CN111093680A - 治疗变应性气道疾病(aad)/哮喘的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及间充质成血管细胞源间充质干细胞(MSC‑MSC)在治疗受试者的变应性气道疾病(AAD)/哮喘中的用途。

Description

治疗变应性气道疾病(AAD)/哮喘的方法
技术领域
本发明涉及治疗受试者的变应性气道疾病(AAD)/哮喘。
背景技术
哮喘是一种慢性呼吸疾病，影响全世界约3亿人，每年造成25万人死亡。其发病机理主要有三个部分：气道炎症(AI)；气道重塑(AWR；代表气道/肺的结构变化，最终导致气道纤维化和阻塞)；和气道高反应性(AHR；哮喘临床特征)。AWR可能起因于持续性或慢性AI，但也可以独立于AI发展并有助于AHR。
当前的哮喘疗法，包括皮质类固醇和β-激动剂，都集中在症状管理上，而不是疾病消退上，因此并不完全有效。使用基于β-激动剂的疗法治疗的受试者可缓解其哮喘症状，但其潜在的AI仍然存在。因此，需要长期使用β-激动剂的受试者处于哮喘严重恶化的更大风险中，从而导致住院和死亡。
皮质类固醇的金标疗法在治疗哮喘患者的严重和严重难治性亚群方面也无效。严重哮喘患者经常需要使用高剂量的皮质类固醇激素治疗，这可能与全身性副作用相关，并不一定改善肺功能或生活质量。此外，哮喘患者的严重难治性亚组表现出固定的气道限制，因此，该人群表明作为其哮喘症状一部分的AWR的关键作用，这突出了对可以靶向和降低AWR的治疗策略的迫切需要。
间充质干细胞(MSC)是能分化成许多细胞谱系的多能基质细胞。这些细胞表达I类主要组织相容性复合体(MHC-I)，但缺乏MHC-II和共刺激分子CD80、CD86和CD40，因此具有免疫特权。因此，MSC可以通过静脉内(IV)输注全身给药，从而可以广泛分布。IV给药后，MSC会在肺中积聚。MSC还通过表达趋化因子受体4型向损伤组织归巢，如同在哮喘中一样，趋化因子受体4型的表达在促炎性环境中增强，从而增强其归巢能力。
已经用模拟人哮喘的几种特征的变应性气道疾病(AAD)小鼠模型证明了，MSC通过直接的细胞接触和旁分泌因子分泌而表现出免疫调节和抗炎特性。证明外源MSC的施用降低了Th2增殖并降低了Th2偏好，这有助于AAD。已经观察到抑制树突状细胞活化、迁移和抗原呈递的抑制。在支气管肺泡灌洗液中观察到嗜酸性粒细胞相关促炎性细胞因子的减少。与抑制AI的皮质类固醇相比，在这些模型中已证明MSC主动减少引起炎症的细胞的存在和活性。
此外，已证明MSC治疗可减少气道上皮厚度、平滑肌增生和杯状细胞化生，并通过其促进降解胶原的明胶酶水平的能力适度降低上皮下和胶原的总沉积(纤维化)，这表明MSC也有抗重塑作用。
但是，并未始终如一地证明MSC缓解与慢性疾病环境相关的不良症状，并且MSC治疗的结果会因其组织起源/来源、培养物扩展的程度、供体依赖性生存力和功效以及给药时间而异。
此外，MSC仅在与第二种治疗剂联合施用时才显示出有益的作用。
此外，由于只能从每个供体器官中分离相对少量的MSC，因此需要连续地供应供体以促进足够的数量供实验使用和商业使用。
应当理解，如果本文引用了任何现有技术出版物，则该引用并不意味着承认该出版物在澳大利亚或任何其他国家构成本领域公知常识的一部分。
发明概述
第一方面提供了用于治疗受试者中的AAD/哮喘的方法，所述方法包括向该受试者施用间充质成血管细胞间充质干细胞(MCA-MSC)，其中MCA-MSC表达miR-145-5p、miR-181b-5p和miR-214-3p，但不表达miR-127-3p和miR-299-5p。
第一方面的替代或另外的实施方式提供了间充质成血管细胞间充质干细胞(MCA-MSC)在制备用于治疗受试者中的AAD/哮喘的药物中的用途，其中MCA-MSC表达miR-145-5p、miR-181b-5p和miR-214-3p，但不表达miR-127-3p和miR-299-5p。
第一方面的另一个替代或另外的实施方案提供了用于治疗受试者的AAD/哮喘的方法中的间充质成血管细胞间充质干细胞(MCA-MSC)，其中MCA-MSC表达miR-145-5p、miR-181b-5p和miR-214-3p，但不表达miR-127-3p和miR-299-5p。
在一个实施方案中，MCA-MSC具有CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45-表型。
在一个实施例中，MCA-MSC通过包括以下的方法制备，所述方法包括：
(a)在常氧条件下在包含LiCl和FGF2但不包括PDGF的间充质集落形成培养基(M-CFM)中将原始中胚层细胞培养足够的时间，以形成间充质集落；和
(b)贴壁培养(a)的间充质集落，以产生MCA-MSC。
在一实施方案中，MCA-MSC被静脉内或鼻内施用。在一实施方案中，MCA-MSC被鼻内施用。
在一个实施方案中，治疗包括向受试者施用约1×106至约1×109个MCA-MSC。
在一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在一个实施方案中，受试者是人。
在一个实施方案中，受试者先前已经被施用了治疗哮喘的皮质类固醇或β激动剂。在另一个实施方案中，受试者先前未被施用治疗哮喘的皮质类固醇或β激动剂。
在一个实施方案中，受试者不被施用皮质类固醇或β激动剂。
在一实施方案中，受试者患有严重哮喘或严重难治性哮喘。
在一个实施方案中，治疗AAD/哮喘或其典型特征包括：
(a)降低AI、AWR、气道纤维化、肺纤维化、杯状细胞化生、上皮增厚、气道转化生长因子(TGF)-β1水平、上皮下肌成纤维细胞密度、上皮下胶原浓度或肺总胶原浓度；或
(b)增加肺基质金属蛋白酶(MMP)活性；或
(c)(a)的任一种或多种特征的任意组合，或者(a)和(b)的任一种或多种特征的任意组合。
使用MCA-MSC治疗AAD/哮喘或其典型特征可以提供以下一项或多项非限制性优势：
·即使不是彻底也会实质性逆转异常气道TGF-β1水平、气道/肺纤维化和AHR，
·降解胶原的MMP的水平升高，
·对所测参数的基础表达无影响，
从而表明安全有效地治疗AAD/哮喘。
本发明提供的解决方案是出乎意料的，因为先前的研究表明卵白蛋白(OVA)诱导的上皮下和总胶原沉积的促进只有在基于干细胞的治疗与抗纤维化药物联合使用时才能完全逆转。因此，本发明在治疗AAD/哮喘方面提供了显著的改善。
附图简述
图1显示了实施例4的MCA-MSC对支气管周围炎症评分的影响。A)来自所研究的各组的苏木精和曙红(H&E)染色的肺切片的代表性纤维照片显示了存在于气道上皮层内和其周围的支气管壁炎性细胞浸润的程度。比例尺＝50μm。B)还显示了来自五只气道/小鼠的平均±SEM炎症评分，n＝8只小鼠/组，其中以0(无明显炎症)至4(严重炎症)的等级对切片的炎性聚集物的数量和分布进行了评分。与盐水(SAL)组相比，*P<0.05，***P<0.001；与OVA组相比，###P<0.001。
图2显示了实施例4的MCA-MSC对杯状细胞化生的影响。A)来自所研究的各组的阿尔辛蓝高碘酸希夫(ABPAS)染色的肺切片的代表性显微照片显示了气道上皮层内杯状细胞的程度(仅在OVA注射的小鼠中以箭头表示)。比例尺＝25μm。B)还显示了来自五只气道/小鼠的平均值±SEM杯状细胞计数，n＝8只小鼠/组。与盐水(SAL)组相比，***P<0.001；与OVA组相比，##P<0.01，###P<0.001。
图3显示了实施例4的MCA-MSC对气道上皮厚度和上皮下胶原沉积(纤维化)的影响。A)来自所研究的各组的Masson三色染色的肺切片的代表性显微照片显示了气道上皮厚度和上皮下胶原厚度的程度(蓝色染色)。比例尺＝50μm。还显示了来自五个气道/小鼠的相对于基底膜(BM)长度的平均值±SEM B)上皮厚度(μm2)和C)上皮下胶原厚度(μm)，(n＝8小鼠/组)。与盐水(SAL)组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与OVA组相比，#P<0.05,###P<0.001；与OVA MCA-MSC IV组相比，
Figure BDA0002408908630000051
图4显示了实施例4的MCA-MSC对肺总胶原浓度(另一种纤维化测量)的影响。显示了来自所研究的各组的平均值±SEM肺总胶原浓度(％肺胶原含量/干重组织)；由每只小鼠第二大肺叶测量，n＝8只小鼠/组。与盐水(SAL)组相比，**P<0.01，**P<0.01,***P<0.001；与OVA组相比，#P<0.05，###P<0.001；与OVA MCA-MSC IV相比，
Figure BDA0002408908630000052
图5显示了实施例4的MCA-MSC对气道TGF-β1(促纤维化细胞因子)表达的影响。A)来自所研究的各组的免疫组织化学(IHC)染色的肺切片的代表性纤维照片显示了在气道上皮层内和其周围的TGF-β1染色/表达程度。比例尺＝50μm。B)还显示了来自五只气道/小鼠的相对平均值±SEM TGF-β1染色(表示为％/视野)，n＝7-8只小鼠/组。与盐水(SAL)组相比，***P<0.001；与OVA组相比，###P<0.001。
图6显示了实施例4的MCA-MSC对上皮下肌成纤维细胞(产生纤维化的关键细胞)密度的影响。A)来自所研究的各组的IHC染色的肺切片的代表性显微照片显示了气道上皮下层内α-SMA染色的肌成纤维细胞密度的程度(如箭头所示)。比例尺＝25μm。B)还显示了来自五只气道/小鼠的平均值±肌成纤维细胞的SEM数(每100μm BM长度)，n＝7-8只小鼠/组的。与盐水(SAL)组相比，***P<0.001；与OVA组相比，#P<0.05,###P<0.001；与OVA MCA-MSC IV组相比，
Figure BDA0002408908630000053
图7显示了实施例4的MCA-MSC对MMP-9(胶原降解酶)水平的影响。A)代表性明胶酶谱图(倒像)显示了所研究的各组中肺MMP-9(明胶酶B；92kDa)和MMP-13(胶原酶3；约55kDa)的相对表达水平。在每种情况下，将每个样品10μg的总蛋白加载到酶谱仪上进行分析；对每组的另外五六个样品进行分析的不同酶谱图产生了相似结果。B)还显示了来自n＝7-8只小鼠/组的相对平均值±SEM光学密度(OD)MMP-9(在雌性Balb/c小鼠的肺中表达最丰富)。与盐水(SAL)组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与OVA组相比，###P<0.001；与OVA MCA-MSC IV组相比，
Figure BDA0002408908630000061
图8显示了实施例4的MCA-MSC对AHR的影响。通过侵入性体积描记法评估了响应于剂量渐增的雾化乙酰甲胆碱(支气管收缩剂；并表示为自基线的阻力变化)的气道阻力(反映AHR的变化)。显示了来自n＝7-8只小鼠/组的针对所测试的各乙酰甲胆碱剂量的平均±SEM气道阻力。与盐水(SAL)组相比，*P<0.05,***P<0.001；与OVA组相比，##P<0.01,###P<0.001；与OVA MCA-MSC IV组相比，
Figure BDA0002408908630000062
图9是实施例5和6的慢性变应性气道疾病模型的示意性时间表。治疗从第64-78天开始(建立和持续进行肺部病理)。
图10显示了实施例5的补充有***(DEX)的MCA-MSC对AHR的影响。根据实施例4，通过侵入性体积描记法评估了响应于剂量渐增的雾化乙酰甲胆碱(支气管收缩剂，表示为自基线的阻力变化)的气道阻力(反映AHR的变化)。显示了来自n＝6-8只小鼠/组的针对所测试的各乙酰甲胆碱剂量的平均值±SEM气道阻力。与(SAL)组相比，*P<0.05，***P<0.001；与OVA组相比，#P<0.05，###P<0.001；与OVA+DEX组相比，
Figure BDA0002408908630000063
图11显示了实施例6的鼻内(IN)、静脉内(IV)和气管内(ET)施用的MCA-MSC对AHR的影响。通过侵入性体积描记法评估响应于剂量渐增的雾化乙酰甲胆碱(支气管收缩剂，表示为自基线的阻力变化)的气道阻力(反映AHR的变化)。显示了来自n＝6-8只小鼠/组的针对所测试的各乙酰甲胆碱剂量的平均值±SEM气道阻力。与盐水治疗组相比，**p<0.01,***p<0.001；与OVA组相比，##p<0.01。
发明详述
称为气道重塑(AWR)的结构变化以慢性/严重哮喘为特征，并导致肺功能障碍。通常，用皮质类固醇和/或β激动剂来管理哮喘。
本发明涉及使用MCA-MSC治疗受试者的哮喘，这是对使用皮质类固醇和/或β激动剂治疗哮喘的改进，并且是对提议的MSC与其他药剂组合的疗法的改进。
实施例1和2证明诱导的人多能干细胞(iPSC)分化成称为间充质成血管细胞(MCA)的前体细胞，然后分化成间充质干细胞(MCA-MSC)，MCA是一类早期克隆内胚层(mesoendodermal)前体细胞。由于iPSC可以无限增殖，且MCA本身可以扩展为数量极大的MSC，因此可以从衍生自单个健康的血液供体的单个iPSC主细胞库获得足够的MCA-MSC，从而限制供体依赖性和扩增依赖性变异性和来自非靶细胞的污染，而无需在MSC形成后进行过度培养扩展。
与现有技术的MSC相比，本公开的MCA-MSC提供了基本上不受限制的供应的优点以及改善的免疫调节作用的进一步的优点。
在本公开中，特别是在实施例4和5中，研究了将这些MCA-MSC递送至已建立的慢性AAD的鼠模型时的治疗潜力。该AAD的鼠模型呈现人哮喘的三个主要特征，即AI、AWR和AHR，并且在本领域中被接受为哮喘的临床前模型。特别是，比较了静脉内(IV)施用与鼻内(IN)施用的MCA-MSC的抗重塑作用。
重要的是，尽管某些MSC在治疗哮喘或其症状方面可能已显示出某些功效，但只有将这些MSC与其他治疗剂联合使用时才能获得这种效果。有利的是，本发明避免了对联合疗法的需要。
哮喘
哮喘和/或AAD可能具有任意组合的一种或多种下述特征：AI、AWR、AHR、气道/肺纤维化、杯状细胞化生、上皮增厚、气道转化生长因子(TGF)-β1水平升高、肺MMP-9缺乏或水平低、上皮下肌成纤维细胞密度增加、上皮下胶原积累和肺总胶原积累。
因此，用本公开的MCA-MSC治疗哮喘和/或AAD的特征可以是任意组合的一种或多种下述特征：AI降低、AWR降低、气道/肺纤维化降低、杯状细胞化生降低、上皮增厚降低、气道转化生长因子(TGF)-β1水平降低、上皮下肌成纤维细胞和胶原减少，以及肺总胶原浓度降低。
用本公开的MCA-MSC治疗AAD/哮喘可以增加MMP的表达/活性，例如明胶酶和/或胶原酶。在一实施方案中，MMP是MMP-9。在另一个实施方案中，MMP是MMP13。在另一个实施方案中，MMP是MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8或MMP12。
间充质成血管细胞-间充质干细胞(MCA-MSC)
因此，本发明通过施用MCA-MSC提供了针对AAD/哮喘或其一种或多种典型特征的改进疗法。MCA-MSC通过其免疫调节特性发挥作用，并能够直接在产生AAD/哮喘的典型特征的部位起作用。
MCA-MSC分泌生物活性分子，例如细胞因子、趋化因子和生长因子，并具有调节免疫***的能力。已证明MCA-MSCs无需依赖移植入就能促进免疫***的再生和作用。换句话说，MCA-MSC本身并不一定要并入宿主受试者中，而是在短时间内发挥作用，然后被消除。然而，可以移植入MCA-MSC。
本文所用的“间充质干细胞”或“MSC”是指可以从包括骨髓、脂肪组织(脂肪)、胎盘和脐带血在内的多种组织中分离的特定类型的干细胞。或者，MSC可以由多能干细胞(PSC)产生。MSC也称为“间充质基质细胞”。
本文所用的“MCA-MCS”是指从iPSC经由通过间充质成血管细胞表型而产生的特定类型的MSC。由PSC产生MCA-MSC描述于2017年3月14日提交的国际专利申请第PCT/AU2017/050228中，通过引用将该申请全文并入，并在实施例1和2中进行了描述。例如，如实施例3所证明的，MCA-MSC不同于现有技术的MSC。
已经证明，MSC对T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞和天然杀伤细胞发挥免疫调节活性。尽管不希望受到理论的束缚，但潜在的机制可能包括免疫调节介质，例如一氧化氮、吲哚胺、2,3,双加氧酶、***素E2、肿瘤坏死因子诱导基因6蛋白、CCL-2和程序性死亡配体1。这些介质以低水平表达，直到受到诸如IFNγ、TNFα和IL-17等炎性细胞因子刺激为止。
本文所用的“多能干细胞”或“PSC”是指具有无限繁殖自身并分化为任何其他细胞类型的能力的细胞。PSC主要有两种类型：胚胎干细胞(ESC)；和诱导型多能干细胞(iPSC)。
本文所用的“胚胎干细胞”或“ESC”是指从已经完成体外受精治疗并且具有多余胚胎的受试者同意捐赠的5-7日大的胚胎中分离的细胞。有关从人胚胎中提取细胞的伦理问题在某种程度上阻碍了ESC的使用。
合适的人PSC包括H1和H9人胚胎干细胞。
本文所用的“诱导型多能干细胞”或“iPSC”是指源自成体细胞的ESC样细胞。iPSC与ESC具有非常相似的特性，但是避免了与ESC相关的伦理问题，因为iPSC并非源自胚胎。实际上，iPSC通常来自已经被“重新编程”回多能状态的完全分化的成体细胞。
合适的人iPSC包括但不限于衍生自成纤维细胞的iPSC 19-9-7T、MIRJT6i-mND1-4和MIRJT7i-mND2-0以及衍生自骨髓单核细胞的iPSC BM119-9。其他合适的iPSC可以从美国威斯康星州麦迪逊市的Cellular Dynamics International(CDI)获得。
在一个实施方案中，根据本发明的MCA-MSC由原始中胚层细胞形成。原始中胚层细胞可具有间充质成血管细胞(MCA)的潜力。原始中胚层细胞可具有EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+表型。在一个实施方案中，本发明所用的MCA-MSC由具有MCA潜力的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞形成。
本发明所用的“具有MCA潜力的EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRα+原始中胚层细胞”是指表达典型原条和侧板/胚外中胚层基因的细胞。这些细胞具有在无血清培养基中响应成纤维细胞生长因子2(FGF2)形成MCA和成血管细胞集落的潜力。根据实施例2，这些细胞在培养时变成MCA-MSCA。
术语EMHlin-表示缺少CD31 VE-钙黏素内皮标志物、CD73和CD105间充质/内皮标志物以及CD43和CD45造血标志物的表达。
在一个实施方案中，本发明所用的MCA-MSC表现出CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45-表型。
在一个实施方案中，本发明所用的MCA-MSC表达microRNAs miR-145-5p、miR-181b-5p和miR-214-3p中的每一个，但不表达miR-127-3p和miR-299-5p。
除了本文证明的MCA-MSC在治疗AAD/哮喘方面的作用外，它们还具有可在体外评估为MCA-MSC抑制辅助性T细胞(CD4+)淋巴细胞增殖的能力的“免疫调节活性”。例如如使用免疫潜能测定法所测定的，可以相对于参照在体外量化免疫调节活性。
合适的免疫潜能测定法使用本文公开的方法产生的辐照测试MCA-MSC和辐照参考样品MSC，将它们分别以不同浓度与从健康供体外周血纯化的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯标记的白细胞一起进行平板接种。通过添加CD3和CD28抗体来刺激代表参考样品子集的辅助性T细胞(CD4+)淋巴细胞。使用流式细胞术计数CD4标记的T细胞，来评估T细胞增殖。IC50值报告为参考样品的函数。较高的IC50值表示更大程度的辅助性T细胞(CD4+)淋巴细胞增殖抑制，因此表示优异的T细胞免疫调节特性。在用于此测定之前，先对MSC样品进行辐照，以消除其增殖潜能的混杂因素。
用MCA-MSC治疗AAD/哮喘
本领域技术人员应当理解，向受试者施用治疗有效量的MCA-MSC以治疗受试者的AAD/哮喘的准确方式应由医师决定。给药方式，包括剂量、与其他药剂的组合、给药的时间和频率等，可能受到受试者的状况和病史的影响。
尽管本发明的一个优点是MCA-MSC可以单独用于治疗AAD/哮喘或其典型特征，但是应当理解，MCA-MSC可以与另一种哮喘疗法组合。例如，当哮喘受试者具有例如包含皮质类固醇或β-激动剂疗法的现有哮喘治疗方案，并且随后进行MCA-MSC治疗时，医师仍可以用另一种哮喘疗法治疗哮喘受试者。
MCA-MSC可以作为治疗组合物施用。本文所用的术语“治疗组合物”是指包含本文所述的MCA-MSC或MCA-MSC群，已被配制用于施用于受试者的组合物。优选，治疗组合物是无菌的。在一实施方案中，治疗组合物是无热原的。
在一个实施方案中，将MCA-MSC或治疗组合物提供在容器中，优选无菌容器，优选无热原的容器。在一个实施方案中，容器是注射器，例如适合于推注给药。在另一个实施例中，容器是适合于输注的输液袋。在另一个实施方案中，所述容器适于IN给药。
MCA-MSC的配制、剂量给药和给药应当以符合良好的医学规范的方式进行。在这种情况下，要考虑的因素包括正在治疗的病症的具体类型和预期的副作用或症状、正在治疗的具体受试者、受试者的临床状况、给药部位、给药方法、给药时间表和医师已知的其他因素。待施用的MCA-MSC的治疗有效量会受到这些考虑因素的控制。
MCA-MSC的剂量范围可以为约103个细胞/m2到约1011个细胞/m2，例如约106个细胞/m2到约2x108个细胞/m2，或者约103个细胞/m2，约5x103个细胞/m2，约104个细胞/m2，约5x104个细胞/m2，约105个细胞/m2，约5x105个细胞/m2，约106个细胞/m2，约5x106个细胞/m2，约107个细胞/m2，约5x107个细胞/m2，约108个细胞/m2，约5x108个细胞/m2，约109个细胞/m2，约5x109个细胞/m2，约1010个细胞/m2，约5x1010个细胞/m2或约1011个细胞/m2。
MCA-MSC的剂量范围可以为约103个细胞/kg至约1011个细胞/kg，例如约106个细胞/kg至约2x108个细胞/kg，或约103个细胞/kg，约5x103个细胞/kg，约104个细胞/kg，约5x104个细胞/kg，约105个细胞/kg，约5x105个细胞/kg，约106个细胞/kg，约5x106个细胞/kg，约107个细胞/kg，约5x107个细胞/kg，约108个细胞/kg，约5x108个细胞/kg，约109个细胞/kg，约5x109个细胞/kg，约1010个细胞/kg，约5x1010个细胞/kg，或约1011个细胞/kg。
MCA-MSC的剂量范围可以为约103个细胞到约1011个细胞，例如约106个细胞到约2x108个细胞，或者约103个细胞，约5x103个细胞，约104个细胞，约5x104个细胞，约105个细胞，约5x105个细胞，约106个细胞，约5x106个细胞，约107个细胞，约5x107个细胞，约108个细胞，约5x108个细胞，约109个细胞，约5x109个细胞，约1010个细胞，约5x1010个细胞或约1011个细胞。
术语“治疗有效量”是指在受试者中有效治疗的MCA-MSC的量。
MCA-MSC可以以单剂量、分剂量或多剂量施用。例如，可以在受试者的鼻孔之间施用分剂量，例如每个鼻孔约剂量的一半。
可以向受试者施用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10剂量的MCA-MSC。
可以相隔1周、2周、1个月或2个月向受试者施用两剂量或更多剂量的MCA-MSC。例如，如果在已经用MCA-MSC治疗的受试者中复发了AAD/哮喘或其典型特征，则可以在复发时或复发后每季度、每半年、每年、每两年或者以更大的间隔向受试者使用两剂量或更多剂量。
MCA-MSC可以通过任何合适的途径全身或外周施用，例如通过包括以下的途径：静脉内(IV)、鼻内(IN)、气管内、肺内和动脉内。在一个实施方案中，通过IV、IN、气管内或肺内途径施用MCA-MSC。在一个实施方式中，以IN施用MCA-MSC。
在一个实施方案中，在给药前预处理MCA-MSC。预处理可以用生长因子或通过基因编辑进行，例如，在生长因子可以引发MCA-MSC，而基因编辑可以赋予MCA-MSC新的治疗特性的情况下。
可以在受试者发展AAD/哮喘或其典型特征之前、之中或之后向受试者施用MCA-MSC。
因此，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指治疗性处置和预防(prophylatic)或预防(preventative)措施，其中目的是预防、减少或改善受试者的AAD/哮喘或其典型特征，或减慢(减轻)受试者的AAD/哮喘或其典型特征的进程。需要治疗的受试者包括已经患有AAD/哮喘或其典型特征的受试者，以及要预防或改善AAD/哮喘或其典型特征的受试者。
术语“预防(preventing)”、“预防(prevention)”、“预防(preventative)”或“预防(prophylatic)”是指防止AAD/哮喘或其典型特征发生，或阻止、防御或免受AAD/哮喘或其典型特征的发生。例如由于家族史，需要预防AAD/哮喘或其典型特征的受试者可能倾向于发展AAD/哮喘或其典型特征。
术语“改善(ameliorate)”或“改善(amelioration)”是指降低、减少或消除AAD/哮喘或其典型特征。
通过施用MCA-MSC治疗AAD/哮喘或其典型特征可使AAD/哮喘或其典型特征降低约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约15％，约20％，约25％，约30％，约35％，约40％，约45％，约50％，约55％，约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或约100％。
在一个实施方案中，通过施用MCA-MSC来治疗AAD/哮喘或其典型特征可以将AAD/哮喘或其典型特征降低至与未患有AAD/哮喘或其典型特征的受试者相等的量级。
本领域技术人员应当容易地理解如何评估和量化AAD/哮喘或其典型特征，并且能够例如使用本发明实施例阐述的方法而没有困难或过度负担地进行。例如，可以量化以下内容：i)炎症评分，作为AI的量度；ii)杯状细胞化生，作为AI诱导的AWR的量度；iii)上皮厚度，作为AWR的量度；iv)上皮下胶原的厚度，作为AWR/纤维化的量度；v)肺总胶原浓度，作为AWR/纤维化的量度；vi)上皮TGF-β1染色，作为AWR的量度；vii)上皮下肌成纤维细胞密度，作为AWR的量度；viii)明胶酶(例如MMP-2和/或MMP-9)和/或胶原酶(例如MMP-1和/或MMP13)的表达/活性，作为AWR的量度；和/或ix)气道高反应性/反应性，作为肺功能和AHR的量度。
可以将AAD/哮喘或其典型特征的任何定量与对照进行比较，例如，未患有AAD/哮喘或其典型特征的健康对照受试者或健康对照受试者群。或者，对照可以是患有AAD/哮喘或其典型特征且已经用MCA-MSC治疗并对其作出反应的对照受试者或对照受试者群。
本文所用的术语“受试者”可以指哺乳动物。哺乳动物可以是灵长类动物，特别是人，或者可以是家畜、动物园动物或伴侣动物。尽管特别考虑了本文公开的方法适用于人的医疗，但它也适用于兽医治疗，包括治疗诸如马、牛和绵羊等家畜，诸如狗和猫等伴侣动物或诸如猫科动物、犬科动物、牛科动物和有蹄类动物等动物园动物。
除非本说明书另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解和引用的公开文本相同的含义。
要注意的是，术语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”是指一个/种或多个/种，例如“MCA-MSC”应理解为代表一个或多个MCA-MSC。因此，术语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”可以在本文种可互换使用。
在随后的权利要求书和本发明的描述中，除非上下文由于明确的语言或必要的暗示另有要求外，否则以包括性含义使用“包含(comprise)”一词或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”之类的变体，即在本发明的各种实施方案中规定存在所陈述的特征，但不排除存在或增加其他特征。
本文所用的术语“约”涵盖给定数值的±25％的值范围。在其他实施例中，术语“约”涵盖给定数值的±20％、±15％、±10％或±5％的值范围。例如，在一个实施例中，“约3克”表示2.7克至3.3克(即3克±10％)等。
类似地，事件的时间或持续时间可以变化至少25％。例如，尽管在一个实施方案中可以将特定事件公开为持续一天，但是该事件可以持续多于或少于一天。例如，“一天”可以包括约18小时到约30小时的时间。在其他实施方案中，时间段的变化可以为该时间段的±20％，±15％，±10％或±5％。
下列实施例有助于描述本发明，但本发明不限于这些实施例。
实施例
实施例1.用于产生MCA-MSC的试剂
表1.试剂
Figure BDA0002408908630000141
Figure BDA0002408908630000151
表1中列出的试剂是本领域技术人员已知的并且具有可接受的组成，例如IMDM和Ham’s F12。GLUTAMAX包含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，通常以200mM在0.85％NaCl中提供。当培养的细胞裂解二肽键时，GLUTAMAX释放L-谷氨酰胺。化学规定脂质浓缩物包含花生四烯酸2mg/L、胆固醇220mg/L、DL-α-醋酸生育酚70mg/L、亚油酸10mg/L、亚麻酸10mg/L、肉豆蔻酸10mg/L、油酸10mg/L、棕榈酸10mg/L、棕榈油酸10mg/L、普朗尼克F-68 90g/L、硬脂酸10mg/L、吐温
Figure BDA0002408908630000161
2.2g/L和乙醇。H-1152和Y27632是高度有效的细胞渗透性选择性ROCK(Rho相关的螺旋形螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶)抑制剂。
表2.IF6S培养基(10X浓度)
10X IF6S 量 终浓度
IMDM 1包，粉末，1L 5X
Ham’s F12营养混合物 1，粉末，1L 5X
碳酸氢钠 4.2g 21mg/mL
L-抗坏血酸2-磷酸Mg<sup>2+</sup> 128mg 640μg/mL
1-硫代甘油 80μL 4.6mM
***钠(0.7mg/mL溶液) 24μL 84ng/mL
GLUTAMAX 20mL 10X
非必需氨基酸 20mL 10X
化学规定脂质浓缩物 4mL 10X
胚胎移植级水 至200mL NA
表3.IF9S培养基(1X浓度；基于IF6S)
IF9S 量 终浓度
IF6S 5mL 1X
聚乙烯醇(PVA；20mg/mL溶液) 25mL 10mg/mL
全铁运铁蛋白(10.6mg/mL溶液) 50μL 10.6μg/mL
胰岛素 100μL 20μg/mL
胚胎移植级水 To 50mL NA
表4.分化培养基(1X浓度；基于IF9S)
分化培养基 量 终浓度
IF9S 36mL 1X
FGF2 1.8μg 50ng/mL
LiCl(2M溶液) 36μL 2mM
BMP4(100μg/mL溶液) 18μL 50ng/mL
激活蛋白A(10mg/mL溶液) 5.4μL 1.5ng/mL
表5.间充质菌落形成培养基(1X浓度)
间充质菌落形成培养基(M-CFM) 量 终浓度
ES-CULT M3120 40mL 40％
STEMSPAN SFEM 30mL 30％
人内皮-SFM 30mL 30％
GLUTAMAX 1mL 1X
L-抗坏血酸(250mM溶液) 100μL 250μM
LiCl(2M溶液) 50μL 1mM
1-硫代甘油(100mM溶液) 100μL 100μM
FGF2 600ng 20ng/mL
表6：间充质无血清扩增培养基(1X浓度)
Figure BDA0002408908630000162
Figure BDA0002408908630000171
实施例2.将人iPSC分化为MCA-MSC
1.在玻连蛋白涂覆(0.5μg/cm2)的塑料制品内的E8完全培养基(DMEM/F12基础培养基+E8补充剂)+1μM H1152中解冻iPSC。在37℃、5％CO2、20％O2(常氧)下孵育接种iPSC。
2.在玻连蛋白涂覆(0.5μg/cm2)的塑料制品内的E8完全培养基(无ROCK抑制剂)中扩增iPSC三代，并在37℃、5％CO2、20％O2(常氧)下孵育，然后开始分化过程。
3.收获iPSC，并将其作为单细胞/小集落以5x103个细胞/cm2接种于胶原IV涂覆(0.5μg/cm2)的塑料制品内的E8完全培养基+10μM Y27632中，并在37℃、5％CO2、20％O2(常氧)下孵育24h。
4.用分化培养基替换E8完全培养基+10μM Y27632，并在37℃、5％CO2、5％O2(常氧)下孵育48h，产生原始中胚层细胞。
5.由分化培养基粘附培养物收获集落形成原始中胚层细胞，作为单细胞悬浮液，转移至M-CFM悬浮培养物，并在37℃、5％CO2、20％O2(常氧)下孵育12天，直到间充质集落形成。
6.收获间充质集落，并将其接种于纤连蛋白/胶原I涂覆(0.67μg/cm2纤连蛋白，1.2μg/cm2胶原I)的塑料制品内的M-SFEM中，并在37℃、5％CO2、20％O2(常氧)下孵育3天，以产生MSC(第0代)。
7.收获集落并将其作为单细胞(第1代)以1.3x104个细胞/cm2接种于纤连蛋白/胶原1涂覆的塑料制品内的M-SFEM中，并在37℃、5％CO2、20％O2(常氧)下孵育3天。
8.收获并作为单细胞(第2代)以1.3x104个细胞/cm2接种于纤连蛋白/胶原1涂覆的塑料制品内的M-SFEM中，并在37℃、5％CO2、20％O2(常氧)下孵育3天。
9.收获并作为单细胞(第3代)以1.3x104个细胞/cm2接种于纤连蛋白/胶原1涂覆的塑料制品内的M-SFEM中，并在37℃、5％CO2、20％O2(常氧)下孵育3天。
10.收获并作为单细胞(第4代)以1.3x104个细胞/cm2接种于纤连蛋白/胶原1涂覆的塑料制品内的M-SFEM中，并在37℃、5％CO2、20％O2(常氧)下孵育3天。
11.收获并作为单细胞(第5代)以1.3x104个细胞/cm2接种于纤连蛋白/胶原1涂覆的塑料制品内的M-SFEM中，并在37℃、5％CO2、20％O2(常氧)下孵育3天。
12.作为单细胞加以收获并冷冻终产物。
进行了两个实验(TC-A-96和DAD-V-90)以研究用PDGF-BB(10ng/mL)和/或LiCl(1mM)补充M-CFM对iPSC源MCA-MSC的T细胞抑制的影响。使用Waisman Biomanufacturing的ImmunoPotency Assay(IPA)对产生的T细胞抑制进行评估。
如表7所述，评估了血小板源生长因子(PDGF)和LiCl的以下组合：PDGF+/LiCl+、PDGF-/LiCl-、PDGF+/LiCl-和PDGF-/LiCl+。请注意，在TC-A-96实验中比较了两种不同的Dneg1种子密度(5x103个细胞/cm2和1x104个细胞/cm2)和分化培养基中两种不同浓度的激活蛋白A(AA)(1X AA＝15ng/mL和0.1X AA＝1.5ng/mL)。在DAD-V-90实验中使用了单个Dneg1种子密度(5x10e3个细胞/cm2)和激活蛋白A浓度(1.5ng/mL)。另请注意，第一个IPA(IPA 1)使用了一个leukopak(LPK7)，第二个IPA(IPA 2)使用了两个leukopak(LPK7和LPK8)。
设计该测定是为了评估各MSC系能抑制辅助性T细胞(CD4+)淋巴细胞增殖的程度。使用从健康受试者的外周血(源自Leucopak(LPK)的外周血单核细胞(PBMC))纯化的冷冻保存的白细胞测试冷冻保存的MSC。这样，预期LPK细胞群在供体之间变化。针对来自两个不同受试者的用于临床级材料的PMBC测试每个MCA-MSC测试样品，并且可以选择将测试限制为用于研究级材料的单个PMBC样品。每个MCA-MSC测试样品的测定均与参考标准MSC系一起运行，以确保测定完整性/可重复性，并使测试样品归一化。该测定法描述于Bloom etal.Cytotherapy,2015,17(2):140-51。
简而言之，将测试MCA-MSC暴露于21Gy的γ辐照下。在48孔组织培养板中，将4x10e5、2x10e5、4x10e4和2x10e4辐照过的MCA-MSC接种到各个孔中。PMBC分别用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯标记。将标记的PMBC细胞以每孔4x105个细胞进行平板接种，每个孔都包含上述MCA-MSC。这导致PBMC:MCA-MSC的滴定比例为1:1、1:0.5、1:0.1和1:0.05。额外的孔仅用受刺激的PBMC的接种，另一孔则仅用MCA-MSC接种，且另一1:0.05比例无刺激，所有这些都用作对照。随后，将T细胞刺激性单克隆抗体即抗人CD3-ε和抗人CD28(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)添加到每个孔中。
培养的第四天，从各个孔中收获细胞。将每个孔的细胞与别藻蓝蛋白标记的抗人CD4一起孵育。然后使用流式细胞仪通过羧基荧光素强度分析CD4+细胞的增殖。单独的MCA-MSC对照用于将MCA-MSC从共培养孔中分离出来。单独的PBMC对照用作最大T细胞增殖的阳性对照，针对该阳性对照测量MCA-MSC介导的抑制程度。使用未刺激的1:0.05比率的孔来生成阴性对照门控,并针对所述阴性对照门控测量增殖。
根据测试样品的比例，使用最佳拟合曲线生成IC50值。将IC50值归一化为参考标准(IC50参考标准/IC50测试样品)。对于更有效(抑制性更高)的样品，此归一化的IC50产生了较大值，而对于较不有效的样品，产生了较小的值。
结果
表7给出的IC 50数据表明，补充有LiCl但不包括PDGF(即PDGF-/LiCl+)的M-CFM对于分化iPSC以产生具有免疫调节作用的iPSC-MSC是最佳的。此外，较低浓度的激活蛋白A也改善了iPSC源MCA-MSC的免疫抑制。
表7.免疫潜能测定
Figure BDA0002408908630000201
该实施例产生的MCA-MSC表现出CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45-表型。
实施例3.MCA-MSC微RNA分析
针对包含1194个miRNA的微RNA(miRNA)微阵列和由miR-127-3p、miR-145-5p、miR-181b-5p、miR-214-3p、miR-299-5p组成的专有miRNA组分析了实施例2产生的MCA-MSC，针对71个MSC样品和94个非MSC样品验证了所述专有miRNA组。
实施例2产生的MCA-MSC表达miR-145-5p、miR-181b-5p和miR-214-3p中的每一个，但不表达miR-127-3p和miR-299-5p。.
在为所有测试样品生成的归一化数据(存在于至少一个测试样品中)中可靠检测到的微阵列的233个miRNA的主成分分析表明，实施例2产生的MCA-MSC不同于其他71个MSC样品中的每一个。
实施例4.体内治疗AAD/哮喘
方法和材料
动物
六至八周龄的雌性Balb/c小鼠获自Monash Animal Services(MonashUniversity,Clayton,Victoria,澳大利亚)，并在可控环境下以12小时光照/12小时暗光照周期进行饲养，可自由获取水和实验室食物(Barastock Stockfeeds,Pakenham,Victoria,澳大利亚)。在进行任何实验之前，为所有小鼠提供4-5天的适应期，并且所执行的所有程序符合澳大利亚用于科学目的的实验动物的护理和使用指南(Australian Guidelines forthe Care and Use of Laboratory Animals for Scientific Purposes)，得到Monash大学动物伦理委员会的批准(伦理编号：MARP/2016/078)。
慢性AAD的诱导
为了评估MSC在慢性AAD中的作用，在小鼠(n＝24)中建立了卵白蛋白(OVA)诱导的慢性AAD模型。在第0天和第14天，通过两次腹膜内(IP)注射10μg V级鸡卵OVA(Sigma-Aldrich,MO,USA)和400μg硫酸铝钾佐剂(alum；AJAX Chemicals,NSW,澳大利亚)致敏小鼠。然后，在第21-63天，通过使用超声波雾化器(Omron NE-U07；Omron,Kyoto,日本)，将它们全身吸入暴露(雾化)于雾化的OVA(在0.9％生理盐水中2.5％w/v)中三十分钟，每周三次，来攻击它们。但是，对于对照小鼠(n＝24)，给予它们IP注射500μL 0.9％的盐水，并用0.9％的盐水雾化，而不是OVA。
MCA-MSC治疗
在建立慢性AAD后24小时(在第64天)，OVA或盐水致敏/攻击的小鼠亚组(n＝8小鼠/组)经受MCA-MSC的IV或IN给药。在所有情况下，均选择14天的治疗期(从第64-77天开始)以复制用于评估诸如人骨髓源(基质)MSC和人羊膜细胞等其他干细胞在OVA诱导的AAD慢性模型中的IN递送作用的时间范围。
根据实施例1和2产生MCA-MSC。MSC的定义特征是表达CD73、CD90和CD105，并且MCA-MSC细胞对于所有这三种标志物均＞99％阳性，而对于CD43/45和CD31是阴性的，证实不存在造血和内皮谱系细胞。在治疗期间(第64天和第71天)，每周进行一次所有治疗。在每次预定治疗的早晨，将冷冻的MCA-MSC在37℃水浴中解冻，然后按如下方式重悬浮：对于MCA-MSC的IV给药，将1x 107个细胞重悬浮于2mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，将小鼠限制在Perspex抑制器中，并将1x 106个细胞/200μl PBS注入盐水或OVA致敏/攻击的小鼠的尾静脉。对于MCA-MSC的IN给药，将1x 107个细胞重悬浮于0.5mL PBS中。将小鼠用异氟烷(Baxter Health Care,NSW,澳大利亚)轻轻麻醉，并在鼻内滴注时使其保持半仰卧位。然后将1×106个细胞/50μl PBS IN施用于小鼠，使用自动移液器，每个鼻孔25μL。
侵入性体积描记法
在第78天(最后一次MCA-MSC治疗后7天)，用0.9％盐水中的***(10mg/kg体重)和甲苯噻嗪(2mg/kg体重)麻醉小鼠。然后用18号气管造口管对所有小鼠进行气管造口术。然后将小鼠放入Buxco FinePointe Plethysmograph(Buxco,Research Systems,Wilmington,NC,USA)的室内并通风。然后测量小鼠响应于溶解在PBS中且气管内递送的雾化乙酰甲胆碱(乙酰甲胆碱；Sigma-Aldrich,MO,USA)的剂量在4个剂量内从6.25mg/mL增加到50mg/mL以引起支气管收缩并评估AHR的气道阻力。将气道阻力的变化(每个剂量后的最大气道阻力减去单独的PBS基线阻力)相对于乙酰甲胆碱的相应剂量作图。
组织收集
在侵入性体积描记法之后，将每只动物的肺组织分离并在冷PBS中冲洗，然后分成四个独立的肺叶。将最大的肺叶固定在10％中性缓冲甲醛中过夜，然后进行切割和包埋在石蜡中(用于各种终点的组织学和免疫组织化学分析)。将其余的三个肺叶在液氮中速冻用于其他各种测定。
肺组织病理学
一旦将每只小鼠的最大肺叶包埋在石蜡中，就将每个组织块连续切片(厚3μm)，置于带电的Mikro Glass载玻片(Grale Scientific,Ringwood,Victoria,澳大利亚)上，并进行各种组织学染色或免疫组织化学。为了评估炎症评分、上皮厚度和上皮下细胞外基质(ECM)沉积，对每只小鼠的每个切片(每个载玻片)进行了Masson三色染色。为了评估杯状细胞化生，对第二组玻片进行了阿尔辛蓝高碘酸希夫(ABPAS)染色。如下文详述，对Masson三色和ABPAS染色的切片进行形态计量分析。
免疫组织化学(IHC)
IHC用于检测TGF-β1(使用多克隆抗体；sc-146；Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA；1:1000稀释)或α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA；肌成纤维细胞分化标志物；使用单克隆抗体；M0851；DAKO,Glostrup,Denmark；1:200稀释)。使用DAKO EnVision抗兔或抗小鼠试剂盒和3,3'-二氨基联苯胺(DAB)色原检测一抗染色，同时也将阴性对照包括在内，在没有任何一抗的情况下将其暴露于EnVision试剂盒。然后将所有载玻片用苏木精复染色，并由Monash Histology Services使用ScanScope AT Turbo(Aperio,CA,USA)扫描，进行形态计量分析。
形态计量分析
对Masson三色、ABPAS和IHC染色的载玻片进行如下形态计量分析。使用AperioImageScope软件(Aperio,CA,USA)随机选择并分析每个切片的五个气道(直径为150-300μm)。对Masson三色染色载玻片进行了半定量的细支气管周围炎症评分，其中，实验者被蒙蔽并从0(气道周围没有可检测到的炎症)到4(广泛且大量的炎性细胞聚集体，合并大小约0.6mm2)对单个气道进行评分。还通过测量上皮和上皮下ECM层(蓝色)的厚度，对Masson三色染色载玻片进行上皮厚度和上皮下ECM沉积的分析，将其表示为μm2/μm基底膜(BM)长度。
通过计数每100μm BM长度阳性染色的杯状细胞或α-SMA阳性细胞的数量，分别分析ABPAS、α-SMA染色的载玻片的杯状细胞化生和上皮下肌成纤维细胞数量。通过运行评估气道内强阳性染色像素的算法，分析了TGF-β1染色载玻片的TGF-β1蛋白表达。结果表示为每气道总面积(mm2)的强阳性像素数；然后相对于盐水处理的对照组，表示为1。
羟脯氨酸测定
如先前所述处理来自每只小鼠的第二大肺叶以测量羟脯氨酸含量(Royce,S.G.etal.,(2013)Clin.Sci.124,41-51)，其是根据纯化的反式-4-羟基-L-脯氨酸(Sigma-Aldrich)的标准曲线测定的。羟脯氨酸值乘以系数6.94(基于羟脯氨酸占大多数哺乳动物组织中胶原氨基酸组成的14.4％)来推断总胶原含量，然后将其除以每个相应组织的干重即可得出胶原百分比浓度。
明胶酶谱法
如前所述，对来自每只小鼠的第三大肺叶进行处理，以提取含有基质金属蛋白酶(MMP)的蛋白质(Woessner,J.F.,(1995)Methods Enzymol.248,510-528)，然后将总蛋白质的等分试样(每份样品10μg)在含有1mg/ml明胶的7.5％丙烯酰胺凝胶上进行评估。将明胶分解活性可视为透明条带。GS710密度计(Bio-Rad Laboratories,Gladesville,NSW,Australia)和Quantity-One软件(Bio-Rad)对MMP-9(雌性Balb/c小鼠的肺中主要的明胶酶)进行光密度测定。然后绘制MMP-9的相对平均值±SEM光密度(OD)图谱。
统计分析
使用GraphPad Prism v6.0(GraphPad Software Inc.,La Jolla,CA,USA)进行所有统计分析，并表示为平均值±SEM。AHR结果用Bonferroni事后检验通过双向方差进行分析。剩余数据用Neuman-Keuls事后检验通过通过单因素方差进行分析，以进行组间的多次比较。在每种情况下，在P<0.05时，数据均被认为是显著的。
结果
MCA-MSC对AI的影响
使用炎症评分***(0-4)由H&E染色的肺切片半定量AI。OVA损伤小鼠的支气管炎性评分(2.75±0.09)明显高于盐水(SAL)致敏/攻击的对照组的评分(0.25±0.09；与SAL组相比P<0.001)(图1)。OVA组中炎症水平升高证实了这些小鼠已成功被OVA致敏和攻击。
当向SAL对照小鼠施用MCA-MSC时，MCA-MSC给药显著降低了OVA诱导的支气管周炎性细胞浸润(1.25±0.23；与OVA组相比，P<0.001)，而不影响基础炎症评分(图1A，图1B)。但是，用MCA-MSC进行治疗不能将AI完全降回在SAL对照小鼠中测量的AI(对于向OVA损伤的小鼠施用MCA-MSC进行治疗，与SAL组相比，P<0.05)。
MCA-MSC对AWR的影响
杯状细胞化生
由ABPAS染色的肺切片对杯状细胞化生进行形态计量评估，并表示为每100μm BM长度的杯状细胞的数量(图2)。与SAL对照对应物相比，OVA处理的小鼠的杯状细胞数显著增加(6.08±0.52)(0.001±0.00；与SAL组相比，P<0.001；图2A、图2B)。MCA-MSC给药，尽管不是全部但能够显著降低OVA诱导的杯状细胞数量的促进(3.97±0.64至2.89±0.48，与OVA组相比，P<0.01；图2A、图2B)。但是，MCA-MSC的递送并未将OVA诱导的杯状细胞化生恢复到在SAL对照中所测量的值(与SAL组相比，均为P<0.001)，但不影响SAL处理的小鼠的杯状细胞数量。
气道上皮厚度
由Masson三色染色的肺切片对气道上皮厚度进行形态计量评估，并表示为μm2/μmBM长度(图3)。OVA处理的小鼠的上皮厚度(19.16±0.63)明显高于在SAL对照组中测量的上皮厚度(14.28±0.45；与SAL组相比，P<0.001；图3A、图3B)。与OVA组相比，MCA-MSCs的递送尽管不是全部但明显降低了上皮厚度(18.59±0.77至16.67±0.87)(与OVA组相比，P<0.05；与SAL组相比，P<0.05；图3A、图3B)。重要的是，MCA-MSC治疗不会影响SAL对照小鼠的基底上皮厚度。
上皮下胶原沉积
由Masson三色染色的肺切片对上皮下胶原沉积进行形态计量评估，并表示为μm2/μm BM长度(图3)，并且与SAL对照，其在OVA损伤的小鼠中明显升高(27.63±0.66)(14.31±1.87；与SAL组相比，P<0.001；图3A、图3C)。MCA-MSC的递送减少了OVA诱导的上皮下胶原沉积的异常促进(22.39±1.78至16.98±0.98；与OVA组相比，P<0.05；图3A、图3C)。
肺总胶原浓度(纤维化)
从每只小鼠第二大肺叶内存在的羟脯氨酸水平推算肺总胶原浓度(％胶原浓度/肺组织干重)，并将其用作纤维化的量度(图4)；且在与SAL对照中所测量的相比，在OVA损伤的小鼠中明显增加(3.94±0.09％)(2.89±0.18％；与SAL相比，P<0.001)。将MCA-MSC施用于损伤的OVA小鼠可减少肺的纤维化(3.26±0.17％至3.62±0.07％；与OVA组相比，P<0.05；图4)。
气道TGF-β1表达
为了确定MCA-MSC能够逆转OVA诱导的上皮下和总胶原沉积(纤维化)的机制，由IHC染色的肺切片对气道TGF-β1(促纤维化细胞因子)表达水平的相对变化进行形态计量评估，并以每个所分析气道的染色百分比表示(图5)。与在SAL对照中测量的表达相比，在OVA损伤小鼠中气道TGF-β1表达明显增加(1.85±0.13)(1.00±0.08；与SAL组相比，P<0.001；图5A、图5B)。将MCA-MSC递送至OVA损伤小鼠可使异常气道TGF-β1表达水平逆转回在SAL对照中测量的水平(1.06±0.05至1.22±0.05；与OVA组相比，P<0.001；不同于SA组)，并且当施用于SAL对照小鼠时，不会影响基础气道TGFβ1表达水平(图5A、图5B)。
上皮下肌成纤维细胞密度
还由IHC染色的肺切片对α-SMA染色的上皮下肌成纤维细胞密度的变化进行了形态计量评估，并表示为成每100μm BM长度的肌成纤维细胞数量(图6)。在SAL对照小鼠中检测到痕量的上皮下α-SMA阳性肌成纤维细胞(0.14±0.05)，而OVA损伤小鼠的肌成纤维细胞密度增加了约30倍(4.37±0.37；与SAL组相比，P<0.001；图6A、图6B)。当施用于SAL对照小鼠时，在对基础肌成纤维细胞数量没有任何影响的情况下，MCA-MSC的给药减少OVA诱导的上皮下肌成纤维细胞密度的增加(2.86±0.27至3.42±0.09；与OVA组相比，P<0.05)(图6A、图6B)。但是，MCA-MSC的给药不能将异常的上皮下肌成纤维细胞负荷完全逆转回在SAL对照小鼠中测量的负荷(与SAL组相比，均P<0.001；图6A、图6B)。
肺明胶酶表达
我们还确定了MCA-MSC介导的OVA诱导的气道/肺纤维化逆转是否与其影响降解胶原的MMP水平的能力有关。明胶酶谱法证明，雌性Balb/c小鼠的肺主要表达MMP-9(明胶酶B)，而较小程度地表达MMP-13(胶原酶3)(图7)。OVA损伤小鼠中的相对MMP-9表达水平(1.62±0.22)与在SAL对照动物中测量的水平(1.00±0.09)没有明显差异(图7A；图7B)。相比之下，相对于在单独用OVA处理的小鼠中测量的水平，向OVA损伤的小鼠施用MCA-MSC可使MMP-9水平(3.77±0.18至4.56±0.20；与OVA MCA-MSC组相比，P<0.05)显著增加约1.3倍和约1.8倍(与OVA组相比，P<0.001；与SAL组相比，P<0.001；图7A、图7B)。有趣的是，将MCA-MSC递送至SAL处理的小鼠也显著增加了MMP-9水平(1.95±0.38至2.65±0.30；与SAL组相比P<0.05)。
MCA-MSC对AHR的影响
通过侵入性体积描记法评估了AHR对浓度渐增的雾化乙酰甲胆碱-支气管收缩剂的响应(图8)。可以预期，与在SAL对照所测量的相比，OVA处理的小鼠的AHR明显升高(与SAL组相比，P<0.001；图8)。MCA-MSC的递送逆转了OVA诱导的AHR增加(与OVA组相比，P<0.05；图8)。与所测量的其他大多数终点一样，当施用于SAL对照小鼠时，MCA-MSC递送不影响基础AHR测量(图8)。
讨论
这项研究旨在评估，当在治疗上给予建立的疾病病理时，新的iPSC源MCA-MSC对慢性AAD/哮喘发病机理的三个主要组成部分即AI、AWR和AHR的治疗潜力。
MCA-MSC的给药防御已建立的AI、AWR(杯状细胞化生、异常气道TGF-β1水平、上皮下肌成纤维细胞和胶原积累，肺总胶原浓度)和通过反复OVA致敏和攻击小鼠诱导的AHR(表8)。在两周(每周一次)的治疗期内，这导致异常气道TGF-β1水平、气道/肺纤维化和AHR发生逆转，并且通过递送MCA-MSC导致降解胶原的MMP-9水平显著增加(表8)。同样重要的是，发现MCA-MSC给药不影响所测参数的基础表达，这表明MCA-MSC的递送提供了安全有效地治疗AAD/哮喘主要成分的方式。
表8.MCA-MSC对慢性AAD病理学影响的总结
Figure BDA0002408908630000281
在表8中，OVA、SAL MCA-MSC IV和SAL MCA-MSC IN列中的箭头反映了相对在盐水(SAL)处理的小鼠中所测量的变化，而OVA MCA-MSC IV和OVA MCA-MSC IN组中的箭头则反映了相对单独的OVA组的变化。(-)表示分别与SAL或OVA处理的小鼠相比没有变化。与OVAMCA-MSC IV组相比，*P<0.05，**P<0.01。
哮喘的炎性成分有助于气道阻塞。Th2偏斜的炎症导致包括白介素(IL)-13在内的细胞因子的特定亚群升高，并诱导杯状细胞化生。
与这些发现一致的是，以前的研究表明，iPSC源MSC(不是本文公开的MCA-MSC)的IV注射可以通过抑制Th2细胞因子即IL-4、IL-5和IL-13的水平部分降低急性OVA模型的气道炎症评分。MCA-MSC的全身效果甚至可能与它们通过直接的细胞间接触激活调节性T细胞的能力有关。但是，目前发现MCA-MSC显著抑制约75％AI和约50％的杯状细胞化生，这表明与衍生自人骨髓或脂肪组织的MSC相比，MCA-MSC介导更大的免疫调节特性。
将MCA-MSC直接施用于气道/肺可使它们分泌的保护因子保留在肺环境中。此外，直接施用的MCA-MSC更可能保留在发炎的肺中，并且对通过抑制包括肺泡巨噬细胞和树突状细胞在内的抗原呈递细胞介导的变应原暴露具有更大的保护作用。
除了杯状细胞化生外，上皮增殖也是哮喘上皮重塑的主要因素。上皮屏障功能的减少和脱皮随着上皮增殖达到顶峰。这种增殖在严重哮喘中特别广泛，在严重哮喘中，上皮的扩展导致气道阻塞。鉴于这种重编程发生在哮喘发病机理的早期，因此哮喘治疗应以上皮为目标。尽管提供了类似的AI减少，但MCA-MCS的递送导致上皮厚度降低。这与以前的与骨髓源MSC相关的发现形成了对比，在骨髓源MSC中，仅骨髓MSC的IN递送对上皮厚度没有影响。在该研究中，上皮厚度不受AI降低的影响。因此，在MCA-MSC和骨髓-MSC之间观察到的差异似乎是由于MCA-MSC自身的主动特性，而不是由于它们减弱AI的能力所产生的被动效应。
此外，在另一项研究中，尽管联合治疗提供了更大的AI降低，但上皮因子修复肽(三叶因子2)的给药可将上皮厚度减少至与抗纤维化和皮质类固醇联合治疗相同的程度。因此，上皮增殖的减少不是由炎症的减少介导的。
有了该额外的证据，本发现表明，MCA-MSC的递送允许i)减少上皮厚度的旁分泌因子的充分积累，和/或ii)这些细胞与损伤的上皮直接接触并介导其增殖的逆转，MCA-MSC引起的上皮厚度和杯状细胞化生的降低是AWR逆转的第一个证据。
除了AI之外，包括机械性损害和变应原在内的许多因素的浓集(culmination)能有助于肺结构和气道功能的破坏，导致AWR。由于变应原或遗传易感性造成的损害使肺部经历内源性重塑过程，以努力自我修复气道的结构和功能，这些修复过程导致异常的伤口愈合，最终导致纤维化。纤维化在OVA致敏的气道中是明显的，表明异常上皮下和总胶原水平升高。MCA-MSC的递送显著减少了异常上皮下和总胶原沉积，并且在某些情况下，将这种异常胶原沉积完全逆转回在未损伤的盐水治疗组所观察到的水平。这些结果出人意料，因为先前的研究表明，只有在干细胞基治疗与抗纤维化药物联合使用时，才能完全逆转OVA诱导的上皮下和胶原总沉积的促进。在这些联合治疗研究中，有人提出抗纤维化药物会创造一个更有利的环境，在该环境中，可以引入干细胞基疗法，从而帮助干细胞存活并增加其增殖和迁移能力，从而诱导其保护性/治疗性效果。因此，MCA-MSC的递送具有与抗纤维化药物相似的作用，并且可以具有类似于胎儿成纤维细胞的抗纤维化性质，这可以在没有纤维化的情况下促进创伤愈合。
这些结果也与观察到的MCA-MSC诱导的上皮厚度减少相对应。成纤维生长因子通常由上皮细胞响应上皮紊乱而释放。在哮喘中，这种响应得到增强，表明上皮下纤维化是由从有缺陷的上皮到较深的气道壁的信号导管引起的。因此，考虑到IV给药时上皮下和总胶原减少，MCA-MSC可以通过免疫调节特性和可能分泌抗纤维化介质而发挥其抗纤维化作用。
这项研究的主要发现是，MCA-MSC逆转了纤维化，并将AHR恢复到未损伤小鼠的水平。AHR由气道阻塞驱动，这可能是由来自杯状细胞化生和上皮增厚的粘液堵塞所致。此外，AI和气道壁纤维化之间的相互作用导致了使AHR升高的环境。纤维化不仅降低哮喘患者的气道顺应性，而且ECM的这种扩展导致可溶性炎性介质的保留和已建立AHR的长期持久性。因此，AHR可以恢复到正常的未损伤的水平，主要是通过减少上皮下纤维化和AI衰减，和/或通过杯状细胞计数减少介导的气道阻塞减少和MCA-MSC提供的较低的上皮增厚水平。如所公开的，MCA-MSC除了具有抗炎作用外，还通过在许多水平上靶向AWR来纠正AHR。
总之，本研究首次使用MCA-MSC治疗慢性AAD/哮喘，发现MCA-MSC有效减少AI，并逆转AWR和AHR的标志物。因此，MCA-MSC为AAD/哮喘提供了独立运行的疗法。MCA-MSC也可以用作AAD/哮喘的辅助疗法。MCA-MSC可以为对当前疗法即皮质类固醇或β受体激动剂治疗无反应的AAD/哮喘患者亚群提供特有的治疗益处。
将MCA-MSC与先前研究的其他干细胞分开的一个惊人发现是，其他MSC/干细胞只有与其他治疗剂联合给药才产生治疗效果。
实施例5
以与实施例4类似的方式在6-8只小鼠组中诱导AAD/哮喘，不同之处在于用卵白蛋白的雾化气雾剂溶液攻击小鼠30分钟，每周3次，共8周(从21天至77天，图9)，而不是如实施例4中那样持续6周。将小鼠随机分为五组之一：1未处理的对照(无哮喘)；2未处理的致敏动物(哮喘)；3致敏动物(哮喘)，用MCA-MSC IN输注治疗；4致敏动物(哮喘)，用***(DEX)IV输注治疗；5致敏动物(哮喘)，用MCA-MSCs+DEX IV输注治疗。所有MCA-MSC处理小鼠两次(在第9周和第10周中每周一次)IN接受106个细胞的剂量。从第9-11周开始，每天一次施用DEX(1mg/kg/天)。DEX改善了AHR，但是MCA-MSC具有明显更明显的效果，而DEX除了单独的MCA-MSC的作用之外没有其他作用(图10)。
实施例6
本实施例所用的模型与实施例5相同，9周的变应原诱导的慢性气道疾病模型使用在该模型中最敏感的雌性Balb/c小鼠。
比较了以下7-8周龄的雌性Balb/c小鼠组(n～8只小鼠/组)，其中从第9-11周起每周一次通过鼻内(IN)、静脉内(IV)和气管内(ET)给药施用MCA-MSC：
i)盐水致敏/攻击的对照；
ii)OVA致敏/攻击的(AAD)；
iii)通过IN给药，OVA致敏/攻击+1x106个MCA-MSC/小鼠；
iv)通过IV给药，OVA致敏/攻击+1x106个MCA-MSC/小鼠；和
vi)通过ET给药，OVA致敏/攻击+1x106个MCA-MSC/小鼠。
SD为20％的这种设计为n＝8只小鼠/组提供了90％的检测25％效应的性能。
分析了气道高反应性(肺功能的量度)，并在图11中进行了报告。
与盐水处理的对应物相比，患有OVA诱导的慢性AAD的小鼠响应于剂量渐增的支气管收缩剂患有显著恶化的AHR。通过MCA-MSC的IN或IV给药(在存在持续OVA诱导的损伤的情况下，从9-11周起每周一次给药)，该OVA诱导的AHR显著降低了79-80％。在用MCA-MSC进行IN或IV处理的小鼠与盐水处理的对照之间，AHR没有显著差异。
MCA-MSC的ET给药使AHR降低了61％-这仍然明显低于由单独的OVA组所测量的AHR，但也显著高于又盐水组所测量的AHR。
在IN-治疗组，在IV处理组和ET处理组之间，AHR没有显著差异，表明所有三种MCA-MSC递送模式均提供了治疗慢性AAD/哮喘的可行方法。
要分析的其他终点包括：
i)炎症评分；
ii)杯状细胞化生；
iii)上皮厚度；
iv)上皮损害；
v)上皮下胶原厚度；
vi)肺总胶原浓度；
vii)上皮TGF-β1染色；
viii)上皮下肌成纤维细胞密度；和
ix)明胶酶(MMP-2和MMP-9)的表达/活性。

Claims (14)

1.用于治疗受试者中的变应性气道疾病(AAD)/哮喘的方法，所述方法包括向所述受试者施用间充质成血管细胞间充质干细胞(MCA-MSC)，其中所述MCA-MSC表达miR-145-5p、miR-181b-5p和miR-214-3p，但不表达miR-127-3p和miR-299-5p。
2.间充质成血管细胞间充质干细胞(MCA-MSC)在制造用于治疗受试者中的变应性气道疾病(AAD)/哮喘的药物中的用途，其中所述MCA-MSC表达miR-145-5p、miR-181b-5p和miR-214-3p，但不表达miR-127-3p和miR-299-5p。
3.根据权利要求1所述的方法或权利要求2所述的用途，其中所述MCA-MSC具有CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45-表型。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法或用途，其中所述MCA-MSC通过以下的方法制备，所述方法包括：
(a)在常氧条件下在包含LiCl和FGF2但不包含PDGF的间充质集落形成培养基(M-CFM)中将原始中胚层细胞培养足够的时间，以形成间充质集落；和
(b)贴壁培养(a)的所述间充质集落，以产生所述MCA-MSC。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法或用途，其中所述MCA-MSC被静脉内或鼻内施用。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法或用途，其中所述MCA-MSC被鼻内施用。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法或用途，其中治疗包括向所述受试者约1×106至约1×109个MCA-MSC。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法或用途，其中所述受试者是哺乳动物。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法或用途，其中所述受试者是人。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法或用途，其中所述受试者先前已经被施用了治疗哮喘的皮质类固醇或β激动剂。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法或用途，其中所述受试者先前未被施用治疗哮喘的皮质类固醇或β激动剂。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法或用途，其中所述受试者患有严重哮喘或严重难治性哮喘。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法或用途，其中治疗AAD/哮喘包括：
(a)降低AI、AWR、气道纤维化、肺纤维化、杯状细胞化生、上皮增厚、气道转化生长因子(TGF)-β1水平、上皮下肌成纤维细胞密度、上皮下胶原浓度或肺总胶原浓度；或
(b)增加肺MMP活性；或
(c)(a)的任一种或多种特征的任意组合，或者(a)和(b)的任一种或多种特征的任意组合。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法或用途，其中所述受试者不被施用皮质类固醇或β激动剂。
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