CN111185248A - 一种含有气泡消除结构的聚合酶链式反应芯片及液滴乳液的处理方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种含有气泡消除结构的聚合酶链式反应芯片及液滴乳液的处理方法，包括设置于所述聚合酶链式反应芯片同一面的进样结构100、微流通道200、气泡漂浮结构300和液滴存储结构400。由于气泡漂浮结构300中的气泡漂浮腔302可以用于对液滴乳液进行气泡消除处理，可以减少气泡的引入甚至消除气泡的引入，以便后续扩增反应的顺利进行。

Description

一种含有气泡消除结构的聚合酶链式反应芯片及液滴乳液的 处理方法

技术领域

本申请涉及试样分析微流控芯片领域，尤其涉及一种含有气泡消除结构的聚合酶链式反应芯片及液滴乳液的处理方法。

背景技术

核酸是生命的最基本物质之一，任何疾病都能在核酸水平上找到证据。目前，核酸检测已被广泛应用于疾病研究、体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。

当前核酸分子的定量检测有三种方法：光度法、实时荧光定量聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)以及数字PCR技术。实时荧光定量PCR属于半定量的检测技术。数字PCR技术是基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种核酸分子扩增及绝对定量的技术，该技术将稀释后的核酸溶液分散至大量的微反应器中，每个微反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR热循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会呈现荧光信号，没有模板的反应器就无荧光信号。在结果读出过程中，根据微反应腔荧光信号的相对比例，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。

基于液滴微流控技术的液滴数字PCR由于具备更容易提供小体积、高通量的微反应器等优点，受到广泛地关注。液滴数字PCR反应分为三个环节：液滴制备、扩增及液滴计数统计。目前，具有代表性的液滴数字PCR***有3款，分别是Bio-Rad公司的QX-100TM/QX-200TM、Raindance公司的Rain Drop TM以及Stilla technologies公司的Naica TM***。QX-200TM和Rain Drop TM未采用一体化的芯片技术，因而操作繁琐、易污染，而一体化的芯片可有效地解决此类问题。

一体化芯片的技术路线，目前存在的问题主要是由于芯片将液滴生成结构，液滴存储扩增腔直接相连，集成于同一块芯片中，液滴生成环节引入的气泡将会直接流入液滴存储腔402中。这些气泡在PCR热循环过程中会导致如下的严重问题：当扩增腔中存在气泡时，在加热时气泡体积膨胀；在降温时气泡体积收缩。这样，气泡在PCR的热循环过程中就形成了一个震荡源，扰乱并破坏液滴，产生细小的碎液滴，以及诱发液滴融合现象(Dropletcoalescence)，进而导致数字PCR检测失败。因此，气泡问题是此类一体化芯片的固有难题。

发明内容

本申请提供了一种含有气泡消除结构的聚合酶链式反应芯片及液滴乳液的处理方法，用于在液滴生成环节减少气泡的引入甚至消除气泡的引入，以便后续扩增反应的顺利进行。

一方面，本申请实施例提供了一种含有气泡消除结构的聚合酶链式反应芯片，包括设置于聚合酶链式反应芯片同一面的进样结构100、微流通道200、气泡漂浮结构300和液滴存储结构400；

进样结构100包括样品进样腔101和油相进样腔102，样品进样腔101和油相进样腔102分别与微流通道200连通；微流通道200用于汇流来自样品进样腔101的样品和来自油相进样腔102的油相，制备液滴乳液；

气泡漂浮结构300包括滴液乳液进口301、气泡漂浮腔302和滴液乳液出口303；滴液乳液进口301与微流通道200连通，气泡漂浮腔302用于对液滴乳液进行气泡消除处理；

液滴存储结构400包括液滴存储进口401和液滴存储腔402；滴液乳液出口303和液滴存储进口401相连通；液滴存储腔402用于存储自滴液乳液出口303和液滴存储进口401流出的气泡消除处理后的液滴乳液。

可选的，根据权利要求1的聚合酶链式反应芯片，其特征在于，气泡漂浮结构300还包括顶层封闭层304；顶层封闭层304覆盖于气泡漂浮腔302的顶部，气泡漂浮腔302的厚度不小于1微米。

可选的，根据权利要求1的聚合酶链式反应芯片，其特征在于，气泡漂浮腔302呈圆柱体、正方体和多边体中的任一种；气泡漂浮腔302的水平尺寸和垂直尺寸均不小于1毫米，气泡漂浮腔302的容积不小于1微升。

可选的，根据权利要求1的聚合酶链式反应芯片，其特征在于，滴液乳液进口301设置于气泡漂浮腔302的中间位置，滴液乳液出口303设置于气泡漂浮腔302的底部。

可选的，根据权利要求1的聚合酶链式反应芯片，其特征在于，样品进样腔101和油相进样腔102的凹陷深度相同，比如，样品进样腔101和油相进样腔102的凹陷深度均为2毫米。

可选的，根据权利要求1的聚合酶链式反应芯片，其特征在于，样品进样腔101的底部、油相进样腔102的底部和微流通道200的底部在同一水平面上。

可选的，根据权利要求1的聚合酶链式反应芯片，其特征在于，样品进样腔101的底部、油相进样腔102的底部和微流通道200的顶部在同一水平面上。

可选的，根据权利要求1的聚合酶链式反应芯片，其特征在于，进样结构100还包括至少一个第一分流支路103和至少一个第二分流支路104；

第一分流支路103的一端与油相进样腔102连通，第一分流支路103的另一端与微流通道200连通；

第二分流支路104的一端与样品进样腔101连通，第二分流支路104的另一端与微流通道200连通；第二分流支路104包括弯拐结构。

可选的，根据权利要求1的聚合酶链式反应芯片，其特征在于，液滴存储结构400还包括液滴存储腔出口403。

可选的，根据权利要求1的聚合酶链式反应芯片，其特征在于，液滴存储腔402位于气泡漂浮腔302的底部；液滴存储腔402的深度为液滴乳液中液滴直径的0.5-2倍。

另一方面提供了一种基于含有气泡消除结构的聚合酶链式反应芯片的液滴乳液的处理方法，其特征在于，聚合酶链式反应芯片包括设置于聚合酶链式反应芯片同一面的进样结构100、微流通道200、气泡漂浮结构300和液滴存储结构400，处理方法包括：

通过微流通道200用于汇流来自进样结构100中的样品进样腔101的样品和来自进样结构100中的油相进样腔102的油相，制备液滴乳液；

通过气泡漂浮结构300对液滴乳液进行气泡消除处理；

通过液滴存储结构400对气泡消除处理后的液滴乳液进行平铺；

对气泡漂浮结构300进行密封破坏操作，且对液滴乳液进行扩增反应；

对液滴乳液进行识别和统计，得到样品中的核酸拷贝数。

本申请实施例提供的提供了一种含有气泡消除结构的聚合酶链式反应芯片及液滴乳液的处理方法，用于在液滴生成环节减少气泡的引入甚至消除气泡的引入，以便后续扩增反应的顺利进行。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案和优点，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。

图1是本申请实施例提供的一种一种含有气泡消除结构的聚合酶链式反应芯片的结构示意图；

图2是本申请实施例提供的一种微流通道的结构示意图；

图3是本申请实施例提供的一种微流通道的的结构示意图；

图4是本申请实施例提供的一种内部流路示意图的流结构示意图；

图5是本申请实施例提供的一种气泡漂浮结构局部放大示意图；

图6是本申请实施例提供的一种液滴漂浮腔消除气泡的示意图；

图7是本申请实施例提供的一种液滴漂浮腔消除气泡的示意图；

图8是本申请实施例提供的一种液滴存储结构的示意图

图9a是本申请实施例提供的一种液滴存储腔中热扩增前的液滴排布图；

图9b是本申请实施例提供的一种液滴存储腔中热扩增后的液滴排布图；

图9c是本申请实施例提供的液滴存储腔中热扩增后的液滴荧光图像；

图10a是本申请实施例提供的现有技术中一种液滴存储腔中热扩增前的液滴排布图；

图10b是本申请实施例提供的现有技术中de液滴存储腔中热扩增前的液滴排布图

图11是本申请实施例提供的一种基于含有气泡消除结构的聚合酶链式反应芯片的液滴乳液的处理方法的流程示意图。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据集在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、***、产品或服务器不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

请参阅图1，图1是本申请实施例提供的一种含有气泡消除结构的聚合酶链式反应芯片的结构示意图，该聚合酶链式反应芯片包括设置于同一面的进样结构100、微流通道200、气泡漂浮结构300和液滴存储结构400，图1中显示的芯片包括M面和N面，其中，进样结构100、微流通道200、气泡漂浮结构300和液滴存储结构400可以设置于M面。

其中，该进样结构100包括样品进样腔101和油相进样腔102，样品进样腔101和油相进样腔102分别与微流通道200连通。微流通道200用于汇流来自样品进样腔101的样品和来自油相进样腔102的油相，制备液滴乳液。气泡漂浮结构300包括滴液乳液进口301、气泡漂浮腔302和滴液乳液出口303，滴液乳液进口301与微流通道200连通，气泡漂浮腔302用于对液滴乳液进行气泡消除处理。液滴存储结构400包括液滴存储进口401和液滴存储腔402，滴液乳液出口303和液滴存储进口401相连通，液滴存储腔402用于存储自滴液乳液出口303和液滴存储进口401流出的气泡消除处理后的液滴乳液。如此，可以在液滴生成环节减少气泡的引入甚至消除气泡的引入，以便后续扩增反应的顺利进行。

本申请实施例中，油相采用的是矿物油以及表面活性剂EM90、Triton X-100、Span80等，本实施例中的油相和表面活性剂的选择仅是说明性的，可使用其他类型的油相及表面活性剂。

一种可选的实施方式中，进样结构100包括的样品进样腔101和油相进样腔102均自M面向N面凹陷，且样品进样腔101和油相进样腔102的凹陷深度可以相同，比如，均为2毫米，且两者并没有穿透至芯片的N面。

可选的，如图2所示，为了避免样品进样腔101和油相进样腔102内有残留液体，样品进样腔101和油相进样腔102连通的微流通道200的底部、样品进样腔101的底部和油相进样腔102的底部在同一水平面上。也就是说，微流通道200可以自样品进样腔101和油相进样腔102的底部向上凹陷形成流道，其中，向上凹陷可达到50微米。

可以的，如图3所示，样品进样腔101的底部、油相进样腔102的底部和微流通道200的顶部在同一水平面上。也就是说，微流通道200可以自样品进样腔101和油相进样腔102的底部向下凹陷形成流道。

本申请实施例中，进样结构100还包括至少一个第一分流支路103和至少一个第二分流支路104，其中，第一分流支路103的一端与油相进样腔102连通，第一分流支路103的另一端与微流通道200连通。第二分流支路104的一端与样品进样腔101连通，第二分流支路104的另一端与微流通道200连通；第二分流支路104包括弯拐结构。如图4所示，进样结构100包括2个第一分流支路103和1个带有弯拐结构的第二分流支路104，2个第一分流支路103的两端分别和油相进样腔102与微流通道200连通，1个第二分流支路104的两端分别和样品进样腔101与微流通道200连通。弯拐结构可以控制样品的流阻，调节生成的液滴的水相油相流量比。可选的，可以将液滴的生成速率控制在50个每秒。

如此，来自样品进样腔101的样品和来自油相进样腔102的油相可以在微流通道200内汇流，制备液滴乳液。可选的，可以通过液油交十字叉口的具体尺寸或者/和液油的具体流量等途径来调节液滴的尺寸，以使液滴乳液中的液滴直径达到90微米。

本申请实施例中，气泡漂浮结构300包括滴液乳液进口301、气泡漂浮腔302和滴液乳液出口303，如图5所示，还包括顶层封闭层304，顶层封闭层304覆盖于气泡漂浮腔302的顶部。滴液乳液进口301的个数可以随着微流通道200与气泡漂浮结构300的连通口数确定，比如，图5中显示，微流通道200包括2个微流支路200a和200b，那么，滴液乳液进口301可以包括301a和301b。可选的，气泡漂浮腔302的厚度不小于1微米。

一种可选的实施方式中，气泡漂浮腔302可以呈圆柱体、正方体和多边体中的任一种，气泡漂浮腔302的水平尺寸和垂直尺寸均不小于1毫米，气泡漂浮腔302的容积不小于1微升。比如，气泡漂浮腔302呈圆柱体，且圆柱体的直径为3毫米，高度为2毫米。

本申请实施例中，如图6所示，气泡漂浮结构300中的滴液乳液进口301可以设置于气泡漂浮腔302的中间位置，滴液乳液出口303可以设置于气泡漂浮腔302的底部。如此，自微流通道200的液滴乳液从滴液乳液进口301流入气泡漂浮腔302后，由于密度差，气泡在腔体内自发上浮，消除了气泡的液滴乳液则在重力的作用下，从气泡漂浮腔302底部的滴液乳液出口303流出，进入液滴存储结构400。可选的，如图7所示，气泡漂浮结构300中的滴液乳液进口301可以设置于气泡漂浮腔302的底部，滴液乳液出口303可以设置于气泡漂浮腔302的底部，也就是说，滴液乳液进口301和滴液乳液出口303存在同一水平面上，此种方式也可实现：气泡在气泡漂浮腔302的筛除，保证液滴存储腔402内无气泡残余，提高数字PCR芯片的有效性。

如图9所示，液滴存储结构400还包括至少一个液滴存储腔出口403(403a和403b)，液滴存储腔402位于气泡漂浮腔302的底部，液滴存储进口401可以和滴液乳液出口303重合。来自气泡漂浮腔302的滴液乳经过滴液乳液出口303和液滴存储进口401，流进液滴存储腔402平铺。可选的，液滴存储腔402的深度为所述液滴乳液中液滴直径的0.5-2倍。例如，液滴存储腔402的深度为100微米，液滴的直径为90微米左右，这样液滴乳液就能在物理尺寸的限制下呈现单层排列的状态。液滴存储腔402的体积一般能容纳4万个以上液滴，优选地容纳5万个以上液滴。通过液滴存储腔出口403可以将液滴存储腔402的空气释放掉，便于液滴乳液顺利地加入液滴存储腔402。有些情况下，有些生化检测实验需要扩增后的液滴乳液做后续的检测，则可以通过液滴存储腔出口403将液滴乳液吸出。

当液滴制备及平铺环节停止后，使用16G针头戳破气泡漂浮腔302的顶层封闭层304，此项操作的目的是破坏气泡漂浮腔302的密封结构，排空气泡漂浮腔302里面的空气，维持热循环过程中，气泡漂浮腔302腔体内压强的稳定。需要说明的是，本实施实例中使用16G针头戳破气泡漂浮腔302顶层封闭层304，仅是说明性的，还可使用激光烧蚀等方式，破坏气泡漂浮腔302的顶层封闭层304。需要说明的是，由于气泡漂浮腔302的存在，流入液滴存储腔402的液滴乳液无气泡，这样液滴存储腔402中的不含气泡。这样就有效地保障了PCR热循环过程中液滴的稳定性。

本申请实例中一体式数字PCR芯片采用气泡漂浮腔302后，液滴乳液在液滴存储腔402中将平铺一层，其热扩增前明场图参照图9a，PCR热扩增后的前明场图9b以及荧光图9c参照图。由于液滴存储腔402中在PCR热循环过程中未含有气泡，所以液滴稳定生存，保存良好。同时，由于液滴平铺成一层，在“液滴计数统计环节”中通过拍照，识别就能统计出其中有荧光液滴的数目，以及所有液滴的数目，通过这两个参数就能推算出核酸样品中目标核酸的数目。

而如果一体式数字PCR芯片不采用气泡漂浮腔302，液滴乳液直接从微流通道200直接流入液滴存储腔402中，这种情况下的液滴存储腔402中热扩增前明场图参照图10a，热扩增后明场图参照图10b。由于未采用气泡漂浮腔302，液滴乳液中的气泡将会直接进入液滴存储腔402。在PCR热循环过程中，液滴存储腔402中的气泡将会持续膨胀，收缩，扰乱及破坏液滴，故难以实现数字PCR的目的。

本申请还提供一种基于含有气泡消除结构的聚合酶链式反应芯片的液滴乳液的处理方法，图11所示的该处理方法包括：

S1101：通过微流通道200用于汇流来自样品进样腔101的样品和来自油相进样腔102的油相，制备液滴乳液。

从样品进样腔101加入样品，从油相进样腔102加入油相，在微流通道200汇聚样品和样品，得到液滴乳液。

S1102：通过气泡漂浮结构300对液滴乳液进行气泡消除处理。

液滴乳液通过和微流通道200连通的滴液乳液进口301进入气泡漂浮腔302，去除气泡，从滴液乳液出口303流出。

S1103：通过液滴存储结构400对气泡消除处理后的液滴乳液进行平铺。

平铺流进液滴存储腔402的液滴乳液。

S1104：对气泡漂浮结构300进行密封破坏操作，且对液滴乳液进行扩增反应；

当液滴乳液生成完毕后，刺破液滴气泡漂浮腔302的顶层封闭层304，对液滴存储腔402进行PCR热循环，完成PCR扩增反应。

S1105：对液滴乳液进行识别和统计，得到样品中的核酸拷贝数。

需要说明的是：上述本申请实施例先后顺序仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。且上述对本说明书特定实施例进行了描述。其它实施例在所附权利要求书的范围内。在一些情况下，在权利要求书中记载的动作或步骤可以按照不同于实施例中的顺序来执行并且仍然可以实现期望的结果。另外，在附图中描绘的过程不一定要求示出的特定顺序或者连续顺序才能实现期望的结果。在某些实施方式中，多任务处理和并行处理也是可以的或者可能是有利的。

本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于设备实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。

本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分步骤可以通过硬件来完成，也可以通过程序来指令相关的硬件完成，所述的程序可以存储于一种计算机可读存储介质中，上述提到的存储介质可以是只读存储器，磁盘或光盘等。

以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种含有气泡消除结构的聚合酶链式反应芯片，其特征在于，包括设置于所述聚合酶链式反应芯片同一面的进样结构100、微流通道200、气泡漂浮结构300和液滴存储结构400；

所述进样结构100包括样品进样腔101和油相进样腔102，所述样品进样腔101和所述油相进样腔102分别与所述微流通道200连通；所述微流通道200用于汇流来自所述样品进样腔101的样品和来自所述油相进样腔102的油相，制备液滴乳液；

所述气泡漂浮结构300包括滴液乳液进口301、气泡漂浮腔302和滴液乳液出口303；所述滴液乳液进口301与所述微流通道200连通，所述气泡漂浮腔302用于对所述液滴乳液进行气泡消除处理；

所述液滴存储结构400包括液滴存储进口401和液滴存储腔402；所述滴液乳液出口303和所述液滴存储进口401相连通；所述液滴存储腔402用于存储自所述滴液乳液出口303和所述液滴存储进口401流出的气泡消除处理后的所述液滴乳液。

2.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应芯片，其特征在于，所述气泡漂浮结构300还包括顶层封闭层304；

所述顶层封闭层304覆盖于所述气泡漂浮腔302的顶部，所述气泡漂浮腔302的厚度不小于1微米。

3.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应芯片，其特征在于，所述气泡漂浮腔302呈圆柱体、正方体和多边体中的任一种；

所述气泡漂浮腔302的水平尺寸和垂直尺寸均不小于1毫米，所述气泡漂浮腔302的容积不小于1微升。

4.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应芯片，其特征在于，所述滴液乳液进口301设置于所述气泡漂浮腔302的中间位置，所述滴液乳液出口303设置于所述气泡漂浮腔302的底部。

5.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应芯片，其特征在于，所述样品进样腔101和所述油相进样腔102的凹陷深度相同。

6.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应芯片，其特征在于，所述样品进样腔101的底部、所述油相进样腔102的底部和所述微流通道200的底部在同一水平面上。

7.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应芯片，其特征在于，所述样品进样腔101的底部、所述油相进样腔102的底部和所述微流通道200的顶部在同一水平面上。

8.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应芯片，其特征在于，所述进样结构100还包括至少一个第一分流支路103和至少一个第二分流支路104；

所述第一分流支路103的一端与所述油相进样腔102连通，所述第一分流支路103的另一端与所述微流通道200连通；

所述第二分流支路104的一端与所述样品进样腔101连通，所述第二分流支路104的另一端与所述微流通道200连通；所述第二分流支路104包括弯拐结构。

9.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应芯片，其特征在于，所述液滴存储结构400还包括液滴存储腔出口403。

10.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应芯片，其特征在于，所述液滴存储腔402位于所述气泡漂浮腔302的底部；所述液滴存储腔402的深度为所述液滴乳液中液滴直径的0.5-2倍。

11.一种基于含有气泡消除结构的聚合酶链式反应芯片的液滴乳液的处理方法，其特征在于，所述聚合酶链式反应芯片包括设置于所述聚合酶链式反应芯片同一面的进样结构100、微流通道200、气泡漂浮结构300和液滴存储结构400，所述处理方法包括：

通过所述微流通道200用于汇流来自进样结构100中的样品进样腔101的样品和来自进样结构100中的油相进样腔102的油相，制备液滴乳液；

通过所述气泡漂浮结构300对所述液滴乳液进行气泡消除处理；

通过所述液滴存储结构400对气泡消除处理后的所述液滴乳液进行平铺；

对所述气泡漂浮结构300进行密封破坏操作，且对所述液滴乳液进行扩增反应；

对所述液滴乳液进行识别和统计，得到所述样品中的核酸拷贝数。

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