CN111118195B - 一种抗草铵膦牛筋草种群的突变位点、引物及检测方法和应用 - Google Patents
一种抗草铵膦牛筋草种群的突变位点、引物及检测方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗草铵膦牛筋草种群的突变位点，所述突变位点位于从草铵膦敏感型牛筋草中克隆的靶标酶谷氨酰胺合成酶基因EiGS1‑S的如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第175位，发生的突变为A‑G。本发明还公开了用于检测抗草铵膦牛筋草种群基因突变位点的dCAPs引物，以及抗草铵膦牛筋草种群的检测方法和上述引物在制备用于检测抗草铵膦牛筋草种群的试剂盒或生物制剂中的应用。
Description
技术领域
本发明属于抗草铵膦牛筋检测技术领域，具体涉及一种抗草铵膦牛筋草种群的突变位点、引物及检测方法和应用。
背景技术
草铵膦(glufosinate ammonium，phosphinothricin)是由原德国艾格福公司(后归属拜耳公司)在20世纪80年代开发成功的一种广谱触杀型灭生性除草剂。草铵膦属于膦酸类除草剂，能够抑制植物氮代谢途径中的谷氨酰胺合成酶，从而干扰植物的代谢，使植物死亡。草铵膦、草甘膦和百草枯并称全球三大广谱灭生性除草剂,其中草甘膦产销量居首，但由于其抗性种群持续增多，导致草甘膦全球销售增长率近5年连续下滑；百草枯则因为毒性大，我国于2016年起禁用百草枯水剂。得益于草甘膦抗性杂草治理需求和填补百草枯禁用的市场空白，且在抗草铵膦转基因作物大面积推广的促动下，近年来国内外草铵膦产销量呈持续高增长之势，成为草甘膦之后，国际排名第二的非选择性茎叶处理除草剂，但随着草铵膦广泛且持续的使用，杂草对草铵膦抗性进化的风险也在增加。
牛筋草：是二倍体(2n＝36)的禾本科杂草，由于其生长快，种子量大，种群密度高，是我国乃至全球作物田十大恶性杂草之一。抗草甘膦和百草枯牛筋草已在我国南方地区泛滥成灾，严重危害水稻、玉米、蔬菜、果树等作物种植，对当地农业生产和生态环境造成严重影响。自2009年起，南方地区广大作物种植户逐步使用草铵膦防控草甘膦和百草枯抗性牛筋草，抗性种群得到有效的控制，但近年来草铵膦的田间防效开始下降。若抗草铵膦牛筋草种群在我国南方地去爆发成灾，必将严重威胁该地区农作物的安全生产。生产中急需储备抗草铵膦牛筋草的科学防控技术，其中抗性杂草快速检测技术的需求尤为迫切。
草铵膦的靶标酶是草铵膦靶标酶谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthesis,GS)，GS是植物氮代谢过程中一种重要的解毒酶,可解除由硝酸盐还原、氨基酸降解及光呼吸中释放出的铵的毒性，GS被草铵膦抑制后，导致植物氮代谢紊乱，铵离子积累，从而破坏植物细胞膜，最终植物光合作用受阻而枯死。GS根据亚细胞定位不同分为胞质型GS1和质体型GS2，本发明涉及的牛筋草GS基因为胞质型，因此，将从草铵膦敏感型和抗型牛筋草中克隆的GS1基因分别命名为EiGS1-S和EiGS1-R。
杂草对除草剂的抗药性分为1)基于除草剂靶标酶突变或过表达的靶标分子机理和2)基于吸收、转运和代谢的非靶标抗性机理两种。目前全球仅发现牛筋草和黑麦草两种杂草的少数几个种群对草铵膦产生了抗性，其抗药性机理还处在原始资料积累阶段。基于靶标基因GS的分子机理研究鲜有研究，尚无基于靶基因GS分子特征的快速检测技术。目前抗草铵膦杂草的鉴定主要通过室内盆栽生测法测定，方法包括田间采样、种子收集、室内培育、茎叶喷雾、生物测定等步骤，周期为2个月左右，费时费工。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗草铵膦牛筋草种群的突变位点。
本发明的目的还在于提供上述用于检测上述突变位点的dCAPs引物。
本发明的第三个目的在于提供一种抗草铵膦牛筋草种群的检测方法。
本发明的最后一个目的在于提供上述引物在制备用于检测抗草铵膦牛筋草种群的试剂盒或生物制剂中的应用。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种抗草铵膦牛筋草种群的突变位点，所述突变位点位于从草铵膦敏感型牛筋草中克隆的靶标酶谷氨酰胺合成酶基因EiGS1-S的如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第175位，发生的突变为A-G。
同时，该突变导致其编码蛋白的第59位氨基酸由丝氨酸(Ser)突变为甘氨(Gly)。
本申请中赋予牛筋草对草铵膦产生抗药性的靶标酶谷氨酰胺合成酶基因EiGS1-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，与其对应的敏感型草铵膦牛筋草种群靶标酶谷氨酰胺合成酶基因(EiGS1-S)的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，抗草铵膦牛筋草种群靶标酶谷氨酰胺合成酶基因EiGS1-R中，在EiGS1-S的第175位存在分子突变特征A-G。
可以通过以下步骤来获取该突变位点：
(1.1)选取抗型草铵膦牛筋草种群和敏感型草铵膦牛筋草种群，分别提取总RNA，并反转录成cDNA；
(1.2)采用上游引物GS1-F(碱基序列如SEQ ID NO：5所示)和下游引物GS1-R(碱基序列如SEQ ID NO：6所示)，以(1.1)中cDNA为模板，克隆EiGS1-R和EiGS1-S基因蛋白编码序列；
(1.3)测序获得gEiGS1-R(SEQ ID NO：4)和gEiGS1-S(SEQ ID NO：3)基因全序列，由测序公司完成；
(1.4)采用核酸序列比对软件(DNAStar、DNAMAN等)分析比对序列差异，获得突变位点。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种检测上述突变位点的dCAPs引物，该引物包括上游引物dCaps-GS1-F和下游引物dCaps-GS1-R，所述上游引物dCaps-GS1-F的碱基序列如SEQ ID NO：7所示，所述下游引物dCaps-GS1-R的碱基序列如SEQID NO：8所示。
该引物特异性强，能检测到抗草铵膦牛筋草种群中谷氨酰胺合成酶基因的A-175-G(在第175位由A突变为G)位点突变。
该引物可通过以下方法获得：以牛筋草谷氨酰胺合成酶GS1基因组序列为模板，包括以下步骤：
(2.1)选取草铵膦抗型和敏感型牛筋草种群，提取其基因组DNA(gDNA)；
(2.2)采用上游引物GS1-F(SEQ ID NO：5)和下游引物GS1-R(SEQ ID NO：6)，以牛筋草gDNA为模板，克隆EiGS1-R和EiGS1-S基因的基因组序列gEiGS1-R和gEiGS1-S；
(2.3)测序获得gEiGS1-R(SEQ ID NO：4)和gEiGS1-S基因全序列(SEQ ID NO：3)，由测序公司完成；
(2.4)根据gEiGS1-R和gEiGS1-S基因序列，设计引物，该引物包括上游引物dCaps-GS1-F和下游引物dCaps-GS1-R，所述上游引物dCaps-GS1-F的碱基序列如SEQ ID NO：7所示，所述下游引物dCaps-GS1-R的碱基序列如SEQ ID NO：8所示。
具体的，获得的dCAPs引物的碱基如下：
dCaps-GS1-F：GTCATCCACTGAGCTGTTATTTGGC(SEQ ID NO：7)
dCaps-GS1-R：TCCTCGCCGGGAGCTTGGCCGGTAC(SEQ ID NO：8)。
本发明的上述第三个目的可以通过以下技术方案来实现：一种抗草铵膦牛筋草种群的检测方法，包括以下步骤：
(1)选取待测牛筋草种群样品和敏感型草铵膦牛筋草种群，提取其基因组gDNA；
(2)根据抗草铵膦牛筋草种群中靶标酶谷氨酰胺合成酶基因EiGS1-S的第175位核苷酸由A突变为G，设计上述的特异性酶切位点KpnI-HF的dCAPs引物，用以扩增突变位点前后约200bp的核酸片段；
(3)利用该dCAPs引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；
(4)用核酸内切酶KpnⅠ-HF酶切PCR产物；
(5)将酶切PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，根据电泳结果鉴定待测样品是否为在第175位具有A-G突变的抗草铵膦突变位点的牛筋草种群；若待测牛筋草种群样品中EiGS1基因核酸序列在第175位发生A-G突变，则会被KpnⅠ-HF切掉部分片段，与未发生突变的EiGS1片段相比，电泳时会跑的较快，电泳位置在未被酶切的片段的下方，从而达到快速鉴定的目的。
该方法基于分子生物学方法检测，简便、快速、省时省力、灵敏度高，准确度高。
在上述基于基因突变的抗草铵膦牛筋草种群的检测方法中：
优选的，步骤(2)中PCR反应体系如下：2×PCR Buffer 12.5μL，10μM的dCaps-GS1-F(10μM)和dCaps-GS1-R(10μM)引物各1μL,牛筋草gDNA2μL(约100ng)，加入8.5μL无菌蒸馏水至反应体系为25μL。
优选的，步骤(2)中PCR程序如下：95℃4min，94℃30s，58℃30s，72℃30s 40个循环，最后72℃延伸7min，4℃短时间保存，如长期保存，则取出后放于-20℃。
优选的，步骤(3)中KpnⅠ-HF酶切时反应体系如下：10×NEB.Custmer Buffer3μL，KpnⅠ-HF 1μL，步骤(3)PCR扩增产物15μL，ddH2O 11μL，总体积30μL。
优选的，步骤(4)中琼脂糖凝胶电泳为质量百分含量为2％的琼脂糖凝胶。
本发明的上述最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：上述的引物在制备用于检测抗草铵膦牛筋草种群的试剂盒或生物制剂中的应用。
本发明提供的快速检测抗草铵膦牛筋草种群的分子生物学方法，具有灵敏度高，特异性强等特点，与传统技术相比，本发明的有益结果是：
(1)简便易行：该检测方法通过分子生物学技术手段进行试验，无需进行培养材料、药剂筛选、测定抗性指数等传统检测步骤，可直接取材待测种群叶片用该方法比对酶切后的扩增条带，快速进行鉴定；
(2)检测高效：本发明与传统药剂筛选抗性牛筋草种群相比，不需要培养材料、喷施农药、称取干重或湿重、计算抗性指数等繁琐过程，使检测时间大大缩短，全过程仅需要1天即可完成检测；
(3)灵敏度高：该方法能检测到牛筋草种群中草铵膦靶标酶谷氨酰胺合成酶基因的A-175-G突变；
(4)准确度高：该检测方法所检测的突变位点在敏感与抗性牛筋草种群基因中区别明显，检测准确性高；
(5)特异性强：酶具有专一性，一种酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，根据该突变位点设计的内切酶可对相应的DNA片段进行定向切割；
(6)本发明是国内外首次运用分子生物学技术进行抗草铵膦牛筋草种群分子检测，这种方法快速简便，可操作性强，对指导农民正确科学用药，以及降低成本和减少环境污染具有重要的现实意义。
附图说明
图1是实施例1中3个草铵膦敏感型牛筋草种群(S1、S2和S3)中EiGS1-S序列(SEQID NO：3)和1个草铵膦抗性牛筋草种群(R1)中EiGS1-R序列(SEQ ID NO：4)突变位点比对结果。(A)EiGS1-S和EiGS1-R核酸序列突变位点附近序列比对结果；(B)EiGS1-S和EiGS1-R部分测序峰图(突变位点用方框标出)；(C)EiGS1-S和EiGS1-R蛋白序列比对结果；
图2是实施例3检测抗草铵膦牛筋草种群以及草铵膦敏感型牛筋草种群中GS1基因A-175-G突变的电泳分析结果；
图3是实施例4检测3个抗草铵膦牛筋草种群和3个草铵膦敏感型牛筋草种群GS1基因A-175-G突变的电泳分析结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的应用方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生试剂原料，使用的实验仪器均为实验室常规仪器，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。
实施例1
本实施例提供的草铵膦抗型和敏感型牛筋草谷氨酰胺合成酶基因EiGS1-R和EiGS1-S克隆以及发现EiGS1-R基因A-175-G突变特征的步骤如下：
(1.1)牛筋草RNA提取，取3个草铵膦敏感型牛筋草种群(10年前，在从未施用过草铵膦的农田采集、扩繁后保存于本实验室，可向公众发放用于验证试验。)和1个草铵膦抗性牛筋草种群(从长期施用草铵膦的农田采集筛选，且在本实验室有保存，可向公众发放用于验证试验)叶片材料(每个草铵膦敏感型牛筋草材料各取3株植株，共9株，草铵膦抗性牛筋草种群材料取6个植株)，分别提取RNA，提取步骤如EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)所述；
(1.2)分别取2μg RNA反转录成cDNA，反应体系如下：Total RNA12μL，4×gDNAEraser Mix 1μL，加去离子无菌水补充到总体积16μL，37℃孵育5min后，再加入4μL 5×TRUE RT Master MixⅡ，42℃孵育20min，85℃加热5min后，4℃保存备用。
(1.3)牛筋草谷氨酰胺合成酶基因GS1扩增，采用GS1-F(SEQ ID NO：5所示)和GS1-R引物(SEQ ID NO：6所示)，分别从草铵膦抗型和敏感型牛筋草cDNA中克隆出谷氨酰胺合成酶基因EiGS1-R和EiGS1-S核酸片段，PCR产物送测序公司测序，获得相应的核苷酸序列，分别如GS1-R SEQ ID NO：4(EiGS1-R)和SEQ ID NO：3(EiGS1-S)所示。
(1.4)采用DNAStar软件的MegAlign程序，比较EiGS1-R和EiGS1-S序列差异，获得变异位点。
结果如图1中所示，与敏感型牛筋草中谷氨酰胺合成酶基因EiGS1-S核酸序列(cDNA)相比，在抗草铵膦牛筋草种群中草铵膦靶标酶谷氨酰胺合成酶EiGS1-R基因核苷酸序列(cDNA)的第175位碱基由A突变为G(A-175-G)，进而导致其编码蛋白的第59位氨基酸发生Ser-59-Gly突变(第59位由Ser突变为Gly，突变前抗草铵膦牛筋草种群中草铵膦靶标酶谷氨酰胺合成酶GS的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，突变后如SEQ ID NO：2所示)。
具体的(1.3)中引物碱基序列如下：
GS1-F：ATGGCCTCCCTCACCGACCTCA(SEQ ID NO：5所示)。
GS1-R：TCAAGGCTTCCAGATGATGGTG(SEQ ID NO：6所示)。
步骤(1.3)中PCR反应体系如下：2×PCR Buffer 12.5μL，10μM的GS1-F(10μM)和GS1-R(10μM)引物各1μL,牛筋草cDNA 2μL(约100ng)，加入8.5μL无菌蒸馏水至反应体系为25μL。
步骤(1.3)中PCR程序如下：95℃4min，94℃30s，57℃30s，72℃30s40个循环，最后72℃延伸7min，4℃短时间保存，如长期保存，则取出后放于-20℃。
步骤(1.3)中PCR产物用0.8％琼脂糖电泳后，切胶回收，回收方法参照凝胶纯化回收试剂盒所述(北京艾德莱生物科技有限公司)。
实施例2
用于检测抗草铵膦牛筋草种群A-175-G基因突变位点的dCAPs引物设计，步骤如下：
(2.1)取草铵膦抗型和敏感型牛筋草叶片，采用CTAB植物基因组提取法，分别获得草铵膦抗型和敏感型牛筋草基因组DNA(gDNA)；
(2.2)采用上游引物GS1-F(SEQ ID NO：5所示)和下游引物GS1-R(SEQ ID NO：6所示)，以牛筋草gDNA为模板，克隆EiGS1-R和EiGS1-S基因的基因组序列(分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：1所示)；PCR反应体系如下：2×PCR Buffer 12.5μL，10μM的GS1-F(10μM)和GS1-R(10μM)引物各1μL,牛筋草gDNA 2μL(约100ng)，加入8.5μL无菌蒸馏水至反应体系为25μL。
PCR程序如下：95℃4min，94℃30s，58℃30s，72℃30s 40个循环，最后72℃延伸7min，4℃短时间保存，如长期保存，则取出后放于-20℃。
(2.3)测序获得gEiGS1-R和gEiGS1-S基因全序列(分别如SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：3所示)，由测序公司完成；
(2.4)根据gEiGS1-R和gEiGS1-S基因序列，在A-175-G突变位点附近约200bp位置设计引物，该引物包括上游引物dCaps-GS1-F和下游引物dCaps-GS1-R，所述上游引物dCaps-GS1-F的碱基序列如SEQ ID NO：7所示，所述下游引物dCaps-GS1-R的碱基序列如SEQID NO：8所示。
具体的，该引物的碱基序列如下：
dCaps-GS1-F：GTCATCCACTGAGCTGTTATTTGGC(SEQ ID NO：7)。
dCaps-GS1-R：TCCTCGCCGGGAGCTTGGCCGGTAC(SEQ ID NO：8)。
实施例3
本实施例提供的抗草铵膦牛筋草种群的检测方法，包括以下步骤：
(3.1)提取草铵膦敏感型和抗型牛筋草(各取10个样)叶片的基因组DNA(gDNA)；
(3.2)采用实施例2中设计的引物dCaps-GS1-F和dCaps-GS1-R，以(3.1)的gDNA进行PCR扩增；PCR反应体系及其条件：2×PCR Buffer 12.5μL，10μM的dCaps-GS1-F(10μM)和dCaps-GS1-R(10μM)引物各1μL,牛筋草gDNA 2μL(约100ng)，加入8.5μL无菌蒸馏水至反应体系为25μL。
PCR程序如下：95℃4min，94℃30s，58℃30s，72℃30s 40个循环，最后72℃延伸7min，4℃短时间保存，如长期保存，则取出后放于-20℃。
(3.3)将(3.2)PCR产物酶切，KpnⅠ-HF酶切时反应体系如下：10×NEB.CustmerBuffer 3μL，KpnⅠ-HF 1μL，步骤(3)PCR扩增产物15μL，ddH2O11μL，总体积30μL。
(3.4)中琼脂糖凝胶电泳为质量百分含量为2％的琼脂糖凝胶。
电泳条件：缓冲液1×TAE、电压120V、时间1.5h。
(3.5)根据电泳结果鉴定待测样品是否为具有A-175-G突变的抗草铵膦突变位点的牛筋草种群；若牛筋草种群中GS基因核酸序列发生A-175-G突变，则会被KpnⅠ-HF切掉部分片段，与未发生突变的GS片段相比，电泳时会跑的较快，电泳位置在未被酶切的片段的下方(也可以描述为前方，图2中由于电泳图摆拍方向的原因，因此是位于下方)，从而达到快速鉴定的目的。
图2中的结果发现，10株草铵膦抗型牛筋草gDNA样品的扩增条带酶切后位置均在敏感型草铵膦牛筋草种群条带的下方。
因此，可以对待测牛筋草种群样品采用本申请中的方法进行检测是否为靶基因A-175-G突变型抗草铵膦牛筋草种群。
实施例4
将实施例2中的引物，以及实施例3中的PCR反应体系一起制成试剂盒，采用实施例3中的方法，来检测未知牛筋草样品是否具有抗草铵膦牛筋草种群位点突变。
取在广东地区采集的，已通过室内生测实验鉴定抗性水平的8牛筋草种群材料提取gDNA(6个敏感种群和2个抗型种群，每个种群取6株植株的叶片混合成一个样提取gDNA)，采用实施例3的方法鉴定其中GS1基因的175位核酸序列特征。经过检测发现(如图3所示)，8个样的电泳条带均为单一条带，草铵膦抗型样品中的酶切产物条带在敏感型样品的酶切产物条带的下方，也就是说6个草铵膦敏感种群中的36株敏感牛筋草植株均未发生A-175-G突变，2个草铵膦抗型牛筋草种群中的12个牛筋草植株均存在A-175-G突变，基因型与表型完全一致。
因此，本发明中设计的引物、检测方法和试剂盒、生物制剂等能准确、快速的检测出抗草铵膦的牛筋草种群，为科学研究和生产实践提供了一种简便、快速、成本低廉的检测技术，也为该抗性杂草的早期预警、流行监测及合理用药提供了理论基础和技术指导。
序列表
<110> 广东省农业科学院植物保护研究所
<120> 一种抗草铵膦牛筋草种群的突变位点、引物及检测方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1071
<212> DNA
<213> 靶标酶谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthesis)
<400> 1
atggcctccc tcaccgacct catcaacctc gacctctccg actccaccga gaagatcatc 60
gccgagtaca tatggatcgg tggatctggc atggacctca ggagcaaggc gaggaccctc 120
cccggcccgg tgagcgatcc cagcaagctg cccaagtgga actacgacgg ctccagcacc 180
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cttgagagga tcactgagat cgccggtgtc gtggtgacat tcgaccccaa gcctatccct 720
ggtgactgga acggtgccgg tgctcactca aactacagca ccaagtccat gaggaacgac 780
ggcggctacg aggtgatcaa gtccgcgatc gagaagctca aactgaggca ccgggagcac 840
atcgccgcct acggtgaggg caacgagcgc cggctcaccg gcaagcacga gaccgctgac 900
atcaacacct tcagctgggg cgtggcaaac cgtggcgcgt ctgtgcgtgt gggtcgcgag 960
acggagcaga acggcaaggg ctacttcgaa gaccgccggc cggcgtccaa catggacccc 1020
tacgtggtga cctccatgat cgccgagacc accatcatct ggaagccttg a 1071
<210> 2
<211> 1071
<212> DNA
<213> 靶标酶谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthesis)
<400> 2
atggcctccc tcaccgacct catcaacctc gacctctccg actccaccga gaagatcatc 60
gccgagtaca tatggatcgg tggatctggc atggacctca ggagcaaggc gaggaccctc 120
cccggcccgg tgagcgatcc cagcaagctg cccaagtgga actacgacgg ctccggcacc 180
ggccaagctc ccggcgagga cagtgaggtc atcctatacc cacaggccat cttcaaggac 240
ccattcagga agggcaacaa catccttgtc atgtgcgatt gctacacccc agctggcgag 300
ccaattccca ccaacaagag ggccaacgct gccaagatct tcagcaaccc tgaggtttct 360
gctgaggagc cctggtacgg tattgaacag gaatacaccc tcctgcagaa ggacaccaac 420
tggcctcttg ggtggcctct tggtggcttc cctggtccac agggtcccta ctactgcggt 480
gttggcgctg acaagtcatt cgggcgtgac attgttgact cccactacaa ggcttgcctg 540
tatgccggaa tcaacatcag tggcatcaat ggtgaagtca tgccaggaca gtgggagttc 600
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ggtgactgga acggtgccgg tgctcactca aactacagca ccaagtccat gaggaacgac 780
ggcggctacg aggtgatcaa gtccgcgatc gagaagctca aactgaggca ccgggagcac 840
atcgccgcct acggtgaggg caacgagcgc cggctcaccg gcaagcacga gaccgctgac 900
atcaacacct tcagctgggg cgtggcaaac cgtggcgcgt ctgtgcgtgt gggtcgcgag 960
acggagcaga acggcaaggg ctacttcgaa gaccgccggc cggcgtccaa catggacccc 1020
tacgtggtga cctccatgat cgccgagacc accatcatct ggaagccttg a 1071
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<211> 3343
<212> DNA
<213> 靶标酶谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthesis)
<400> 3
tgccatggcc tccctcaccg acctcatcaa cctcgacctc tccgactcca ccgagaagat 60
catcgccgag tacatatggt acgtcttacg gcggcgttgc cttgttgatc cctctgcgcg 120
ttacgcttgt tttttttttc cctcgtcaat ctggaattca ggatcgatct tgctgggngc 180
tggactgctg gtcgcctttt catggcgttt ccccatgcga aaactggttc tttccggtag 240
tattgaggaa aggcaagatc ttttgggggt ttagngggtt tttgggngcg agtaacatgg 300
attggtgcan atttcagtct tgttcgccgg ctcaagcagg ggnggggttt gttttccctg 360
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tggaactacg acggctccag caccggccaa gctcccggcg aggacagtga ggtcatccta 1140
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cagttatgat acacccgtga aacactgaat ctctctctga ttggatgtta tgtcgacttt 1560
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ccagctggcg agccaattcc caccaacaag agggccaacg ctgccaagat cttcagcaac 1800
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ttccctggtc cacaggtaca taacatcatt aatttgattg attcagagaa atgcatcgtt 2040
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Claims (7)
1.一种检测抗草铵膦牛筋草种群的突变位点的dCAPs引物，其特征是：该引物包括上游引物dCaps-GS1-F和下游引物dCaps-GS1-R，所述上游引物dCaps-GS1-F的碱基序列如SEQIDNO：7所示，所述下游引物dCaps-GS1-R的碱基序列如SEQ ID NO：8所示，所述突变位点位于从草铵膦敏感型牛筋草中克隆的靶标酶谷氨酰胺合成酶基因EiGS1-S的如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第175位，发生的突变为A-G。
2.一种抗草铵膦牛筋草种群的检测方法，其特征是包括以下步骤：
(1)选取待测牛筋草种群样品和草铵膦敏感型牛筋草种群，提取其基因组gDNA；
(2)根据抗草铵膦牛筋草种群中靶标酶谷氨酰胺合成酶基因EiGS1-S的第175位核苷酸由A突变为G，设计权利要求1中所述的dCAPs引物，用以扩增突变位点前后约200bp的核酸片段；
(3)利用该dCAPs引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；
(4)用核酸内切酶Kpn Ⅰ-HF酶切PCR产物；
(5)将酶切PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，根据电泳结果鉴定待测样品是否为在第175位具有A-G突变的抗草铵膦突变位点的牛筋草种群；若待测牛筋草种群样品中EiGS1基因核酸序列在第175位发生A-G突变，则会被Kpn Ⅰ-HF切掉部分片段，与未发生突变的EiGS1片段相比，电泳时会跑的较快，电泳位置在未被酶切的片段的下方，从而达到快速鉴定的目的。
3.根据权利要求2所述的抗草铵膦牛筋草种群的检测方法，其特征是：步骤(3)中PCR反应体系如下：2×PCR Buffer 12.5μL，10μM的dCaps-GS1-F和dCaps-GS1-R引物各1μL，牛筋草gDNA 2μL，加入8.5μL无菌蒸馏水至反应体系为25μL。
4.根据权利要求2所述的抗草铵膦牛筋草种群的检测方法，其特征是：步骤(3)中PCR程序如下：95℃4min，94℃30s，58℃30s，72℃30s 40个循环，最后72℃延伸7min。
5.根据权利要求2所述的抗草铵膦牛筋草种群的检测方法，其特征是：步骤(4)中KpnⅠ-HF酶切时反应体系如下：10×NEB.Custmer Buffer 3μL，KpnⅠ-HF 1μL，PCR扩增产物15μL，ddH2O 11μL，总体积30μL。
6.根据权利要求2所述的抗草铵膦牛筋草种群的检测方法，其特征是：步骤(5)中琼脂糖凝胶电泳为质量百分含量为2％的琼脂糖凝胶。
7.权利要求1中的引物在制备用于检测抗草铵膦牛筋草种群的生物制剂中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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