CN111073981B

CN111073981B - 环状RNA circEMB_003作为结直肠癌标志物的应用

Info

Publication number: CN111073981B
Application number: CN202010053100.6A
Authority: CN
Inventors: 胡育菡; 张哲莹; 马帅; 李健; 钟加滕
Original assignee: Xinxiang Medical University
Current assignee: Xinxiang Medical University
Priority date: 2020-01-17
Filing date: 2020-01-17
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2040-01-17
Also published as: CN111073981A

Abstract

本发明涉及一种环状RNA circEMB_003作为结直肠癌标志物的应用。该标志物的表达水平与结直肠癌肿瘤的大小(p<0.05)、TNM分期(p<0.05)及远处转移(p<0.05)呈负相关，而与病人的年龄、性别、肿瘤的分化没有相关性(p>0.05)。同时还通过RNA酶R消化和放线菌素D处理验证了circEMB_003的稳定性，能较好地反映结直肠肿瘤的发生发展，从而可用于监测结直肠肿瘤对治疗措施的反应等。该标志物的发现，为进一步研究结直肠癌的发病机理，探索结直肠癌的治疗靶点提供了新的实验理论基础和新的方向，并可应用于制备结直肠癌诊断和/或预后评估的试剂或试剂盒，丰富了结直肠癌的诊断和检测手段。

Description

环状RNA circEMB_003作为结直肠癌标志物的应用

技术领域

本发明涉及结直肠癌领域，特别是涉及一种环状RNA circEMB_003作为结直肠癌标志物的应用。

背景技术

结直肠癌是一种常见的、严重危害人类健康的消化道恶性肿瘤。其发病率在全球各种恶性肿瘤中高居第三位，肿瘤相关死亡率高居第二位。随着肿瘤早期筛查工作的开展以及新的治疗方法的应用，结直肠癌的死亡率有所下降，但是其发病率却明显上升且日益年轻化。因此，深入研究结直肠癌的发生发展过程，寻找关键的分子标志物和药物靶点，对开发有效的治疗措施、提高结直肠癌患者的生存率具有重要的科学意义和临床价值。

环状RNA(circRNA)是最近几年发现的一类在哺乳动物体内广泛存在的非编码RNA，其表达丰富，是由特殊的末端反向互补的前体mRNA经过可变剪切形成。与传统线性RNA(linear RNA)含5’和3’末端不同，circRNA的首尾相连形成闭合环状结构。circRNA的闭合环状结构使其比线性RNA更加稳定，能够耐受核酸外切酶的降解。同时，circRNA的表达具有组织及细胞类型的特异性，并且在血液、唾液、尿液或外泌体中也能检测到丰富的circRNA。circRNA的这些特征表明它具有作为疾病诊断标志物的潜能。现已在多种肿瘤中发现具有诊断和预后判断价值的circRNA。比如，Josh N.Vo等人通过外显子捕获RNA测序的方法检测了多种肿瘤中circRNA的表达情况，筛选到了能够作为***癌潜在分子标志物的circRNA。Weng等研究发现circRNA ciRS-7在结直肠癌中表达水平增加且与病人的预后生存率相关。这些研究均表明circRNAs作为肿瘤早期标志物的筛查是一种有效的检测手段，有望成为新型的肿瘤分子治疗靶点。目前，与结直肠癌相关的环状RNA仍有很多未被发现，研究寻找这些环状RNA对结直肠癌的防治诊断具有重要的研究价值和临床价值。

发明内容

基于此，有必要提供一种环状RNA circEMB_003作为结直肠癌标志物的应用。

一种环状RNA circEMB_003的定量检测剂在制备用于结直肠癌诊断和/或预后评估的试剂盒中的应用，其特征在于，所述环状RNA circEMB_003具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

在其中一个实施例中，所述环状RNA circEMB_003的定量检测剂包括适用于如下至少一种方法的试剂：

荧光染料法、数字PCR、共振光散射法、实时荧光定量PCR、测序或生物质谱法。

在其中一个实施例中，所述环状RNA circEMB_003的定量检测剂为能够特异性结合环状RNA circEMB_003或环状RNA circEMB_003对应的cDNA的探针或引物。

在其中一个实施例中，所述探针或引物带有可检测的标记。

在其中一个实施例中，所述标记为荧光标记物、化学发光探针或同位素标记物。

在其中一个实施例中，所述环状RNA circEMB_003的定量检测剂为环状RNAcircEMB_003的qRT-PCR引物，其上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示。

在其中一个实施例中，所述试剂盒中还包括内参引物对。

在其中一个实施例中，所述内参引物对包括18S rRNA扩增引物对和GAPDH扩增引物对中的一种或多种。

在其中一个实施例中，所述18S rRNA扩增引物对的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示，所述GAPDH扩增引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQID NO.7所示。

在其中一个实施例中，所述试剂盒中还包括RNA提取试剂、PCR反应缓冲液、dNTPs以及DNA聚合酶中的至少一种。

通过统计分析结直肠癌组织中上述结直肠癌分子标志物(circEMB_003)的相对表达量与结直肠癌患者临床病理参数之间的关系发现，circEMB_003的表达水平与结直肠癌肿瘤的大小(p<0.05)、TNM分期(p<0.05)及远处转移(p<0.05)呈负相关，而与病人的年龄、性别、肿瘤的分化没有相关性(p>0.05)。同时还通过RNA酶R消化和放线菌素D处理验证了circEMB_003的稳定性，能较好地反映结直肠肿瘤的发生发展，从而可用于监测结直肠肿瘤对治疗措施的反应等。另外，通过应用结直肠癌(CRC)组织及癌旁组织中circEMB_003的相对表达量或CRC患者和正常人外周血血浆中circEMB_003的相对表达量制作受试者工作特征曲线(ROC)，评价其作为CRC诊断标志物的潜在价值。结果ROC曲线下面积(AUC)为0.768(95％可信区间为0.669～0.876)，特异性为0.9275(95％可信区间为0.8389～0.9761)。ROC曲线下面积越接近1越具有诊断价值，这表明通过检测circEMB_003的表达可以高效地将结直肠癌从正常组织中鉴别出来，circEMB_003具备作为结直肠癌诊断标志物的潜在价值。该标志物的发现，为进一步研究结直肠癌的发病机理，探索结直肠癌的治疗靶点提供了新的实验理论基础和新的方向，并可应用于制备结直肠癌诊断和/或预后评估的试剂或试剂盒，丰富了结直肠癌的诊断和检测手段。

附图说明

图1为CircEMB_003形成的模式图；

图2为CircEMB_003扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为CircEMB_003的Sanger测序结果图；

图4为CircEMB_003的qRT-PCR扩增曲线；

图5为CircEMB_003的qRT-PCR溶解曲线；

图6为CircEMB_003在43例配对结直肠癌组织与癌旁组织中表达的倍比关系图；

图7为CircEMB_003在43例配对结直肠癌组织与癌旁组织中的平均表达水平图；

图8为RNA酶R消化验证CircEMB_003的稳定性结果图，其中A为琼脂糖凝胶电泳图，B为qRT-PCR结果图；

图9为放线菌素D处理验证CircEMB_003的稳定性结果图；

图10为评估circEMB_003潜在诊断价值的受试者工作特征曲线；

图11为FISH探针检测circEMB_003在结直肠癌组织中的表达结果图；

图12为CircEMB_003在7株结直肠癌细胞和正常肠上皮细胞NCM460中的表达结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

术语“环状RNA circEMB_003的定量检测剂”在本发明中不应仅仅理解为对环状RNA circEMB_003的检测剂，而应包括被本领域技术人员所知的其余可反映环状RNAcircEMB_003表达水平的检测试剂。例如可通过定量检测环状RNA circEMB_003反转录所得的cDNA，或对环状RNA circEMB_003的表达量进行间接检测。

在本发明中，若无特别声明，“环状RNA circEMB_003”可被“标志物”、“标志物基因”、“生化标志物”、“结直肠癌肿瘤标志物”或“结直肠癌癌标志物”所替换。其具体指要用作分析患者实验样品的靶标的分子。

在本发明中用作标志物的环状RNA circEMB_003预期包括其全长核糖核苷酸序列，或天然存在的变体，或全长序列及变体的片段，特别是可被检测并确定具体序列的片段，更优选为能够在结直肠组织中与其他RNA序列相区分的片段。优选地包含所述全长核糖核苷酸序列的至少7、8、9、10、11、12、15或20个连续的核糖核苷酸。

本领域的技术人员可认识到，由细胞释放的核糖核苷酸或存在于胞外基质中的核糖核苷酸可能受到损害(例如，在炎症过程中)，且可被降解或切割成这样的片段。如熟练的技术人员将明白的，mRNA或其片段也可以作为复合物的部分而存在。这样的复合物也可以用作本发明意义上的标志物。

“天然存在的变体”应被理解为，高等动物的基因通常伴有高频率的多态性。也存在许多在剪接过程中产生含有相互不同的氨基酸序列的同种型的分子。与癌症相关疾病相关的具有与标志物基因的活性相似的活性的任何基因包括在标志物基因中，即使其由于多态性或为同种型而具有核苷酸序列差异。

RNA的定量检测剂可选用本领域技术人员所公知的试剂，例如能够与该RNA杂交，且标记有荧光标记的核酸等；常见情况下RNA的检测剂可以选自RT-PCR的引物，以及用于扩增RT-PCR的产物——cDNA的引物。

下面主要结合具体实施方式和附图对结直肠癌相关环状RNA基因、结直肠癌分子标志物及其应用作进一步详细的说明。

一、组织和细胞RNA的提取

应用TRIzol试剂提取结直肠癌组织和细胞的总RNA。

(1)研钵及所用剪刀等物品用锡箔纸包好，放置180℃烤箱内烤6～8小时以去除RNA酶；

(2)将研钵等物品从烤箱中取出冷却至室温，并用液氮预冷研钵；剪取约黄豆大小的组织块，放入研钵中小心研磨，边研磨边加液氮，直至将组织碾碎；

(3)组织被研磨成粉末状后，加入RNAiso^TM Plus试剂(1mL/50mg～100mg)并进行匀浆处理，待到组织与RNAiso^TM Plus混合物融合后，将研磨物转入无RNA酶的1.5mL离心管中；

(4)如果提取细胞的总RNA，则收集生长状态良好的细胞，胰酶消化收集至1.5mL离心管中，PBS洗3次，按每9.6cm²面积加入1mL RNAiso^TM Plus，静置片刻后用枪头吹打至无细胞沉淀，室温静置5min；

(5)每1mL TRIzol试剂加入200μL氯仿，加入氯仿后盖紧离心管，用力上下摇荡20秒钟，以保证水相和有机相能够充分接触，室温静置10分钟。将离心管置于低温离心机中离心，4℃，12000rpm，15分钟。离心后混合液出现分层，上面一层为基本无色的水相，内含有总RNA，下层为浅红色的酚-氯仿相；

(6)将上层水相转入一新离心管中，在离心管中加入与水相液体等体积的异丙醇，轻柔地上下颠倒使其充分混匀，室温静置10分钟，4℃，12000rpm离心15分钟。

(7)小心弃去上清液，洗涤沉淀RNA，用1ml 75％乙醇(用高压灭菌后的0.1％的DEPC水配制)洗涤2次，再放置于低温离心机中离心，4℃，12000rpm离心5分钟，弃去上清液，室温干燥10分钟，加约20μL DEPC水溶解。

(8)1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，分光光度计检测RNA的浓度和纯度，并进行标记。

二、RNA逆转录

(1)RNA逆转录按照PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)说明书进行，首先去除RNA里可能污染的gDNA，按照下表配置反应体系：

试剂	体积(μL)
		5×gDNA Eraser Buffer	2
gDNA Eraser	1
		RNA	2(500ng/μL)
RNase Free dH<sub>2</sub>O	up to 10

(2)去除gDNA程序：42℃，2min；

(3)按照下表在冰上加入如下试剂到已去除gDNA的前述反应体系内：

试剂	体积(μL)
		5×PrimeScript Buffer	4
PrimeScript RT Enzyme Mix I	1
		Random 6mers(100μM)	1
RNase Free dH<sub>2</sub>O	4

(4)逆转录程序：37℃，15min；85℃，5sec；

(5)逆转录产物用无菌超纯水稀释5～10倍，-20℃保存尽快使用或者直接进行PCR及qRT-PCR反应。

三、Hsa_circEMB_003序列(以下为cDNA序列)

位置：chr5:49694940-49707217strand:-

长度：954bp

RNA sequence(circBank):

aacattctagtatgccagtagaaaaaaatatcactttagaaaggccttctaatgtaaatctcacatgccagttcacaacatctggggatttgaatgcagtaaatgtgacttggaaaaaagatggtgaacaacttgagaataattatcttgtcagtgcaacaggaagcaccttgtatacccaatacaggttcaccatcattaatagcaaacaaatgggaagttattcttgtttctttcgagaggaaaaggaacaaaggggaacatttaatttcaaagtccctgaacttcatgggaaaaacaagccattgatctcttacgtaggggattctactgtcttgacatgtaaatgtcaaaattgttttcctttaaattggacctggtacagtagtaatgggagtgtaaaggttcctgttggtgttcaaatgaataaatatgtgatcaatggaacatatgctaacgaaacaaagctgaagataacacaacttttggaggaagatggggaatcttactggtgccgtgcactattccaattaggcgagagtgaagaacacattgagcttgtggtgctgagctatttggtgcccctcaaaccatttcttgtaatagtggctgaggtgattcttttagtggccaccattctgctttgtgaaaagtacacacaaaagaaaaagaagcactcagatgaggggaaagaatttgagcagattgaacagctgaaatcagatgatagcaatggtatagaaaataatgtccccaggcatagaaaaaatgagtctctgggccagtgaatacaaaacatcatgtcgagaatcattggaagatatacagagttcgtatttcagctttgtttatccttcctgttaagagcctctgagtttttagttttaaaaggatgaaaagcttatgcaacatgctcagcaggagcttcatcaacgatatatgtcagatctaaag

四、引物设计

EMB及circEMB_003引物均应用Oligo7进行设计。NCBI查询EMB mRNA序列，选取其保守区域设计引物。circEMB_003序列为EMB第3～9外显子序列，将其5’端一部分序列(约150bp)连到3’末端，形成的模式图如图1所示。将序列输入Oligo7中，设定引物长度18bp～23bp，扩增片段长度100bp～250bp，选取评分高、上下游引物Tm值接近，尽量无发夹结构、无二聚体、无错配的引物，circEMB_003上下游引物需跨剪切位点(即5’端和3’末端的接点)。GAPDH、18S rRNA引物序列为本实验室已验证有效的序列。所有引物序列均在NCBI上blast以初步排除与其他基因存在非特异结合扩增。引物由生工生物工程股份有限公司合成，粉末状引物先高速离心后用无核酶水稀释为100μM储存液，再用无菌水稀释为10μM工作液，并通过qRT-PCR观察溶解曲线挑选无非特异及二聚体的引物进行后续实验。具体引物序列如下表所示：

五、聚合酶链式反应(polymer chain reaction,PCR)

(1)根据PrimeSTAR GXL DNAPolymerase(Takara，R050Q)试剂盒说明书进行，首先在冰上配置如下反应体系：

试剂	体积(μL)
		5×PrimeSTAR GXL Buffer	10
dNTP Mixture(2.5mM each)	4
		Forward Primer	1.5
Reverse Primer	1.5
		cDNAor DNA	1
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase	1
		灭菌蒸馏水	up to 50

(2)PCR反应程序：98℃，10sec变性；55℃or 60℃，15sec退火(引物Tm值小于55℃设为55℃，大于55℃设为60℃)；68℃，18sec延伸(按产物1kb设为1min计算)；35个循环；

(3)PCR产物结束后放于4℃保存，并尽快进行琼脂糖凝胶电泳。

六、琼脂糖凝胶电泳及Sanger测序

根据产物片段长度，选择配置2％的琼脂糖凝胶，即2g琼脂粉加入到100mL1×TAE中，微波反复加热至完全溶解，溶液澄清，注意避免过度沸腾导致的液体蒸发而影响终浓度，冷却至60℃左右，加入10μL GelStain，摇匀后倒入已插好梳子的配胶槽内，室温约凝固40min，拔掉梳子，将胶放入电泳槽内，注意上样孔在负极侧，将1×TAE倒入槽内没过胶面约1mm，每孔上样10μL已加入loading buffer的PCR产物，5μL DNAmarker加于最左侧孔内，100V电压，电泳约25min～40min，电泳结束后在凝胶成像***内采集图像，如图2所示，证实了CircEMB_003的反向剪切序列。然后用干净刀片切胶送测序，Sanger测序由北京睿博兴科生物技术有限公司完成，结果如图3所示，进一步证实了circEMB_003的反向剪切序列。

七、荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)

(1)根据SybrGreen qPCR Master mix(DBI)说明书进行，避光条件下在冰上配置qRT-PCR反应体系如下：

试剂	体积(μL)
		SybrGreen qPCR master mix	10
Forward primer(10μM)	0.5
		Reverse primer(10μM)	0.5
cDNA	2
		ddH<sub>2</sub>O(灭菌超纯水)	7
Total	20

(2)每个样本加3个复孔，充分混匀后瞬时离心，八连管放入ABI7500荧光定量PCR仪中；

(3)qRT-PCR反应程序：95℃，预变性1min；95℃，变性15sec；60℃，退火及延伸34sec；40个循环；

(4)数据分析：用2^-△△Ct方法进行数据整理分析，将各样品的Ct值(Ct值指所测反应管内的荧光信号达到所设定的阈值时总共经历的循环次数)减去内参的Ct值(△Ct＝Ct目的基因－Ct内参)即△Ct值，放线菌素D处理实验用18S rRNA为内参，其余以GAPDH为内参，△△Ct＝△Ct实验组－△Ct对照组，以公式2^-△△Ct计算相对表达量。实验均重复3次，计算3次平均值及标准差。

扩增曲线如图4所示，显示扩增效率高，且具有特异性。溶解曲线如图5所示，显示为单峰，说明无非特异性扩增及引物二聚体。CircEMB_003在43例配对结直肠癌组织与癌旁组织中表达的倍比关系图如图6所示(T/N，N代表正常结直肠组织，T代表结直肠癌组织)，结果显示circEMB_003在结直肠癌组织表达下调。CircEMB_003在43例配对结直肠癌组织与癌旁组织中的平均表达水平如图7所示，Normal代表正常结直肠组织，Tumor代表结直肠癌组织，△Ct值越高则circEMB_003的表达水平越低，结果表明circEMB_003在结直肠癌组织的表达水平显著低于癌旁组织。

八、RNA酶R消化验证circEMB_003稳定性

提取结直肠癌癌旁组织RNA，并分成1μg×4份，1份不加RNA酶R，另3份各加入0.05μL RNA酶R和RNA酶R buffer 0.7μL，加无核酸酶的灭菌水补至7μL，消化反应在PCR仪内进行，37℃分别消化15min、30min，消化完成后，与未消化的RNA一起分别在每管内加入gDNAbuffer 2μL和gDNA Eraser 1μL，42℃，2min去除RNA内可能会污染的gDNA，按照PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNAEraser(TaKaRa)说明书进行逆转录，逆转录成的cDNA用灭菌水稀释4倍，取2μL进行PCR及qRT-PCR，circEMB_003、EMB及GAPDH mRNA水平均与未消化前的RNA进行比较。

结果如图8所示，分别应用RNA酶R消化处理(+)结直肠细胞SW480的RNA15min、30min，0为未加RNA酶R(-)的RNA，应用(图8A)PCR扩增琼脂糖电泳及(图8B)qRT-PCR检测circEMB_003、EMB及GAPDH mRNA水平(*,p<0.05；**,p<0.01)。结果表明，与线性RNA相比，circEMB_003的确能够耐受RNA酶R的消化作用。

九、放线菌素D处理细胞验证circEMB_003稳定性

(1)放线菌素D粉末(1mg)离心后在超净台内用100μL DMSO充分溶解(浓度10μg/μL)，4℃保存，并尽快使用；

(2)SW480细胞铺于6孔板内，24h后，实验组加入放线菌素D(使终浓度为100ng/mL)，对照组加入相同剂量的DMSO，每组设3个复孔；

(3)分别在0h、12h、24h胰酶消化收集细胞提取RNA，定量后取500ng进行逆转录及后续qRT-PCR反应。

结果如图9所示，应用放线菌素D抑制结直肠癌细胞SW480新生RNA合成验证circEMB_003的稳定性，qRT-PCR结果显示应用放线菌素D后12h，EMB已降解60％以上(p<0.0001)，而circEMB_003未见明显降解(p>0.05)，说明circEMB_003比线性RNA EMB稳定。

十、受试者工作特征曲线(ROC)评估circEMB_003潜在的诊断价值

应用CRC组织及癌旁组织中circEMB_003的相对表达量制作受试者工作特征曲线(ROC)，评价其作为CRC诊断标志物的潜在价值。结果如图10所示，ROC曲线下面积(AUC)为0.768(95％可信区间为0.669～0.876)，特异性为0.9275(95％可信区间为0.8389～0.9761)。ROC曲线下面积越接近1越具有诊断价值，这表明通过检测circEMB_003的表达可以高效地将结直肠癌从正常组织中鉴别出来，circEMB_003具备作为结直肠癌诊断标记物的潜在价值。

十一、CircEMB_003在结直肠癌组织中的表达与患者临床病理特征的关系

我们统计分析了结直肠癌组织中circEMB_003的相对表达量与结直肠癌患者临床病理参数之间的关系。结果如表1所示，circEMB_003的表达水平与结直肠癌肿瘤的大小(p<0.05)、TNM分期(p<0.05)及远处转移(p<0.05)呈负相关，而与病人的年龄、性别、肿瘤的分化没有相关性(p>0.05)。

表1CircEMB_003的表达水平和结直肠癌患者临床病理特征之间的关系

a依据平均年龄分组。

b肿瘤直径依据平均值分组。

*p<0.5。

十二、荧光原位分子杂交(Fluorescence In situ hybridization,FISH)

将30例大肠癌标本的石蜡切片经脱石蜡、梯度脱水后，将载玻片浸入0.2N的HCl内5min，洗涤后用40μg/mL的蛋白酶K在37℃条件下消化10min，PBS洗涤后用乙醇梯度脱水：70％、80％、90％、无水乙醇浸泡。从乙醇中取出的组织迅速滴加1×杂交buffer，室温放置5min，轻轻倾去buffer，并加入由1×杂交buffer稀释的绿色荧光标记的circEMB_003探针(50nM)，盖上盖玻片56℃处理1小时。SSC梯度洗杂，5×SSC 56℃5min，1×SSC 56℃5min×2次，0.2×SSC 56℃5min×2次，0.2×SSC常温5min，PBS冲洗5min×3次。滴加DAPI工作液(1:1000)，室温孵育10min，PBS冲洗5min×3次。滴加适量抗荧光衰减封片剂封片，然后使用荧光显微镜进行观察、照相，结果如图11所示，表明circEMB_003在结直肠癌组织中表达下调。

十三、CircEMB_003在结直肠癌细胞株中的表达

应用qRT-PCR技术分别检测circEMB_003在7种结直肠癌细胞株SW620、HCT116、RKO、SW480、LoVo、Caco-2、HCT8及正常结肠上皮细胞株NCM460中的表达，结果如图12所示，结果表明与NCM460相比，结直肠癌细胞中circEMB_003的表达水平显著下调。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 新乡医学院

<120> 环状RNA circEMB_003作为结直肠癌标志物的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 954

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

aacauucuag uaugccagua gaaaaaaaua ucacuuuaga aaggccuucu aauguaaauc 60

ucacaugcca guucacaaca ucuggggauu ugaaugcagu aaaugugacu uggaaaaaag 120

auggugaaca acuugagaau aauuaucuug ucagugcaac aggaagcacc uuguauaccc 180

aauacagguu caccaucauu aauagcaaac aaaugggaag uuauucuugu uucuuucgag 240

aggaaaagga acaaagggga acauuuaauu ucaaaguccc ugaacuucau gggaaaaaca 300

agccauugau cucuuacgua ggggauucua cugucuugac auguaaaugu caaaauuguu 360

uuccuuuaaa uuggaccugg uacaguagua augggagugu aaagguuccu guugguguuc 420

aaaugaauaa auaugugauc aauggaacau augcuaacga aacaaagcug aagauaacac 480

aacuuuugga ggaagauggg gaaucuuacu ggugccgugc acuauuccaa uuaggcgaga 540

gugaagaaca cauugagcuu guggugcuga gcuauuuggu gccccucaaa ccauuucuug 600

uaauaguggc ugaggugauu cuuuuagugg ccaccauucu gcuuugugaa aaguacacac 660

aaaagaaaaa gaagcacuca gaugagggga aagaauuuga gcagauugaa cagcugaaau 720

cagaugauag caaugguaua gaaaauaaug uccccaggca uagaaaaaau gagucucugg 780

gccagugaau acaaaacauc augucgagaa ucauuggaag auauacagag uucguauuuc 840

agcuuuguuu auccuuccug uuaagagccu cugaguuuuu aguuuuaaaa ggaugaaaag 900

cuuaugcaac augcucagca ggagcuucau caacgauaua ugucagaucu aaag 954

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggagcttc atcaacgat 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaatccccag atgttgtga 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acacggacag gattgacaga 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggacatctaa gggcatcaca 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggctgttgtc atacttctca tgg 23

Claims

1.环状RNA circEMB_003的定量检测剂在制备用于结直肠癌诊断的试剂盒中的应用，其特征在于，所述环状RNA circEMB_003的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述环状RNA circEMB_003的定量检测剂包括适用于如下至少一种方法的试剂：

数字PCR、共振光散射法、实时荧光定量PCR、测序或生物质谱法。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述环状RNA circEMB_003的定量检测剂为能够特异性结合环状RNA circEMB_003或环状RNA circEMB_003对应的cDNA的探针或引物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述探针或引物带有可检测的标记。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述标记为荧光标记物或同位素标记物。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述环状RNA circEMB_003的定量检测剂为环状RNA circEMB_003的qRT-PCR引物，其上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQID NO.3所示。

7.根据权利要求1~6任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中还包括内参引物对。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述内参引物对包括18S rRNA扩增引物对和GAPDH扩增引物对中的一种或多种。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述18S rRNA扩增引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述GAPDH扩增引物对的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中还包括RNA提取试剂、PCR反应缓冲液、dNTPs以及DNA聚合酶中的至少一种。