CN111088361A - 一种可用于恶性黑素瘤早期诊断的长链非编码rna标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可用于恶性黑素瘤早期诊断的长链非编码RNA标志物及其应用，该长链非编码RNA标志物为Linc01296，其对应的DNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。长链非编码RNA标志物Linc01296在制备恶性黑素瘤早期诊断试剂中作为目标RNA的应用。本发明成功筛选了恶性黑素瘤血清中表达异常的lncRNA Linc01296，并在恶性黑素瘤患者血清中检测到Linc01296呈显著高表达。此外，Linc01296可高效区分恶性黑素瘤患者和健康人群、皮肤良性痣患者。该标志物具有较高敏感性和特异性，其中敏感度能高达84.69％，特异度能达到88.77％，具有较高的诊断特性。

Description

一种可用于恶性黑素瘤早期诊断的长链非编码RNA标志物及 其应用

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，涉及一种长链非编码RNA及其应用，特别涉及一种可用于恶性黑素瘤早期诊断的长链非编码RNA标志物及其应用。

背景技术

恶性黑素瘤起源于神经嵴黑素细胞，是体表恶性肿瘤中致死率最高的肿瘤，目前已成为我国发病率增长最快的恶性肿瘤之一。恶性黑素瘤早期发现可通过手术治愈。然而，其侵袭性强、发展迅速，放化疗不敏感，部分患者就诊时已发生转移，这类患者预后很差，死亡率极高(Siegel R L,Miller K D,Jemal A.Cancer statistics,2018[J].CA Cancer JClin,2018,68(1):7-30.)。因此，恶性黑素瘤的早期诊断及早期治疗对于提高患者生存率及改善患者预后具有极其重要的意义。然而，由于诊断技术的限制，目前尚缺少恶性黑素瘤的早期诊断标志物。因此，依托基础研究探索恶性黑素瘤发病机制，寻找新的、无创的、可靠的恶性黑素瘤早期诊断的方法显得尤为迫切。令人遗憾的是，尽管目前已开展大量恶性黑素瘤发生及进展机制的相关研究，但其具体分子机制仍不清楚。近年来，越来越多的研究表明：肿瘤的转移与基因的“表观遗传学”改变密切相关。表观遗传学是指基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达发生变化，表型变化从一代传递到下一代，这种基因的变化通常由DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等调控方式而实现(Li Y,Jia R,Ge S.Role ofEpigenetics in Uveal Melanoma[J].Int J Biol Sci,2017,13(4):426-433.)。其中非编码RNA表观遗传学调控研究进展迅速，已证实在恶性黑素瘤等多种肿瘤的转移中发挥着重要作用，并贯穿于肿瘤发生及进展的整个过程。因此，进一步研究非编码RNA在恶性黑素瘤转移中的表观遗传学调控机制，对阐明恶性黑素瘤恶性进展的分子机制、寻找有效的诊断及治疗靶点及制定个体化治疗策略意义重大。

长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)是一类含有200个以上核苷酸序列，且不参与蛋白质编码的RNA，在生物生长发育和疾病发生进展过程中发挥着重要作用。研究表明，LncRNA可参与调控细胞分化、血管生成、细胞增殖等生理或病理过程(RichtigG,Ehall B,Richtig E,et al.Function and Clinical Implications of Long Non-Coding RNAs in Melanoma[J].Int J Mol Sci,2017,18(4).)。因此，在肿瘤的发生及进展中LncRNA也起着至关重要的作用，并有作为肿瘤诊断和预后判断的分子标志物的潜能。随着研究的不断深入，目前在恶性黑素瘤患者组织或血清中发现了大量异常表达的LncRNAs，其中一些LncRNAs被证实是恶性黑素瘤增殖、凋亡和转移等生物学功能的重要调控分子。例如，HOTAIR、UCA1和MALAT1等促癌性长链非编码RNA被证实在转移性黑色素瘤患者组织中表达显著升高，沉默它们的表达均可抑制恶性黑素瘤细胞的侵袭和转移能力(Sarkar D,Leung E Y,Baguley B C,et al.Epigenetic regulation in human melanoma:past andfuture[J].Epigenetics,2015,10(2):103-21)。lncRNA SAMMSON在90％的恶性黑素瘤患者中高表达，而在正常黑素细胞及其他正常组织中则不表达，沉默其表达可导致肿瘤细胞死亡，研究者认为SAMMSON可作为恶性黑素瘤诊断和治疗的潜在靶点(Leucci E,VendraminR,Spinazzi M,et al.Melanoma addiction to the long non-coding RNA SAMMSON[J].Nature,2016,531(7595):518-22.)。然而，对其进一步机理则缺乏新的研究。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，弥补现有恶性黑素瘤早期诊断技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于恶性黑素瘤早期诊断的长链非编码RNA标志物及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种可用于恶性黑素瘤早期诊断的长链非编码RNA标志物，该长链非编码RNA标志物为Linc01296，其对应的DNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。

长链非编码RNA标志物Linc01296在制备恶性黑素瘤早期诊断试剂中作为目标RNA的应用。

所述恶性黑素瘤早期诊断试剂为实时荧光定量PCR检测血清样本中Linc01296水平的试剂。

所述恶性黑素瘤早期诊断试剂包括特异性扩增Linc01296的引物。

所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的上游引物、下游引物。

所述恶性黑素瘤为皮肤恶性黑素瘤。

该检测试剂盒为检测血清中Linc01296表达水平的试剂盒，至少包括特异性扩增Linc01296基因的引物。

检测试剂盒为检测Linc01296的一步法反转录-荧光定量PCR试剂盒，包括如下组分：

特异性引物、2×一步法反转录-荧光定量PCR混合液、热启动Taq酶、RTase逆转录酶和DEPC-ddH₂O；

其中所述的特异性引物包括：SEQ ID NO.2所示的上游引物，SEQ ID NO.3所示的下游引物；所述2×一步法反转录-荧光定量PCR混合液包括SYBR Green II、dNTP、Mg²⁺及缓冲液。

所述一步法反转录-荧光定量PCR试剂盒的荧光定量PCR体系为：

Linc01296或U6上游引物1μL，浓度15μmol/L；

Linc01296或U6下游引物1μL，浓度15μmol/L；

2×一步法反转录-荧光定量PCR混合液12.5μl；

热启动Taq酶1.5μl；

RTase逆转录酶0.5μL；

RNA模板0.1μg，DEPC-ddH₂O补齐至25μL；

一步法反转录-荧光定量PCR程序：50℃30min反转录；95℃2min预变性；40个循环：94℃20s变性；60℃20s退火；68℃20s延伸。

以上所述血清样本总RNA的提取、Linc01296的扩增的具体步骤包括：

1)血清总样本RNA提取：按照天跟生化科技(北京)有限公司的高效血液总RNA提取试剂盒(货号DP443)所需试剂及步骤提取血清中总RNA；而后用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量所提取的RNA纯度与浓度。

2)Linc01296的扩增：按照天跟生化科技(北京)有限公司的一步法反转录-荧光定量试剂盒(货号FP303)所需试剂及步骤，将血清总RNA反转录为cDNA，并以cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。

通过对阳性样品的检测，发现利用本发明染料类荧光定量试剂盒进行连续3次重复实验，结果重复性为100％，实验结果稳定。

综上，本发明提供了一种与恶性黑素瘤早期诊断相关的lncRNA标志物，以及该lncRNA标志物的外周血中的检测方法及其在恶性黑素瘤早期诊断中应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于成功筛选了恶性黑素瘤血清中表达异常的lncRNA Linc01296，并在恶性黑素瘤患者血清中检测到Linc01296呈显著高表达。此外，Linc01296可高效区分恶性黑素瘤患者和健康人群、皮肤良性痣患者。该标志物具有较高敏感性和特异性，其中敏感度能高达84.69％，特异度能达到88.77％，具有较高的诊断特性。因此，将Linc01296的表达水平作为恶性黑素瘤早期诊断的标志物，可以有效提高恶性黑素瘤早期检出率，具有极高的临床应用潜能和推广性。

附图说明

图1为Linc01296 qRT-PCR产物电泳鉴定图(利用琼脂糖凝胶电泳检测两例健康对照及两例恶性黑素瘤血清Linc01296 PCR产物大小及纯度)。

图2为Linc01296在健康对照、皮肤良性痣、恶性黑素瘤患者血清中的表达差异(利用qRT-PCR检测Linc01296在98例健康对照、皮肤良性痣、恶性黑素瘤患者血清中的表达，并利用t检验分析各组件Linc01296表达水平差异)。

图3为血清Linc01296表达在恶性黑素瘤中的诊断价值(根据Linc01296在健康对照和恶性黑素瘤患者血清中的表达水平绘制受试者工作特征Receiver OperatingCharacteristic，ROC曲线，计算曲线下面积值Under the curve，AUC、敏感度和特异度)。

图4为接受根治性切除术前后血清Linc01296的表达水平(利用qRT-PCR检测Linc01296在根治术前及根治术后3个月在恶性黑素瘤患者血清中的表达，并利用t检验分析根治术前后血清Linc01296表达水平差异)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

申请人曾利用LncRNA芯片技术，发现长链非编码RNA Linc01296在恶性黑素瘤细胞中特异性高表达，并初步证实Linc01296通过结合EZH2蛋白抑制抑癌基因CADM1的表达从而促进恶性黑素瘤细胞增殖、侵袭、转移，是恶性黑素瘤发生及进展的潜在驱动因子。

为***探索Linc01296在恶性黑素瘤早期诊断中的价值，在上述技术基础上，本发明检测了Linc01296在健康对照、皮肤良性痣、恶性黑素瘤患者血清中的表达。研究证实：与健康对照和皮肤良性痣患者相比，Linc01296在恶性黑素瘤患者血清中的表达水平显著升高，且具有极高的诊断敏感度和特异度。Linc01296将有望进一步丰富和完善恶性黑素瘤发生机制的相关研究，并为恶性黑素瘤的早期诊断提供新的分子标志物，详细的实验过程可参考实施例1、实施例2和实施例3。

实施例1qRT-PCR验证Linc01296在血清中的表达

一、实验材料

1，已收集的98例健康对照、皮肤良性痣、恶性黑素瘤患者血清。

2，染料类Linc01296 qRT-PCR试剂盒，组分如下：

(1)Linc01296上游引物(序列如SEQ ID NO.2)

(2)Linc01296下游引物(序列如SEQ ID NO.3)

(3)U6上游引物(内参校准基因，序列如SEQ ID NO.4)

(4)U6下游引物(内参校准基因，序列如SEQ ID NO.5)

(5)2×一步法反转录-荧光定量PCR混合液

(6)热启动Taq酶

(7)RTase逆转录酶

(8)DEPC-ddH₂O

二、实验方法

1，血清样本总RNA提取

按照天跟生化科技(北京)有限公司的高效血液总RNA提取试剂盒(货号DP443)所需试剂及步骤提取健康对照、皮肤良性痣和恶性黑素瘤患者血清中的总RNA。具体步骤如下：

(1)按照血清：红细胞裂解液体积比为1:2的比例添加红细胞裂解液，冰上孵育15min，孵育过程中涡旋振荡2次，以彻底裂解样本中残留的红细胞。

(2)4℃条件下2100rpm离心15min，弃去上清。

(3)向沉淀中加入600μL裂解液RLH，涡旋振荡后，将溶液转移至过滤柱中。

(4)4℃条件下12000rpm离心2min，弃去过滤柱，收集滤液。

(5)向滤液中加入等体积的70％乙醇，混匀。将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱中。

(6)4℃条件下12000rpm离心1min，弃去滤液。将吸附柱放回收集管中。

(7)向吸附柱中加入80μL DNase I工作液，室温放置15min。

(8)向吸附柱中加入250μL去蛋白液,室温放置10min。

(9)4℃条件下12000rpm离心1min，弃去滤液。将吸附柱放回收集管中。

(10)向吸附柱中加入500μL漂洗液，室温放置2min。

(11)4℃条件下12000rpm离心1min，弃去滤液。将吸附柱放回收集管中。

(12)室温放置5min，以彻底晾干吸附柱中残留的漂洗液。

(13)将吸附柱放置于新的收集管中，加入50μL DEPC-ddH₂O，室温放置2min。

(14)4℃条件下12000rpm离心2min。所得溶液即为血清中总RNA。

(15)应用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量所提取的RNA纯度与浓度。

2.Linc01296的扩增：按照天跟生化科技(北京)有限公司的一步法反转录-荧光定量试剂盒(货号FP303)所需试剂及步骤，将血清总RNA反转录为cDNA，并以cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。具体步骤如下

(1)配置qRT-PCR反应液，具体成分如下

组成成分	使用量
		Linc01296/U6上游引物	1μL
Linc01296/U6下游引物	1μL
		2×一步法反转录-荧光定量PCR混合液	12.5μL
热启动Taq酶	1.5μL
		RTase逆转录酶	0.5μL
RNA模板	0.1μg
		DEPC-ddH<sub>2</sub>O	补齐至25μL

(2)进行一步法反转录-荧光定量反应

反应条件设置如下：

3.PCR产物电泳鉴定及测序(cDNA如SEQ.ID.NO.1所示，本发明采用一步法PCR，反转录和PCR在一部完成)

(1)称取0.5g琼脂糖粉，加入50mL TBE电泳缓冲液，微波加热至完全溶解后，待自然冷却至50℃左右时，加入5μL溴化乙锭(终浓度：0.5g/mL)，摇匀后，导入制胶槽中，插好样品梳。

(2)待琼脂糖胶完全凝固后，小心拔取样品梳。将凝胶放置于已预先加满TAE电泳液的电泳槽中。

(3)向拟测序PCR样品中加入10x上样缓冲液，用移液器将样品移入样品梳孔中。上样孔1为Marker(自上之下依次为5kb、3kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp)，上样孔2和3为两例恶性黑素瘤患者血清Linc01296 PCR产物，上样孔4和5为两例健康对照血清Linc01296PCR产物。

(4)设定电泳程序，恒压，电压120V。

(5)当溴酚蓝至凝胶中前段时，停止电泳。

(6)切下样品条带，放入1.5mL样品管中，送测序公司测序。

三、结果

PCR产物电泳鉴定结果如图1所示，结果显示健康对照与恶性黑素瘤患者血清Linc01296 PCR产物大小约为1400bp，与Linc01296大小相符。测序结果显示所送四个样品序列正确，序列如SEQ.ID.NO.1所示。本方法可有效扩增并检测血清样本中Linc01296的表达。

根据qRT-PCR的相对定量公式：2^-ΔΔCt计算各血清样本Linc01296相对表达水平，其中ΔCt＝Ct(Linc01296)-Ct(U6)。-ΔΔCt＝对照样本(任一健康对照血清样品)ΔCt平均值-各样本ΔCt值。因此，2^-ΔΔCt可反映各样本相对对照样品Linc01296的相对表达水平。比较Linc01296在恶性黑素瘤患者、皮肤良性痣患者、健康对照血清中的相对表达水平。结果如图2所示，在健康对照、皮肤良性痣、和恶性黑素瘤患者血清中均可以检测到Linc01296。其中Linc01296在健康对照中的相对表达水平为1.322±0.573，Linc01296在皮肤良性痣中的相对表达水平为1.479±0.432，Linc01296在恶性黑素瘤的相对表达水平为4.026±1.643。与健康对照和皮肤良性痣患者相比，Linc01296在黑色素瘤患者血清中的表达水平显著上调。在检测了恶性黑素瘤患者及健康对照血清中Linc01296相对表达水平的基础上，对qRT-PCR反应结果使用SPSS 22.0软件，依据数据类型选用方差分析及LSD-t检验分析各组间Linc01296相对表达水平差异。方差分析结果显示三组间血清Linc01296表达差异具有统计学意义(F＝10.353，P＝0.013)，LSD-t检验结果进一步显示恶性黑素瘤血清中Linc01296的表达水平显著高于皮肤良性痣(t＝3.482，P＝0.025)及健康对照(t＝4.103，P＝0.018)。

结果表明：与健康对照和皮肤良性痣患者相比，Linc01296在恶性黑素瘤患者血清中的表达水平显著升高，且具有极高的诊断敏感度和特异度；发现长链非编码RNALinc01296在恶性黑素瘤细胞中特异性高表达，可以用于恶性黑素瘤的早期诊断。

实施例2ROC曲线分析血清Linc01296表达在恶性黑素瘤中的诊断价值

在检测了恶性黑素瘤患者及健康对照血清中Linc01296相对表达水平的基础上，对qRT-PCR反应结果使用SPSS 22.0软件，绘制ROC曲线。结果如图3显示：血清Linc01296诊断恶性黑素瘤的ROC曲线下面积为0.896(95％CI:0.847～0.946；P<0.001)，血清Linc01296对结直肠癌的最佳诊断阈值为2.149，敏感度为84.69％，特异度为88.77％。根据本次结果确定的诊断阈值2.149选取Linc01296阳性的恶性黑素瘤患者血清样本。而后，利用本发明染料类荧光定量试剂盒对阳性样本进行连续3次重复实验，结果重复性为100％，实验结果稳定。

结果表明：显示血清Linc01296可用于恶性黑素瘤患者的诊断，以2.149作为诊断阈值，可高效地区分恶性黑素瘤患者于健康人群，且血清Linc01296作为恶性黑素瘤的诊断目标具有极高的敏感度、特异度和稳定性。

实施例3qRT-PCR检测恶性黑素瘤患者接受根治术前后Linc01296在血清中的表达

一、实验材料

1，已收集的76例已接受根治术切除瘤体的恶性黑素瘤患者术前及术后3个月的血清。

2，染料类Linc01296 qRT-PCR试剂盒(组分同上所述)。

二、实验方法

1，血清样本总RNA提取

按照天跟生化科技(北京)有限公司的高效血液总RNA提取试剂盒(货号DP443)所需试剂及步骤提取健康对照、皮肤良性痣和恶性黑素瘤患者血清中的总RNA。具体步骤如前述。

2.Linc01296的扩增：按照天跟生化科技(北京)有限公司的一步法反转录-荧光定量试剂盒(货号FP303)所需试剂及步骤，将血清总RNA反转录为cDNA，并以cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。具体步骤如前述。

三、结果

根据qRT-PCR的相对定量公式：2^-ΔΔCt计算各血清样本Linc01296表达水平，其中ΔCt＝Ct(Linc01296)-Ct(U6)。比较Linc01296在恶性黑素瘤患者接受根治术前及术后血清中的相对表达水平。结果如图4所示，在76例根治术前恶性黑素瘤患者血清中Linc01296的相对表达水平为4.261±1.363；在接受根治术后3个月恶性黑素瘤患者血清中Linc01296相对表达水平为1.789±0.549。与术前相比，术后3个月血清Linc01296的表达水平显著下调。在检测了术前及术后恶性黑素瘤患者血清中Linc01296相对表达水平的基础上，对qRT-PCR反应结果使用SPSS 22.0软件，依据数据类型选用配对样本t检验分析各组间Linc01296相对表达水平差异。t检验结果进一步证实与接受根治性切除术前比较，恶性黑素瘤患者血清中Linc01296的表达水平在接受根治性切除术后显著降低(t＝8.517，P<0.001)。随着后期研究结果的深入，Linc01296在恶性黑素瘤中的功能及其作用机制将进一步阐明，这一新颖的长链非编码RNA不仅能成为恶性黑素瘤早期诊断相关的生物标志物，还有望成为新的恶性黑素瘤治疗靶点以改善、提高临床恶性黑素瘤治疗效果。显然，找到更多、更准确的像Linc01296这样的有望参与辅助恶性黑素瘤早期诊断、治疗及预后相关的生物标志物，具有十分重要的现实意义。

序列表

<110> 西安交通大学医学院第一附属医院

<120> 一种可用于恶性黑素瘤早期诊断的长链非编码RNA标志物及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1401

<212> DNA

<213> human

<400> 1

ccctgcagca gcagcggcgt ggtcagagcg agcttcggag aagcagtggt gggttccatg 60

tgatggtgga gtaggaggca ggtctccgcg gttcatctgt gttgctctaa atgacactgt 120

ttcattattt tgatggctgg agaatatttc ctagtgtatg tatatgagag tttcttgatc 180

tctttatctg tggatgaaca gctactttga aacatatgat acatttgtgt taaggctagt 240

caccctgctg tggaatagaa ggccagaatt gatcagtctc atctgagagt aactttgtac 300

ccatcactga ttccttctga gactgcctcc acttccccag cagcctctgg tttcttcatg 360

tggctgcaga tggcaggatt tcccaaaggt ttctggctga aacatattcc gtggtgtatc 420

tgtacagcag tttcctcatc cctgcagctg tgtttgaaca ggttcaacag tatggctcca 480

aaggatgaaa tttcattctg attttctggc tgaagactat tctctttgtg tatgtccacc 540

acagttactt tatcccttca tctgtggatg ggcagtctcg ctgtattgcc caggctggag 600

tgcagtggca tgatctcagc tcactgcaag ctctgcttcc tgggttcacg ccattctcct 660

gcctcagcct cctgagtagc tgggattaca ggcacccgcc accacgccca ggaaagaaaa 720

aagaagaaaa caaacctcca tacgagaatg ggtctaaagg aacttcccaa acctccatga 780

ttttgcagga aacaagataa agctccaggc caggagcccc aactggctgg tggaggatgt 840

cttgctcctc agcagctggg atttgtaagt atttgtagga acatggaaca gatcagtggc 900

tgacaggccc aggaagcaga cagtcccctt cccataggtc accagcttca cttccccttc 960

ctgcacccca tcctgatttg agggagccca ggatgacaaa gagggagtag ttgagcaagg 1020

tatggagtgg cagcctctac aggagctcaa aggatgcatt tgtccatctg ccctgggctc 1080

agcttccaca ctcagagtca ctcacatccc tccaccgtcg ccacagctca cctgtgtgcc 1140

cacacggcca aggtcacact gaccccaaac gcacactgtt tcaactctca gcacttcact 1200

gtcacactcg cgtgtgtaca cacatgcttt ctaatttcca cagccacatg gatgctcaca 1260

cactcacacc tttgcacaca cacacaagct ggctcacaga cacactgggg gcccagatcc 1320

tggtcattcc ccacaggtct taataaaggt tcatggaagg aaacctgttt cctaaggtag 1380

ggtgggagtg tgtgtgagtg t 1401

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagaagcagt ggtgggttcc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagcaacaca gatgaaccgc 20

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aacgcttcac gaattttgcg t 21

Claims (9)

1.一种可用于恶性黑素瘤早期诊断的长链非编码RNA标志物，其特征在于，该长链非编码RNA标志物为Linc01296，其对应的DNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.长链非编码RNA标志物Linc01296在制备恶性黑素瘤早期诊断试剂中作为目标RNA的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述恶性黑素瘤早期诊断试剂为实时荧光定量PCR检测血清样本中Linc01296水平的试剂。

4.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，所述恶性黑素瘤早期诊断试剂包括特异性扩增Linc01296的引物。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的上游引物、下游引物。

6.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述恶性黑素瘤为皮肤恶性黑素瘤。

7.一种用于恶性黑素瘤早期诊断的检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒为检测血清中Linc01296表达水平的试剂盒，至少包括特异性扩增Linc01296基因的引物。

8.根据权利要求7所述用于恶性黑素瘤早期诊断的检测试剂盒，其特征在于，检测试剂盒为检测Linc01296的一步法反转录-荧光定量PCR试剂盒，包括如下组分：

特异性引物、2×一步法反转录-荧光定量PCR混合液、热启动Taq酶、RTase逆转录酶和DEPC-ddH₂O；

其中所述的特异性引物包括：SEQ ID NO.2所示的上游引物，SEQ ID NO.3所示的下游引物；

所述2×一步法反转录-荧光定量PCR混合液包括SYBR Green II、dNTP、Mg²⁺及缓冲液。

9.根据权利要求8所述用于恶性黑素瘤早期诊断的检测试剂盒，其特征在于，所述一步法反转录-荧光定量PCR试剂盒的荧光定量PCR体系为：

Linc01296或U6上游引物1μL，浓度15μmol/L；

Linc01296或U6下游引物1μL，浓度15μmol/L；

2×一步法反转录-荧光定量PCR混合液12.5μl；

热启动Taq酶1.5μl；

RTase逆转录酶0.5μL；

RNA模板0.1μg，DEPC-ddH₂O补齐至25μL；

一步法反转录-荧光定量PCR程序：50℃30min反转录；95℃2min预变性；40个循环：94℃20s变性；60℃20s退火；68℃20s延伸。

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