CN111072729B - 一种寡核苷酸合成用固相载体装置及其选择性修饰方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种寡核苷酸合成用固相载体装置及其选择性修饰方法，提供了用于寡核苷酸合成的固相载体装置和选择性功能化修饰方法。所述固相载体装置为硅片，包含一级孔和二级孔，一级孔为合理的阵列排布，是嵌入二级孔的通孔。所述选择性修饰方法为：将第一组分子施加到硅片表面，使用匀胶机利用离心力将其均匀地旋涂在硅片表面和二级孔区域，保护其不发生功能化反应，使用功能化试剂对一级孔区域进行修饰。本发明具有成本低、实验操作简单、易实现、修饰效率高的优点，避免光刻技术复杂的实验操作和工艺流程。固相载体的选择性修饰方法的设计，能够解决新一代DNA合成技术中微流控芯片固相载体装置的定位修饰问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物合成领域，特别是涉及一种寡核苷酸合成用固相载体装置及其选择性修饰方法。
背景技术
随着社会的发展和科技的进步，合成生物学技术成为新兴战略性国际前沿技术，其快速发展对基因合成能力提出了日益迫切的需求。自1960年以来，化学法体外合成寡核苷酸技术一直发展至今，DNA合成仪的通量、效率以及性能是影响DNA合成的成本以及质量的关键因素。现阶段第一代DNA合成仪，大多都是基于柱式合成的设备，在最新的国内外研究进展中，基于微流控芯片及喷墨打印技术等的新一代DNA合成技术及仪器的研究成为新的研发方向，探索合成反应中固相载体设计方式、修饰方式、试剂到芯片和固相载体的微量释放控制方式等是实现在芯片上高通量合成DNA的关键技术。
目前对于化学法合成寡核苷酸的固体载体的设计，柱式合成仪中多采用多孔玻璃。然而，多孔玻璃做固相载体具有试剂消耗量大、合成成本高等不足之处。基于微流控芯片的新一代DNA合成仪将微量试剂集成至微流控芯片中进行反应，降低了成本，但是其固相载体的修饰多采用光刻技术，需要经过涂胶、前烘、曝光、显影、坚膜、刻蚀和去胶等七个步骤，流程较为复杂。基于微流控芯片的新一代DNA合成技术，本发明提出了一种寡核苷酸合成用固相载体装置及其选择性修饰方法，该方法中固相载体选用双级孔设计的硅片，使用匀胶机对硅片旋涂第一组分子，进而对固相载体进行选择性功能化修饰，避免了光刻技术的复杂工艺流程，能够简单有效的解决新一代DNA合成技术中微流控芯片固相载体装置的定位修饰问题。这种修饰方法操作简单、易于实现、效率高、成本低。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种寡核苷酸合成用固相载体装置及其选择性修饰方法。
本发明为所要解决的技术问题提出的技术方案是：一种寡核苷酸合成用固相载体装置，包括：用于寡核苷酸合成的固体支持物为硅片，所述硅片包含一级孔和二级孔，一级孔是嵌入二级孔的通孔；
其中，所述硅片的一级孔形状至少为正方形、矩形、圆形、三角形、五边形、六边形、八边形、其他正多边形、蜂窝状、无定型形状、Z字型、直线型中的一种，按照规则阵列、不规则阵列的组合进行排布；
其中，所述一级孔具有包括但不限于1μm至300μm的直径；
其中，所述一级孔具有包括但不限于1μm至500μm的孔深；
其中，所述二级孔具有包括但不限于500μm至2000μm的直径，具有包括但不限于1μm至300μm的孔深。
本发明的第二个目的是一种寡核苷酸合成用固相载体装置的选择性修饰方法，将第一组分子施加到硅片的表面和二级孔区域，其中所述的第一组分子与硅片表面和二级孔区域结合但不与一级孔侧壁结合，功能化试剂只在硅片的一级孔中进行反应，实现只对硅片一级孔侧壁区域进行功能化修饰。
将旋涂第一组分子的硅片羟基化处理，其中包括但不限于Plasma处理、在紫外灯臭氧照射后用浓硫酸与双氧水的混合液处理。
所述第一组分子为固化型材料，包括但不限于聚二甲基硅氧烷(PDMS)、有机硅凝胶。
将羟基化处理之后的硅片在功能化试剂中浸泡包括但不限于4小时至6小时的时长，最后将固相载体装置用清洗剂进行冲洗。
所述功能化试剂包括但不限于0.1％的乙酸、95％乙醇、5％去离子水和2％N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基-4-羟基丁酰胺)的混合溶液。
将第一组分子施加到硅片表面，使用匀胶机先低速旋涂后，再以至少1000rpm的转速处理，利用离心力将第一组分子均匀地旋涂在硅片表面和二级孔侧壁区域中，通过旋涂微米级的第一组分子保护一级孔以外的区域，使其不能够发生功能化反应。
通过试剂配比、添加调节剂改变其黏度，并且根据一级孔的直径选择第一组分子的旋涂转速，保证第一组分子能够均匀旋涂在硅片的表面和二级孔区域且不堵塞一级孔。
第一组分子具有以厘泊(cP)为单位至少大于或等于90的黏度并且小于200000的黏度，以保证第一组分子能够均匀旋涂在硅片的表面和二级孔区域且不堵塞一级孔。
所述一级孔的阵列包含但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000个数。
所旋涂的第一组分子同硅片之间有很好的粘附性，不影响后续寡核苷酸的合成，无需去除第一组分子，避免光刻技术通过去胶等复杂操作剥离残留物。
当本发明所提出的第一组分子影响寡核苷酸的合成时，需要在功能化修饰之后将其去除。在第一组分子完全固化后，利用包括但不限于纯酒精溶液对其进行剥离脱模处理。
本发明具有如下优点：
1、第一组分子是高分子有机硅化合物，是柔性材料，具有成本低、无毒、配置工艺简单等优点，可以通过改变试剂配比、添加调节剂等改变第一组分子的黏度，第一组分子可以粘结至固相载体表面。
2、使用匀胶机对固相载体表面和二级孔旋涂第一组分子，通过改变匀胶机的转速控制第一组分子的旋涂厚度，为后序芯片的功能化处理提供条件。
3、本发明具有效率高，实验操作简单的优点。仅通过使用匀胶机进行旋涂，即可以在DNA合成芯片表面实现第一组分子的选择性修饰，规避了光刻技术的预处理、涂胶、前烘、曝光、显影、坚膜、刻蚀和去胶等复杂工艺流程。
附图说明
图1是本发明公开的寡核苷酸合成用固相载体装置及其选择性修饰方法第一实施例4×4正方形阵列装置结构俯视图；
图2是本发明公开的寡核苷酸合成用固相载体装置及其选择性修饰方法第一实施例4×4正方形阵列装置剖面图；
附图标记：
101:硅片
102:一级孔
103:二级孔
104:一级孔侧壁区域
105:二级孔侧壁区域
106:第一组分子膜。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明的寡核苷酸合成用固相载体装置及其选择性修饰方法做出详细说明。
如图1所示，本发明的寡核苷酸合成用固相载体装置及其选择性修饰方法，所述固相载体装置包括一级孔和二级孔两个主要设计部分。
本发明所提出的一级孔102是嵌入二级孔103的通孔，硅片的一级孔形状至少为正方形、矩形、圆形、三角形、五边形、六边形、八边形、其他正多边形、蜂窝状、无定型形状、Z字型、直线型中的一种，按照规则阵列、不规则阵列的组合进行排布。本发明所提出的一级孔的阵列包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000个数的一级孔。本发明所提出的一级孔102具有包括但不限于1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm的直径。本发明所提出的一级孔102具有包括但不限于1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm的孔深。
在一些情况下，本发明所提出的二级孔103具有包括但不限于500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm、1100μm、1200μm、1300μm、1400μm、1500μm、1600μm、1700μm、1800μm、1900μm、2000μm的直径。本发明所提出的二级孔具有包括但不限于1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、200μm、300μm的孔深。
如图2所示，本发明公开的寡核苷酸合成用固相载体装置及其选择性修饰方法的实施方法是：整个硅片101是用于寡核苷酸合成的固相载体。合成寡核苷酸时，通过喷墨打印将寡核苷酸单体试剂喷入一级孔102中，本发明所提出的寡核苷酸的合成只发生在一级孔102中。
在第一实施例中，第一组分子为PDMS，将PDMS的主剂和固化剂按照包括但不限于10:1的比例混合，搅拌至均匀，通过抽真空使混合液中的气泡浮至表面并破裂进行脱气处理。然后，利用注射器吸取少量制备完成的PDMS，将PDMS以点涂的形式少量且均匀的滴在硅片101上，也可以通过喷洒的形式将PDMS均匀的喷洒在硅片101上，点涂或者喷涂的时候避免将PDMS涂覆在一级孔102中。将硅片放入匀胶机，通过卡盘固定在匀胶机的基板上。开启匀胶机，使其先低速旋涂后，再以至少1000rpm的转速处理，利用离心力将PDMS均匀地旋涂在硅片表面和二级孔侧壁区域105中，这样就可实现在硅片表面以及二级孔侧壁区域105旋涂一层微米级别厚度的PDMS膜。然后，将旋涂PDMS的硅片放入烤箱以包括但不限于80℃的温度烘烤至PDMS完全固化。
在第二实施例中，第一组分子为有机硅凝胶，将有机硅凝胶的A组分和B组分按照包括但不限于1:1的比例混合，搅拌至均匀，通过抽真空使混合液中的气泡浮至表面并破裂进行脱气处理。然后，利用注射器吸取少量制备完成的有机硅凝胶，将有机硅凝胶以点涂的形式少量且均匀的滴在硅片101上，也可以通过喷洒的形式将有机硅凝胶均匀的喷洒在硅片101上，点涂或者喷涂的时候避免将有机硅凝胶涂覆在一级孔102中。将-硅片放入匀胶机，通过卡盘固定在匀胶机的基板上。开启匀胶机，使其先低速旋涂后，再以至少1000rpm的转速处理，利用离心力将有机硅凝胶均匀地旋涂在硅片表面和二级孔侧壁区域105中，这样就可实现在硅片表面以及二级孔侧壁区域105旋涂一层微米级别厚度的有机硅凝胶膜。然后，使旋涂有机硅凝胶的硅片在室温或加热条件下固化。若在室温下固化，至有机硅凝胶完全固化即可。若在加热条件下固化，将旋涂有机硅凝胶的硅片放入烤箱以包括但不限于80℃的温度烘烤至有机硅凝胶完全固化。
将旋涂第一组分子的硅片羟基化处理，处理方法包括但不限于Plasma处理或者在紫外灯臭氧照射后用浓硫酸与双氧水的混合液处理。然后，滴加至少10μL的或者更少的功能化试剂到旋涂第一组分子的硅片101进行修饰，功能化试剂包括但不限于0.1％的乙酸、95％乙醇、5％去离子水和2％N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基-4-羟基丁酰胺)的混合溶液。由于硅片的表面、二级孔区域103和二级孔侧壁区域105被第一组分子覆盖，功能化试剂只在硅片的一级孔中进行反应，只对硅片一级孔侧壁区域104进行功能化修饰。硅片在功能化试剂中浸泡包括但不限于4小时至6小时的时长，最后将硅片用乙醇或者***进行冲洗。本发明所述的清洗方法为使用包括但不限于乙醇、***等清洗剂进行冲洗。
本发明公开的寡核苷酸合成用固相载体装置及其选择性修饰方法具有操作简单、成本低、易实现、效率高的优点，规避了光刻技术的涂胶、前烘、曝光、显影、坚膜、刻蚀和去胶等高要求的实验条件、复杂的实验操作和工艺流程，仅使用匀胶机就可以对寡核苷酸合成的固相载体装置进行选择性修饰，从而也能够避免光刻技术对寡核苷酸合成的影响。
本发明公开和揭示的所有组合可以通过借鉴本文公开内容产生，尽管本发明的组合已通过详细实施过程进行了描述，但是本领域技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本发明所述的装置进行拼接或改动，或增减某些部件，更具体地说，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容之中。
Claims (9)
1.一种寡核苷酸合成用固相载体装置，其特征在于，包括：用于寡核苷酸合成的固体支持物为硅片，所述硅片包含一级孔和二级孔，一级孔是嵌入二级孔的通孔；
其中，所述硅片的一级孔形状至少为正方形、矩形、圆形、三角形、五边形、六边形、八边形、其他正多边形、蜂窝状、无定型形状、Z字型、直线型中的一种，按照规则阵列、不规则阵列的组合进行排布；
其中，所述一级孔具有1μm至300μm的直径；
其中，所述一级孔具有1μm至500μm的孔深；
其中，所述二级孔具有500μm至2000μm的直径，具有1μm至300μm的孔深；
所述的一种寡核苷酸合成用固相载体装置的选择性修饰方法为：将第一组分子施加到硅片的表面和二级孔区域，使用匀胶机先低速旋涂后，再以至少1000rpm的转速处理，利用离心力将第一组分子均匀地旋涂在硅片表面和二级孔侧壁区域中，所述第一组分子与硅片表面和二级孔区域结合，通过旋涂微米级的第一组分子保护一级孔以外的区域，使其不能够发生功能化反应；将旋涂第一组分子的硅片羟基化处理，所述第一组分子为高分子有机硅化合物；将羟基化处理之后的硅片在功能化试剂中浸泡，最后用清洗剂进行冲洗，功能化试剂只在硅片的一级孔中进行反应，实现只对硅片一级孔侧壁区域进行功能化修饰。
2.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸合成用固相载体装置的选择性修饰方法，其特征在于，将第一组分子施加到硅片的表面和二级孔区域，使用匀胶机先低速旋涂后，再以至少1000rpm的转速处理，利用离心力将第一组分子均匀地旋涂在硅片表面和二级孔侧壁区域中，所述第一组分子与硅片表面和二级孔区域结合，通过旋涂微米级的第一组分子保护一级孔以外的区域，使其不能够发生功能化反应；将旋涂第一组分子的硅片羟基化处理；所述第一组分子为高分子有机硅化合物；将羟基化处理之后的硅片在功能化试剂中浸泡，最后用清洗剂进行冲洗，功能化试剂只在硅片的一级孔中进行反应，实现只对硅片一级孔侧壁区域进行功能化修饰。
3.根据权利要2所述的一种寡核苷酸合成用固相载体装置的选择性修饰方法，其特征在于，第一组分子为聚二甲基硅氧烷或有机硅凝胶。
4.根据权利要2所述的一种寡核苷酸合成用固相载体装置的选择性修饰方法，其特征在于，羟基化处理包括：Plasma处理或在紫外灯臭氧照射后用浓硫酸与双氧水的混合液处理。
5.根据权利要2所述的一种寡核苷酸合成用固相载体装置的选择性修饰方法，其特征在于，所述功能化试剂为0.1％的乙酸、95％乙醇、5％去离子水和2％N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基-4-羟基丁酰胺)的混合溶液。
6.根据权利要求2所述的一种寡核苷酸合成用固相载体装置的选择性修饰方法，其特征在于，通过试剂配比、添加调节剂改变其黏度，并且根据一级孔的直径选择第一组分子的旋涂转速，保证第一组分子能够均匀旋涂在硅片的表面和二级孔区域且不堵塞一级孔。
7.根据权利要求2所述的一种寡核苷酸合成用固相载体装置的选择性修饰方法，其特征在于，第一组分子具有以厘泊为单位至少大于或等于90的黏度并且小于200000的黏度，以保证第一组分子能够均匀旋涂在硅片的表面和二级孔区域且不堵塞一级孔。
8.根据权利要求2所述的一种寡核苷酸合成用固相载体装置的选择性修饰方法，其特征在于，如果存在第一组分子影响后续合成反应的情况，在第一组分子完全固化后，可以对第一组分子进行剥离处理。
9.据权利要求1所述的一种寡核苷酸合成用固相载体装置，其特征在于，所述一级孔的阵列包含但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000个数。
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