CN111139275B

CN111139275B - 一种改进的利用酵母制备贻贝寡糖的方法

Info

Publication number: CN111139275B
Application number: CN201911415088.2A
Authority: CN
Inventors: 张金华; 刁梦奇; 袁超; 刘飞; 张林军; 邵华荣; 张晓元; 陈勉; 张兆倩; 凌沛学
Original assignee: Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences
Current assignee: Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2021-12-21
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN111139275A

Abstract

本发明提供了一种改进的利用酵母制备贻贝寡糖的方法，所述方法包括如下步骤：(1)提供能够分泌淀粉酶的酵母；(2)利用贻贝多糖对步骤(1)的酵母进行培养；(3)培养完毕后，去除酵母、未降解的贻贝多糖和蛋白，即可得贻贝寡糖。本发明的方法与原有的工艺相比可以缩短时间、减少成本、提高产率。

Description

一种改进的利用酵母制备贻贝寡糖的方法

技术领域

本发明涉及一种寡糖的制备方法，尤其涉及一种贻贝寡糖的制备方法。

背景技术

贻贝，又名海红，味道鲜美，营养丰富，是海洋贝类养殖中的重要种类。除食用外，贻贝干品还是一种重要的药材，具有补肾壮阳，益精养血，消瘿散结等功能。现代研究表明，贻贝肉含有大量蛋白质和多糖，其中多糖具有降1血脂、预防心脑血管疾病、提高免疫力、抗肿瘤等功效。

申请人在申请号为201710351379.4的发明专利中提供了一种贻贝多糖的结构，并通过实验证明该多糖具有显著的降血脂功效。申请人在申请号为201710550343.9的发明专利申请中提供了一种贻贝寡糖的制备方法，并通过实验证明该寡糖混合物能显著降低高血脂大鼠血清中甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的水平。申请号为201710550343.9的发明专利申请中提供的方法虽然可以制得贻贝寡糖，主要包括的步骤为：用α-淀粉酶降解贻贝多糖为贻贝寡糖；用酵母菌除去降解产生的葡萄糖、麦芽糖；用活性炭吸附寡糖，低浓度乙醇洗去杂质，高浓度乙醇洗脱寡糖。申请号为201710550343.9的发明专利申请中提供的方法虽然可以制得贻贝寡糖，但寡糖得率较低，迫切需要对现有工艺进行改进，提高寡糖得率，减少寡糖成分。

发明内容

本发明提供了一种制备贻贝寡糖的方法，所述方法包括利用能够分泌淀粉酶的酵母对贻贝多糖进行处理的步骤。

具体的，所述方法包括利用贻贝多糖和能够分泌淀粉酶的酵母进行发酵培养，培养完毕后，除去酵母、未降解的贻贝多糖和蛋白，即可得贻贝寡糖。

酵母的去除可以采用过滤或离心的方式进行去除；比如，采用滤膜过滤去除酵母。

未降解的贻贝多糖可以采用醇沉的方式进行去除，例如，采用乙醇沉淀的方式，采用95％乙醇使未降解贻贝多糖沉淀，然后再除去沉淀；另外，还可以采用盐析的方式去除未降解的贻贝多糖。

蛋白的去除可以采用超滤的方式进行去除，比如，采用截留分子量为2000Da-5000Da的超滤膜进行超滤；另外，也可以采用凝胶层析的方式去除。

上述能够分泌淀粉酶的酵母可以是重组的能够分泌淀粉酶的酵母，也可以是经诱变筛选或驯化的能够分泌淀粉酶的酵母。

在一个实施方式中，将淀粉酶重组到酵母中得到能够分泌淀粉酶的酵母，所述酵母选自酿酒酵母、毕赤酵母等；所述淀粉酶可以是本领域公知的淀粉酶，也可以是SEQ IDNo.1所编码的淀粉酶。

在构建上述重组酵母时，可以将淀粉酶编码基因整合到酵母的基因组上，也可以采用重组质粒的方式将淀粉酶编码基因转入酵母菌中，在一个实施方式中，所述重组质粒是适于酵母表达***的表达质粒，例如，pGAPZα-A。

所述利用贻贝多糖和能够分泌淀粉酶的酵母进行发酵培养，可以采用本领域常规的方法对酵母进行培养，例如，在25℃-35℃的条件下，摇床培养；所述贻贝多糖的质量浓度为0.1％-10％，优选，0.5％-5％。

所述贻贝多糖优选为冻煮厚壳贻贝干经水提醇沉法制备得到的贻贝多糖。

在优选的实施例中，本发明的方法包括利用质量浓度为1％的贻贝多糖溶液培养能够分泌淀粉酶的酵母，培养完毕后，培养液用滤膜过滤除去酵母细胞，得到滤过液I。滤过液I中加入3倍体积95％乙醇使未降解贻贝多糖沉淀，过滤除去沉淀，得滤过液II。用旋转蒸发仪对滤过液II进行浓缩，浓缩液经滤膜过滤后，用截留分子量3000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集透过液，即为贻贝寡糖溶液。

本发明专利为专利CN201710550343.9所述技术方案的改进，本发明的技术方案具有以下有益效果：1、缩短时间：原工艺包括酶解和酵母除副产物2个步骤，新工艺2个步骤同时进行；2、减少成本：减少了淀粉酶的成本以及酶解反应所需的加热、过滤等成本；3、提高产率：酵母菌产生的重组淀粉酶水解贻贝多糖产生贻贝寡糖和葡萄糖、麦芽糖等副产物，产生的葡萄糖和麦芽糖可迅速被酵母菌利用，副产物的减少会进一步促进水解反应的进行，使酶解更彻底。

附图说明

图1.标准品液相色谱图，1：葡萄糖；2：麦芽糖；3：麦芽三糖。

图2.本发明制备贻贝寡糖的液相色谱图。

实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1：重组毕赤酵母构建

根据GenbankAccessionNo.KJ741397所述来源于青霉菌(Penicillium sp.)的低温淀粉酶核苷酸序列进行密码子优化，使其更易于在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达，优化后的低温淀粉酶基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。根据SEQ ID No.1所述序列进行低温淀粉酶全基因合成。合成得到的低温淀粉酶基因amy的核苷酸序列全长1488bp，是一个完整的ORF，编码495个氨基酸。

根据SEQ ID No.1所示序列设计引物amy-F和amy-R，分别引入能***pGAPZα-A质粒(购自美国Invitrogen公司)的EcoRI、XbaI酶切位点(下划线所示)，序列如下：

amy-F：5’-GCGGAATTCATGGTCTTGGCTAGATTGGCT-3’(SEQ ID NO.2)；amy-R：5’-GCGTCTAGAAGAAGAACACAAAGCGGAA-3’(SEQ ID NO.3)。

以合成的amy基因为模板，采用上述引物进行PCR扩增。PCR总体系为50μL，其中超纯水18μL、10×LAtaqbuffer(含MgCl₂)5μL、dNTP(各2.5mmol/L)4μL、引物(20μmol/L)各1μL、模板DNA2ng，TaKaRa LATaq酶2.5U。PCR扩增条件：95℃预变性5分钟，反应30个循环(95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸6.5分钟)，30个循环结束后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪检测，用Omega凝胶回收试剂盒进行PCR片段切胶回收。PCR产物回收后加EcoRI、XbaI(NEB，USA)于37℃酶切1小时，进行DNA纯化，采用同样酶切方法处理pGAPZα-A质粒载体。将制备好的酶基因片段与pGAPZα-A载体按一定比例混合，采用T4连接酶(NEB，USA)于16℃连接18小时，然后采用CaCl₂转化法转化宿主菌大肠杆菌Top10，转化菌液涂布zeocin(25μg/mL)抗性低盐LB平板，37℃过夜培养。挑取生长良好的单菌落至低盐LB液体培养基中37℃培养10小时，提取质粒，通过酶切法和PCR法验证阳性转化子，得到重组质粒pGAPZα-amy。

将上述重组质粒pGAPZα-amy用AvrII内切酶(NEB，USA)于37℃酶切1小时，进行DNA纯化。然后将线性化的pGAPZα-amy采用电转化方法转化宿主毕赤酵母SMD 1168H，转化菌液涂布zeocin(100μg/mL)抗性YPD平板，30℃培养3天。挑取生长良好的单菌落至YPD液体培养基中30℃培养3天，提取基因组，通过PCR法验证阳性转化子，得到重组毕赤酵母SMD 1168H-amy。

实施例2：重组毕赤酵母制备贻贝寡糖

将上述在zeocin抗性YPD平板中生长良好的毕赤酵母重组菌接种于200mL YPD培养液，28℃培养20h。发酵液离心收集菌体，纯水洗菌体3次，用200mL质量浓度为1％的贻贝多糖溶液重悬菌体并于28℃摇床振荡培养5h，摇床转速200r/min。培养液用4.5μm滤膜过滤除去酵母细胞，得到滤过液I。滤过液I中加入3倍体积95％乙醇使未降解贻贝多糖沉淀，过滤除去沉淀，得滤过液II。用旋转蒸发仪对滤过液II进行浓缩，浓缩温度50℃。浓缩液经0.22μm滤膜过滤后，用截留分子量3000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集透过液，即为贻贝寡糖溶液。将贻贝寡糖溶液进行冷冻干燥，得到贻贝寡糖。用HPLC法对贻贝寡糖进行检测，结果如附图1和图2所示，可以看出制备得到的贻贝寡糖是一种混合物，且不含有葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖成分。

上述YPD培养液成分：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L，自然pH，115℃灭菌30分钟。其中葡萄糖单独配制灭菌，115℃灭菌30分钟，取出后与其他成分混合。

上述贻贝多糖为冻煮厚壳贻贝干经水提醇沉法制备得到。

上述HPLC法所用色谱柱为FUJI NH-SG(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为乙腈-水(65:35)，流速1.0mL/min，柱温30℃，示差检测器。

对比例：

同时利用专利CN201710550343.9所述方法和本专利方法进行贻贝寡糖制备。将2种方法制备得到的贻贝寡糖分别进行称重，根据公式(贻贝寡糖质量/使用的贻贝多糖质量×100％)计算贻贝寡糖得率。经计算，使用原工艺制备贻贝寡糖，得率为0.59％；使用本专利方法制备贻贝寡糖，得率为1.87％，是原工艺的3.17倍。

序列表

<110> 山东省药学科学院

<120> 一种改进的利用酵母制备贻贝寡糖的方法

<130> JH-CNP191874

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1488

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atggtcttgg ctagattggc ttggttggct ggtttggttt ccactgctat tgctgctact 60

ccagctgaat ggcgttctca gtctatctac ttcatgctga ctgacagatt cgccagaact 120

gacggttcta ctactgctgc ttgtgacact gctgacagaa agtactgtgg tggtacttgg 180

cagggtatca tcgacaagtt ggactacatc caaggtatgg gtttcaccgc tatctggatc 240

actccagtta ctggtcaatt gtccggtgag actgcttacg gtgatgctta ccatggttac 300

tggcagcagg atatctactc cttggactcc aactacggta ctgctggtga tttgaaggct 360

ttggctgctg ccttgcacaa gagaaacatg tacttgatgg ttgacgtcgt cgccaaccac 420

atgggttata atggtgctgg tgctgacgtt gactacacca agtttaaccc attcaacgag 480

gccaagtact tccactccta ctgtccaatc actgactaca acgacgacac tatgtcccag 540

aactgttggt tgggtgacaa caaggtttcc ttgccagact tgaacaccca gtccaaagag 600

gttcaagacc tttggtacga ctgggtcggt tccttggttt ctaactactc catcgacggt 660

ctgagagtgg acactgttaa gcacgttcag aaggatttct ggccaggtta caacaaggct 720

gccggtgttt actgtgttgg tgagattttg gatggtgacc cagactacac ctgtccatac 780

caagaggtta tggacggtgt cctgaactac ccaatctact accctttgct gaaggccttt 840

caatccactt ccggttccat gaccgacctg tacaacatga tcaacaccgt caagtccacc 900

tgtaaggact ccactttgct gggtaacttt ttggagaacc acgacaaccc aagattcgct 960

cacgctactg atgacattgc tttggctaag aacgctgcca ccttcactat tatggctgac 1020

ggtatcccaa tcgtctacgc tggtcaagaa caacactgtt ctggtggtga agatccagct 1080

aacagagaag ctttgtggct gtccggatac aacactgact ctgagttgta caagttgatc 1140

gccaaggcta acggtgctag aaaccaggct attgctaagt ccaccaacta caccatctac 1200

cagaaccatc caatctacaa ggacgagtcc actatcgcca tgagaaaggg ttttgacggt 1260

ggtcagacta tcaccgtctt gactaatctt ggtgccggtg gtaaagagta ctccgtttct 1320

attccagaca ccggttttaa ggctggtgcc aagttgactg aggttgtttc ctgtacttcc 1380

gttaccgttg gtgactctgg tgaagtttct gttccaatgg ctggtggtgc tccaaagatc 1440

ttgttgccaa ctcctttgtt ggagggttcc gctttgtgtt cttcttag 1488

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gcggaattca tggtcttggc tagattggct 30

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gcgtctagaa gaagaacaca aagcggaa 28

Claims

1.一种改进的利用酵母制备贻贝寡糖的方法，所述方法包括如下步骤：

（1）提供能够分泌淀粉酶的酵母，所述能够分泌淀粉酶的酵母为重组淀粉酶的重组酵母，所述重组酵母是将重组了淀粉酶基因的重组质粒转入酵母中从而得到重组淀粉酶的重组酵母或者将淀粉酶基因整合到酵母基因组中从而得到重组淀粉酶的重组酵母，所述淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）利用贻贝多糖对步骤(1)的酵母进行培养；

（3）培养完毕后，去除酵母、未降解的贻贝多糖和蛋白，即可得贻贝寡糖；所述酵母为毕赤酵母。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤 (2)贻贝多糖的质量浓度为0.1％-10％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)，采用过滤或离心的方式去除酵母。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)，采用醇沉或盐析的方式去除未降解的贻贝多糖。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)，采用超滤或凝胶层析的方式去除蛋白。