CN111116741A - 抗h3n2流感病毒的全人中和性抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抗H3N2流感病毒的全人中和性抗体及其应用。具体地本发明公开了一株针对H3N2流感病毒的全人单克隆抗体，该抗体能够结合具有天然构象的流感病毒血凝素蛋白(HA)，能够阻止H3N2亚型流感病毒侵染易感细胞，对人体来说具有较低的免疫原性，可以避免人抗鼠等其它物种来源的抗体介导免疫排斥反应，在临床上具有预防和治疗H3N2亚型流感病毒感染的潜在价值。

Description

抗H3N2流感病毒的全人中和性抗体及其应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体地涉及一株抗H3N2流感病毒的全人中和性抗体及其应用。
背景技术
WHO的调查显示，全球每年约5-10％的成人和20-30％的儿童罹患季节性流感，导致300-500万住院病例和29-65万人死亡。而在我国，每年有高达6500万-1.9亿人患流行性感冒。季节性流行的毒株主要是H1N1、H3N2以及B型流感病毒。近年来，H3N2病毒频繁流行。2017年，H3N2病毒在香港地区流行，截止到8月份，约有四百多死亡病例。同年冬季，“澳大利亚H3N2流感”在英国迅速蔓延，除少数地区外，全英各州几乎全部沦陷，截止到2017年1月中旬，流感感染病例达2000例。因此，H3N2的流行给人类造成了巨大的危害。
目前，国家许可用于治疗流感的药物主要为以下两大类：1)烷胺类(金刚烷胺和金刚乙胺)；2)流感病毒神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦和扎那米韦)。对烷胺类药物，已出现大量的耐药性流感毒株，因此目前世界卫生组织不建议使用烷胺类药物作为治疗流感的药物；目前大部分流感病毒(包括H3N2流感病毒)仍对奥司他韦和扎那米韦敏感，但在日本等地区也已经出现耐药性毒株，耐药性毒株的出现限制了这些化学小分子药物的大规模使用。
治疗性抗体用于流感的等病毒感染性疾病的治疗早有报道，抗血清用于治疗SARS和重症H5N1禽流感病毒感染者的案例已经证明了抗体在治疗病毒感染中发挥的重要作用。具有广谱中和活性的抗流感病毒的治疗性抗体具有以下潜在优势，一方面它可以阻断病毒与靶细胞的结合，另一方面通过补体和T细胞、NK细胞等效应细胞的作用，将被病毒感染的细胞杀死。1986年，第一株治疗器官移植出现的排斥反应的鼠单抗——莫罗单抗-CD3(murmonabCD3,hoclone OKT3)获得美国FDA批准上市，但由于其在人体内会产生人抗鼠抗体(HAMA)反应，限制了应用。随着免疫学和分子生物学的发展，基因工程抗体迅速发展，嵌合抗体，人源化抗体和全人抗体生产技术不断发展，将HAMA反应降至最低乃至消除。2009年，美国FDA批准的14个药物中有4个为全人抗体，这标志着全人治疗性单克隆抗体时代的来临，全人抗体成为抗体药物未来的发展方向。
因此，本领域仍然需要开发能够中和H3N2亚型流感病毒的全人单克隆抗体。
发明内容
本发明目的是提供了一种能够中和H3N2亚型流感病毒的全人单克隆抗体。
本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.:3所示的CDR1，
SEQ ID NO.:4所示的CDR2，和
SEQ ID NO.:5所示的CDR3。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能够保留H3N2流感病毒HA蛋白结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述重链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。
本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明第一方面所述的重链可变区。
在另一优选例中，所述的抗体的重链还包括重链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的。
本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.:6所示的CDR1’，
氨基酸序列为GNT的CDR2’，和
SEQ ID NO.:7所示的CDR3’。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能够保留H3N2流感病毒HA蛋白结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列。
本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明第三方面所述的轻链可变区。
在另一优选例中，所述的抗体的轻链还包括轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的。
本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：
(1)如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或
(2)如本发明第三方面所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链；和/或如本发明第四方面所述的轻链。
在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗H3N2流感病毒HA蛋白的抗体。
在另一优选例中，所述抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体、或多克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:1所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:2所示。
本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签、GGGS序列、FLAG标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合H3N2流感病毒HA蛋白。
本发明的第七方面，提供了一种CAR构建物，所述的CAR构建物的抗原结合区域的scFv段为特异性结合于HA蛋白的结合区，并且所述scFv具有如本发明第一方面所述的重链可变区和如本发明第三方面所述的轻链可变区。
本发明的第八方面，提供了一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如本发明第七方面所述的CAR构建物。
在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：NK细胞、T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
本发明的第九方面，提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体、或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
本发明的第十方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或其组合，所述活性成分用于用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒。
在另一优选例中，所述试剂、检测板或试剂盒用于检测H3N2流感病毒。
在另一优选例中，所述药剂用于治疗或预防H3N2流感病毒感染。
在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。
本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、如本发明第八方面所述的免疫细胞、如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于预防和/或治疗H3N2流感病毒感染。
本发明的第十二方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体；或
(2)如本发明第六方面所述的重组蛋白；
(3)如本发明第七方面所述的CAR构建物。
在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO.:8和/或SEQ ID NO.:9所示的序列。
本发明的第十三方面，提供了一种载体，所述的载体含有如本发明第十二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
本发明的第十四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明第十三方面所述的载体或基因组中整合有如本发明第十二方面所述的多核苷酸。
本发明的第十五方面，提供了一种检测样品中H3N2流感病毒血凝素HA蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与本发明的第五方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在H3N2流感病毒血凝素HA蛋白。
在另一优选例中，所述检测为非治疗非诊断目的。
本发明的第十六方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明第五方面所述的抗体或如本发明第九方面所述的免疫偶联物。
本发明的第十七方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有如本发明第五方面所述的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗如本发明第五方面所述的抗体的二抗；
或者，所述试剂盒含有如本发明第十六方面所述的检测板。
本发明的第十八方面，提供了一种重组多肽的制备方法，所述方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养如本发明第十四方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明第五方面所述的抗体或如本发明第六方面所述的重组蛋白。
本发明的第十九方面，提供了一种治疗H3N2流感病毒感染的方法，所述方法包括：给需要的对象施用如本发明第五方面所述的抗体、所述抗体的抗体-药物偶联物、或表达所述抗体的CAR-T细胞、或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了A型流感病毒结构示意图。
图2显示了ELISA方法测定全人抗体5Ab浓度的结果。
图3显示了全人单克隆抗体(5Ab)识别不同H3N2毒株的HA蛋白，对不同H3N2毒株的HA均有结合活性。
图4显示了全人单克隆抗体(5Ab)中和A/Jiangxi-Donghu/312/2006(H3N2)流感病毒的抑制率曲线。
图5显示了全人单克隆抗体(5Ab)中和A/canine/Beijing/362/2009(H3N2)流感病毒的抑制率曲线。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，意外地的获得一株针对H3N2流感病毒的全人单克隆抗体。该抗体能够识别不同H3N2的血凝素HA蛋白，并对H3N2流感病毒抗原具有很高的结合中和活性，具有识别广谱性和广谱中和性，能够抑制或阻止H3N2亚型流感病毒侵染易感细胞。在此基础上，完成了本发明。
本发明从接种过2016年季节性三价流感病毒裂解疫苗(上海生物制品所生产)的志愿者体内获得外周血单个核细胞(PBMC)，使用CD19+/IgG+/HA为特异性标志物，经流式细胞仪分选(FACS)获得识别HA蛋白特异性B细胞。使用文献已报道的单细胞RT-PCR技术(Journal of Immunological Methods 329(2008)112–124)，获得了抗体基因并在CHO细胞中进行表达获得全人单克隆抗体5Ab。ELISA分析得知这株抗体识别不同H3N2的血凝素HA蛋白，微中和实验证明此抗体能够中和A/Jiangxi-Donghu/312/2006(H3N2)及A/canine/Beijing/362/2009(H3N2)流感病毒，这预示该抗体在临床上具有预防和治疗H3N2亚型流感病毒感染的潜在价值。
术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的针对H3N2流感病毒的单克隆抗体及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。
本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、***或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,100％。
流感病毒H3N2
流感病毒属于正粘病毒科，有包膜，呈球型、椭圆型或丝状，病毒包膜来自宿主细胞的双层类脂膜。流感病毒属单链的RNA病毒。根据核蛋白(NP)和细胞质蛋白(M1)的差异，流感病毒可分为A、B、C(甲、乙、丙)三种亚型。对A型流感病毒，根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)表面糖蛋白抗原性的不同，又可进一步分为不同的亚型。目前，A型流感病毒有16种HA亚型(H1–H16)和9种NA亚型(N1–N9)。
A型流感病毒的基因组(图1)由8个单独的单链RNA片段组成，每个RNA片段编码一至两个蛋白。因此A型流感病毒共有8个基因，编码10种蛋白。其中，HA蛋白对于结合细胞表面受体和病毒与细胞的膜融合起重要作用，在感染细胞前，HA会水解成HA1和HA2，其中位于HA1上的的受体结合区(receptor binding domain，RBD)的附近区域，在不同流感病毒株中高度变异(RBD本身比较保守)，是重要的中和性表位所在区域，目前发现的多种中和性抗体所针对的表位大多位于HA1蛋白的RBD附近区域。但是这些抗体大多不具备中和不同亚型或同一亚型不同毒株流感病毒的能力。NA可以去除唾液酸，帮助子代病毒的释放和避免病毒自身的聚集；PA、PB1和PB2三种聚合酶以及NP核蛋白主要用于病毒RNA的复制和转录；基质蛋白M1负责核外输送，M2负责形成离子通道；非结构蛋白NS1是干扰素的抑制剂，NS2负责核外输送。
治疗性抗体用于流感的等病毒感染性疾病的治疗早有报道，抗血清用于治疗SARS和重症H5N1禽流感病毒感染者的案例已经证明了抗体在治疗病毒感染中发挥的重要作用。具有广谱中和活性的抗流感病毒的治疗性抗体具有以下潜在优势，一方面它可以阻断病毒与靶细胞的结合，另一方面通过补体和T细胞、NK细胞等效应细胞的作用，将被病毒感染的细胞杀死。1986年，第一株治疗器官移植出现的排斥反应的鼠单抗——莫罗单抗-CD3(murmonabCD3,hoclone OKT3)获得美国FDA批准上市，但由于其在人体内会产生人抗鼠抗体(HAMA)反应，限制了应用。随着免疫学和分子生物学的发展，基因工程抗体迅速发展，嵌合抗体，人源化抗体和全人抗体生产技术不断发展，将HAMA反应降至最低乃至消除。2009年，美国FDA批准的14个药物中有4个为全人抗体，这标志着全人治疗性单克隆抗体时代的来临，全人抗体成为抗体药物未来的发展方向。
抗体
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明还包括具有所述的抗H3N2流感病毒HA蛋白单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的抗H3N2流感病毒HA蛋白单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的抗H3N2流感病毒HA蛋白单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗H3N2流感病毒HA蛋白单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
术语“抗体的抗原结合片段”(或简称“抗体片段”)是指抗体的保持特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。己显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语“抗体的抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含通过较链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab”)2片段；抗体重链；抗体轻链。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15个连续或非连续的氨基酸。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-7M，例如大约小于1O-8M、1O-9M或lO-10M或更小的亲和力(KD)结合。
如本文所用，术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的针对H3N2流感病毒的单克隆抗体。术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。人源化抗体可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A等人，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication91-3242)提供。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
CDR1:GYTFTGFY(SEQ ID NO.:3)，
CDR2：SNPDSGAT(SEQ ID NO.:4)，和
CDR3：ARNDILTGYS(SEQ ID NO.:5)。
在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示，其中双下划线标注的依次为重链可变区CDR1，CDR2，CDR3的氨基酸序列。
Figure BDA0001847949650000113
在另一优选例中，所述重链可变区的核酸编码序列如SEQ ID NO.:8所示，其中双下划线标注的依次为重链可变区CDR1，CDR2，CDR3的核酸编码序列。
Figure BDA0001847949650000114
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区可以为鼠源或人源。
如本文所用，术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的抗体的轻链可变区，具有选自下组的互补决定区CDR：
CDR1’：NSNLGAGHV(SEQ ID NO.:6)，
CDR2’：GNT，和
CDR3’：QSYDSSLNAYV(SEQ ID NO.:7)。
在另一优选例中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示，其中双下划线标注的依次为轻链可变区CDR1’，CDR2’，CDR3’的氨基酸序列。
Figure BDA0001847949650000115
在另一优选例中，所述轻链可变区的核酸编码序列如SEQ ID NO.:9所示，其中双下划线标注的依次为轻链可变区CDR1’，CDR2’，CDR3’的核酸编码序列。
Figure BDA0001847949650000116
Figure BDA0001847949650000121
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源或人源。
本发明抗体的功能是由此抗体轻链和重链可变区基因特异性基因序列决定，能够结合具有天然构象的流感病毒血凝素蛋白(HA)，能够阻止H3N2亚型流感病毒侵染易感细胞。利用此抗体可变区基因或互补决定区(CDR)基因，可在利用原核和真核细胞的任何表达***中改造和生产不同形式的基因工程抗体。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合抗H3N2流感病毒的抗体，例如具有重链可变区(如SEQ ID NO.:8所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列)和/或轻链可变区(如SEQ ID NO.:9所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
在另一优选例中，所述的抗体为抗H3N2流感病毒HA蛋白的鼠或人鼠嵌合单克隆抗体，它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地，所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少约90％同源性，较佳地至少约95％同源性。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有抗H3N2流感病毒HA蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约60个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
Figure BDA0001847949650000131
Figure BDA0001847949650000141
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:8或9所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与SEQ ID NO.:8或9所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:1和/或SEQ ID NO.:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可偶联的治疗剂包括但不限于：胰岛素、IL-2、干扰素、降钙素、GHRH肽、肠肽类似物、白蛋白、抗体片段、细胞因子、和激素。
此外还可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口服、呼吸道、瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合H3N2流感病毒HA蛋白分子，因而可用于延长药物的半衰期，此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。
本发明的主要优点
(1)本发明全人单克隆抗体能够特异性识别并结合H3N2甲型流感病毒的HA蛋白，对H3N2型流感病毒具有很高的中和活性，并且可以结合中和不同的H3N2毒株，有效抑制或阻止H3N2亚型流感病毒侵染易感细胞。
(2)本发明全人单克隆抗体具有识别广谱性和中和广谱性，能有效中和多种H3N2流感病毒。
(3)本发明是全人单克隆抗体，对人体来说具有较低的免疫原性，可以避免人抗鼠等其它物种来源的抗体介导免疫排斥反应。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
本发明实施例或测试例中未注明具体条件的实验，通常按常规条件进行，或按照原料/商品制造商建议的条件；未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
以下说明本发明能够中和H3N2流感病毒的中和性全人单克隆抗体制备以及抗体特性分析过程。
实施例1单细胞RT-PCR法获得抗体基因以及抗体表达
1.外周血单核细胞(PBMC)的获得
从根据血凝抑制实验筛选的志愿者体内抽取外周血，采用常规Ficoll-Paque密度梯度离心，得到107以上个外周血单核细胞(PBMC)。
2.HA特异性记忆B细胞分选
使用FITC-CD19/APC-IgG/Cy3-HA为标志物，经流式细胞仪获得特异性B细胞至96孔RT-PCR板，每孔一个细胞，获得了若干个HA特异性记忆B细胞。
3.抗体基因
使用RT-PCR和Nested-PCR技术，获得抗体基因(重轻链可变区基因)，将来源于同一个B细胞抗体重轻链基因可变区连接T载体，进行测序，验证抗体基因。然后将重、轻链基因分别连接表达载体IgG和IgL。
4.瞬时转染CHO细胞，进行全人抗体表达
1)转染前一天(第–1天)，分种ExpiCHO-STM细胞，最终密度为3×106–4×106个活细胞/mL，使细胞过夜生长。
2)次日(第0天)，测定活细胞密度和存活率百分比。细胞密度应达到约7×106–10×106个活细胞/mL。存活率应为95–99％，方可继续转染。
3)将细胞稀释至最终密度为6×106个活细胞/mL。
4)使用冷的试剂(4℃)配制ExpiFectamineTM CHO/质粒DNA复合物。
5)室温孵育ExpiFectamineTM CHO/质粒DNA复合物1–5分钟，然后将溶液慢慢转移至CHO细胞培养瓶中，在添加过程中轻轻晃动培养瓶。
6)将细胞置于轨道摇床上(37℃培养箱含8％CO2的湿化空气条件下)培养。5.ELISA方法测定全人抗体浓度
1)包被羊抗人IgG(Fab Specific)抗体于ELISA板，10μg/ml，每孔100μl，4℃过夜；
2)PBST洗板，3次；
3)封闭：1％BSA，每孔200μl，37℃,2h；
4)PBST洗板，3次；
5)使用倍比稀释的人IgG做标准曲线，浓度、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、1.5625ng/ml、0ng/ml，100μl/孔；全人抗体细胞上清稀释160倍，每孔100μl，37℃,2h；
6)PBST洗板，3次；
7)羊抗人IgG(Fc specific)-Peroxidase抗体，1:10000稀释，每孔100μl，37℃,1h；
8)PBST洗板，3次；
9)底物A液：B液＝1:1，每孔100μl,37℃,15min，避光反应；
10)加入2M H2SO4，每孔50μl；
11)测定OD450，并进行数据处理。
实验结果：
经测序得到全人抗体5Ab重链可变区和轻链可变区的基因序列和氨基酸序列：
全人抗体5Ab重链可变区基因序列如下，其中双下划线标注的依次为重链基因CDR1，CDR2，CDR3序列。
Figure BDA0001847949650000181
Figure BDA0001847949650000191
全人抗体5Ab重链可变区氨基酸序列如下，其中双下划线标注的依次为重链氨基酸CDR1，CDR2，CDR3序列。
Figure BDA0001847949650000192
全人抗体5Ab轻链可变区基因序列如下，其中双下划线标注的依次为轻链基因CDR1，CDR2，CDR3序列。
Figure BDA0001847949650000193
全人抗体5Ab轻链可变区氨基酸序列如下，其中双下划线标注的依次为轻链氨基酸CDR1，CDR2，CDR3序列。
Figure BDA0001847949650000194
结果如图2所示，ELISA结果表明成功表达了全人抗体，其浓度约为4μg/ml。
实施例2抗体特性分析
1.抗原特异性检测
检测表达的全人抗体是否识别HA蛋白、H3N2流感病毒疫苗裂解液。ELISA进行检测，分别包被HA、H3N2流感疫苗裂解液于ELISA板，10μg/ml，每孔100μl，4℃过夜；
1)PBST洗板，3次；
2)封闭：1％BSA，每孔200μl，37℃，2h；
3)PBST洗板，3次；
4)根据测定浓度，调整全人抗体细胞至相同浓度，每孔100μl，37℃,2h；
5)PBST洗板，3次；
6)羊抗人IgG(Fc specific)-Peroxidase抗体，1:10000稀释，每孔100μl加到ELISA板中，37℃,1h；
7)PBST洗板，3次；
8)底物A液：B液＝1:1，每孔100μl，37℃,15min，避光反应；
9)加入2M H2SO4，每孔50μl；
10)测定OD450，并进行数据处理。
结果如图3所示，ELISA结果表明，全人抗体5Ab对H3N2甲型流感病毒具有很高的结合活性，可以结合不同的H3N2毒株，表明这株全人单克隆抗体具有识别广谱性。其中NC为阴性对照。
2.抗体中和活性测定
2.1微中和试验
1)MDCK细胞铺至96孔板(1-11列，A-H行)，DMEM+10％FBS培液培养，12h后生长至90％，备用。
2)96孔板，抗体用DMEM+0.2％BSA 2×梯度稀释(1-10列2^0至2^-9稀释)，终体积50μl/well。
3)每孔加入50μl含100个TCID50病毒(预先用DMEM+0.2％BSA稀释至100TCID50/50μl。
4)每块板包括对照：
病毒对照(PC)——50μl DMEM 0.2％BSA+50μl病毒(11列A-D)
细胞对照(NC)——100μl DMEM 0.2％BSA(11列E-H)
5)37℃5％CO2,1h，使抗体与病毒充分作用。
6)MDCK单层细胞吸去培液，PBS洗两遍，加100μl DMEM+0.2％BSA+2μg/mlTPCK-trypsin。
7)将抗体-病毒孵育混合物100μl全部对应移至MDCK细胞平板中。
8)37℃,5％CO2,20h；
9)PBS洗一遍。预冷的80％丙酮-PBS溶液固定10min；
10)anti-NP ELISA
2.2 ELISA实验
1)固定好的细胞板PBS+0.05％Tween 20(漂洗液)洗3遍。
2)用PBS+1％BSA 0.1％Tween 20(稀释液)1:10000稀释anti-NP(HRP)抗体，50μl/孔，室温1小时。
3)漂洗液洗6遍。
4)TMB显色，100μl/孔。
5)2N H2SO4终止反应，50μl/孔。
6)分光光度计450nm读板。
7)计算：X＝(PC孔的平均OD450值–实验孔的平均OD450值)/(PC孔的平均OD450值-NC孔的平均OD450值)]*100％。至少做两次独立实验。
全人单克隆抗体(5Ab)使用CHO细胞进行表达，使用微中和试验测定其对A/Jiangxi-Donghu/312/2006(H3N2)及A/canine/Beijing/362/2009(H3N2)流感病毒的中和活性。
结果如图4、图5和表2所示，5Ab能够显著中和以上2株H3N2亚型的流感病毒，在临床上具有预防和治疗H3N2亚型流感病毒感染的潜在价值。5Ab对这些病毒的中和活性呈现出浓度梯度依赖性。
表2：全人单克隆抗体5Ab中和两株H3N2毒株的IC50值(单位：ug/ml)
抗体 A/Jiangxi-Donghu/312/2006(H3N2) A/canine/Beijing/362/2009(H3N2)
5Ab 5.880 5.337
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海巴斯德研究所
<120> 抗H3N2流感病毒的全人中和性抗体及其应用
<130> P2018-1233
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Gln Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Phe
20 25 30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ser Asn Pro Asp Ser Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Arg Ser Ile Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Asn Ser Asn Leu Gly Ala Gly
20 25 30
His Val Val His Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro Thr Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ala Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Lys Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Asn Ala Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Phe Tyr
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Ser Asn Pro Asp Ser Gly Ala Thr
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
Ala Arg Asn Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Asn Ser Asn Leu Gly Ala Gly His Val
1 5
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Asn Ala Tyr Val
1 5 10
<210> 8
<211> 351
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagcagc ctggggcctc agtgaaggtg 60
tcctgcaagg cctctggata caccttcact ggcttctatt tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg agcaaccctg acagtggtgc cacagactat 180
gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg acccgggaca ggtctatcaa tacagcctac 240
atggagttga accgactgag atccgacgac acggccgtgt attactgtgc gaggaacgat 300
attttgactg gttattcctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351
<210> 9
<211> 333
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
cagtctgtgc tgactcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60
tcctgcactg ggagcaactc caacttaggg gcgggtcatg ttgtacattg gtaccagcag 120
gttccaggaa cagcccccac cctcctcatc tatggtaaca ccaatcggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tcgctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240
aaggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gaatgcttat 300
gtcttcggaa gtgggaccaa ggtcaccgtc cta 333

Claims (10)

1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.:3所示的CDR1，
SEQ ID NO.:4所示的CDR2，和
SEQ ID NO.:5所示的CDR3。
2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区。
3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.:6所示的CDR1’，
氨基酸序列为GNT的CDR2’，和
SEQ ID NO.:7所示的CDR3’。
4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区。
5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：
(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或
(2)如权利要求3所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有：如权利要求2所述的重链；和/或如权利要求4所述的轻链。
6.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:1所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:2所示。
7.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
8.一种CAR构建物，其特征在于，所述的CAR构建物的抗原结合区域的scFv段为特异性结合于HA蛋白的结合区，并且所述scFv具有如权利要求1所述的重链可变区和如权利要求3所述的轻链可变区。
9.一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗体药物偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体、或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
10.一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体、如权利要求7所述的重组蛋白、或其组合，其特征在于，所述活性成分用于用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒。
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