CN111111801A - 一种检测人超敏c反应蛋白用微流控纸芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片，包括基板和盖板，基板与盖板通过键合而成，所述盖板上设有加样孔、检测孔，所述基板上依次设有加样区、反应区、检测区、废液区，所述反应区包被有荧光微球标记的超敏C反应蛋白抗体I，检测区内固定包被有不同表位的超敏C反应蛋白抗体II；本发明微流控芯片检测结果准确度高、线性关系良好、稳定性好、特异性强、灵敏度高；超敏C反应蛋白是心血管疾病危险评估的“金标准”，是心血管疾病强有力的预示因子与危险因子，本发明对于心血管疾病的干预及预后可以提供可靠的临床参考价值。

Description

一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片
技术领域
本发明涉及微流控纸芯片技术领域，具体为一种检测人超敏C 反应蛋白用微流控纸芯片。
背景技术
C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)，是Tillet和Francis于1930 年在急性大叶性肺炎患者血清中发现的，因其在钙离子存在时能和肺 炎双球菌细胞壁的C多糖起沉淀反应而得名，是相对分子质量为 115-140KD的血清β球蛋白。关于CRP的研究已经有70多年的历史， 传统观点认为CRP是一种非特异的炎症标志物。CRP在临床上主要 用于评价感染、组织损伤和炎症性疾病，同时为炎症性疾病的诊断提 供数据支持，也可为疾病的治疗和监控提供诊疗信息。随着检测技术 的进步，采用超敏感方法检测到的CRP被称为超敏CRP(HS-CRP)。 近年来，大量的文章研究显示，HS-CRP在冠心病、中风、心肌梗死、 周围血管栓塞等疾病诊断和预测中发挥越来越重要的作用。在由慢性 炎症引发心血管疾病的独立危险因素中CRP的作用已被证实，及时 监测CRP的水平变化对心血管疾病的干预及预后起重要作用，且CRP 水平越高，发生心脑血管的危险性就越大。因此欧美等发达国家已将 HS-CRP作为预防心血管疾病的相对独立的一个新的筛查指标。有学 者认为CRP是心血管疾病危险评估的“金标准”，是心血管疾病强有 力的预示因子与危险因子。
目前，超敏C反应蛋白的检测方法有酶联免疫分析法和胶体金 比色法免疫浊比浊法：胶体金比色法有快速简便，易观察的特点，但 只能进行定性或半定量检测，灵敏度低。酶免分析法操作简便，特异 性强，但灵敏度较低、线性范围较窄；免疫比浊法操作简便、结果准 确可靠、自动化程度高，且检测快速，具有较高的临床可用度。微流 控芯片技术是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、 检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全 过程；能够极大地简化了操作流程，降低了样品和试剂消耗，并且不 需要配备昂贵的仪器，使现场即时检测成为可能，具有可预见的巨大 的经济价值和社会价值；因此，建立一种检测超敏C反应蛋白的微 流控芯片技术平台具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种检测人超敏C反应蛋 白用微流控纸芯片，提高了检测的准确率和灵敏度。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种检测人超敏C 反应蛋白用微流控纸芯片，包括基板和盖板，基板与盖板通过键合而 成，所述基板、盖板的截面均为长方形结构，所述盖板上设有加样孔、 检测孔，所述基板上依次设有加样区、反应区、检测区、废液区，所 述反应区包被有荧光微球标记的超敏C反应蛋白抗体I，检测区内固 定包被有不同表位的超敏C反应蛋白抗体II，加样区的下端设有开口 与过滤通道的上端相连通，所述反应区的上端设有开口与过滤通道的 下端相连通，所述过滤通道内设有多层过滤棉，所述反应区的下端设 有开口与反应通道的上端相连通，所述检测区的上端与反应通道的下 端相连通，反应通道为S蛇形结构，所述检测区的下端设有开口与废 液通道的上端相连通，废液区的上端设有开口与废液通道的下端相连 通，所述废液区内设有第二限流柱，第二限流柱的截面为弧形结构， 第二限流柱位于废液区上端开口处，所述废液区的下端部与溢流通道的上端相连通。
上述一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片，其中，所述 加样区、反应区、检测区、废液区的截面均为圆形结构，且直径相同。
上述一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片，其中，所述 废液通道的高度从检测区到废液区呈下降趋势，所述第二限流柱最高 点高于检测区底部。
上述一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片，其中，所述 过滤棉为全血分离膜。
上述一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片，其中，所述 溢流通道的高度低于废液通道的最高点。
上述一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片，其中，所述 加样孔与加样区相对应，所述检测孔与检测区相对应。
上述一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片，其中，所述 基板、盖板选用聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯中 的一种。
本发明具有有益效果：本发明灵敏度高、可重复性好，所需样本 量极少，检测时间短，操作简便，能够极大地简化了操作流程，降低 了样品和试剂消耗，并且不需要配备昂贵的仪器，使现场即时检测成 为可能，具有巨大的经济价值和社会价值；对心血管疾病的干预及预 后提供可靠的临床诊断价值。
附图说明
图1为本发明底板结构示意图；
图2为本发明盖板结构示意图；
图3为图1中A-A剖面示意图；
图4为本发明检测不同标准品的标准曲线图。
图中：1基板、2盖板、3加样孔、4检测孔、5加样区、6反应 区、7检测区、8废液区、9过滤通道、10过滤棉、11反应通道、12 溢流通道、13废液通道、14第二限流柱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方 案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部 分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普 通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片，包括基板1和盖 板2，基板1与盖板2通过键合而成，所述基板1、盖板2的截面均 为长方形结构，所述盖板1上设有加样孔3、检测孔4，所述基板1 上依次设有加样区5、反应区6、检测区7、废液区8，所述反应区6 包被有荧光微球标记的超敏C反应蛋白抗体I，检测区7内固定包被 有不同表位的超敏C反应蛋白抗体II，加样区5的下端设有开口与过 滤通道9的上端相连通，所述反应区6的上端设有开口与过滤通道9 的下端相连通，所述过滤通道9内设有多层过滤棉10，所述反应区6 的下端设有开口与反应通道11的上端相连通，所述检测区7的上端 与反应通道11的下端相连通，反应通道11为S蛇形结构，反应通道 11的S蛇形结构可有效控制流体在反应通道11内的时间，从而使待 测流体与抗体反应充分完全；所述检测区7的下端设有开口与废液通 道13的上端相连通，废液区8的上端设有开口与废液通道13的下端 相连通，所述废液区8内设有第二限流柱14，第二限流柱14的截面 为弧形结构，第二限流柱14位于废液区8上端开口处，第二限流柱 14可以阻挡废液区8中的废液返回检测区7，同时可起到引流的作用， 便于检测区7的流体能顺利流入废液区8，所述废液区8的下端部与 溢流通道12的上端相连通，溢流通道与微流控芯片外部相连通，有 效防止废液逆流。
上述一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片，其中，所述 加样区5、反应区6、检测区7、废液区8的截面均为圆形结构，且 直径相同。
上述一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片，其中，所述 废液通道13的高度从检测区到废液区呈下降趋势，所述第二限流柱 14最高点高于检测区7底部，便于检测区的流体能顺利流入废液区， 且不会回流。
上述一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片，其中，所述 过滤棉10为全血分离膜，过滤膜为全血分离膜，膜中大孔能够通过 物理方式截留全血中的红细胞、白细胞，血浆从膜下游面的小孔流出， 可快读分离全血中的血浆而无溶血现象，避免红细胞对检测结果的影 响。
上述一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片，其中，所述 溢流通道的高度低于废液通道的最高点。
上述一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片，其中，所述 加样孔3与加样区5相对应，所述检测孔4与检测区7相对应。
上述一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片，其中，所述 基板1、盖板2选用聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙 烯中的一种。
实施例2
本实施例中详细阐述了定量检测超敏C反应蛋白的微流控芯片 的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)将多层过滤膜固定于反应通道内；
(2)将荧光微球用0.05mol/L MES缓冲液(pH＝7.2)洗涤，洗 涤后，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应2h,得到荧光微 球溶液，将超敏C反应蛋白抗体I溶于0.05mol/L的PBS缓冲液 (pH＝7.2)，得到超敏C反应蛋白抗体I溶液，将荧光微球溶液加入超敏C反应蛋白抗体I溶液中，室温反应2h，离心过滤，用0.01mol/L 的PBS缓冲液(pH＝7.2)洗涤3-5次，得到荧光微球标记的超敏C 反应蛋白抗体I，将荧光微球标记的超敏C反应蛋白抗体I滴涂于反 应区；
(3)将超敏C反应蛋白抗体II固定包被于检测区；
(4)将基板与盖板合并。
检测时：将全血样本从加样孔中加进加样区，全血样本经过过滤 通道的过滤棉，去除红细胞、白细胞，随后进入反应区；样本中的抗 原与荧光微球标记的超敏C反应蛋白抗体反应形成，形成抗原-超敏 C反应蛋白抗体-荧光微球复合物，反应区中的抗原-超敏C反应蛋白 抗体I-荧光微球复合物从反应通道进入检测区，抗原-超敏C反应蛋 白抗体I-荧光微球复合物与检测区固定的超敏C反应蛋白抗体II发 生特异性免疫反应，形成荧光微球-超敏C反应蛋白抗体I-抗原-超敏 C反应蛋白抗体II的双抗体夹心复合物，并固定在检测区；没有固定 的样本进入废液区，通过加样孔加入清洗液，清洗微流控通道，最后 将微流控芯片通过荧光检测仪进行检测，检测荧光微球的发光强度， 荧光强度与待测物浓度呈相关性。
实施例3
本发明微流控芯片性能分析：
1.线性：本发明以超敏C反应蛋白标准品浓度值(标准品分别 为0、10、25、50、100、200ng/mL)为X轴，以标准品信号值为Y 轴，建立定标曲线，根据待测样本的信号值强度回算相应的浓度值， 如图4所示，线性方程为y＝19.082x+151.34，R2＝0.9955，最低检 测限为0.8ng/mL。
取浓度为25ng/ml的超敏C反应蛋白标准品进行10次试验，利 用线性方程y＝19.082x+151.34，计算检测浓度值；检测结果如表1 所示，测定的平均值分别为25.084ng/ml，标准偏差为314，批内变 异系数为1.3％。
表1
超敏C反应蛋白标准品(10pg/ml)
第一次 25.14
第二次 24.91
第三次 25.15
第四次 24.89
第五次 24.93
第六次 25.08
第七次 24.96
第八次 25.05
第九次 24.81
第十次 25.92
平均值 25.084
标准偏差 0.314
批内变异系数 1.3％
2.稳定性：取超敏C反应蛋白微流控芯片进行常规贮存稳定性试 验，2-8℃放置分别按时间1，3，5，7，9，11，12，13，14，15个 月进行检测；开盖稳定性试验分别按2-8℃放置0天、7天、14天、 16天、18天、24天、30天、35天、45天、60天进行测定；结果显 示超敏C反应蛋白微流控芯片贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为 12个月，开盖贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为45天。
3.特异性检测：在所示浓度检测以下内源性物质，检测结果如下 表2，没有发现显著的干扰性。
表2
干扰物 添加最高浓度
甘油三酯 1000mg/dl
血红蛋白 50mg/dl
肝素钠 40U/ml
EDTA.K2 600μg/ml
生物素 20ng/ml
胆红素 50mg/dl
本发明微流控芯片检测结果准确度高、线性关系良好、稳定性好、 特异性强、灵敏度高，对于心血管疾病的干预及预后可以提供可靠的 临床参考价值。
不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多 种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同 物限定。

Claims (7)

1.一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片，其特征在于，包括基板和盖板，基板与盖板通过键合而成，所述基板、盖板的截面均为长方形结构，所述盖板上设有加样孔、检测孔，所述基板上依次设有加样区、反应区、检测区、废液区，所述反应区包被有荧光微球标记的超敏C反应蛋白抗体I，检测区内固定包被有不同表位的超敏C反应蛋白抗体II；加样区的下端设有开口与过滤通道的上端相连通，所述反应区的上端设有开口与过滤通道的下端相连通，所述过滤通道内设有多层过滤棉，所述反应区的下端设有开口与反应通道的上端相连通，所述检测区的上端与反应通道的下端相连通，反应通道为S蛇形结构，反应通道内设有第一限流柱，所述检测区的下端设有开口与废液通道的上端相连通，废液区的上端设有开口与废液通道的下端相连通，所述废液区内设有第二限流柱，第二限流柱的截面为弧形结构，第二限流柱位于废液区上端开口处。
2.如权利要求1所述的一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片，其特征在于，所述加样区、反应区、检测区、废液区的截面均为圆形结构，且直径相同。
3.如权利要求1所述的一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片，其特征在于，所述废液通道的高度从检测区到废液区呈下降趋势，所述第二限流柱最高点高于检测区底部。
4.如权利要求1所述的一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片，其特征在于，所述过滤棉为全血分离膜。
5.如权利要求1所述的一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片，其特征在于，所述第一限流柱为圆柱形结构。
6.如权利要求1所述的一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片，其特征在于，所述加样孔与加样区相对应，所述检测孔与检测区相对应。
7.如权利要求1所述的一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片，其特征在于，所述基板、盖板选用聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯中的一种。
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