CN111164216A

CN111164216A - 通过限制培养基中的氨量来提高微生物细胞对邻氨基苯甲酸的耐受性的方法

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Publication number: CN111164216A
Application number: CN201880066313.3A
Authority: CN
Inventors: G.耶格; W.克莱克纳; S.贝恩肯; S.克拉费尔; J.扎西
Original assignee: Covestro Deutschland AG
Current assignee: Covestro Deutschland AG
Priority date: 2017-10-12
Filing date: 2018-10-12
Publication date: 2020-05-15
Also published as: WO2019073035A1; US20200263213A1; CA3072310A1; BR112020007305A2; EP3694999A1

Abstract

本发明涉及通过限制培养基中的氨浓度来增加给定微生物细胞耐受的邻氨基苯甲酸浓度的方法。

Description

通过限制培养基中的氨量来提高微生物细胞对邻氨基苯甲酸的耐受性的方法

目前，没有商购可得的邻氨基苯甲酸盐或相应酸的可再生的或生物衍生的来源。当前的苯胺生产方法依赖于石油衍生原料的化学合成。与可再生的原料如可再生资源"生物质"相反，这种石油衍生原料是不可再生的。苯胺的化学合成是一个多步骤过程。苯胺生产中涉及的几个反应步骤导致高的生产成本。此外，常规的（即化学的）苯胺合成与危险的中间体、溶剂和废产物有关，它们能够对环境具有重大影响。芳环上的非特异性副反应导致产物收率的降低，因此进一步增加了生产成本。石油衍生原料受全球石油价格导致的成本波动的影响。

邻氨基苯甲酸和/或盐（o-aminobenzoate）是莽草酸（shikimate acid）途径的天然中间体，并且是用于芳族氨基酸L-色氨酸的生物合成的前体。WO2015/124687公开了一种以两个过程步骤生产生物衍生的苯胺的概念：(1)使用重组细菌发酵生产邻氨基苯甲酸和/或盐（o-aminobenzoate）和(2)随后将邻氨基苯甲酸催化转化为苯胺。用于所述过程中的重组细菌属于棒状杆菌（Corynebacterium）或假单胞菌（Pseudomonas）科。两种细菌在7至8的pH值下都生产邻氨基苯甲酸和/或盐。

当在7至8范围内的pH下生产邻氨基苯甲酸和/或盐时存在以下问题：由于发酵生产邻氨基苯甲酸（o-aminobenzoate），其是一种酸，需要添加碱如NH₄OH以确保稳定的中性pH。因此，产生例如NH₄ ⁺/邻氨基苯甲酸根^-的盐。然而，这样的邻氨基苯甲酸盐对微生物细胞是有毒的。根据图3，当达到大于25 g/L邻氨基苯甲酸根（o-aminobenzoate） (不包括阳离子的质量) 的NH₄ ⁺/邻氨基苯甲酸根（o-aminobenzoate）浓度时，细菌细胞的代谢活性(见OTR)受到限制，并且细胞生长(见干重)在更高浓度(＞50 g/L)下停止。对于产物如谷氨酸或赖氨酸而言，这种毒性是未知的。

这种类型的毒性问题通常通过所应用的微生物细胞的直接进化来解决。首先，在重复的分批实验或连续发酵试验中，将微生物细胞暴露于浓度增加的毒性组分(例如邻氨基苯甲酸和/或盐)。由此，微生物细胞通过随机诱变(其可以通过添加诱变剂来加速)进化，并且更耐受的微生物细胞得以存活。其次，分离/选择最耐受的细胞，并可将其用于生产。

然而，作为这些微生物细胞中的耐受性的基础的许多机制消耗能量(AindrilaMukhopadhyay，Trends in Microbiology，2015年8月，第23卷，第8号；Rau等人，Microb Cell Fact (2016) 15: 176; Warnecke T, Gill RT. Microbial Cell Factories.2005; 4: 25)。因此，消耗一定比例的可发酵底物用于维持代谢，导致邻氨基苯甲酸和/或盐的产率降低。由于这个原因，该过程的合理的空时产率所需要的邻氨基苯甲酸和/或盐的高滴度伴随地降低了产物产率。

尽管由可再生来源以生物技术生产邻氨基苯甲酸和/或盐作为用于苯胺生产的前体提供了潜在的益处，但是上述毒性因素减少了该过程的潜在益处。因此，需要用于增加微生物细胞对邻氨基苯甲酸的耐受性的替代方法。

所述问题通过权利要求书和以下的说明书中定义的实施方案来解决。

在第一实施方案中，本发明涉及用于培养至少一种微生物细胞的方法，所述微生物细胞能够在可发酵底物的存在下将可发酵底物转化为oAB，同时维持其代谢活性，其中培养基的特征在于不超过200 mM的氨浓度和至少40 g/l的邻氨基苯甲酸(oAB)浓度。

优选地，该实施方案中的oAB浓度为40 g/l至80 g/l，更优选40 g/l至70 g/l，和更优选40 g/l至60 g/l。

在该实施方案中，所述代谢活性优选是通过培养物的氧转移速率(OTR)确定的氧消耗。所述"培养物"是由至少一种微生物细胞和培养基组成的悬浮液。一种或多种细胞的维持的代谢活性通过培养物的OTR没有降低来表明。优选地，维持的代谢活性是培养物的OTR增加。

在上述培养条件下（Und），所述微生物细胞将至少一部分可发酵底物转化为oAB。因此，在另一个实施方案中，本发明涉及用于通过在可发酵底物的存在下和在适于可发酵底物转化为oAB的条件下培养能够将可发酵底物转化为oAB的微生物细胞来生产邻氨基苯甲酸(oAB)的方法，其中培养基中的氨浓度不超过200 mM且oAB浓度为至少40 g/l。

所述微生物细胞是，优选地，能够将可发酵底物生物转化为oAB的细胞。术语"生物转化"是指将可发酵底物的一种或多种分子转化为一种或多种分子oAB的生物化学过程。这些过程主要由通过细菌细胞表达的酶来介导。

本申请中所提及的术语"邻氨基苯甲酸" (或oAB)涉及2-氨基苯甲酸。该化合物也称为邻氨基苯甲酸（anthranilic acid）。本领域技术人员知道酸可以以其质子化形式作为中性物质存在或去质子化作为阴离子存在。在水溶液中，一部分酸是质子化的，一部分作为阴离子存在。质子化酸和阴离子之间的比例取决于溶液的pH和所讨论的酸的解离常数K_a。除非另有说明，否则本申请中使用的术语"邻氨基苯甲酸"始终是指质子化的酸以及相应的阴离子两者。

本发明中使用的微生物细胞可以是天然存在的菌株，即没有任何进一步的人类交互作用（特别是没有遗传操作）的能够将可发酵底物转化为oAB的微生物菌株。然而，在本发明的一个优选实施方案中，其是在遗传操作过程中获得上述能力的微生物细胞或是使用这些方法来改善预先存在的能力的微生物细胞。

在本发明含义内的术语"遗传修饰"是指与野生型序列相比，在微生物宿主给定基因的核酸序列中的改变。这种遗传修饰可以包括一个或多个脱氧核糖核酸的缺失以及***。这种遗传修饰可以包括部分的或完全的缺失以及通过转化引入到微生物宿主的基因组中的***。这种遗传修饰可产生重组微生物宿主，其中所述遗传修饰可包括与各自的微生物宿主的野生型序列相比至少一个、两个、三个、四个或更多个单核苷酸的改变。例如，遗传修饰可以是缺失或***至少一个、两个、三个、四个或更多个单核苷酸，或转化至少一个、两个、三个、四个或更多个单核苷酸。根据本发明的遗传修饰可以具有例如各自的基因的表达降低或例如各自的基因的表达增强的效果。

所述微生物细胞是原核细胞或真核细胞。优选地，所述原核细胞是细菌细胞。优选的细菌细胞属于棒状杆菌属、分枝杆菌（Mycobacterium）属、芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属、埃希氏菌（Escherichia）属和弧菌（Vibrio）属。更优选谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）和恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）。最优选谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032。优选的真核细胞属于酵母（Saccharomycetales）目或曲霉（Aspergillus）属。更优选地，它们属于棉桃阿舒氏囊霉（Ashbya gossypii）种、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）种、多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）种、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）种、拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）种、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）种和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）种。最优选地，所述酵母是酿酒酵母。

特别优选的是，所述微生物细胞的特征在于trpD基因的遗传修饰，其防止或降低了所述基因的表达和/或其导致了具有降低的酶活性或没有酶活性的基因产物。本领域普通技术人员可以使用常规遗传方法容易地产生这种微生物细胞。

特别适用于本发明方法的重组细菌细胞公开于WO 2015/124687中。

术语"培养"是指在促进代谢活性的条件下培育微生物细胞。这些条件是本领域技术人员已知的。所述条件最低限度地包括在允许细胞增殖的温度下、在适于细胞生长的培养基中微生物细胞的存在，可发酵底物的存在和氧的存在。优选地，所述代谢活性是氧消耗。更优选地，代谢活性作为选自氧消耗、葡萄糖消耗、oAB-生产和生长速率中的一个或多个参数来测量。最优选地，代谢活性是可发酵底物生成oAB的生物转化或生长速率。

优选地，所述培养在pH为6.0-8.0的培养基中进行。

如本申请所理解的可发酵底物是任何有机化合物或有机化合物的混合物，其可以被微生物细胞利用以在存在或不存在氧的情况下生产邻氨基苯甲酸。优选的可发酵底物还充当用于微生物细胞生长的能量源和碳源。优选的可发酵底物是加工过的甜菜、甘蔗、含淀粉的植物和木质纤维素。也优选作为可发酵底物的是甘油和C1化合物，优选CO，和可发酵糖。优选的可发酵糖是葡萄糖。

术语"培养基"是本领域通常理解的。它是指提供允许微生物细胞代谢活性的条件的水溶液。所述条件是物理的或物理化学的，如温度、溶解氧浓度、离子强度和pH。它们也是化学的，并且包括微生物细胞为其活性所需的不同营养素的浓度。本领域技术人员可以基于对特定微生物细胞可获得的公知常识使这些条件适应特定微生物细胞的需要。

术语"氨"是指呈其中性形式的氨，即NH₃，以及铵，即NH₄ ⁺。因此，"氨浓度"总是指这两种物质的浓度之和。

氨水是生物技术应用中常用的缓冲液。在有机酸如oAB的生产中，尽管酸性发酵产物的浓度增加，但它可用于维持稳定的pH。然而，在作为本发明的基础的研究中，令人惊奇地已经发现，由于使用氢氧化钠作为缓冲物质而不存在高的氨浓度，导致所讨论的微生物耐受的oAB-浓度显著增加。

因此，在通过微生物细胞生产oAB期间的氨浓度必须受到限制，以伴随地限制oAB的产物毒性。在oAB生产期间存在的氨浓度不超过300 mM，优选200 mM。更优选地，其达到最大100 mM，和最优选50 mM。应当理解，从原液中添加氨水或铵盐作为氮源或作为缓冲体系的组分可能导致浓度局部地和在有限的时间段内超过上述值，因为添加的液体在发酵容器中的均匀分布需要一定量的时间。这同样适用于添加固体形式的铵盐，其中盐的溶解可能导致在溶解的盐被稀释之前氨浓度的局部峰值。

因此，术语"局部地"是指不超过培养基总体积的10%的比例。在混合培养基导致容器中所添加的化合物的分布以致不超过上述定义的阈值水平之前，培养基中的氨浓度的任何峰值不会持续超过15分钟。

由于较小的氨浓度不会引起oAB的过度毒性，因此在本发明的一个优选实施方案中，培养基含有0.5 mM至300 mM、优选0.5 mM至200 mM和最优选0.5 mM至100 mM的氨。优选地，氨浓度的下限为10 mM。因此，氨仍可用作缓冲体系的一部分，并且它可用作便宜和方便的氮源。

然而，在本发明的另一个优选实施方案中，没有将氨主动添加到培养基中，以使氨浓度不超过5.0 mM，优选1.0 mM，更优选0.5 mM。在该实施方案中，必须使用除氨之外的氮源。替代氮源是本领域技术人员公知的。优选的替代氮源是尿素、氨基酸、肽以及包含上述化合物的复杂混合物。包含替代氮源的混合物是，优选地，酵母提取物、胰蛋白胨、酪蛋白氨基酸和玉米浆。优选的氨基酸是谷氨酰胺、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和丝氨酸。

在本发明的一个优选实施方案中，低的氨浓度用替代氮源来补充。如果在培养的任何时间点总的氨浓度在0.5至250 mM，更优选0.5至100 mM的范围内，则优选这样做。用于补充上述氨浓度的优选替代氮源是尿素。

在上面定义的培养条件下达到至少20 g/l，优选至少30 g/l，最优选至少40 g/l的oAB-浓度。

优选地，在上面定义的培养条件下，微生物生物质达到至少6 g/l，更优选至少9g/l的生物质。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，在上面定义的培养条件下并且在至少30g/L oAB、更优选至少40 g/L oAB的存在下，微生物生物质达到至少6 g/l、更优选至少9 g/l的生物质。

有利地，如果培养基中的氨浓度不超过300 mM、更优选250 mM、最优选100 mM，则微生物细胞维持其代谢活性直到至少30 g/l oAB、更优选至少40 g/l oAB、最优选至少50g/l oAB的浓度。如果所述代谢活性为不存在oAB的情况下的活性的至少50%，则所述细胞维持其代谢活性。优选地，代谢活性被测量为选自氧消耗、葡萄糖消耗、oAB-生产和生长速率中的一个或多个参数。

应理解，oAB浓度的任何突然增加引起微生物细胞代谢活性的瞬时降低(参见实施例)。在oAB生产过程期间，这种效果不太可能遇到，因为oAB浓度逐渐增加，使得微生物细胞有时间适应。然而，为了测试目的而添加oAB可能具有这种效果。因此，优选的是在oAB浓度的（例如通过向培养基中添加oAB引起的）任何急剧增加之后至少两小时测量微生物细胞的代谢活性。否则，对于给定的条件，oAB对活性的真正持久效果可能被高估。

在本发明的一个优选的实施方案中，在微生物细胞培养期间，用碱金属离子的碱代替氨水作为缓冲剂。所述碱金属的碱优选为氢氧化钠。

在本发明的另一个优选实施方案中，在微生物细胞培养期间不添加缓冲剂。如果从发酵过程开始培养基就含有足够浓度的CaCO₃，或者如果使用尿素作为替代氮源，则可以省略缓冲剂。基于中和给定量的oAB所需的CaCO₃的量和可接受的pH最大下降，可以计算oAB的初始浓度。如果在发酵期间省略添加缓冲剂，则在发酵开始之前向培养基中添加10至30g/l，更优选15至25 g/l CaCO₃。

在另一个优选实施方案中，本发明涉及氨浓度不超过300 mM、优选不超过200 mM的培养基用于通过能够进行所述转化的微生物细胞将可发酵碳源生物转化为oAB的用途。

除非另有说明，否则以上针对本发明的方法给出的所有定义也适用于该实施方案。

更优选地，培养基中的氨浓度不超过200 mM。甚至更优选地，其不超过100 mM。最优选地，其不超过5 mM。

在又一个实施方案中，本发明涉及氨浓度不超过10 mM的培养基用以增加微生物细胞对oAB的耐受性的用途。

术语"培养基用以增加微生物细胞对oAB的耐受性的用途"

以下实施例仅意在说明本发明。它们不应以任何方式限制权利要求的范围。

实施例

附图示出：

图 1:评估在用经修饰的谷氨酸棒状杆菌（C. glutamicum）生产菌株在1L实验室规模生物反应器中分批培养期间最大可耐受oAB浓度。在23小时和39小时、48小时(两次)、64小时(两次)和71小时(两次)之后添加20 mL的500 g/L oAB原液(在pH7下的用NaOH溶解的oAB)，并在40小时、48小时、63小时、65和71.5小时之后添加葡萄糖溶液以防止葡萄糖限制。初始培养体积VL = 1L，温度30℃，通过在培养期间添加NH₄OH (10 w% NH₃)控制的pH =7，空气通气（gassing）速率= 0.2L/min，通过将搅拌器速度调节在200至1200 rpm将pO₂控制在30%空气饱和度。

图 2:在用谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032以1L规模分批培养期间，Na-oAB和NH₄-oAB的添加对oAB耐受性的影响。实心符号：在7小时和24小时之后添加40 mL的500 g/L oAB原液(在pH7下的用NaOH溶解的oAB)。空心符号：在7小时和24小时之后添加40 mL的500 g/LoAB原液(在pH7下的用NH₄OH溶解的oAB)。两个生物反应器：在7.5小时和24.5小时之后添加36 g/L葡萄糖(作为原液添加)以防止葡萄糖限制。初始培养体积VL = 1L，温度30℃，用NH₄OH (10 w% NH₃)控制的pH =7，空气通气速率= 0.2L/min，通过将搅拌器速度调节在200至1200 rpm将pO₂控制在30%空气饱和度。

图 3:在用谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032以1L规模分批培养期间，Na-oAB和NH₄-oAB的添加对oAB耐受性的影响。实心符号：在6.4小时和23.6小时之后添加40 mL的500 g/LoAB原液(在pH7下的用NaOH溶解的oAB)。空心符号：在6.4小时和23.6小时之后添加40 mL的500 g/L oAB原液(在pH7下的用NH₄OH溶解的oAB)。初始培养体积VL = 1L，温度30℃，用NH₄OH (10 w% NH₃)控制的pH =7，空气通气速率= 0.2L/min，通过将搅拌器速度调节在200至1200 rpm将pO₂控制在30%空气饱和度。

图 4:在用经修饰的谷氨酸棒状杆菌生产菌株以1L规模分批培养期间NaCl和NH₄Cl的添加对oAB耐受性的影响。在23小时、39小时和47小时(两次)之后添加20 mL的500g/L oAB原液(在pH7下的用NaOH溶解的oAB)，并在19小时、37小时、47小时和71小时之后添加葡萄糖以防止葡萄糖限制。实线：反应器1，在64小时之后添加70mL的244 g/L NaCl原液。虚线：反应器2，在64小时之后添加70 mL 的223 g/L NH₄Cl-原液。初始培养体积VL = 1L，温度30℃，用NH₄OH水溶液(10 w% NH₃)控制的pH =7，空气通气速率= 0.2L/min，通过将搅拌器速度调节在200至1200 rpm将pO₂控制在30%空气饱和度。

实施例1:评估经修饰的谷氨酸棒状杆菌生产菌株的最大可耐受oAB浓度。

用经修饰的谷氨酸棒状杆菌生产菌株测试在培养基中的在钠离子存在下的最大可耐受oAB浓度。该菌株通过进化工程衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032，以增加其对oAB的耐受性。然后对该菌株进行遗传修饰以使其能够进行oAB生产并包括下列修饰。并入的修饰具有下述效果：减少编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的trpD基因的表达、敲除编码PEP羧化酶的基因ppc、组成型过表达来自大肠杆菌的分别编码反馈耐受性DAHP合成酶和邻氨基苯甲酸合成酶的异源aroG ^D146N和trpEG ^S40F基因，组成型过表达来自大肠杆菌的编码莽草酸激酶的基因aroL。

标称体积为1L的生物反应器填充有无菌培养基，该培养基包括初始量的20 g/L葡萄糖、5 g/L (NH₄)₂SO₄、1 g/L KH₂PO₄、1 g/L K₂HPO₄、0.25 g/L MgSO₄·7 H₂O、0.01 g/LCaCl₂·2 H₂O、2 mg/L 生物素(维生素B7)、0.03 g/L原儿茶酸(3,4-二羟基苯甲酸)、0.01g/L MnSO₄·H₂O、0.01 g/L FeSO₄·7H₂O、1 mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.2 mg/L CuSO₄·5H₂O和0.02 mg/L NiCl₂·6H₂O。

用于在摇瓶中的培养的预培养基另外含有42 g/L MOPS缓冲液、3.7 g/L脑心浸液肉汤、5 g/L尿素(CH₄N₂O)和20 g/L (NH₄)₂SO₄ (而不是5 g/L)。在28℃的温度和180 rpm的摇动频率下，在液体体积为25 mL的300 mL摇瓶中培养预培养物，直到达到OD₆₀₀ > 20。

该培养在实验室规模的生物反应器中进行，初始培养体积为1L。在发酵期间，将温度控制在30℃，并通过添加NH₄OH水溶液(10 w% NH₃)将pH保持恒定在pH =7。将通气速率调节至0.2L/min空气，并通过将搅拌器速度控制在200 rpm至1200 rpm，将溶氧张力控制在30%空气饱和度。培养结果示于图1中。通过在23小时、39小时、48小时(两次)、64小时(两次)和71小时(两次)之后添加20 mL的500 g/L oAB原液(在pH7下的用NaOH溶解的oAB)逐步增加oAB浓度。在40小时、48小时、63小时、65和71.5小时之后添加葡萄糖作为原液以防止葡萄糖限制。如图1中所示，即使在oAB浓度为80 g/l时也观察到生物质浓度的增加。71小时之后oAB浓度从80 g/L增加到100 g/L，导致代谢活性降低(由下降的OTR信号表明)，并且此时未观察到生物质的进一步增加。用该实验证明了可通过向生物反应器中添加作为钠盐而不是铵盐的oAB，以此方式避免高的铵浓度，来实现在80 g/L oAB存在下谷氨酸棒状杆菌生产菌 株的生长。

实施例 2: 比较在谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032培养期间添加NH₄-oAB和Na-oAB之后的代谢活性。

使用衍生自ATCC 13032的谷氨酸棒状杆菌菌株用于比较在培养期间添加NH₄-oAB和Na-oAB之后的代谢活性。该菌株通过进化工程衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032，以增加其对oAB的耐受性。其不被进一步遗传修饰。因此它不能生产oAB。为此目的，用包括以下初始浓度的无菌培养基填充两个1L生物反应器：20 g/L葡萄糖、5 g/L (NH₄)₂SO₄、1 g/LKH₂PO₄、1 g/L K₂HPO₄、0.25 g/L MgSO₄·7 H₂O、0.01 g/L CaCl₂·2 H₂O、2 mg/L 生物素(维生素B7)、0.03 g/L 原儿茶酸(3,4-二羟基苯甲酸)、0.01 g/L MnSO₄·H₂O、0.01 g/LFeSO₄·7H₂O、1 mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.2 mg/L CuSO₄·5H₂O 和0.02 mg/L NiCl₂·6H₂O。

干的生物质、oAB和NH₄浓度的结果和氧转移速率(OTR)信号示于图2中。在7小时和24小时的培养时间处，向反应器1添加40 mL的500 g/L oAB原液 (在pH7下的用NaOH溶解的oAB)之后，生物质浓度和OTR信号继续增加(图2中的实心符号)。与此相反，向反应器2添加NH₄-oAB (通过注入40 mL的含有在pH7下的用NH₄OH溶解的oAB的500 g/L的oAB原液来添加)在24小时之后导致恒定的OTR信号和减少的生物质积累(图2中的空心符号)。该实验表明，用钠替代氨作为oAB的抗衡离子提高了谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032对oAB的耐受性。

实施例 3: 比较在谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032培养期间添加NH₄-oAB和Na-oAB之后的代谢活性

用谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032(没有进一步的遗传修饰，没有通过进化工程修饰)测试铵的影响，使用两个1L生物反应器，所述生物反应器填充有无菌培养基，所述培养基包括下列初始浓度：20 g/L葡萄糖、5 g/L (NH₄)₂SO₄、1 g/L KH₂PO₄、1 g/L K₂HPO₄、0.25 g/LMgSO₄·7 H₂O、0.01 g/L CaCl₂·2 H₂O、2 mg/L 生物素 (维生素B7)、0.03 g/L 原儿茶酸(3,4-二羟基苯甲酸)、0.01 g/L MnSO₄·H₂O、0.01 g/L FeSO₄·7H₂O、1 mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.2 mg/L CuSO₄·5H₂O和0.02 mg/L NiCl₂·6H₂O。

在发酵期间，将温度控制在30℃，并通过添加NH₄OH水溶液(10 w% NH₃)将pH保持恒定在pH =7。将通气速率调节至0.2L/min空气，并通过将搅拌器速度控制在200 rpm至1200rpm，将溶氧张力控制在30%空气饱和度。

干的生物质和oAB浓度的结果和氧转移速率(OTR)的相关信号示于图3中。在6.4小时和23.6小时之后，向反应器1添加40 mL的500 g/L oAB原液 (在pH7下的用NaOH溶解的oAB) (实心符号)，并在6.4小时和23.6小时之后，向反应器2添加40 mL的500 g/L oAB原液(在pH7下的用NH₄OH溶解的oAB) (空心符号)

如图3中所示，在向反应器1添加Na-oAB后，生物质继续积累(图3中的实心符号)。与此相反，向反应器2添加NH₄-oAB在24小时之后引起生长抑制(图3中的空心符号)。由此得出，与在高铵浓度存在下的毒性相比，在高钠浓度存在下的oAB对谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的毒性降低。

实施例 4: 比较在经修饰的谷氨酸棒状杆菌生产菌株培养期间添加添加NaCl和NH₄Cl之后的代谢活性

如实施例1中所述般修饰菌株。为了评价对oAB耐受性的提高是由培养基中的高铵浓度的缺乏引起的还是由培养基中的钠的存在引起的，测试了NaCl和NH₄Cl的添加对oAB的毒性的影响。用无菌培养基填充标称体积为1L的两个生物反应器，所述培养基包括以下初始浓度：20 g/L葡萄糖、5 g/L (NH₄)₂SO₄、1 g/L KH₂PO₄、1 g/L K₂HPO₄、0.25 g/L MgSO₄·7 H₂O、0.01 g/L CaCl₂·2 H₂O、2 mg/L 生物素 (维生素B7)、0.03 g/L 原儿茶酸 (3,4-二羟基苯甲酸)、0.01 g/L MnSO₄·H₂O、0.01 g/L FeSO₄·7H₂O、1 mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.2 mg/LCuSO₄·5H₂O和0.02 mg/L NiCl₂·6H₂O。

该培养在实验室规模的生物反应器中进行，初始培养体积为1L。在发酵期间，将温度控制在30℃，并通过添加NH₄OH水溶液(10 w% NH₃)将pH值保持恒定在pH 7。将通气速率调节至0.2L/min空气，并通过将搅拌器速度控制在200 rpm至1200 rpm，将溶氧张力控制在30%空气饱和度。用生产菌株接种两个生物反应器。培养结果示于图4中。通过在23小时、39小时、48小时(两次)之后添加20 mL的500 g/L oAB原液(Na-oAB)逐步增加oAB浓度。在19小时、37小时、47小时和71小时之后添加葡萄糖，以防止葡萄糖限制。在64小时的培养时间之后，将含有244 g/L NaCl的70 mL体积的水添加到生物反应器1中 (图4中的实线)，产生292mmol Na⁺离子的添加量。64小时之后通过添加70 mL的223 g/L NH₄Cl 原液将等摩尔量的NH₄Cl添加到反应器2中(虚线)。图4中显示了两个生物反应器的氧转移速率(OTR)的在线信号。NaCl的添加对反应器1的OTR信号没有影响。与此相反，在添加NH₄Cl溶液后，反应器2的OTR信号降低约20% (图4)。代谢活性的下降影响最终干重浓度，在91小时的培养时间之后，反应器1中达到7.8 g/Ll，反应器2中达到6.8 g/Ll。该结果表明，铵浓度的增加导致谷氨酸 棒状杆菌生产菌株代谢活性的降低。

上述效果至少可以推广到棒状杆菌属。经受进化工程（一种以随机方式改变生物体遗传物质的方法）的菌株显示与实施例3中所用菌株相同的行为。因此，该效果似乎是基于细胞的一些不易改变的相当基本的功能。

Claims

1.用于培养至少一种微生物细胞的方法，所述微生物细胞能够在可发酵底物的存在下将可发酵底物转化为oAB，同时维持其代谢活性，其中培养基的特征在于不超过200 mM的氨浓度和至少40 g/l的邻氨基苯甲酸(oAB)浓度。

2.权利要求1的方法，其中维持的代谢活性通过培养物的氧转移速率没有降低来表明。

3.用于生产邻氨基苯甲酸(oAB)的方法，其通过在可发酵底物的存在下和在适于可发酵底物转化为oAB的条件下培养能够将可发酵底物转化为oAB的微生物细胞，其中培养基中的氨浓度不超过200 mM且oAB浓度为至少40 g/l。

4.权利要求2的方法，其中培养基中的氨浓度不超过5 mM。

5.权利要求3或4的方法，其中oAB浓度不超过80 g/l。

6.权利要求3至5中任一项的方法，其中所述培养基含有不是氨的替代氮源。

7.权利要求6的方法，其中所述替代氮源是尿素。

8.权利要求6的方法，其中所述氮源选自谷氨酰胺、丙氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、肽和含氮的复杂混合物。

9.权利要求3至8中任一项的方法，其包括向所述培养基中添加碱金属碱作为缓冲剂的进一步的步骤。

10.权利要求1至9中任一项的方法，其中微生物生物质达到至少6 g/l干重。

11.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述微生物细胞是细菌细胞，属于棒状杆菌属。

12.氨浓度不超过200 mM且oAB浓度为40 g/l至80 g/l的培养基用于通过能够进行所述转化的微生物细胞将可发酵碳源生物转化为oAB的用途。

13.氨浓度不超过10 mM的培养基用以增加微生物细胞对oAB的耐受性的用途。