化(图2c)，因为在EB周围的空间中形成纤维状凝胶(图2d)。这种增加的硬度锁定打印的脉管***的形状，并使压力驱动的流动能够渗透组织。

对于层级血管网络的产生至关重要，在保持恒定的牺牲材料流率的同时改变打印速率使得血管直径的平滑变化(图2e)，同时对EBs的完整性没有不利影响。

实施例3：

当在高氧条件下(95％O2/5％CO2)在灌注了12h的搅拌浴中温育立方形组织聚集体时，强调了对打印的脉管***的需求，只有最外层0.8mm的组织仍然可以存活。由于氧气和/或营养物供应不足，核心发生了坏死。

为了能够直接灌注组织核心，打印3D打印模具，其具有用于与泵接合的集成入口和出口(图3a，b)。

使用该模具，引入2.5mL的聚集体组织(约400000个胚状体)，并打印出层级的血管网络，所述血管网络的直径不同，其可被设计为在整个网络中分配流并保持恒定的壁切应力(图3d)。一旦将组织温热、胶凝并排空牺牲材料，就将组织连接到贮存器，以实现平稳的重力驱动流，并经由循环泵保持头部高度。12小时后，打印的血管保持开放(图3e，顶部)，并且组织在其整个厚度上均保持活力(图3e，底部)。

该嵌入式打印方法使得能够将脉管***自由形式打印到致密组织中，并且提供了在具有前所未有的规模和细胞密度的***中维持组织活力的手段。由于细胞密度和高活力，预期这些组织在分化时将表现出显著且令人惊讶的功能水平。

实施例4：

该实施例说明了将一种或相同类型的细胞聚集体构图成由一种或相同类型的细胞组成的基质的方法。

具体地，将荧光标记的胚状体(例如EB-mKATE2)的墨水以螺旋形状打印到野生型胚状体的基质中(图14)。

参考图14，所有细胞核都用Hoechst染色(蓝色)标记。图4A显示了打印的细胞聚集体螺旋(红色)进入细胞-聚集体基质(黄色)的图。图14B示出了喷嘴嵌入打印到基质中的照片。注意到，喷嘴的出口位于EB基质的表面下方。图14C显示在胶凝之后，可以将构图的组织从支架上移除并切片。图14D显示组织的横截面落射荧光图，表明了打印的细胞的螺旋图案。

这表明了压实细胞聚集体的基质，其通常是其中可以打印牺牲纤丝作为脉管***模板的组织浴，也可以用作墨水本身。这表明发明者的“嵌入打印”能力，将细胞聚集体材料压实成类似的材料。这可以导致直接将聚集体材料打印成致密的细胞纤丝的能力。

实施例5：

图15示出了用内皮细胞衬里血管通道的示例。如图15A所示，打印了牺牲墨水网络。在图15B中，去除牺牲墨水，留下通道。在图15C中，内皮细胞流过通道网络；显示内皮细胞在来自该对血管的两股流中离开组织顶部。图5D显示表面上内皮的CD31染色揭示出类似于卵石构造的细胞结构，显示了血管壁的内皮细胞衬里。

图15表明内皮细胞可以通过模板化的脉管***输注并排列血管壁。

所有参考文献均以其整体并入本文：

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在整个说明书中，已经给出了关于本发明的优选和替代实施方式的各种指示。然而，前面的详细描述的说明书被认为是说明性的而不是限制性的，并且本发明不限于所提供的任何一个实施方式。应当理解，所附权利要求，包括所有等同物，旨在限定本发明的精神和范围。

Claims (48)

1.一种生产组织构建体的方法，包括：

提供颗粒样组织，其中所述颗粒样组织包含多个细胞，所述多个细胞已被压实形成所述颗粒样组织；

在所述颗粒样组织上或所述颗粒样组织中沉积一根或多根纤丝，每根纤丝包含墨水；和

使所述颗粒样组织胶凝或融合，从而产生组织构建体。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述颗粒样组织包括1,000至10亿细胞/毫升颗粒样组织。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述颗粒样组织包含直径为10 μm至5 mm的单细胞、细胞聚集体或两者形式的细胞。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述墨水包括用于脉管***/导管/小管/腺体打印的一种或多种牺牲墨水，用于多细胞组织的复杂构图的载有细胞的墨水，用于支撑/机械信号/致动的结构墨水，用于传感/致动/刺激的导电墨水，用于刺激/光遗传学的光波导，或颗粒样组织。

5.如权利要求1或2所述的方法，进一步包括移除所述墨水以产生一个或多个开放通道或空隙，以及将所述一个或多个开放通道或空隙暴露于流体灌注。

6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述沉积步骤是在所述颗粒样组织上或所述颗粒样组织中形成功能性血管通道网络。

7.如权利要求1或2所述的方法，其中所述颗粒样组织包括类器官、胚状体、细胞球状体和多细胞组织聚集体中的一种或多种。

8.如权利要求1或2所述的方法，其中所述颗粒样组织进一步包括明胶、透明质酸、琼脂糖、藻酸盐、聚(乙二醇)、天然胞外基质混合物中的至少一种以充当填充剂、致孔剂、药物递送载体、传感器、致动器、光响应元件或流变改性剂。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述提供颗粒样组织的步骤还包括：

生长多个细胞；

收集所述多个细胞。

10.如权利要求9所述的方法，还包括在所述生长和收集步骤之后将所述多个细胞聚集成颗粒样组织。

11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述生长步骤在基底上或悬浮培养物中进行。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述基底是微孔阵列，并且其中所述悬浮培养物是非附着型烧瓶或生物反应器，或悬滴。

13.如权利要求9或10所述的方法，还包括将所述颗粒样组织倒入任意形状的模具中。

14.如权利要求9或10所述的方法，还包括将所述颗粒样组织打印到基底上或模具中，以允许所述颗粒样组织的进一步构图。

15.如权利要求9或10所述的方法，还包括将所述颗粒样组织打印到支撑基质中或支撑基质上，以允许所述颗粒样组织构建体的进一步构图。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述支撑基质为另一颗粒样组织、无细胞基质或两者的混合物。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述支撑基质包括明胶、透明质酸、琼脂糖、藻酸盐、聚(乙二醇)、天然胞外基质混合物中的至少一种以充当填充剂、致孔剂、药物递送载体、传感器、致动器、光响应元件或流变改性剂。

18.如权利要求9或10所述的方法，还包括将所述细胞与胞外基质材料溶液混合。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述胞外基质材料溶液包含能够驻留在所述颗粒样组织的胞外空间中的任何天然或合成溶液。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述胞外基质材料溶液包括明胶、纤维蛋白、胶原和甲基丙烯酸明胶、基质胶、藻酸盐、壳聚糖、聚乙二醇、胶原酶敏感性聚乙二醇、层粘连蛋白、IV型胶原、纤连蛋白、玻连蛋白、透明质酸、琼脂糖、纤维素、羟基磷灰石、丝心蛋白及其任何修饰形式中的一种或多种。

21.如权利要求5所述的方法，其中所述一根或多根纤丝、流动通道或空隙与一个或多个外部设备连通。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述一个或多个外部设备选自泵、光导、致动器、电动机控制板、微控制器、数据采集板和现场可编程门阵列中的一个或多个。

23.如权利要求1或2所述的方法，其中所述纤丝包括在所述颗粒样组织上或所述颗粒样组织中的功能性血管通道网络，所述功能性血管通道网络包括与外部泵流动连通的流动通道以在移除所述墨水后直接灌注氧气和营养物。

24.如权利要求5所述的方法，其中所述将所述一个或多个开放通道或空隙暴露于流体灌注的步骤在流体剪切应力FSS下进行。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述FSS是脉冲型的，以模拟常规心脏搏动期间的血压变化。

26.如权利要求1、2、9-10、12、17、19-20、22、24和25中任一项所述的方法，还包括将所述组织构建体暴露于一种或多种生物制剂、生物制剂梯度、压力和/或氧张力梯度。

27.如权利要求5所述的方法，还包括在移除所述墨水之后，将内皮细胞的悬浮液注入所述一个或多个开放通道或空隙中。

28.如权利要求1、2、9-10、12、17、19-20、22、24和25中任一项所述的方法，其中每根纤丝还包括一个或多个同心和同轴的逃逸墨水层。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述同心墨水层被布置为牺牲核心、包含平滑肌细胞的壳体和成纤维细胞外壳。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述同心墨水层被布置为牺牲核心、载有内皮细胞的内壳、包含平滑肌细胞的壳体和成纤维细胞外壳。

31.如权利要求5所述的方法，其中所述移除墨水的步骤包括温热所述一根或多根纤丝。

32.如权利要求1所述的方法，其中所述胶凝或融合所述颗粒样组织的步骤包括温热所述颗粒样组织或将所述组织暴露于光以诱导交联。

33.如权利要求1所述的方法，其中所述一根或多根纤丝在被沉积在所述颗粒样组织上或所述颗粒样组织中之前通过单个打印头挤出。

34.如权利要求1所述的方法，其中所述一根或多根纤丝在被沉积在所述颗粒样组织上或所述颗粒样组织中之前通过多个打印头挤出。

35.如权利要求33或34所述的方法，其中所述沉积通过打印进行，其中所述打印的速率可变，同时所述墨水的流动被保持在恒定的流动速率，使得血管直径平滑变化。

36.如权利要求33或34所述的方法，其中所述沉积通过打印进行，其中所述挤出的速率可变，同时所述打印的速率保持恒定，使血管直径平滑变化。

37.如权利要求5所述的方法，还包括在提供所述颗粒样组织的步骤之前和/或与该步骤同时在基底上逐层沉积一根或多根结构纤丝以形成模具。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述模具包括与所述通道或空隙流体连通的流动通道，以用于在移除所述墨水之后对其进行灌注。

39.如权利要求37所述的方法，其中所述模具是3D打印的，具有用于与泵接合的一个或多个集成的入口和出口。

40.如权利要求5所述的方法，其中所述通道或空隙具有相同或不同的直径。

41.通过权利要求1至40中任一项所述的方法产生的组织构建体。

42.通过权利要求1至40中任一项所述的方法产生的组织构建体，其中所述组织构建体是心脏、动脉、静脉***、肝脏、胆道、肾、胰腺、脾脏、***、骨骼、肌肉、脑、脊髓、神经、耳、眼、皮肤、皮下组织、***、乳腺、肌肉、肌腱、横膈膜、骨髓、淋巴、鼻、鼻咽、喉、气管、支气管、肺、口、唾液腺、舌、口咽、喉咽、食道、胃、小肠、结肠、直肠、***、泌尿生殖道、输尿管、膀胱、尿道、子宫、***、外阴、卵巢、胎盘、阴囊、***、***睾丸、精囊、垂体、松果体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺和朗格汉斯岛。

43.通过权利要求1至40中任一项所述的方法产生的组织构建体用于制备用于缝合到体内的器件的用途。

44.通过权利要求1至40中任一项所述的方法产生的组织构建体用于制备用于在体外成熟的器件的用途。

45.通过权利要求1至40中任一项所述的方法产生的组织构建体用于药物毒性研究中的用途。

46.通过权利要求1至40中任一项所述的方法产生的组织构建体用于药物筛选应用中的用途。

47.通过权利要求1至40中任一项所述的方法产生的组织构建体用于疾病建模的用途。

48.通过权利要求1至40中任一项所述的方法产生的组织构建体用于机理研究的用途。

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