CN111154737A - 一种能降解黄曲霉毒素b1的锰过氧化物酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能降解黄曲霉毒素B1的锰过氧化物酶，属于生物技术和基因工程技术领域。本发明发现一种来源Phanerochaete chrysosporium的锰过氧化物酶具有降解黄曲霉毒素B1的功能，并且用一个食品安全级宿主乳酸克鲁维酵母GG799和食品安全级质粒pKLAC1实现了Phanerochaete chrysosporium来源的锰过氧化物酶的重组表达。构建得到的重组菌的表达产物具有降解黄曲霉毒素B1的作用，且降解率可达到75.7％。本发明为来源Phanerochaete chrysosporium的锰过氧化物酶后续的蛋白质改造及工业化应用提供了一定的理论依据和数据支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种能降解黄曲霉毒素B1的锰过氧化物酶，属于生物技术和基因工程技术领域。
背景技术
黄曲霉毒素主要是由黄曲霉、寄生曲霉等多种真菌产生的有毒次级代谢产物，黄曲霉毒素B1(AFB1)是已知黄曲霉毒素家族中毒性最大的，被世界卫生组织的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物，对人和家畜的健康产生极大的威胁。因此在食品、饲料等行业中，黄曲霉毒素B1的脱毒和降解显得尤为重要。
传统的黄曲霉毒素的脱毒方式有物理和化学方法。物理方法主要包括高温法、辐射法和物理吸附法。其中，采用高温法要加热至300℃才能使黄曲霉毒素B1有明显的分解，成本太高；辐射法存在辐照技术本身的放射性污染问题，辐射机理的认知不全，辐照对食物、饲料的安全性问题使辐射除毒技术的应用受到限制。化学法主要包括碱处理法和氧化法，但化学法本身存在不稳定性，在碱性条件下，黄曲霉毒素B1的内酯环被打开，变成了香豆素钠盐或铵盐，黄曲霉毒素毒性消失，但从碱性恢复到中性时，打开的内酯环会重新连接成毒素。其次，化学法安全性有待于评估，对产品的其他成分也有一定程度的破坏。黄曲霉毒素B1的生物脱毒主要是利用微生物或其产生的酶及其制剂通过生物催化的方法脱毒，与物理、化学方法相比，生物脱毒条件相对温和且高效，产品的品质得以保证，甚至有些益生菌还能提升产品的营养价值。
已知锰过氧化物酶家族具有降解芳香族化合物的特殊能力，因此其在纸浆的生物漂白、褐煤的生物降解、农业废弃物的处理、有机污染物的降解等工业和农业应用方面有重要作用。例如黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)来源的锰过氧化物酶，在之前的研究报道中主要应用于降解木质素领域，但从未发现其具有降解黄曲霉毒素的作用。另外，目前有在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)以及大肠杆菌(Escherichia coli)中成功异源表达不同来源的锰过氧化物酶的报道，但是巴斯德毕赤酵母表达***易分泌产生有害代谢产物，且需要利用有害化学物质甲醇进行诱导表达，并不适合应用于食品、谷物加工、农业等领域；而大肠杆菌本身就是致病菌的一种，当使用大肠杆菌作为表达宿主时，还会导致锰过氧化物酶蛋白不能够正确折叠，从而以没有活性的包涵体形式存在，需要繁琐的重折叠过程使酶恢复活性，实验操作繁杂且成本高，也不适合应用于食品、谷物加工、农业等领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种锰过氧化物酶在降解黄曲霉毒素B1中的应用，所述锰过氧化物酶是(a)或(b)：
(a)具有NCBI Protein-ID为AAA33745.1的氨基酸序列的蛋白质；
(b)或者，在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有锰过氧化物酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
在本发明的一种实施方式中，所述降解是在pH 3.0～pH 5.5，25℃～45℃下反应30h～60h。
在本发明的一种实施方式中，所述降解的反应体系中，MnSO4浓度为0.25μmol/μg～1.75μmol/μg黄曲霉毒素B1，锰过氧化物酶的添加量为1.0mg/μg～4.0mg/μg黄曲霉毒素B1，葡萄糖的添加量为0.5μmol/μg～3.0μmol/μg黄曲霉毒素B1，葡萄糖氧化酶的添加量为0.25U/μg～1.5U/μg黄曲霉毒素B1。
在本发明的一种实施方式中，所述锰过氧化物酶包括发酵表达锰过氧化物酶的细胞所得的含锰过氧化物的发酵上清液。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞的宿主包括乳酸克鲁维酵母。
在本发明的一种实施方式中，所述表达锰过氧化物酶的细胞包括重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP，所述重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP是以食品安全级宿主乳酸克鲁维酵母GG799为表达宿主，以食品安全级质粒pKLAC1质粒为表达载体，表达锰过氧化物酶的重组菌。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵上清液是将重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP接种于YPD培养基中，在28℃～32℃，200rpm～220rpm下培养15h～20h后以1％～5％接种量(V/V)转接至YPG培养基中，在28℃～32℃，200rpm～220rpm恒温发酵60h～80h；发酵结束后，离心，收集上清液得到的发酵上清液。
在本发明的一种实施方式中，编码所述锰过氧化物酶的基因的核苷酸序列如NCBIGene-ID为L29039.1的核苷酸序列所示。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括用于降解食品、谷物或饲料中的黄曲霉毒素B1。
本发明的目的还在于提供一种重组乳酸克鲁维酵母，其表达锰过氧化物酶；所述锰过氧化物酶是(a)或(b)：
(a)具有NCBI Protein-ID为AAA33745.1的氨基酸序列的蛋白质；
(b)或者，在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有锰过氧化物酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
在本发明的一种实施方式中，所述重组乳酸克鲁维酵母以食品安全级宿主乳酸克鲁维酵母GG799为表达宿主，以食品安全级质粒pKLAC1质粒为表达载体。
本发明的有益效果：
(1)本发明发现Phanerochaete chrysosporium来源的锰过氧化物酶具有降解黄曲霉毒素B1的作用，并且以乳酸克鲁维酵母为宿主，构建了表达Phanerochaetechrysosporium来源的锰过氧化物酶的食品安全级菌株重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP，应用该重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP发酵得到的发酵上清液在pH 4.5、40℃条件下降解黄曲霉毒素B140 h，对黄曲霉毒素B1的降解率达75.7％；
(2)本发明构建了食品安全级菌株重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP，该菌株能够将锰过氧化物酶直接分泌到发酵上清液中，发酵上清液可用于降解黄曲霉毒素B1，表达产物直接分泌到发酵上清液中，和现有技术中以大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母作为表达宿主表达锰过氧化物酶相比，具有不需要经过重折叠等过程、步骤简单、成本低、无需使用有害诱导物、安全性高等优点，适宜在食品工业大规模应用。
附图说明
图1：蛋白电泳结果，其中，泳道1是乳酸克鲁维酵母GG799的发酵培养物无细胞提取液；泳道2是乳酸克鲁维酵母GG799的细胞破碎沉淀物；泳道3是乳酸克鲁维酵母GG799的发酵上清液；泳道4是重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP的发酵培养物无细胞提取液；泳道5是重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP的细胞破碎沉淀物；泳道6是重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP的发酵上清液。M为分子量标准(单位：kDa)。
具体实施方式
1、培养基
(1)YPD固体培养基：1.0％酵母粉，2.0％蛋白胨，2.0％葡萄糖，2.0％琼脂粉。
(2)YPD液体培养基：1.0％酵母粉，2.0％蛋白胨，2.0％葡萄糖。
(3)YPG诱导培养基：1.0％酵母粉，2.0％蛋白胨，2.0％半乳糖，0.2％MnSO4，0.2％Hemin。
(4)YCB固体培养基：0.34％YNB，1.0％葡萄糖，1.5％琼脂粉，5.0mmol/L乙酰胺。
2、黄曲霉毒素B1检测方法
黄曲霉毒素B1的含量通过超高效液相色谱串联四级杆质谱联用仪(UPLC-TQD)测定。
色谱条件：柱：C18；流速：0.30mL/min；柱温：40℃；流动相：H2O(缓冲液A)和乙腈(缓冲液B)；梯度洗脱程序如表1所示。
表1黄曲霉毒素B1检测液相色谱梯度洗脱程序
质谱条件：离子源：电喷雾离子源；质谱扫描方式：多重反应监测模式(MRM)；锥孔电压：3.0kV；加热气温度：500℃；离子源温度：150℃；脱溶剂气：800L/h；质谱参数见表2所示。
表2黄曲霉毒素B1的质谱参数
实施例1食品安全级菌株重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP的构建
人工合成编码Phanerochaete chrysosporium来源锰过氧化物酶PhcMnP的基因(NCBI编号为L29039.1)，并在5'端和3'端分别引入BgIⅡ和SalⅠ限制性酶切位点。用BgIⅡ和SalⅠ限制性酶对合成的基因片段进行双酶切，将酶切后的片段克隆到pKLAC1表达载体上，构建的重组质粒命名为pKLAC1-PhcMnP。
将合成的pKLAC1-PhcMnP重组质粒转入E.coli DH5α感受态细胞中，将得到的重组菌命名为E.coli DH5α/pKLAC1-PhcMnP。挑取转化子单菌落接入LB(含100.0μg/mL氨苄青霉素)液体培养基过夜培养(12-16h)后，抽提质粒，用BgIⅡ和SalⅠ限制性酶双酶切后，进行1.0％琼脂糖凝胶电泳验证，将验证成功后的质粒送测序，保存测序结果正确的质粒。
利用SacⅡ限制性内切酶将重组质粒pKLAC1-PhcMnP线性化，通过电脉冲转入到食品安全级宿主乳酸克鲁维酵母GG799中。电脉冲仪参数设置：1.5kV，电击1次，点击时间约为5.4ms。电击完毕立即加入1.0mL预冷的1.0mol/L山梨糖醇吹吸，30℃复苏2h后，4000rpm离心收集菌体，用100.0μL的1.0mol/L山梨糖醇重悬菌体，均匀涂布在含有5.0mmol/L乙酰胺的YCB平板上30℃培养3天。挑取生长良好的阳性转化子单菌落到5.0mL YPD试管中30℃，200rpm过夜培养(12-16h)，离心收集菌体后抽提重组菌基因组，作为PCR验证的模板，PCR验证成功的重组菌命名为重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-MnP。
上下游引物Primer-F和Primer-R如下：
Primer-F：5’-GCTAGATCTATGAGAACTAGATCAACTATTTCTACACCAAATGG-3’；
Primer-R：5’-CCGTCGACATGATGGTGATGATGATGCAAATG-3’。
PCR反应体系及程序见表3。
表3 PCR验证反应体系及程序
实施例2食品安全级菌株重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP的发酵培养
将实施例1中得到的食品安全级菌株重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP接种于YPD试管培养基中，在30℃，200rpm下培养18h后以1％接种量(V/V)转接至YPG诱导培养基中，30℃，200rpm恒温发酵72h产酶。发酵结束后，4℃，8000rpm离心，收集上清液。
菌体沉淀用1mmol/L pH 7.4的PBS缓冲液洗涤两次，然后重悬至OD600至2.5，冰水浴超声破碎细胞。细胞破碎条件：功率600W(60％)，每超声2s停4s，总计超声时长30min。
分别用乳酸克鲁维酵母GG799和重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP的发酵培养物无细胞提取液、细胞破碎沉淀物、发酵上清液共6个样本进行蛋白质电泳，以检验重组菌表达PhcMnP结果。其中，乳酸克鲁维酵母GG799的3个样本作为阴性对照。电泳结果见图1，泳道4和泳道5显示在70kDa处有一条比理论分子量偏大的条带，是目的蛋白质经过糖基化的结果。其中，泳道1是乳酸克鲁维酵母GG799的发酵培养物无细胞提取液；泳道2是乳酸克鲁维酵母GG799的细胞破碎沉淀物；泳道3是乳酸克鲁维酵母GG799的发酵上清液；泳道4是重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP的发酵培养物无细胞提取液；泳道5是重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP的细胞破碎沉淀物；泳道6是重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP的发酵上清液。
实施例3利用重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP的发酵上清液降解黄曲霉毒素B1
利用重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP的发酵上清液降解黄曲霉毒素B1的反应条件为：pH 4.5，40℃下反应40h。反应体系中黄曲霉毒素B1浓度为2.0μg/mL，MnSO4浓度为1.2mmol/L，发酵上清液蛋白质浓度为3.0mg/mL，葡萄糖添加量为2.5mmol/L，葡萄糖氧化酶添加量为1.5U/mL。反应结束后，80℃水浴10min灭酶，且用截留分子量3kDa的超滤离心管4℃，4000rpm离心去除大分子蛋白，过0.22μm滤膜后通过UPLC-TQD分析剩余黄曲霉毒素B1的含量。经UPLC-TQD检测，剩余黄曲霉毒素B1浓度为485.9ng/mL，重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP的发酵上清液对黄曲霉毒素B1降解率达75.7％。
对比例1 Phanerochaete sordida来源的锰过氧化物酶在乳酸克鲁维酵母GG799中异源表达产物对黄曲霉毒素B1的降解
本实验室以Phanerochaete sordida基因组DNA为模板，设计引物进行PCR扩增，获得编码Phanerochaete sordida来源的锰过氧化物酶的基因(NCBI Gene-ID:AB078604)，并以此基因为目的基因，构建了以乳酸克鲁维酵母GG799为宿主菌、以pKLAC1为载体的食品安全级重组表达菌株。该重组表达菌株的构建、转化、验证步骤以及毒素降解反应方法和条件、检测方法和条件与实施例1-3中完全一致。在实施例3所述的反应方法和条件下，发酵上清液对黄曲霉毒素B1的降解效率为45.34％。
对比例2 Pleurotus ostreatus来源的锰过氧化物酶在乳酸克鲁维酵母GG799中异源表达产物对黄曲霉毒素B1的降解
本实验室以Pleurotus ostreatus基因组DNA为模板，设计引物进行PCR扩增获得编码Pleurotus ostreatus来源的锰过氧化物酶的基因(NCBI Gene-ID:AB698450.1)，并以此基因为目的基因，构建了以乳酸克鲁维酵母GG799为宿主菌、以pKLAC1为载体的食品安全级重组表达菌株。该重组表达菌株的构建、转化、验证步骤以及毒素降解反应方法和条件、检测方法和条件与实施例1-3中完全一致。在实施例3所述的反应方法和条件下，发酵上清液对黄曲霉毒素B1的降解效率为56.11％。
综上所述，本发明将来源于Phanerochaete chrysosporium的锰过氧化物酶在乳酸克鲁维酵母GG799中成功实现异源表达，得到食品安全级菌株重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP，且锰过氧化物酶直接分泌到重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP的发酵上清液中，利用该发酵上清液降解黄曲霉毒素B1的反应体系为黄曲霉毒素B1浓度为2.0μg/mL，MnSO4浓度为1.2mmol/L，发酵上清液蛋白质浓度为3.0mg/mL，葡萄糖添加量为2.5mmol/L，葡萄糖氧化酶添加量为1.5U/mL，反应条件为pH 4.5，温度40℃，40h时，对黄曲霉毒素B1的降解率达到75.7％。然而，在相同表达体系和相同反应体系及条件下，对比例1中来源于Phanerochaete sordida的锰过氧化物酶对黄曲霉毒素B1的降解率(45.34％)和对比例2中来源于Pleurotus ostreatus的锰过氧化物酶对黄曲霉毒素B1的降解率(56.11％)明显低于来源于Phanerochaete chrysosporium的锰过氧化物酶对黄曲霉毒素B1的降解率(75.7％)。因此，本发明提供的来源Phanerochaete chrysosporium的锰过氧化物酶对于黄曲霉毒素B1的降解效果更好，研究及应用价值更高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种能降解黄曲霉毒素B1的锰过氧化物酶及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctagatcta tgagaactag atcaactatt tctacaccaa atgg 44
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccgtcgacat gatggtgatg atgatgcaaa tg 32
Claims (10)
1.一种锰过氧化物酶在降解黄曲霉毒素B1中的应用，其特征在于，所述锰过氧化物酶是(a)或(b)：
(a)具有NCBI Protein-ID为AAA33745.1的氨基酸序列的蛋白质；
(b)或者，在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有锰过氧化物酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述降解是在pH 3.0～pH 5.5，25℃～45℃下反应30h～60h。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述降解的反应体系中，MnSO4浓度为0.25μmol/μg～1.75μmol/μg黄曲霉毒素B1，锰过氧化物酶的添加量为1.0mg/μg～4.0mg/μg黄曲霉毒素B1，葡萄糖的添加量为0.5μmol/μg～3.0μmol/μg黄曲霉毒素B1，葡萄糖氧化酶的添加量为0.25U/μg～1.5U/μg黄曲霉毒素B1。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述锰过氧化物酶包括表达锰过氧化物酶的细胞发酵所得的含锰过氧化物酶的发酵上清液。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细胞的宿主包括食品安全级宿主乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述表达锰过氧化物酶的细胞包括重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP，所述重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP是以食品安全级宿主乳酸克鲁维酵母GG799为表达宿主，以食品安全级质粒pKLAC1质粒为表达载体，表达锰过氧化物酶的重组菌。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵上清液是将重组乳酸克鲁维酵母GG799/pKLAC1-PhcMnP接种于YPD培养基中，在28℃～32℃，200rpm～220rpm下培养15h～20h后以1％～5％接种量转接至YPG培养基中，在28℃～32℃，200rpm～220rpm恒温发酵60h～80h；发酵结束后，离心，收集上清液得到的发酵上清液。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括用于降解食品、谷物或饲料中的黄曲霉毒素B1。
9.一种重组乳酸克鲁维酵母，其特征在于，所述重组乳酸克鲁维酵母表达锰过氧化物酶；所述锰过氧化物酶是(a)或(b)：
(a)具有NCBI Protein-ID为AAA33745.1的氨基酸序列的蛋白质；
(b)或者，在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有锰过氧化物酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
10.根据权利要求9所述的重组乳酸克鲁维酵母，其特征在于，所述重组乳酸克鲁维酵母以食品安全级宿主乳酸克鲁维酵母GG799为表达宿主，以食品安全级质粒pKLAC1质粒为表达载体。
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