CN111185458A - 一种烟草废弃物的处理方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种烟草废弃物的处理方法及其应用，属于生物质废物资源利用技术领域。本发明为了实现烟草废弃物合理有效利用的目的，将烟草废弃物经烘干、粉碎、酸碱处理后，加入纤维素酶、β‑葡萄糖苷酶和木聚糖酶进行酶解，获得烟草废弃物酶解液，该酶解液可用于培养菌株发酵生产化合物。本发明适用于烟草废弃物的回收与利用。
Description
技术领域
本发明属于生物质废物资源利用技术领域，具体涉及一种烟草废弃物的处理方法及其应用。
背景技术
烟草废弃物，是指未能用于制烟的烟草组成部分(制烟过程中用下脚料制造的膨胀烟丝与薄片等)，包括烟茎(又称烟杆、烟秆、烟梗)、无法进行卷烟加工的低等级或者等级外烟草、烟草植株的上部烟草、烟花、烟种、叶脉(烟筋)、腋芽、卷烟企业积存的烟末、烟根、根出条。我国是烟草种植和生产大国，烟草种植面积和产量居世界首位。然而，在烟草种植和生产过程中，全国每年大约有百万吨废次烟草、烟灰、烟末、烟梗等烟草固体废物产生。这些废弃物中含有大量可供利用的蛋白质、糖、脂和烟碱等物质，现今阶段合理利用这些废弃资源具有重要意义。
烟草中含有很多高价值的成分，废弃烟叶合理有效的利用，不仅可以缓解环境的污染，而且可能成为我国宝贵的植物资源，促进我国生物产业的发展。目前对烟草废弃的应用主要是：一是当肥料，填埋在土地上作肥料；也可用作沼气原料。二是当饲料，烟草中蛋白质含量高达15％～17％，废弃烟叶可青贮作饲料。三是当杀虫剂，烟碱(尼古丁)是烟叶主要化学成分，烟碱在农业上常用做家兽寄生虫驱除剂。四是当燃料，烟叶烘烤需要消耗大量燃煤，用烟杆制成生物质燃料，代替烤煤，点火容易，燃烧稳定，烧火易调控，完全能够满足烟叶烘烤要求。第五是提取茄尼醇、烟碱以及植物蛋白等高价值的化合物。这些处理方法虽可以处理部分烟草废弃物，但存在利用范围窄，利用率低等问题。而且，目前我国废弃物利用我国的新技术开发不力，技术单一，其它技术的发展缓慢，设备落后。所以新的生物质废弃资源应用技术的开发就有着重要的价值和意义。
发明内容
为了实现烟草废弃物合理有效利用的目的，本发明提供了一种烟草废弃物的处理方法，包括如下步骤：
(1)将烟草废弃物进行预处理，获得预处理液；
(2)然后加入纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶进行酶解，获得烟草废弃物酶解液。
进一步地限定，步骤1)所述烟草废弃物是指烤烟及雪茄烟草种植、生产以及加工过程中所产生的废弃物，包括烟茎、无法进行卷烟加工的低等级烟草、烟花、烟种、叶脉、腋芽、卷烟企业积存的烟末、烟根和根出条。
进一步地限定，步骤1)所述预处理包括烟草废弃物收集、烘干、粉碎以及酸碱处理。
更进一步地限定，所述粉碎，其时间为0.5min～2min，粉碎后过40目筛。
更进一步地限定，所述酸碱处理是指按照1g:2mL的料液比向粉碎后的烟草废弃物中加入质量分数为85％磷酸溶液，获得的混合液经100℃煮沸15min～30min，然后调节混合液pH为7.0或6.0，经100℃煮沸15min～30min，获得预处理液。
优选地，所述调节混合液pH所用的试剂为碱性过氧化氢。
进一步地限定，步骤2)所述酶解是指每克烟草废弃物经预处理后，预处理液冷却至室温后，加入1.44U/mg纤维素酶8mg～12mg、7.7U/mg半纤维素酶2mg～5mg、60U/mgβ-葡萄糖苷酶10mg～15mg，30～40℃酶解36h～48h，获得烟草废弃物酶解液。
本发明还提供了上述处理方法获得的烟草废弃物酶解液在培养菌株发酵生产化合物中的应用。
进一步地限定，是将获得的烟草废弃物酶解液离心，获得的上清液作为碳源和氮源添加到大肠杆菌发酵培养基中，培养大肠杆菌发酵生产化合物。
进一步地限定，将获得的烟草废弃物酶解液经离心，获得的上清液作为碳源和氮源添加到酵母发酵培养基中,培养酵母发酵生产化合物。
有益效果
本发明提供了一种烟草废弃物应用的新方法，可处理烟草生产加工中所产生的大量废弃物，在资源利用效能最大化，减少环境污染以及缓解环境压力均有着积极地作用，实现了生物质废弃资源合理有效的利用。该处理方法操作简单，节能减排，发展潜力巨大。
此外，该方法处理后的烟草废弃物，可以绿色化的方式生产出大量的基础有机化工原料，不仅具有较好经济性也具有极强的可持续性。
附图说明
图1为大肠杆菌发酵获得γ-松油烯的质谱图，横坐标为离子的质荷比(m/z)值，纵坐标为离子流的强度。
图2大肠杆菌发酵所产γ-松油烯的气相色谱图，横坐标为保留时间，纵坐标为响应值。
图3为酵母发酵获得桧烯的质谱图，横坐标为离子的质荷比(m/z)值，纵坐标为离子流的强度。
图4酵母发酵所产桧烯的气相色谱图，横坐标为保留时间，纵坐标为响应值。
具体实施方式
本发明将烟草废弃物进行预处理，预处理液冷却后直接进行酶解处理，酶解后的溶液去除不溶物后，直接用作发酵培养基，发酵菌株生产化合物。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
其中纤维素酶与β-葡萄糖苷酶菌购买自sigma公司。
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1.烟草废弃物的处理方法。
1)烟草废弃物的预处理。
a.样品收集
本发明所述的烟草废弃物是指烤烟及雪茄烟草种植、生产以及加工过程中所产生的废弃物。烟草类样本的收集采用随机抽样的原则，主要采样的类型包括：烟茎、无法进行卷烟加工的低等级烟草、烟花、烟种、叶脉(烟筋)、腋芽、卷烟企业积存的烟末、烟根、根出条等。
b.样品的烘干
将采集的烟脉样品放入烘箱中，在不高于40℃的条件下烘干，直至可用手指捻碎。
c.样品的粉碎
从烘箱中取出烘好的烟脉样品，马上研磨，持续研磨时间不应超过2min。然后过40目筛，未过筛的细脉应重新研磨过筛。研磨时间过长会造成样品温度升高，可能引起植物碱逸失。将过筛粉末立即装人洁净干燥的棕色广口瓶中密闭起来。充分摇动，混匀。此即为制备好的试样。
d.样品酸碱处理
样品5.00g，质量分数为85％磷酸(H3PO4)10mL，获得混合液，100℃煮沸15min,用pH9.0碱性过氧化氢将该混合液调节为pH为7.0或6.0，然后经100℃煮沸15min。将混合液调节为pH为7.0可用于大肠杆菌发酵，将混合液pH调节为6.0则可用于酵母菌发酵。
综上，将烟草废弃物经过收集、烘干、粉碎以及酸碱处理后，即获得预处理液。
2)预处理液酶解处理。
将步骤1)获得的预处理液经冷却至室温后，直接加入1.44U/mg的纤维素酶40mg、7.7U/mg的β-葡萄糖苷酶10mg、60U/mg的木聚糖酶50mg，37℃，180rmp条件下酶解48h。
经过上述酶解处理，获得烟草废弃物酶解液。
实施例2.重复实施例1，与实施例1的不同在于：
本实施例中步骤1)中d.样品酸碱处理：所述的样品5.00g，质量分数为85％磷酸(H3PO4)10mL，获得混合液，100℃煮沸30min,用pH9.0碱性过氧化氢将该混合液调节为pH为7.0或6.0，然后经100℃煮沸30min。
步骤2)中预处理液酶解处理：将步骤1)获得的预处理液经冷却至室温后，直接加入1.44U/mg的纤维素酶50mg、7.7U/mg的β-葡萄糖苷酶15mg、60U/mg的木聚糖酶60mg，37℃，180rmp条件下酶解40h。
经过上述酶解处理，获得烟草废弃物酶解液。
实施例3.重复实施例2，与实施例2的不同在于：步骤2)中预处理液酶解处理：将步骤1)获得的预处理液经冷却至室温后，直接加入1.44U/mg的纤维素酶60mg、7.7U/mg的β-葡萄糖苷酶25mg、60U/mg的木聚糖酶75mg，37℃，180rmp条件下酶解36h。
经过上述酶解处理，获得烟草废弃物酶解液。
实施例4.利用实施例1获得的烟草废弃物酶解液培养大肠杆菌发酵生产γ-松油烯。
将实施例1获得的烟草废弃物酶解液经离心后，弃除沉淀，上清液直接作为发酵培养基的碳源和氮源，用于大肠杆菌发酵的培养基成分为，总体积50mL中含有9.8g/L K2HPO4；1mL/L微量元素((NH4)6Mo7O24·4H2O 0.37g，ZnSO4·7H2O 0.29g，H3BO4 2.47g，CuSO4·5H2O0.25g，MnCl2·4H2O 1.58g，用纯水定容至100mL)；0.06g/L MgSO4；分别添加1mL/L的三种抗生素(卡那霉素50mg/mL；氨苄霉素100mg/mL；氯霉素34mg/mL)；用酶解后的上清液补齐50mL；pH值7.0(用5M NaOH调节pH值)，所述各成分为在培养基中的终浓度。
本实施例以产γ-松油烯基因工程大肠杆菌，验证实施例1制备获得的烟草废弃物酶解液可用于培养大肠杆菌发酵生产γ-松油烯。
所用的产γ-松油烯基因工程大肠杆菌及构建方法记载在Qi C,Zhao H,L i W,etal.Production ofγ-terpinene by metabolically engineered Escherichi a coliusing glycerol as feedstock[J].Rsc Advances,2018,8.30851–30859中，将该菌株接种于50mL LB液体培养基中，37℃振荡培养8-10h作为种子液，按接种量2％(体积分数)，接种于上述的发酵培养基中，37℃培养至OD600等于1，加入50μL 20％(w/v)IPTG，并加塞。30℃培养24h。发酵结束后，加入体积分数为20％正十二烷，萃取后，溶剂层取1mL过滤后，进行气相色谱检测，检测条件为：
色谱柱：Agilent HP-INNOWAX；进样量：1μL；柱温：初始75℃保持1min，以10℃/min速率升温至100℃，保持5min；运行时间：8.5min。
根据γ-松油烯气相检测标准曲线，计算获得γ-松油烯产量，最终产量为99.78±1.24mg/L，实验样品质谱图如图1所示，气相色谱图如图2所示。
实施例5.利用实施例1获得的烟草废弃物酶解液培养酿酒酵母菌发酵生产桧烯。
将实施例1获得的烟草废弃物酶解液经离心后，弃除沉淀，上清液直接作为发酵培养基的碳源和氮源，用于酿酒酵母发酵的培养基成分为：总体积50mL中含有体积分数为10％营养盐，所述营养盐由终浓度为15g/L尿素、终浓度为8g/L KH2PO4、终浓度为6g/LMgSO4组成，其余用上述上清液补齐，pH值为6.0。
以产桧烯的基因工程酵母菌为例，验证实施例1制备获得的烟草废弃物酶解液可用于培养酿酒酵母菌发酵生产桧烯。
所用的产桧烯的基因工程酵母菌，出发菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，基因型为：CEN.PK2-1C(MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3_112；his3Δ1；MAL2-8c；SUC2)。该菌株敲除了GAL80基因，含有经过密码子优化的桧烯合成酶基因SabS1，GenBank登录号为DQ785794.1，所述桧烯合成酶基因SabS1整合在该酵母菌株染色体GAL80位点。
该基因工程菌是利用CRISPR-Cas9***结合酵母体内同源重组技术，将线性化的含有Cas9基因的质粒与含有桧烯合成酶基因SabS1的供体DNA片段、gRNA表达片段共同转入酵母细胞，实现该重组菌的构建，具体构建方法记载在已提交的专利申请文件中：一种合成桧烯的基因工程菌及其构建方法与应用，申请号：201711130703.6。
将该菌种接种于5mL YPD液体培养基中，37℃振荡培养12-16h作为一级种子液，5mL全部接种于50mL YPD发酵培养基中，37℃培养至OD600等于13，按4％(体积分数)接种量接种于上述的发酵培养基中，30℃培养48h。发酵结束后，加入体积分数为20％正十二烷，萃取后，溶剂层取1mL过滤后，进行气相色谱检测，检测条件为：
色谱柱：Agilent HP-INNOWAX；进样量：1μL；柱温：初始75℃保持1min，以10℃/min速率升温至100℃，再降至初始温度；运行时间：8.5min。根据法尼烯气相检测标准曲线，计算获得桧烯产量，最终产量为22.55±2.62mg/L，实验样品质谱图如图3所示，气相色谱图如图4所示。
Claims (10)
1.一种烟草废弃物的处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将烟草废弃物进行预处理，获得预处理液；
(2)然后加入纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶进行酶解，获得烟草废弃物酶解液。
2.根据权利要求1所述的烟草废弃物的处理方法，其特征在于，步骤1)所述烟草废弃物是指烤烟及雪茄烟草种植、生产以及加工过程中所产生的废弃物，包括烟茎、无法进行卷烟加工的低等级烟草、烟花、烟种、叶脉、腋芽、卷烟企业积存的烟末、烟根和根出条。
3.根据权利要求1所述的烟草废弃物的处理方法，其特征在于，步骤1)所述预处理包括烟草废弃物收集、烘干、粉碎以及酸碱处理。
4.根据权利要求3所述的烟草废弃物的处理方法，其特征在于，所述粉碎，其时间为0.5min～2min，粉碎后过40目筛。
5.根据权利要求3所述的烟草废弃物的处理方法，其特征在于，所述酸碱处理是指按照1g:2mL的料液比向粉碎后的烟草废弃物中加入质量分数为85％磷酸溶液，获得的混合液经100℃煮沸15min～30min，然后调节混合液pH为7.0或6.0，经100℃煮沸15min～30min，获得预处理液。
6.根据权利要求5所述的烟草废弃物的处理方法，其特征在于，所述调节混合液pH所用的试剂为碱性过氧化氢。
7.根据权利要求1所述的烟草废弃物的处理方法，其特征在于，步骤2)所述酶解是指每克烟草废弃物经预处理后，预处理液冷却至室温后，加入1.44U/mg纤维素酶8mg～12mg、7.7U/mgβ-葡萄糖苷酶2mg～5mg、60U/mg木聚糖酶10mg～15mg，30～40℃酶解36h～48h，获得烟草废弃物酶解液。
8.权利要求1-7任意一项所述的处理方法获得的烟草废弃物酶解液在培养菌株发酵生产化合物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将获得的烟草废弃物酶解液离心，获得的上清液作为碳源和氮源添加到大肠杆菌发酵培养基中，培养大肠杆菌发酵生产化合物。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将获得的烟草废弃物酶解液经离心，获得的上清液作为碳源和氮源添加到酵母发酵培养基中,培养酵母发酵生产化合物。
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