CN111167409A - Ni-NTA修饰的二氧化硅包覆四氧化三铁磁性纳米功能组装体的制备方法及应用 - Google Patents

Ni-NTA修饰的二氧化硅包覆四氧化三铁磁性纳米功能组装体的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Ni‑NTA修饰的二氧化硅包覆四氧化三铁磁性纳米功能组装体的制备方法及应用，属于材料领域。制备方法包括：溶剂热法制备Fe3O4纳米团簇；Stöber溶胶凝胶法制备Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒；加入硅烷偶联剂，化学法完成Fe3O4@SiO2的表面羧基化(Fe3O4@SiO2@COOH)；引入活化剂，在羧基化Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒的表面完成NTA修饰(Fe3O4@SiO2@COOH@NTA)；加入Ni2+，制备得到组装体。本发明步骤清晰、制备得到磁性纳米功能组装体表面基团丰富、Ni2+结合量大，与His标签蛋白具有较强结合力，分离效率高。

Description

Ni-NTA修饰的二氧化硅包覆四氧化三铁磁性纳米功能组装体 的制备方法及应用
技术领域
本发明属于材料领域，具体涉及一种用于分离提取His标签蛋白的磁性功能组装体的制备方法。
背景技术
随着生物科学、生物技术的发展，分离蛋白和肽的方法变得多种多样，包括沉淀法、超滤法、色谱法(排阻色谱、离子交换色谱、亲和色谱等)、二维电泳等。而好的分离方法应该具备下述三个优点：第一，偶合技术选择性高，稳定性好，可再生；第二，蛋白负载量高、可控，再现性好，易于检测；第三，具备抗非特异性蛋白吸附能力，保持蛋白活性不受影响。
伴随磁性纳米颗粒的研究与发展，基于它磁性强、比表面积大、大小可控、易于分离等特点，在核磁共振、蛋白纯化、药物传递、细菌检测、酶的固定、催化等领域得到了广泛应用。磁性纳米颗粒通过表面功能化后用于蛋白分离纯化的方法(磁亲和分离)经济实用，分离条件温和，对样本要求低、分离过程简便、快速、高效。
现有方法制得的复合磁性纳米粒子可在纳米尺度控制包覆层的厚度，具有分离纯化组氨酸标签蛋白质的能力，且可重复使用。然而，在合成过程中存在工艺复杂，丙烯酸难以枝节到磁性纳米粒子表面，从而导致羧基密度过低、Zeta电位的绝对值偏小，同时NTA反应效率低下(次氮基三乙酸结构中并无氨基，与磁性纳米颗粒表面的羧基很难反应)。
发明内容
本发明的目的是提供一种磁性纳米功能组装体的制备方法，以解决现有方法存在的制备工艺复杂、表面基团密度不足、分离效率不高等问题。
本发明的另一目的是提供一种由该制备方法获得的磁性纳米功能组装体。
本发明的另一目的是提供一种该磁性纳米功能组装体在His标签蛋白分离中的应用。
本发明的技术方案如下：一种Ni-NTA修饰的二氧化硅包覆四氧化三铁磁性纳米功能组装体的制备方法，包括如下步骤：
（1）溶剂热法制备Fe3O4纳米团簇；
（2）Stöber溶胶凝胶法制备Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒；
（3）化学法完成Fe3O4@SiO2的表面羧基化(Fe3O4@SiO2@COOH)，具体步骤是将所述的Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒分散于有机溶剂中，在氮气保护、冷凝回流的条件下，加入硅烷偶联剂N-（三甲氧基硅基丙基）乙二胺三乙酸钠，加热搅拌反应，然后用有机溶剂和去离子水清洗，得到Fe3O4@SiO2@COOH磁性纳米颗粒；
（4）将所述Fe3O4@SiO2@COOH磁性纳米颗粒分散于去离子水中，加入EDC和NHS进行活化，加入NA,NA-二(羧甲基)-L-赖氨酸水合物进行孵育反应，待反应结束后，用去离子水清洗，得到Fe3O4@SiO2@COOH@NTA磁性纳米颗粒分散液；
（5）在所述的Fe3O4@SiO2@COOH@NTA磁性纳米颗粒分散液中引入Ni2+，待反应结束后得到Ni-NTA修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米功能组装体。
步骤（4）中{Fe3O4@SiO2@COOH@NTA磁性纳米颗粒在1624cm-1处出现-COO-中C=O的伸缩振动峰强度较前述得到的Fe3O4@SiO2@COOH磁性纳米颗粒有3倍增强。
步骤（5）中Ni-NTA修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米功能组装体中Ni2+含量为1×10- 5mol/g-9×10-5mol/g。
进一步的，所述步骤（3）中N-(三甲氧基硅基丙基)乙二胺三乙酸钠的加入量为0.5-3ml；加热温度为60-90℃；反应时间为5-10h；所制得的Fe3O4@SiO2@COOH磁性纳米颗粒羧基密度为0.1-0.5μmol/mg，Zeta电位为-30mv- -38mv。
进一步的，所述步骤（4）中加入EDC和NHS的量分别为10-40mg；加入NA,NA-二(羧甲基)-L-赖氨酸水合物量为1-4mg；孵育反应时间为18-48h。
进一步的，所述步骤（5）中加入Ni2+浓度为0.1-1mol/L；所述加入Ni2+反应时间为1.5-3h。所制得的Ni-NTA修饰的二氧化硅包覆四氧化三铁磁性纳米功能组装体的Ni2+的含量为2.19-8.69×10-5mol/g。
上述方法获得的Ni-NTA修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米功能组装体在分离His标签蛋白中的应用，包括如下步骤：取一定量的所述Ni-NTA修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米功能组装体，分别加入荧光标记的His标签蛋白和非His标签蛋白，最后加入缓冲溶液，使得反应体系浓度为2μM，孵育1h；外部磁分离后，加入缓冲溶液清洗3次，加入洗脱液，孵育10min，外部磁分离，收集上清液，用荧光光谱测定荧光强度，检测分离效率。其分离效率为25%-66.7%。
本发明机理如下：磁性纳米颗粒表面进行功能化修饰是磁亲和分离的重中之重。鉴于此，本发明选用羧基化硅烷偶联剂对二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒进行羧基化修饰，利于克服表面羧基密度低、Zeta电位的绝对值偏小、结合力差的难题，同时，用NA,NA-二(羧甲基)-L-赖氨酸水合物代替次氮基三乙酸，NA,NA-二(羧甲基)-L-赖氨酸水合物在磁性颗粒表面形成配体，用于鳌合金属Ni离子，用途用于生物分子的分离提取，检测。利用NA,NA-二(羧甲基)-L-赖氨酸水合物中的氨基直接和磁珠表面羧基结合且通过优化工艺条件，有望解决NTA接枝不足和Ni2+结合量低的问题。
本发明特点在于：1、通过加入N-(三甲氧基硅基丙基)乙二胺三乙酸钠加热反应得到羧基化磁珠，本发明工艺简单，羧基密度高。2、通过加入NA,NA-二(羧甲基)-L-赖氨酸水合物进行反应得到该结构，相对于次氮基三乙酸，该化合物自带一个氨基，与活化后的羧基具有很强的结合能力，因此得到的NTA结构也更加稳定，链接的基团也更多。3、利用红外、Zeta电位、电导滴定、ICP测试等手段对组装体及中间体进行了表征说明；4、利用荧光检测，检测方法更加简单、直观。
与现有技术相比：本发明具有如下优点和有益效果：
1、本发明以磁性纳米团簇为内核，表面进行了SiO2的无机包覆，增加了稳定性；同时，在羧基化过程中，选用羧基硅烷化试剂，提高了SiO2层表面羧基基团结合力和羧基密度；保证了后续NTA基团链接的稳定性和可靠性。
2、在NTA修饰过程中，选用NA,NA-二(羧甲基)-L-赖氨酸水合物，利用其结构中的氨基和颗粒表面羧基进行脱水缩合，大大提高了NTA的结合量，通过图3可以看到1624cm-1处的峰强度有约3倍提高；进而增加了下一步中Ni2+的鳌合量。
3、本发明通过对实验步骤的细化、改变反应物、改进工艺，提高了Ni-NTA修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米功能组装体的整体性能，与His标签蛋白具有较强结合力，可以使His标签的蛋白更加高效、快速、大量的被分离提取，在His标签蛋白的分离中具有很大的应用前景，同时在生物检测、药物筛选等领域具有潜在价值。
附图说明
图1为本发明实施例Ni-NTA修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米功能组装体制备方法的流程图；
图2为本发明实施例制备的Fe3O4纳米团簇；Fe3O4@SiO2；Fe3O4@SiO2-
@ COOH； Fe3O4@SiO2@COOH@NTA； Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni的Zeta电位分布图；
图3为本发明实施例制备的Fe3O4；Fe3O4@SiO2；Fe3O4@SiO2@COOH ；Fe3O4@SiO2@COOH@NTA的红外图谱；
图4为本发明实施例制备的Fe3O4@SiO2@COOH的电导滴定图；
图5为本发明实施例制备的Fe3O4纳米团簇；Fe3O4@SiO2；Ni-NTA修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米功能组装体链接蛋白的TEM照片；
图6为本发明实施例制备的Ni-NTA修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米功能组装体提取His标签蛋白和非His标签蛋白的荧光光谱图。
图7. 为2μM纯的His标签蛋白、2μM纯的His标签蛋白与本发明实施例制备的Ni-NTA修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米功能组装体反应后上清液及洗脱液的荧光光谱图。
具体实施方式
下面的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例中， EDC:1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，NHS:N-羟基丁二酰亚胺。
实施例1
(1)Fe3O4纳米团簇的制备：
称取0.34gFeCl3·6H2O，0.9gNaAc·3H2O溶于60mL的乙二醇中，室温搅拌，使固体完全溶解，得到混合溶液；将混合液加入100mL聚四氟乙烯内嵌的不锈钢高温反应釜中，于180℃下反应8h，冷却后使用乙醇和去离子水各洗涤3次，外部磁场分离，冷冻干燥，得到Fe3O4纳米团簇；
图5中：(a)Fe3O4；(b)Fe3O4@SiO2；(c)Ni-NTA修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米功能组装体链接蛋白的TEM照片；
从图5(a)透射电镜中可以看到Fe3O4纳米团簇由许多很小的 Fe3O4纳米颗粒组装而成的，团簇粒径大小在200nm左右。
从图2(1)Zeta电位分布图中可以看到Fe3O4纳米团簇表面带正电荷，为38mv。
图3为本发明实施例制备的Fe3O4；Fe3O4@SiO2；Fe3O4@SiO2@COOH ；Fe3O4@SiO2@COOH@NTA的红外图谱；图中：(a)Fe3O4；(b)Fe3O4@SiO2；(c)Fe3O4@SiO2@COOH ；(d)Fe3O4@SiO2@COOH@NTA的红外图谱。
从图3(a)傅立叶变换红外光谱图中可以看到590cm-1出现的峰是Fe-O键的伸缩振动峰，是Fe3O4的特征峰，同时在3378 cm-1附近出现O-H键的伸缩振动峰，这是由于Fe3O4纳米团簇表面含有羟基。
342的制备：
称取0.025g步骤(1)中制备的Fe3O4纳米团簇，加入12mL去离子水，20mL乙醇，超声10min，在冰水浴的条件下，加入2mL浓氨水，0.05mL正硅酸乙酯，超声40min；外部磁分离，用去离子水洗涤3次，冷冻干燥，得到Fe3O4@SiO2。
从图5(b)透射电镜中可以看到在Fe3O4纳米团簇的表面均匀包覆了一层20nm左右的SiO2，且表面光滑。
从图2(2)Zeta电位分布图中可以看到Fe3O4@SiO2表面带负电荷，为-31mv。
从图3(b)傅立叶变换红外光谱图可以看到1084 cm-1处出现Si-O的反伸缩振动峰，795 cm-1处出现Si-O的对称伸缩振动峰，955cm-1处出现了Si-OH的弯曲振动峰；同时在3378cm-1处强度变大是由于SiO2表面含有大量的硅羟基。
(3)Fe3O4@SiO2@COOH磁性纳米颗粒的制备：
称取0.05g步骤(2)制备的Fe3O4@SiO2，置于100mL三颈瓶中，加入40mL乙醇，室温机械搅拌，加入N-(三甲氧基硅基丙基)乙二胺三乙酸钠1mL，通氮气的条件下，于80℃下反应8h；外部磁分离，去离子水清洗三次，得到Fe3O4@SiO2@COOH磁性纳米颗粒的分散液。
从图2(3)Zeta电位分布图中可以看到Fe3O4@SiO2@COOH磁性纳米颗粒表面带负电荷，为-38mv。
从图3(c)傅立叶变换红外光谱图可以看到1624cm-1处出现-COO-中C=O的伸缩振动峰。
从图4电导滴定图中可以看到Fe3O4@SiO2@COOH磁性纳米颗粒的羧基密度为0.5μmol/mg。
(4)Fe3O4@SiO2@COOH@NTA磁性纳米颗粒的制备：
取步骤(3)制备的Fe3O4@SiO2@COOH磁性纳米颗粒分散液，含Fe3O4@SiO2@COOH磁性纳米颗粒为0.03g，加入4 mL去离子水，加入40mgEDC和40mgNHS，混匀搅拌2h，加入4mgNA,NA-二(羧甲基)-L-赖氨酸水合物，室温下反应36h；外部磁分离，加入4mL去离子水，清洗3次，得到Fe3O4@SiO2@COOH@NTA磁性纳米颗粒的分散液。
从图2(4)Zeta电位分布图中可以看到Fe3O4@SiO2@COOH@NTA磁性纳米颗粒表面带负电荷，为-28mv。
从图3(d)傅立叶变换红外光谱图可以1385cm-1出现的峰对应C-N键，1624cm-1处出现-COO-中C=O的伸缩振动峰，且强度是Fe3O4@SiO2@COOH磁性纳米颗粒的3倍。是由于NTA结构中包含3个羧基。
(5)Ni-NTA修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米功能组装体的制备：
取步骤(4)制备的Fe3O4@SiO2@COOH@NTA磁性纳米颗粒的分散液，外部磁分离后，加入4mL1MNiCl2水溶液，混合反应2h；外部磁分离，加入去离子水，清洗3次，最后分散于4mL去离子水中，得到Ni-NTA修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米功能组装体的分散液。
从图2(5)Zeta电位分布图中可以看到Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni磁性纳米颗粒表面带负电荷，为-24mv。
本发明实施例制备的Ni-NTA修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米功能组装体的Ni2+含量参见表1，从表1中可以看到经过电感耦合等离子光谱仪(ICP)测试后得到的Ni-NTA修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米功能组装体中Ni2+含量，1g该磁性纳米功能组装体Ni2+含量可达到8.693×10-5mol。
Figure 682949DEST_PATH_IMAGE001
实施例2
如实施例1所述，不同的是：
步骤(1)Fe3O4纳米团簇的制备不变；
步骤(2)Fe3O4@SiO2的制备不变；
步骤(3)中加入N-(三甲氧基硅基丙基)乙二胺三乙酸钠0.5mL，加热温度为60℃，加热时间为10h；
步骤(4)中加入10mgEDC和10mgNHS，加入1mg NTA，反应时间为48h；
步骤(5)中加入0.1MNiCl2水溶液，混合反应3h。
实施例3
如实施例1所述，不同的是：
步骤(1)Fe3O4纳米团簇的制备不变；
步骤(2)Fe3O4@SiO2的制备不变；
步骤(3)中加入N-(三甲氧基硅基丙基)乙二胺三乙酸钠2mL，加热温度为70℃，加热时间为9h；
步骤(4)中加入20mgEDC和20mgNHS，加入2mg NA,NA-二(羧甲基)-L-赖氨酸水合物，反应时间为36h；
步骤(5)中加入0.5MNiCl2水溶液，混合反应2.5h。
实施例4
如实施例1所述，不同的是：
步骤(1)Fe3O4纳米团簇的制备不变；
步骤(2)Fe3O4@SiO2的制备不变；
步骤(3)中加入N-(三甲氧基硅基丙基)乙二胺三乙酸钠3mL，加热温度为90℃，加热时间为5h；
步骤(4)中加入40mgEDC和40mgNHS，加入4mg NA,NA-二(羧甲基)-L-赖氨酸水合物，反应时间为18h；
步骤(5)中加入1.5MNiCl2水溶液，混合反应1.5h。
《His标签蛋白提取测试》
将上述实施例中制备的Ni-NTA修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米功能组装体用于His标签蛋白的分离提取测试，具体步骤如下：
取上述实施例中制备的Ni-NTA修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米功能组装体的分散液8.65μL。加入240μL，5μM荧光标记的具有His标签的蛋白，再加入一定量的PBS缓冲溶液，使总体积为4mL，此时反应体系的浓度为2μM，反应1h；
同时相同条件下另外一组加入240μL，5μM荧光标签的无His标签的蛋白。反应结束后，PBS缓冲溶液清洗三次，加入600μL洗脱液，外部磁分离后，通过测量上清液荧光强度，测量Ni-NTA修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米功能组装体对于His标签蛋白的提取能力。
图5(c)投射电镜可以看到Ni-NTA修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米功能组装体与His标签蛋白链接后与图5(b)相比，表面出现明显凸起。
图6(a)荧光光谱图可以看到提取后的上清液具有很强的荧光强度，而图6(b)无荧光强度。说明His标签的蛋白与该磁性纳米功能组装体有良好的特异性结合能力，无His标签的蛋白与该磁性纳米功能组装体无结合能力。
图7(a)荧光光谱图可以看到2μM纯的His标签蛋白的荧光强度，图7(b) 以看到2μM纯的His标签蛋白与组装体反应后的上清液的荧光强度，可以计算此时的提取效率为66.7%。同时，图7(c)可以看到洗脱液无荧光强度，表明对提取无影响。
实施例1-4中功能组装体的性能及提取效率参见表2，示出了本发明实施例制备的Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni的Ni2+含量，通过表2说明实施例1的提取效果最好，可以达到66.7%，其原因在于：1、组装体制备过程中，随着工艺参数的变化，中间体的表面羧基密度会发生变化，而本发明制备的组装体有较高的羧基密度，利于下一步反应；2、组装体表面的Ni2+含量高，可以鳌合较多的蛋白。
Figure DEST_PATH_IMAGE002

Claims (5)

1.一种Ni-NTA修饰的二氧化硅包覆四氧化三铁磁性纳米功能组装体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）溶剂热法制备Fe3O4纳米团簇；
（2）Stöber溶胶凝胶法制备Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒；
（3）化学法完成Fe3O4@SiO2的表面羧基化(Fe3O4@SiO2@COOH)，具体步骤是将所述的Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒分散于有机溶剂中，在氮气保护、冷凝回流的条件下，加入硅烷偶联剂N-（三甲氧基硅基丙基）乙二胺三乙酸钠，加热搅拌反应，然后用有机溶剂和去离子水清洗，得到Fe3O4@SiO2@COOH磁性纳米颗粒；
（4）将所述Fe3O4@SiO2@COOH磁性纳米颗粒分散于去离子水中，加入EDC和NHS进行活化，加入NA,NA-二(羧甲基)-L-赖氨酸水合物进行孵育反应，待反应结束后，用去离子水清洗，得到Fe3O4@SiO2@COOH@NTA磁性纳米颗粒分散液；
（5）在所述的Fe3O4@SiO2@COOH@NTA磁性纳米颗粒分散液中引入Ni2+，待反应结束后得到Ni-NTA修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米功能组装体。
2.根据权利要求1所述的 Ni-NTA修饰的二氧化硅包覆四氧化三铁磁性纳米功能组装体的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中N-(三甲氧基硅基丙基)乙二胺三乙酸钠的加入量为0.5-3ml；加热温度为60-90℃；反应时间为5-10h。
3.根据权利要求1所述的Ni-NTA修饰的二氧化硅包覆四氧化三铁磁性纳米功能组装体的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中加入EDC和NHS的量分别为10-40mg；加入NA,NA-二(羧甲基)-L-赖氨酸水合物量为1-4mg；孵育反应时间为18-48h。
4.根据权利要求1所述的Ni-NTA修饰的二氧化硅包覆四氧化三铁磁性纳米功能组装体的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中加入Ni2+浓度为0.1-1mol/L；所述加入Ni2+反应时间为1.5-3h。
5.按照权利要求1-4中任何一项所述方法获得的Ni-NTA修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米功能组装体在分离His标签蛋白中的应用，包括如下步骤：取一定量的所述Ni-NTA修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米功能组装体，分别加入荧光标记的His标签蛋白和非His标签蛋白，最后加入缓冲溶液，使得反应体系浓度为2μM，孵育1h；外部磁分离后，加入缓冲溶液清洗3次，加入洗脱液，孵育10min，外部磁分离，收集上清液，用荧光光谱测定荧光强度，检测分离效率。
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