CN111154907A - 一种用于检测靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的引物、方法和应用 - Google Patents

一种用于检测靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的引物、方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的引物，该引物包括上游引物Sense Primer CT‑F和下游引物Anti‑sense Primer CT‑R，所述上游引物Sense Primer CT‑F的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物Anti‑sense Primer CT‑R的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。还公开了利用上述引物检测靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的检测方法，该方法基于分子生物学方法检测，简便、快速、省时省力、灵敏度高，准确度高。以及上述引物在制备用于检测靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的试剂盒或生物制剂中的应用。

Description

一种用于检测靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的引物、方 法和应用
技术领域
本发明属于抗草甘膦牛筋检测技术领域，具体涉及一种用于鉴定靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的引物、方法和应用。
背景技术
牛筋草[Eleusine indica(L.)Gaertn]是一年生禾本科植物，在全世界范围内广泛分布。牛筋草具有很强的适应力和繁殖力，生长于农田、草坪、苗圃、果园、路旁等地，是世界十大恶性杂草之一，严重威胁全球农作物安全生产的恶性杂草。
草甘膦[N-(磷羧基甲基)-甘氨酸](glyphosate)是一种高效、低毒性、低残留全球第一大广谱灭生性除草剂，被誉为20世纪最伟大的除草剂。使用草甘膦防控牛筋草是广大农户最简单、经济、有效的手段。随着草甘膦的长期、连续、超量使用，导致牛筋草对草甘膦产生抗药性。在我国，抗草甘膦牛筋草首先在广东惠州地区发现，之后在广东及华南地区的果园、菜田、甘蔗田和玉米地等农田迅速发生和蔓延，肆虐严重，由于缺乏快速准确的抗草甘膦牛筋草检测技术，缺乏科学指导，生产上滥用、乱用的草甘膦情况严重。农民往往通过增加草甘膦的使用量进行防除，生产成本增加的同时影响农作物产量和质量，对农田生态环境污染严重。
目前牛筋草对草甘膦的抗药性主要基因靶标酶EPSPS的基因突变或基因复增所致。目前在我国华南地区发现的抗草甘膦牛筋草种群且主要为靶基因复增型。
靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的传统的抗性鉴定主要分三步：
1)材料培养：在田间牛筋草成熟期采集种子，晾干保存。选择无牛筋草种子、无除草剂残留的土壤装于直径不小于10cm盆钵中，待长至2叶期，间苗，每盆保留长势一直的约10个植株。
2)生物测定：待植株长至4-5叶期，用草甘膦进行茎叶喷雾，至少5个剂量，每个剂量不少于4个重复，用剂量反应曲线鉴定种群的抗药性指数。
3)靶基因检测：检测牛筋草中草甘膦靶基因EPSPS是否复增，主要采用Southernblot和荧光定量PCR(qPCR)两种方法进行。Southern blot鉴定包括基因组DNA提取-酶切-琼脂糖电泳-转膜-杂交-显影等6步；qPCR鉴定包括总RNA提取-反转录—PCR-数据分析等四步。Southern blot结果直观，但步骤较多，费时、费力；qPCR对RNA质量和引物要求高，且容易出现假阳性，准确性偏低。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gelelectrophoresis)，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，用于分离蛋白质和管核苷酸。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶。在电场的作用下，带电粒子能在聚丙烯酰胺凝胶中迁移，其迁移速率与带电粒子的大小、构型、和所带的电荷有关。
银染法：银染法是一种用于检测聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质(或核酸)的高灵敏度方法。在碱性条件下，用甲醛将蛋白质带上的硝酸银(银离子)还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白质(或核酸)带上。
目前还未有人采用普通PCR结合聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染法来检测靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供用于检测靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的引物，该引物特异性强。
本发明的第二个目的在于提供一种利用上述引物进行靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的快速检测方法，该方法基于分子生物学方法检测，简便、快速、省时省力、灵敏度高，准确度高。
本发明的第三个个目的在于提供上述引物在制备用于检测靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群或相关生物制剂中的应用。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种用于检测靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的引物，该引物包括上游引物Sense Primer CT-F和下游引物Anti-sense Primer CT-R，所述上游引物Sense Primer CT-F的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物Anti-sense Primer CT-R的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
本申请研究发现，与敏感型牛筋草的EPSPS基因特征相比，抗草甘膦牛筋草种群发生EPSPS基因复增后其5’端非翻译区相应存在一个12bp的CT重复序列的***突变。
而本申请中设计的引物能扩增出靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群EPSPS基因5’端非翻译区CT***突变位点上下游约130bp序列(如果没有CT***突变，扩增出来的片段长度约为120bp，若发生CT***突变，则扩增出来的片段约为130bp)，结合聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨特性，从而可以用于判断待测牛筋草中是否产生了基于EPSPS基因5’端非翻译区CT重复序列***突变的草甘膦抗药性。
具体的，该组引物的碱基序列如下：
CT-F:5’-GCGGCGCACGCCTCAGCTCA-3’
CT-R:5’-GTCGAGGTTGGTTTGGCTGC-3’。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的快速检测方法，包括以下步骤：
(1)选取待测牛筋草样品和敏感型牛筋草种群，分别提取二者的基因组DNA；
(2)根据靶基因复增型抗草甘膦牛筋草EPSPS基因5’端非翻译区存在一个12bp的CT重复序列***，设计上述引物；
(3)选取步骤(1)中的基因组DNA，利用步骤(2)设计的引物进行PCR扩增，得PCR产物；
(4)将上述PCR产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，银染法显色后观察扩增条带位置；
(5)根据电泳结果鉴定是否为靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群，如果待测牛筋草样品扩增条带位置在敏感型牛筋草种群扩增条带的上方约12bp，则待测牛筋草样品判定为靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群；如果待测样品扩增条带与敏感型牛筋草种群扩增条带的位置平齐，则判定为非靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群。
在该靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的快速检测方法中：
步骤(3)中PCR扩增时，PCR反应体系如下：2mM的dNTP混合液2μL，10×PCR Buffer2.5μL，10μM的CT-F和CT-R引物各0.5μL,5U/μL的高保真Taq DNA聚合酶0.5μL，提取的待测DNA样品1μL，加入18μL无菌蒸馏水至反应体系为25μL。
步骤(3)中PCR扩增时，PCR反应程序如下：95℃加热5min，使DNA裂解变性；进入反应循环，在每一个循环中，95℃裂解30sec，58℃退火30sec，68℃延伸20sec，共30个循环；最后72℃延伸5min，使产物延伸完整。
步骤(3)中所述聚丙烯酰胺凝胶电泳中聚丙烯酰胺的质量百分含量为8％。
研究发现，基因复增型抗草甘膦牛筋草种群中EPSPS基因5’非翻译区有一段CT序列***，本发明采集待测牛筋草叶片提取基因组DNA后，采用普通PCR结合高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法，能快速、准确、直观的鉴定田间牛筋草是否通过EPSPS基因复增对草甘膦产生了抗药性。本发明在实施例中利用对8个基因复增型(采集不同地点的8个牛筋草种群)抗草甘膦牛筋草种群的47个植株的CT区进行检测，明确了基因复增型抗草甘膦牛筋草种群中CT***突变存在普遍性，进而确定该方法的可靠性。
本发明的上述第三个目的可以通过以下技术方案来实现：上述的引物在制备用于检测靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的试剂盒或生物制剂中的应用。
本发明提供的快速检测靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的分子生物学方法，具有灵敏度高，特异性强等特点，与传统技术相比，本发明的有益结果是：
(1)简便易行：该检测方法通过分子生物学技术手段进行试验，无需进行培养材料、药剂筛选、测定抗性指数等传统检测步骤，可直接取材待测种群叶片用该方法检测条带后与敏感种群标准条带对比，快速进行鉴定。
(2)检测高效：本发明与传统药剂筛选抗性牛筋草种群相比，不需要培养材料、喷施农药、称取干重或湿重、计算抗性指数等繁琐过程，使检测时间大大缩短，全过程仅需约6小时即可完成检测。
(3)灵敏度高：该方法采用硝酸银染色技术检测聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，银染后的产物清晰，可以判断相差12bp的核酸基因型。
(4)准确度高：该检测方法所检测的突变位点在敏感与抗性牛筋草种群基因中区别明显，检测准确性很高。
(5)本发明是国内外首次运用分子生物学技术进行抗草甘膦牛筋草种群检测，这种方法快速简便，对指导农民正确科学用药，以及降低成本和减少环境污染具有重要的现实意义。
附图说明
图1是实施例1中草甘膦抗(R)、感(S)型牛筋草EPSPS基因分子特征比较；
图2是实施例2中聚丙烯酰胺凝胶电泳分析抗(R)、感(S)型牛筋草EPSPS基因CT***突变位点特征；
图3是实施例3中分别用聚丙烯酰胺凝胶电泳(A)和荧光定量(qPCR)分析牛筋草EPSPS基因CT***突变和基因复增特征。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的应用方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生化试剂原料，使用的实验仪器均为实验室常规仪器，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。
实施例1
本申请研究发现，与敏感型牛筋草中草甘膦靶标酶EPSPS基因序列相比(GenBankaccession number:KX018288)，靶基因复增型抗草甘膦牛筋草中EPSPS基因5’端非翻译区存在一个12bp的CT重复序列***突变(如图1中所示)，该突变在6个不同地点采集地的牛筋草种群中均有发生，说明该分子特征在靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群中具有广谱性。
因此，可基于PCR引物设计基本原则(长度在15-30bp之间，Tm值介于50-72℃之间)，设计一组上述引物，用于检测靶基因复增型抗草甘膦牛筋草中EPSPS基因5’端非翻译区存在的12bp的CT重复序列***突变。
从而获得一组用于检测靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的引物，该引物包括上游引物Sense Primer CT-F和下游引物Anti-sense Primer CT-R，所述上游引物SensePrimer CT-F的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物Anti-sense Primer CT-R的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
具体的，该组引物的碱基序列如下：
CT-F:5’-GCGGCGCACGCCTCAGCTCA-3’
CT-R:5’-GTCGAGGTTGGTTTGGCTGC-3’。
实施例2
利用实施例1中的引物进行的靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的快速检测方法，包括以下步骤：
(1)选取待测牛筋草样品和敏感型牛筋草种群(其中敏感型牛筋草种群来源是自己实验室采集保存的，抗草甘膦牛筋草发现前在无草甘膦污染草地采集的，也可以采用其它无草甘膦污染草地采集的牛筋草种群作为敏感型牛筋草种群，在本实验室有保存，可向公众发放用于验证试验)，分别提取二者的基因组DNA；
(2)根据靶基因复增型抗草甘膦牛筋草EPSPS基因5’端非翻译区存在一个12bp的CT重复序列***，在含有牛筋草的EPSPS基因CT区上设计1对引物(实施例1中设计的引物)，P CR反应所用的引物是：
CT-F:5’-GCGGCGCACGCCTCAGCTCA-3’
CT-R:5’-GTCGAGGTTGGTTTGGCTGC-3’
(3)分别选取待测牛筋草样品和敏感型牛筋草种群的基因组DNA，利用该引物进行PCR扩增；
PCR反应体系如下：2mM的dNTP混合液2μL，10×PCR Buffer 2.5μL，10μM的CT-F和CT-R引物各0.5μL,5U/μL的高保真Taq DNA聚合酶0.5μL，提取的待测DNA样品1μL，加入18μL无菌蒸馏水至反应体系为25μL。
PCR反应程序如下：95℃加热5min，使DNA裂解变性；进入反应循环，在每一个循环中，95℃裂解30sec，58℃退火30sec，68℃延伸20sec，共30个循环；最后72℃延伸5min，使产物延伸完整。
(4)PCR产物50μL加入10μL 6×Loading Buffer混匀后，在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上分离，观察扩增条带位置。8％PAGE胶配方如下：尿素2.4g，10x TBE 2mL，40％丙烯酰胺4mL，TEMED 9μL，10％过硫酸铵0.8mL。其中，10×TBE:108gTris+55g硼酸+40mlEDTA(0.5M)，定容到1000mL；40％丙烯酰胺：38g丙烯酰胺+2g甲叉双丙烯酰胺，定容到100mL。
PAGE电泳条件：
缓冲液0.5×TBE、电压150V、时间150min。
银染染色液和显影液配方：
0.1％硝酸银：1g硝酸银+dd H2O，定容到1000mL。
显影液：30g NaOH+0.38g四硼酸钠+8mL甲醛，定容到2000mL。
银染实验步骤：
①电泳完成后小心用胶铲取下凝胶，蒸馏水洗胶30s；
②弃去蒸馏水，0.1％硝酸银染色液染色10min；
③弃去染色液，蒸馏水洗胶1min；
④弃去蒸馏水，显影液显色2min；
⑤换显影液，继续染色2min，重复此步骤1～2次直到凝胶显色清晰；
⑥弃去显色液，蒸馏水洗胶30s，凝胶成像仪下成像。
(5)鉴定是否为靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群：根据电泳结果鉴定待测牛筋草样品的EPSPS基因是否发生12bp的CT***突变；如果待测牛筋草样品扩增条带位置在敏感型牛筋草种群扩增条带的上方约12bp，则判定为带有CT***突变的抗草甘膦牛筋草种群(即为靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群)；如果待测牛筋草样品扩增条带与敏感型牛筋草种群扩增条带的位置平齐，则判定为不带有CT***突变的草甘膦敏感型牛筋草种群(即为非靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群)。具体如图2中所示。
在华南区域采集喷药后存活下来的8个牛筋草种群的47株植株，经过检测发现，其EPSPS基因带有CT***突变位点的抗草甘膦牛筋草种群有45株，且其EPSPS基因均发生复增，不带有抗草甘膦突变位点的草甘膦敏感型牛筋草种群有2株(图3第28和36号植株)这两株牛筋草中的EPSPS基因未发生复增。结果表明抗草甘膦牛筋草中的EPSPS基因复增与CT***突变呈一一对应的关系，从而证明通过检测CT***突变来判断基因复增型牛筋草的准确性和可靠性，从目前的结果来看，发了EPSPS基因复增的牛筋草均存在CT***突变。
因此，可以将实施例1中的引物，以及实施例2中的PCR反应体系一起制成试剂盒或生物制剂，采用实施例2中的方法，来检测未知牛筋草样品是否具有抗草甘膦牛筋草EPSPS基因5’非翻译区是否存在12bp的CT***突变即是否为靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群。
综上所述，本发明中设计的引物，及检测方法和试剂盒、生物制剂等能准确、快速的检测出靶基因复增型抗草甘膦的牛筋草种群，为科学研究和生产实践提供了一种简便、快速、成本低廉的检测技术，也为该类抗性杂草的早期预警、流行监测及合理用药提供了理论基础和技术指导。
序列表
<110> 广东省农业科学院植物保护研究所
<120> 一种用于检测靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的引物、方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcggcgcacg cctcagctca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcgaggttg gtttggctgc 20

Claims (6)

1.一种用于检测靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的引物，其特征是：该引物包括上游引物Sense Primer CT-F和下游引物Anti-sense Primer CT-R，所述上游引物SensePrimer CT-F的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物Anti-sense Primer CT-R的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的快速检测方法，其特征是包括以下步骤：
(1)选取待测牛筋草样品和敏感型牛筋草种群，分别提取二者的基因组DNA；
(2)根据靶基因复增型抗草甘膦牛筋草EPSPS基因5’端非翻译区存在一个12bp的CT重复序列***，设计权利要求1中的引物；
(3)选取步骤(1)中的基因组DNA，利用步骤(2)设计的引物进行PCR扩增，得PCR产物；
(4)将上述PCR产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，银染法显色后观察扩增条带位置；
(5)根据电泳结果鉴定是否为靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群，如果待测牛筋草样品扩增条带位置在敏感型牛筋草种群扩增条带的上方约12bp，则待测牛筋草样品判定为靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群；如果待测样品扩增条带与敏感型牛筋草种群扩增条带的位置平齐，则判定为非靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群。
3.根据权利要求2所述的靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的快速检测方法，其特征是：步骤(3)中PCR扩增时，PCR反应体系如下：2mM的dNTP混合液2μL，10×PCR Buffer 2.5μL，10μM的CT-F和CT-R引物各0.5μL，5U/μL的高保真Taq DNA聚合酶0.5μL，提取的待测DNA样品1μL，加入18μL无菌蒸馏水至反应体系为25μL。
4.根据权利要求2所述的靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的快速检测方法，其特征是：步骤(3)中PCR扩增时，PCR反应程序如下：95℃加热5min，使DNA裂解变性；进入反应循环，在每一个循环中，95℃裂解30sec，58℃退火30sec，68℃延伸20sec，共30个循环；最后72℃延伸5min，使产物延伸完整。
5.根据权利要求2所述的靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的快速检测方法，其特征是：步骤(4)中所述聚丙烯酰胺凝胶电泳中聚丙烯酰胺的体积百分含量为8％。
6.权利要求1中所述的引物在制备用于检测靶基因复增型抗草甘膦牛筋草种群的试剂盒或生物制剂中的应用。
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