CN111065453B - 催化活性物质 - Google Patents

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Abstract

催化活性物质包括硫化亚铜(I)矿物颗粒和结合至硫化亚铜(I)矿物颗粒的表面的炔烃官能化的分子。在示例性方法中，硫化亚铜(I)矿物与炔烃官能化的分子反应以形成催化活性物质。催化活性物质与叠氮化物官能化的分子反应，以将催化活性物质与叠氮化物官能化的分子偶联。

Description

催化活性物质
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年12月22日提交的美国临时申请序列号62/609,370的权益，该临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。
背景
生物阵列是用于检测和分析分子的多种工具之一，所述分子包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。在这些应用中，阵列被设计成包括用于在人类和其他生物体的基因中存在的核苷酸序列的探针。例如，在某些应用中，单独的DNA探针和RNA探针可以附接在阵列支撑物上的呈几何网格(或随机)的位置处。例如来自人或生物体的测试样品可以暴露于网格，使得互补片段在阵列中的单独位点处与探针杂交。然后可以通过在位点上方扫描特定频率的光以识别在样品中存在哪些片段、通过片段被杂交的位点的荧光来检查阵列。
生物阵列可以用于基因测序。一般来说，基因测序包括确定一段遗传物质中的核苷酸或核酸的顺序，所述一段遗传物质诸如DNA或RNA的片段。越来越长的碱基对序列正在被分析，并且得到的序列信息可以用于多种生物信息学方法中，以将片段逻辑地拟合在一起，以便可靠地确定广泛长度的遗传物质的序列，片段源自该广泛长度的遗传物质。特征性片段的自动的基于计算机的检查已经被开发，并且已经被用于基因组作图、基因及其功能的识别、某些状况和疾病状态的风险的评估等。除了这些应用以外，生物阵列还可以用于检测和评估范围广泛的分子、分子的家族、基因表达水平、单核苷酸多态性和基因分型。
引言
在一个方面中，催化活性物质包括硫化亚铜(I)矿物颗粒；以及直接结合至硫化亚铜(I)矿物颗粒的表面的炔烃官能化的分子。
在该方面的示例中，硫化亚铜(I)矿物颗粒选自由辉铜矿(chalcocite)、久辉铜矿(djurleite)和蓝辉铜矿(digenite)组成的组。
在该方面的示例中，炔烃官能化的分子是具有炔烃官能团的引物，任选地其中炔烃官能团被附接在引物的5’末端。
在该方面的示例中，配位键将炔烃官能化的分子结合至硫化亚铜(I)矿物颗粒的表面。
应理解，催化活性物质的该方面的任何特征可以以任何合意的方式和/或配置组合在一起。
在另一个方面中，方法包括使硫化亚铜(I)矿物与炔烃官能化的分子反应，以形成催化活性物质；以及使催化活性物质与叠氮化物官能化的分子反应，以将催化活性物质与叠氮化物官能化的分子偶联。在另一个方面中，制备***的方法包括在硫化亚铜(I)矿物的存在下，使炔烃官能化的分子与叠氮化物官能化的分子反应。
在该方面的示例中，所述方法还包括在使催化活性物质与叠氮化物官能化的分子反应之前，从催化活性物质中过滤未反应的硫化亚铜(I)矿物。
在该方面的示例中，在使硫化亚铜(I)矿物与炔烃官能化的分子反应之前，所述方法还包括向炔烃官能化的分子添加相对于炔烃官能化的分子化学计量过量的硫化亚铜(I)矿物。
在该方面的示例中，硫化亚铜(I)具有在从约500nm至约45μm的范围内的平均粒度。
在该方面的示例中，使硫化亚铜(I)矿物与炔烃官能化的分子反应包括形成硫化亚铜(I)矿物、炔烃官能化的分子和炔烃官能化的分子的溶剂的混合物；以及将混合物保持在高于溶剂的凝固点且低于溶剂的沸点的温度持续多达约50天的时间。在该示例中，溶剂选自由以下组成的组：水、碳酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液和二甲基亚砜；并且混合物的pH在从约4至约12的范围内。同样在该示例中，所述保持包括将混合物加热至在从约30℃至约60℃的范围内的温度，持续在从约30分钟至约90分钟的范围内的时间。
在该方面的示例中，在使炔烃官能化的分子或催化活性物质与叠氮化物官能化的分子反应之前，所述方法还包括在流动池基底的表面上形成叠氮化物官能化的分子的层，并且其中使炔烃官能化的分子或催化活性物质与流动池基底的表面上的叠氮化物官能化的分子的层反应。在该示例中，炔烃官能化的分子或催化活性物质存在于液体混合物中，并且其中液体混合物流经流动池基底的表面上的叠氮化物官能化的分子的层。同样在该示例中，在形成层之前，所述方法还可以包括将硅烷或硅烷衍生物附接至基底的表面，以形成硅烷化表面。
在该方面的示例中，所述方法在没有配体配位并且不暴露于还原剂的情况下进行。
应理解，所述方法的该方面的任何特征可以以任何合意的方式组合在一起。此外，应理解，所述方法的该方面和/或催化活性物质的方面的特征的任何组合可以被一起使用，和/或来自这些方面的任一方面或两方面的任何特征可以与本文公开的任何示例组合。
在还另一方面中，接枝混合物包含含有炔烃官能团的引物；溶剂；和硫化亚铜(I)矿物。
在该方面的示例中，炔烃官能团待与硫化亚铜(I)矿物的表面反应，以在接枝混合物中形成催化活性物质。
在该方面的示例中，接枝混合物还包含叠氮化物官能化的分子，其中叠氮化物官能化的分子待与由硫化亚铜(I)矿物介导的炔烃官能化的分子反应。在示例中，叠氮化物官能化的分子是聚合物。在示例中，聚合物在基底的表面上，任选地其中基底是流动池。
在该方面的示例中，接枝混合物包含相对于引物化学计量过量的硫化亚铜(I)矿物。
在该方面的示例中，接枝混合物包含从约1μM至约20μM的引物；和从约0.1M至约3M的硫化亚铜(I)矿物。
在该方面的示例中，硫化亚铜(I)矿物选自由辉铜矿、久辉铜矿和蓝辉铜矿组成的组，并且具有在从约500nm至约45μm的范围内的平均粒度。
应理解，接枝混合物的该方面的任何特征可以以任何合意的方式组合在一起。此外，应理解，来自接枝混合物的特征和/或来自所述方法的特征和/或来自催化活性物质的特征的任何组合可以被一起使用，和/或来自这些方面中的任何或全部方面的任何特征可以与本文公开的示例的任何特征组合。
在还另外的方面中，将引物接枝至流动池表面的方法包括在硫化亚铜(I)矿物的存在下，使炔烃官能化的引物与流动池表面上的叠氮化物官能化的分子反应。
在该另外的方面的示例中，硫化亚铜(I)矿物与炔烃官能化的引物反应，以形成催化活性物质；并且催化活性物质与叠氮化物官能化的分子反应，以将催化活性物质与流动池表面上的叠氮化物官能化的分子偶联。在一些示例中，在使硫化亚铜(I)矿物与炔烃官能化的引物反应之前，所述方法还包括向炔烃官能化的引物添加相对于炔烃官能化的引物化学计量过量的硫化亚铜(I)矿物。在一些示例中，硫化亚铜(I)矿物与炔烃官能化的引物的反应包括形成硫化亚铜(I)矿物、炔烃官能化的引物和炔烃官能化的引物的溶剂的混合物；以及将混合物保持在高于溶剂的凝固点且低于溶剂的沸点的温度持续多达约50天的时间。在这些示例中的一些中，溶剂选自由以下组成的组：水、碳酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液和二甲基亚砜，并且混合物的pH在从约4至约12的范围内。同样在这些示例中的一些中，所述保持包括将混合物加热至在从约30℃至约60℃的范围内的温度，持续在从约30分钟至约90分钟的范围内的时间。
在该另外的方面的示例中，在使催化活性物质与流动池表面上的叠氮化物官能化的分子反应之前，所述方法还包括在流动池表面上形成叠氮化物官能化的分子的层，并且其中使催化活性物质与流动池表面上的叠氮化物官能化的分子的层反应。在该示例中，催化活性物质存在于液体混合物中，并且液体混合物流经流动池表面上的叠氮化物官能化的分子的层。在这些示例中的一些中，在形成层之前，所述方法还包括将硅烷或硅烷衍生物附接至流动池表面以形成硅烷化表面。同样在这些示例中的一些中，叠氮化物官能化的分子的层是聚(N-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)。
该另外的方面的示例还包括在使催化活性物质与流动池表面上的叠氮化物官能化的分子反应之前，从催化活性物质中过滤未反应的硫化亚铜(I)矿物。
应理解，所述方法的该方面的任何特征可以以任何合意的方式组合在一起。此外，应理解，来自该方法的特征和/或接枝混合物的特征和/或其他方法的特征和/或来自催化活性物质的特征的任何组合可以被一起使用，和/或来自这些方面中的任何或全部方面的任何特征可以与本文公开的示例的任何特征组合。
附图简述
通过参考以下详细描述和附图，本公开内容的示例的特征将变得明显，其中相似的参考数字对应于类似的尽管可能不相同的组分。为了简洁起见，具有先前描述的功能的参考数字或特征可以结合或可以不结合其中它们出现的其他附图来描述。
图1是图示出本文公开的方法的示例的流程图；
图2A至图2E是描绘使用第一示例的接枝混合物将表面化学物质(surfacechemistry)添加至图案化基底的示例的示意性横截面视图，并且图2A、图2B和图2E是描绘使用第二示例的接枝混合物将表面化学物质添加至图案化基底的示例的示意性横截面视图；
图3A至图3D是描绘使用第一示例的接枝混合物将表面化学物质添加至非图案化基底的示例的示意性横截面视图，并且图3A、图3B和图3D是描绘使用第二示例的接枝混合物将表面化学物质添加至非图案化基底的示例的示意性横截面视图；
图4是示例性流动池和比较性流动池的表面引物可及性测试(surface primeraccessibility test)(CFR测定)之后的荧光强度(相对强度单位，RFU)的图；
图5是由孵育持续不同时间段的催化活性物质形成的不同的示例性流动池在表面引物可及性测试(CFR测定)之后的荧光强度(相对强度单位，RFU)的图；以及
图6A至图6C是描绘不同混合物的动态光散射结果的图，其结果说明本文公开的接枝混合物形成催化活性物质。
详细描述
本文公开的方法的示例包括形成含有处于其+1氧化态的铜(Cu)的催化活性物质。硫化亚铜(I)矿物是单硫化铜(copper monosulfide)，其中1.6≤Cu/S≤2。硫化亚铜(I)矿物的示例是辉铜矿(Cu2S)或久辉铜矿(Cu31S16)或蓝辉铜矿(Cu9S5)。在一些方面中，催化活性物质是使用矿物硫化亚铜(I)形成的，该矿物硫化亚铜(I)用作活性铜物质(Cu+)的来源。在本文公开的示例中，使硫化亚铜(I)矿物与炔烃官能化的分子和叠氮化物官能化的分子反应以形成***。在一些方面中，使硫化亚铜(I)与炔烃官能化的分子反应以形成催化活性物质，该催化活性物质包括硫化亚铜(I)矿物颗粒和直接结合至矿物硫化亚铜(I)颗粒的表面的炔烃官能化的分子。已经发现，该反应可以在不将Cu2+物质配位至稳定配体(例如，以避免沉淀)的情况下并且在不将稳定的Cu2+物质暴露于还原剂(例如，抗坏血酸盐)的情况下进行以产生催化活性铜物质。避免使用另外的用于配体配位和Cu2+还原的试剂是合意的，因为这些另外的试剂可能增加反应的复杂性和成本，可能产生不合意的副反应，并且可能包括不合意的或有毒的反应物。在没有配体配位和还原的情况下，本文公开的示例性方法是简化的工艺，该工艺除了矿物硫化亚铜(I)和炔烃官能化的分子之外，不包括额外的试剂。
此外，已经发现，炔烃官能化的分子在硫化亚铜(I)矿物的表面上的非均相反应在不存在光的情况下发生(即，不由光驱动)，这不同于聚合物稳定的Cu2S量子点。
还另外地，在本文公开的方法的一些示例中，炔烃官能化的分子是含有炔烃官能团的引物。在这些示例中，催化活性物质可以用于铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成反应，以将引物的炔烃官能团偶联至叠氮化物官能化的分子。这种环加成反应可以在水性介质的存在下和氧气的存在下发生，而不使活性铜物质歧化成Cu0和Cu2+，部分是因为活性铜物质被配位至引物和催化活性物质中的硫。
在其他叠氮化物-炔烃环加成反应中，铜催化剂的除去已经被证明是困难的，部分是因为活性铜物质歧化成Cu0和Cu2+的倾向。通常使用的除去技术包括离子交换技术或液-液萃取技术。使铜催化剂的除去变得容易的其他技术包括将氟标记(fluorous tag)并入催化剂，其中氟标记有助于通过固相萃取技术除去标记的催化剂。不同于包括复杂工具和/或另外的材料以促进铜催化剂的除去的这些技术，本文公开的方法的一些示例包括用于除去未反应的矿物硫化亚铜(I)的简单方法，诸如离心或过滤。可以使用这些简单的技术，因为在一些示例中，单一接枝混合物(在本文中被称为第二示例的接枝混合物)包含溶解的叠氮化物-炔烃反应产物和未溶解的未反应的硫化亚铜(I)矿物，后者可以通过离心或过滤分离。
应理解，除非另外说明，否则本文使用的术语将采用它们在相关领域中的普通含义。下文阐述了本文使用的若干术语和它们的含义。
除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”、和“该(the)”包括复数指示物。
术语包含(comprising)、包括(including)、含有(containing)和这些术语的多种形式彼此同义，并且意指同样广泛。
术语顶(top)、底(bottom)、下(lower)、上(upper)、上(on)等在本文中用于描述流动池和/或流动池的多种部件。应理解，这些方向术语并不意指暗示特定的取向，而是用于指示部件之间的相对取向。方向术语的使用不应被解释为将本文公开的示例限制于任何特定的取向。
如本文使用的，“烷基”指的是完全饱和(即，不包含双键或三键)的直链或支链的烃链。烷基基团可以具有1个至20个碳原子。示例性的烷基基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基以及类似基团。作为示例，名称“C1-4烷基”指示在烷基链中存在一个至四个碳原子，即烷基链选自由以下组成的组：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。
如本文使用的，“烯基”指的是包含一个或更多个双键的直链或支链的烃链。烯基基团可以具有2个至20个碳原子。示例性的烯基基团包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基以及类似基团。
如本文使用的，“炔烃”或“炔基”指的是包含一个或更多个三键的直链或支链的烃链。炔基基团可以具有2个至20个碳原子。炔烃官能化的分子是包含炔烃官能团的任何分子。
如本文使用的，“芳基”指的是在环骨架中仅包含碳的芳香族环或芳香族环体系(即，共享两个相邻的碳原子的两个或更多个稠环)。当芳基是环体系时，在该体系中的每一个环是芳香族的。芳基基团可以具有6个至18个碳原子。芳基基团的示例包括苯基、萘基、薁基以及蒽基。
如本文使用的，术语“附接”指的是两个事物彼此接合、紧固、粘附、连接或结合的状态。例如，核酸可以通过共价键或非共价键被附接至聚合物。共价键的特征在于共享原子之间的电子对。在示例中，共价键可以是硫化亚铜(I)和炔烃官能化的分子之间的配位键。非共价键是不包括电子对的共享的物理键，并且可以包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。
“叠氮化物”或“叠氮基”官能团指的是-N3。叠氮化物官能化的分子是包含叠氮化物官能团的任何分子。
如本文使用的，“结合区域(bonding region)”指的是支撑物或基底上待与另一种材料结合的区域，该另一种材料例如可以是间隔层、盖、另一基底等或其组合(例如，间隔层和盖)。在结合区域处形成的结合可以是化学键(如上文描述的)或者机械结合(例如，使用紧固件等)。
如本文使用的，“碳环基”意指在环体系骨架中仅包含碳原子的非芳香族环状环或非芳香族环体系。当碳环基是环体系时，两个或更多个环可以以稠合的、桥接的或螺连接的方式接合在一起。碳环基可以具有任何饱和度，条件是环体系中的至少一个环不是芳香族的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基以及环炔基。碳环基基团可以具有3个至20个碳原子。碳环基环的示例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,3-二氢-茚、双环[2.2.2]辛基、金刚烷基以及螺[4.4]壬基。
如本文使用的，“亚环烷基”意指经由两个附接点附接至分子的剩余部分的完全饱和的碳环基环或碳环基环体系。
如本文使用的，“环烯基”或“环烯烃”意指具有至少一个双键的碳环基环或碳环基环体系，其中在环体系中没有环是芳香族的。示例包括环己烯基或环己烯和降冰片烯基或降冰片烯。还如本文使用的，“杂环烯基”或“杂环烯烃”意指具有至少一个双键的、在环骨架中具有至少一个杂原子的碳环基环或碳环基环体系，其中在环体系中没有环是芳香族的。
如本文使用的，“环炔基”或“环炔烃”意指具有至少一个三键的碳环基环或碳环基环体系，其中在环体系中没有环是芳香族的。示例是环辛炔。另一个示例是双环壬炔。还如本文使用的，“杂环炔基”或“杂环炔烃”意指具有至少一个三键的、在环骨架中具有至少一个杂原子的碳环基环或碳环基环体系，其中在环体系中没有环是芳香族的。
如本文使用的术语“沉积”指的是任何合适的施加技术，其可以是手动的或自动的，并且导致表面性质的改变。通常，沉积可以使用气相沉积技术、涂布技术、接枝技术或类似技术来进行。一些具体的示例包括化学气相沉积(CVD)、喷涂(例如，超声喷涂)、旋涂、浸泡涂布或浸涂、刮刀涂布、水坑分配(puddle dispensing)、流过涂布、气溶胶印刷、喷墨印刷或类似技术。
如本文使用的，术语“凹陷部(depression)”指的是图案化基底中的离散凹形特征，其具有被图案化基底表面的间隙区域完全包围的表面开口。凹陷部可以在其表面中的开口处具有多种形状中的任一种，例如包括圆形、椭圆形、正方形、多边形、星形(具有任何数目的顶点)等。与表面正交地截取的凹陷部的横截面可以是弯曲的、正方形的、多边形的、双曲线的、锥形的、角形的等。作为示例，凹陷部可以是阱(well)。还如本文使用的，“官能化的凹陷部”指的是其中聚合物和引物被附接的离散凹形特征。
当提及物品的集合使用时，术语“每个(each)”意图识别集合中的单独的物品，但不一定指的是集合中的每一个物品。如果明确的公开内容或上下文另外明确指出，则可能发生例外。
如本文使用的，术语“流动池”意图意指容器，该容器具有其中反应可以进行的室(即，流动通道)、用于将试剂递送至室的入口和用于从室中除去试剂的出口。在一些示例中，室使得能够检测在室中发生的反应。例如，室可以包括一个或更多个透明表面，允许对室中的阵列、光学标记的分子或类似物进行光学检测。
如本文使用的，“流动通道”可以是限定在两个结合的部件之间的区域，该区域可以选择性地接纳液体样品。在一些示例中，流动通道可以被限定在图案化基底和盖之间，并且因此可以与限定在图案化基底中的一个或更多个凹陷部流体连通。在其他示例中，流动通道可以被限定在非图案化基底和盖之间。
术语“官能化的层”是指包含具有与其偶联的炔烃官能化的分子的叠氮化物官能化的分子的层。
如本文使用的，术语“接枝混合物”指的是包含表面化学组分的混合物或溶液。本文公开的第一示例的接枝混合物包含硫化亚铜(I)和炔烃官能化的分子和/或硫化亚铜(I)和炔烃官能化的分子的反应产物(其在本文中被称为催化活性物质)。该第一示例的接枝混合物还可以包含溶剂。如本文进一步描述的，第一示例的接枝混合物可以用于将炔烃官能化的分子引入叠氮化物官能化的分子的已经形成的层。本文公开的第二示例的接枝混合物包含硫化亚铜(I)、炔烃官能化的分子和叠氮化物官能化的分子，和/或催化活性物质，和/或催化活性物质和叠氮化物官能化的分子的反应产物。该第二示例的接枝混合物还可以包含溶剂。如本文进一步描述的，接枝物混合物的第二示例可以用于将官能化的层引入流动池基底。
如本文使用的，“杂芳基”指的是在环骨架中包含一个或更多个杂原子(即，不同于碳的元素，包括但不限于氮、氧以及硫)的芳香族环或芳香族环体系(即，共享两个相邻原子的两个或更多个稠环)。当杂芳基是环体系时，在该体系中的每一个环是芳香族的。杂芳基基团可以具有5-18个环成员。
如本文使用的，“杂环基”意指在环骨架中包含至少一个杂原子的非芳香族环状环或非芳香族环体系。杂环基可以以稠合的、桥接的或螺连接的方式接合在一起。杂环基可以具有任何饱和度，条件是环体系中的至少一个环不是芳香族的。在环体系中，杂原子可以存在于非芳香族环或芳香族环中。杂环基基团可以具有3个至20个环成员(即，构成环骨架的原子的数目，包括碳原子和杂原子)。在一些示例中，杂原子是O、N或S。
如本文使用的，“氢氧基(hydroxy)”或“羟基(hydroxyl)”指的是-OH基团。
如本文使用的，术语“间隙区域”指的是将凹陷部分离的在基底中或在表面上的区域。例如，间隙区域可以将阵列的一个特征与阵列的另一个特征分离。彼此分离的两个特征可以是离散的，即，彼此缺少物理接触。在另一示例中，间隙区域可以将特征的第一部分与特征的第二部分分离。在许多示例中，间隙区域是连续的，而特征是离散的，例如，如对于在其他连续表面中限定的多个阱的情况。由间隙区域提供的分离可以是部分的或完全的分离。间隙区域可以具有的表面材料不同于限定在表面中的特征的表面材料。例如，阵列的特征可以具有的涂层和引物的量或浓度超过在间隙区域处存在的量或浓度。在一些示例中，涂层和引物可以不存在于间隙区域处。
如本文使用的，“核苷酸”包括含氮杂环碱基、糖以及一个或更多个磷酸酯基团。核苷酸是核酸序列的单体单元。在RNA中，糖是核糖，并且在DNA中，糖是脱氧核糖，即缺少存在于核糖中的2’位处的羟基基团的糖。含氮杂环碱基(即，核碱基)可以是嘌呤碱基或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)及其修饰的衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)及其修饰的衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子键合至嘧啶的N-1或嘌呤的N-9。
术语“流动池基底”或“基底”指的是表面化学物质可以被添加在其上的支撑物。术语“图案化基底”指的是支撑物，凹陷部限定在该支撑物中或该支撑物上。术语“非图案化基底”指的是大体上平面的支撑物。基底可以是晶片、面板、矩形片材、管芯或任何其他合适的配置。基底通常是刚性的，并且不溶于水性液体。基底对用于修饰凹陷部的化学物质可以是惰性的。例如，基底对用于形成聚合物层、用于将引物附接至聚合物层等的化学物质可以是惰性的。合适的基底的示例包括环氧硅氧烷、玻璃和改性的或功能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸类、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(诸如来自Chemours的
Figure BDA0002350231600000121
)、环烯烃类/环烯烃聚合物(COP)(诸如来自Zeon的
Figure BDA0002350231600000122
)、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化硅、熔融二氧化硅或基于二氧化硅的材料、硅酸铝、硅和改性的硅(例如，硼掺杂的p+硅)、氮化硅(Si3N4)、氧化硅(SiO2)、五氧化钽(TaO5)或其他钽氧化物(TaOx)、氧化铪(HaO2)、碳、金属、无机玻璃或类似物。基底还可以是玻璃或硅，在表面处具有钽氧化物或另一种陶瓷氧化物的涂层。
如本文使用的，“等离子体灰化”指的是通过氧等离子体从基底除去有机物质的工艺。由等离子体灰化产生的产物可以用真空泵/真空***除去。等离子体灰化可以通过引入反应性羟基基团使基底活化。
本文提及的“聚合物层”意图意指对液体和气体可渗透的半刚性材料。聚合物层可以是水凝胶，该水凝胶在吸收液体时可以膨胀并且在通过干燥除去液体时可以收缩。在本文公开的示例中，聚合物层可以包括可以与炔烃官能团反应的叠氮化物官能化的分子。在示例中，叠氮化物官能化的分子和聚合物层是聚(N-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。
如本文使用的，“引物”被定义为单链核酸序列(例如，单链DNA或单链RNA)，其用作用于DNA合成或RNA合成的起点。引物的5’末端可以被修饰以允许与叠氮化物官能化的分子的偶联反应。引物长度可以是任何数目的碱基长的并且可以包括多种非天然核苷酸。在示例中，测序引物是在从20个至40个碱基的范围内的短链。
如本文使用的，术语“硅烷”和“硅烷衍生物”指的是包含一个或更多个硅原子的有机化合物或无机化合物。无机硅烷化合物的示例是SiH4或卤化的SiH4，其中氢被一个或更多个卤素原子替换。有机硅烷化合物的示例是X-RB-Si(ORC)3，其中X是不可水解的有机基团，诸如氨基、乙烯基、甲基丙烯酸酯、环氧基
Figure BDA0002350231600000131
硫、烷基、烯基或炔基；RB是间隔基，例如-(CH2)n-，其中n是0至1000；RC选自氢、任选地被取代的烷基、任选地被取代的烯基、任选地被取代的炔基、任选地被取代的碳环基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的5-10元杂芳基以及任选地被取代的5-10元杂环基，如本文所定义的。如本文使用的，术语“硅烷”和“硅烷衍生物”可以包括不同的硅烷和/或硅烷衍生物化合物的混合物。
在一些示例中，硅烷或硅烷衍生物包括能够与叠氮化物官能化的分子的官能团反应的不饱和部分。如本文使用的，术语“不饱和部分”指的是包括至少一个双键或至少一个三键的化学基团，该化学基团包括环烯烃、环炔烃、杂环烯烃、杂环炔烃或其任选地被取代的变体。不饱和部分可以是单价的或二价的。当不饱和部分是单价的时，环烯烃、环炔烃、杂环烯烃和杂环炔烃分别与环烯基、环炔基、杂环烯基和杂环炔基可互换地使用。当不饱和部分是二价的时，环烯烃、环炔烃、杂环烯烃和杂环炔烃分别与亚环烯基(cycloalkenylene)、亚环炔基(cycloalkynylene)、亚杂环烯基(heterocycloalkenylene)和亚杂环炔基(heterocycloalkynylene)可互换地使用。
不饱和部分可以直接共价地附接至硅烷或硅烷衍生物的硅原子，或者经由接头间接地附接。合适的接头的示例包括任选地被取代的亚烷基(即，被认为是通过打开双键衍生自烯烃或通过从不同的碳原子除去两个氢原子衍生自烷烃的二价饱和脂肪族自由基(诸如亚乙基))、被取代的聚乙二醇或类似物。
如本文使用的“间隔层”指的是将两种组分结合在一起的材料。在一些示例中，间隔层可以是有助于结合的辐射吸收材料，或者可以与有助于结合的辐射吸收材料接触。
如本文使用的术语“表面化学物质”指的是被并入到流动池的室中的化学活性组分和/或生物活性组分。本文公开的表面化学物质的示例包括引物，该引物可以是催化活性物质的一部分，并且可以附接至叠氮化物官能化的分子。因此，表面化学物质的一个示例是官能化的层。
方法100的示例在图1中描绘。方法100包括使硫化亚铜(I)矿物与炔烃官能化的分子反应，以形成催化活性物质(如参考数字102处所示)；以及使催化活性物质与叠氮化物官能化的分子反应，以将催化活性物质与叠氮化物官能化的分子偶联(如参考数字104处所示)。
如先前提及的，硫化亚铜(I)矿物可以是任何硫化亚铜(I)矿物，诸如辉铜矿(Cu2S)或久辉铜矿(Cu31S16)或蓝辉铜矿(Cu9S5)。矿物形式是硫化亚铜(I)矿物的天然存在形式。因此，硫化亚铜(I)矿物未被表面聚合物或其他稳定化合物稳定化，未暴露于表面处理等。硫化亚铜(I)矿物可以具有任何合适的粒度。在示例中，硫化亚铜(I)矿物具有小于或等于45μm的平均粒度。在另一个示例中，硫化亚铜(I)矿物具有在从约500nm至约45μm的范围内的平均粒度。在还另一个示例中，硫化亚铜(I)矿物具有在从约1μm至约40μm的范围内的平均粒度。虽然已经提供了若干个示例，但硫化亚铜(I)矿物的平均粒度可以是更高或更低的。
任何炔烃官能化的分子可以用于本文公开的示例。在示例中，炔烃官能化的分子是引物，诸如包含炔烃官能团的测序引物。引物可以是包含炔烃官能团的任何正向扩增引物或反向扩增引物。合适的引物的具体示例包括P5引物和/或P7引物，它们在由IlluminaInc.出售的商业流动池的表面上使用，以用于在HISEQTM、HISEQXTM、MISEQTM、MISEQXTM、NEXTSEQTM、NOVASEQTM、GENOME ANALYZERTM和其他仪器平台上测序。
为了形成催化活性物质，硫化亚铜(I)矿物和炔烃官能化的分子被组合在一起，并且孵育持续一段时间，允许组分反应。组分可以在炔烃官能化的分子是可溶性的任何溶剂中组合。在一些示例中，选择可以溶解叠氮化物官能化的分子的溶剂也可以是合意的，因为催化活性物质与叠氮化物官能化的分子的反应也可以在该溶剂中发生。在示例中，溶剂是极性溶剂。合适的极性溶剂的示例选自由以下组成的组：水、碳酸钠(NaHCO3)缓冲液、磷酸钾(KH2PO4)缓冲液、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、乙腈、丁醇、丙醇、乙醇、甲醇及其混合物。据信可以使用其他溶剂，并且在一些情况下，催化活性物质可以不溶于或可以部分地溶于这些其他溶剂中。
使硫化亚铜(I)矿物与炔烃官能化的分子反应的示例包括形成硫化亚铜(I)矿物、炔烃官能化的分子和炔烃官能化的分子的溶剂的混合物(即，第一示例的接枝混合物)，以及将第一示例的接枝混合物保持在高于溶剂的凝固点且低于溶剂的沸点的温度持续多达约50天的时间。虽然反应可以在硫化亚铜(I)矿物和炔烃官能化的分子组合时立即开始，但孵育时期可以延长，以便确保反应完成。
第一示例的接枝混合物的pH可以在从约4至约12的范围内，部分地取决于所使用的溶剂以及溶剂是否将存在于催化活性物质与叠氮化物官能化的分子的后续反应期间。对于水性溶剂，合适的缓冲液或强酸可以用于调节pH。
在形成第一示例的接枝混合物的一个示例中，可以将炔烃官能化的分子添加至溶剂以形成溶液，并且然后可以将硫化亚铜(I)矿物添加至溶液。在形成第一示例的接枝混合物的另一个示例中，可以将炔烃官能化的分子和硫化亚铜(I)矿物添加至溶剂。在形成第一示例的接枝混合物的还另一个示例中，可以将溶液添加至硫化亚铜(I)矿物。例如，可以将硫化亚铜(I)矿物填充在柱中，并且可以使炔烃官能化的分子在溶剂中的溶液流过柱以产生催化活性物质。在这些示例中的任何示例中，可以添加化学计量过量的硫化亚铜(I)矿物(相对于溶液中炔烃官能化的分子的浓度)。所使用的硫化亚铜(I)矿物的量也可以部分地取决于硫化亚铜(I)矿物的平均粒度。较小的硫化亚铜(I)矿物颗粒具有比较大的硫化亚铜(I)矿物颗粒更高的表面积与体积的比率，并且因此与可以使用的较大的硫化亚铜(I)矿物颗粒的量相比，可以使用较少量的较小的硫化亚铜(I)矿物颗粒。
第一示例的接枝混合物可以包含从约1μM至约100μM的炔烃官能化的分子和从约0.1M至约3M的硫化亚铜(I)矿物颗粒。可以使用任何浓度的炔烃官能化的分子，尽管上限取决于炔烃官能化的分子在所使用的溶剂中的溶解度。如先前描述的，可以使用任何浓度的硫化亚铜(I)矿物，只要该浓度在炔烃官能化的分子的浓度的化学计量过量中。
作为第一示例的接枝混合物的具体示例，P5引物和P7引物(具有与其附接的炔烃官能团)以及化学计量过量的Cu2S颗粒被混合至处于约10的pH的0.5M或1M碳酸钠缓冲液中。作为第一示例的接枝混合物的另一个具体示例，P5引物和P7引物(具有与其附接的炔烃官能团)和化学计量过量的Cu2S颗粒被混合至去离子水或二甲基亚砜中。作为第一示例的接枝混合物的还另一个具体示例，P5引物和P7引物(具有与其附接的炔烃官能团)和化学计量过量的Cu2S颗粒被混合至处于约8的pH的50mM磷酸钾缓冲液中。
因此，第一示例的接枝混合物的一些示例包含含有炔烃官能团的引物、引物的溶剂和硫化亚铜(I)矿物。在一些示例中，第一示例的接枝混合物包含相对于引物化学计量过量的硫化亚铜(I)矿物。在一个示例中，第一示例的接枝混合物包含从约1μM至约20μM的引物和从约0.1M至约3M的硫化亚铜(I)矿物。由于炔烃官能团和硫化亚铜(I)矿物之间的反应可以大体上瞬时地发生，所以第一示例的接枝混合物除了任何未反应的引物(或其他炔烃官能化的分子)、任何未反应的硫化亚铜(I)矿物和溶剂之外可以包含催化活性物质。
在混合物(第一示例的接枝混合物)被制备后，将第一示例的接枝混合物保持在高于溶剂的凝固点且低于溶剂的沸点的温度持续多达约50天的孵育时期。因此，混合物被保持的温度部分地取决于用于反应的溶剂。已经发现，作为反应结果形成的催化活性物质在孵育持续多达约50天时仍然是稳定的且是催化活性的。然而，应理解，如果在孵育时期结束时，催化活性物质保持稳定和催化活性，则该时期可以更长。在一些示例中，保持第一示例的接枝混合物包括允许混合物静置持续所述孵育时期，而不进行任何另外的加热。在其他示例中，保持第一示例的接枝混合物包括将混合物加热至期望的温度。例如，保持第一示例的接枝混合物可以包括将第一示例的接枝混合物加热至在从约30℃至约60℃的范围内的温度，持续在从约30分钟至约90分钟的范围内的时间。
形成催化活性物质的反应不由光驱动，并且因此可以在黑暗的容器或烘箱中进行，或者可以在环境光中发生。没有另外的光被用于驱动反应。
所述方法可以包括在反应期间将硫化亚铜(I)矿物和炔烃官能化的分子混合。例如，第一示例的接枝混合物可以在孵育的同时偶发地或连续地搅拌。如本文提及的，所述方法还可以包括使炔烃官能化的分子的溶液流过硫化亚铜(I)矿物的柱。
在第一示例的接枝混合物中，并且在孵育时期期间，硫化亚铜(I)与炔烃官能化的分子的炔烃官能团反应以形成催化活性物质。更特别地，炔烃官能化的分子的炔烃可以在硫化亚铜(I)的表面上经历非均相反应。因此，炔烃可以在界面处例如在固体硫化亚铜(I)催化剂的表面上经历化学变化。因此，炔烃官能化的分子直接结合至固体硫化亚铜(I)矿物颗粒的表面。得到的物质可以呈簇的形式，簇可以溶于反应中所使用的溶剂中。在这些簇中，炔烃官能化的分子可以与固体硫化亚铜(I)的表面上的Cu+配位。单个簇包括单个硫化亚铜(I)颗粒，单个硫化亚铜(I)颗粒具有与其配位的一个或更多个炔烃官能化的分子。单个硫化亚铜(I)颗粒具有许多潜在的炔烃结合位点，其数目取决于颗粒的尺寸。被形成的簇的尺寸由硫化亚铜(I)颗粒的尺寸(其可以例如通过动态光散射(DLS)来确定)和使用的炔烃官能化的分子的尺寸来限定。在一些示例中，簇是具有在从约1nm至小于1000nm的范围内的尺寸的纳米簇。在其他示例中，簇具有约2μm或更小的尺寸，并且因此可以是微簇(microcluster)或纳米簇。
当物质形成时，第一示例的接枝混合物是液体混合物，该液体混合物可以包含溶剂、催化活性物质(其可以溶解在溶剂中)和任何未反应的硫化亚铜(I)矿物颗粒。然后，第一示例的接枝混合物可以被储存(例如，如果孵育时期较短，则多达约50天)，在与叠氮化物官能化的聚合物的反应中按原样使用，或者在用于与叠氮化物官能化的聚合物的反应之前经受除去未反应的硫化亚铜(I)矿物颗粒的工艺。因此，虽然图1中未示出，但方法100的一个示例可以包括在使催化活性物质与含叠氮化物的分子反应之前，从第一示例的接枝混合物中的催化活性物质中过滤未反应的硫化亚铜(I)矿物。
为了除去未反应的硫化亚铜(I)矿物颗粒，可以过滤或沉降第一示例的接枝混合物。过滤可以使用将任何未反应的硫化亚铜(I)矿物颗粒从第一示例的接枝混合物中除去的任何合适的过滤器来完成。在示例中，使用了0.2μm过滤器。过滤器尺寸可以取决于工艺中使用的硫化亚铜(I)矿物的平均粒度。沉降可以使用离心并且然后从沉降的颗粒中除去液体来完成。在过滤、或沉降、或从第一示例的接枝混合物的剩余部分中分离未反应的硫化亚铜(I)矿物的一些其他工艺之后，第一示例的接枝混合物是液体混合物，该液体混合物可以包含溶剂和溶解或分散在溶剂中的催化活性物质。当未反应的硫化亚铜(I)矿物颗粒被过滤时，第一示例的接枝混合物可以从黑色转变为大体上无色，或者具有略微透明的蓝色。
然后，储存或未储存的和过滤或未过滤的第一示例的接枝混合物可以与叠氮化物官能化的分子组合，以使催化活性物质与叠氮化物官能化的分子反应，以将催化活性物质与叠氮化物官能化的分子偶联。
叠氮化物官能化的分子可以是包含叠氮化物官能团以与催化活性物质的炔烃反应的任何分子(例如，单体、聚合物等)。叠氮化物官能化的分子的示例包括丙烯酰胺聚合物，诸如聚(N-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺，PAZAM。PAZAM和其他形式的丙烯酰胺共聚物通常由式(I)的重复单元表示：
Figure BDA0002350231600000181
其中：
RA选自由以下组成的组：叠氮基、任选地被取代的氨基、任选地被取代的烯基、任选地被取代的腙、任选地被取代的肼、羧基、羟基、任选地被取代的四唑、任选地被取代的四嗪、腈氧化物、硝酮和硫醇；
RB是H或任选地被取代的烷基；
RC、RD和RE独立地选自由H和任选地被取代的烷基组成的组；
-(CH2)p-中的每个可以是任选地被取代的；
p是在1至50的范围内的整数；
n是在1至50,000的范围内的整数；以及
m是在1至100,000的范围内的整数。
本领域普通技术人员将认识到，式(I)中重复的“n”和“m”特征的布置是代表性的，并且单体亚基(monomeric subunit)可以以任何顺序存在于聚合物结构中(例如，随机的、嵌段的、图案化的或其组合)。
PAZAM的具体示例由以下表示：
Figure BDA0002350231600000191
其中n是在1-20,000的范围内的整数，并且m是在1-100,000的范围内的整数。如同式(I)一样，本领域普通技术人员将认识到，“n”和“m”亚基是以随机顺序存在于整个聚合物结构中的重复单元。
式(I)或PAZAM聚合物的分子量可以在从约10kDa至约1500kDa的范围内，或者在特定示例中可以是约312kDa。
在一些示例中，式(I)或PAZAM聚合物是线性聚合物。在一些其他示例中，式(I)或PAZAM聚合物是轻度交联的聚合物。
在其他示例中，叠氮化物官能化的分子可以是式(I)的变型。在一个示例中，丙烯酰胺单元可以用N,N-二甲基丙烯酰胺
Figure BDA0002350231600000201
替换。在该示例中，式(I)中的丙烯酰胺单元可以用
Figure BDA0002350231600000202
替换，其中RD、RE和RF各自是H，并且RG和RH各自是甲基基团(而不是如丙烯酰胺的情况中的H)。在该示例中，q可以是在1至100,000的范围内的整数。在另一个示例中，除了丙烯酰胺单元之外，可以使用N,N-二甲基丙烯酰胺。在该示例中，除了重复的“n”和“m”特征之外，式(I)可以包括
Figure BDA0002350231600000203
其中RD、RE和RF各自是H，并且RG和RH各自是甲基基团。在该示例中，q可以是在1至100,000的范围内的整数。
应理解，可以使用其他叠氮化物官能化的分子，只要它们包含例如通过与催化活性物质相互作用与炔烃官能化的分子反应的叠氮化物官能团。合适的叠氮化物官能化的分子的其他示例包括其他叠氮化的聚丙烯酰胺聚合物或叠氮化形式的无硅烷的丙烯酰胺(SFA)。
催化活性物质(来自第一示例的接枝混合物)和叠氮化物官能化的分子可以混合在一起，并且该物质的硫化亚铜(I)纳米簇充当用于催化活性物质和叠氮化物官能化的分子之间的叠氮化物-炔烃环加成反应的Cu+的来源。环加成形成唑类，以将叠氮化物官能化的分子连接至催化活性物质。在更具体的示例中，环加成形成唑类，以将引物的炔烃基团连接至聚合物的叠氮化物基团。在炔烃结合至硫化亚铜(I)颗粒上的可用表面位点后，然后叠氮化物也结合至该表面位点(经由与Cu+的配位)，这形成了用于C-N键形成步骤的过渡状态。形成的任何1,2,3-***产物与硫化亚铜(I)颗粒解离。
来自第一示例的接枝混合物的液体可以在叠氮化物-炔烃环加成反应期间存在。
在本文公开的方法100的一些示例中，叠氮化物-炔烃环加成反应可以在流动池的表面上发生。在这些示例中，叠氮化物官能化的分子可以是流动池基底上的聚合物层，并且第一示例的接枝混合物可以暴露于该聚合物层。在一些示例中，在使催化活性物质与叠氮化物官能化的分子反应之前，方法100还包括在流动池的表面(例如，流动池基底)上形成叠氮化物官能化的分子的层，并且使催化活性物质与流动池的表面上的叠氮化物官能化的分子的层反应以形成官能化的层。这些方法的示例将参考图2A-图2E和图3A-图3D进一步描述。
在方法100的另一个示例中，利用了第二示例的接枝混合物。在该示例中，可以将炔烃官能化的分子添加至溶剂以形成溶液，并且该溶液可以与叠氮化物官能化的分子组合。然后可以将硫化亚铜(I)矿物添加至包含炔烃官能化的分子和叠氮化物官能化的分子两者的溶液。起初，第二示例的接枝混合物包含溶剂、炔烃官能化的分子、叠氮化物官能化的分子和硫化亚铜(I)矿物。随着反应发生，第二示例的接枝混合物可以包含催化活性物质、叠氮化物官能化的分子以及任何未反应的炔烃官能化的分子和任何未反应的硫化亚铜(I)矿物，或者叠氮化物-炔烃反应产物(即，催化活性物质和叠氮化物官能化的分子的反应产物)；以及任何其他尚未反应的组分。
针对第一示例的接枝混合物阐述的任何材料和/或量/浓度可以用于形成第二示例的接枝混合物。
在第二示例的接枝混合物被制备后，将第二示例的接枝混合物保持在高于溶剂的凝固点且低于溶剂的沸点的温度持续多达约50天的孵育时期。因此，混合物被保持的温度部分地取决于用于反应的溶剂。已经发现，作为反应结果形成的叠氮化物-炔烃反应产物在孵育持续多达约50天时是稳定的且活性的。然而，应理解，如果在孵育时期结束时，叠氮化物-炔烃反应产物保持稳定且活性，则该时期可以更长。在一些示例中，保持第二示例的接枝混合物包括允许混合物静置持续孵育时期，而不进行任何另外的加热。在其他示例中，保持第二示例的接枝混合物包括将混合物加热至期望的温度。例如，保持第二示例的接枝混合物可以包括将第二示例的接枝混合物加热至在从约30℃至约60℃的范围内的温度，持续在从约30分钟至约90分钟的范围内的时间。
为了除去未反应的硫化亚铜(I)矿物颗粒，可以过滤或沉降第二示例的接枝混合物。过滤可以使用将从第二示例的接枝混合物中除去任何未反应的硫化亚铜(I)矿物颗粒的任何合适的过滤器来完成。在示例中，使用0.2μm过滤器。过滤器尺寸可以取决于工艺中使用的硫化亚铜(I)矿物的平均粒度。沉降可以使用离心并且然后从沉降的颗粒中除去液体来完成。在过滤、或沉降、或从第二示例的接枝混合物的剩余部分中分离未反应的硫化亚铜(I)矿物的一些其他工艺之后，第二示例的接枝混合物是液体混合物，该液体混合物可以包含溶剂和溶解或分散在溶剂中的叠氮化物-炔烃反应产物。
在本文公开的方法100的一些其他示例中，第二示例的接枝混合物可以用于在流动池基底或支撑物表面上形成官能化的层。在这些示例中，第二示例的接枝混合物可以施加至流动池基底/支撑物表面，并且叠氮化物-炔烃反应产物的官能团可以与流动池的表面上的官能团反应，以将叠氮化物-炔烃反应产物附接至表面并且形成官能化的层。这些方法的示例将参考图2A、图2B和图2E以及图3A、图3B和图3D进一步描述。
应理解，表面化学物质(例如，官能化的层)可以添加至图案化基底或非图案化基底的表面。向图案化基底添加表面化学物质将参考图2A至图2E描述，并且向非图案化基底添加表面化学物质将参考图3A至图3D描述。
图2A是图案化基底12的横截面视图。图案化基底12可以是图案化晶片或图案化管芯或任何其他图案化基底(例如，面板、矩形片材等)。可以使用本文描述的基底12的任何示例。图案化晶片可以用于形成若干个流动池，并且图案化管芯可以用于形成单个流动池。在示例中，基底可以具有在从约2mm至约300mm的范围内的直径，或者具有其最大尺寸多达10英尺(～3米)的矩形片材或面板。在示例中，基底晶片具有在从约200mm至约300mm的范围内的直径。在另一个示例中，基底管芯具有在从约0.1mm至约10mm的范围内的宽度。虽然已经提供了示例性的尺寸，但应理解，可以使用具有任何合适的尺寸的基底。
图案化基底12包括限定在基底12的暴露的层或表面上或者限定在基底12的暴露的层或表面中的凹陷部14，以及将相邻凹陷部14分离的间隙区域16。在本文公开的示例中，凹陷部14变成被表面化学物质(例如，20、22)官能化，而间隙区域16可以用于结合，但将不具有存在于其上的引物22(在图2E中示出)。
凹陷部14可以使用多种技术制造在基底12中或基底12上，所述技术包括例如光刻术、纳米压印光刻术、冲压技术、压花技术、模制技术、微蚀刻技术、印刷技术等。如本领域技术人员将理解的，所使用的技术将取决于基底12的组成和形状。
可以设想凹陷部14的许多不同的布局，包括规则的、重复的和非规则的图案。在示例中，凹陷部14被设置成六边形网格用于紧密充填和改进的密度。其他布局可以包括例如直线(即，矩形)布局、三角形布局以及诸如此类。在一些示例中，布局或图案可以是以行和列的x-y格式的凹陷部14。在一些其他示例中，布局或图案可以是凹陷部14和/或间隙区域16的重复布置。在还其他示例中，布局或图案可以是凹陷部14和/或间隙区域16的随机布置。图案可以包括斑点、垫、阱、柱、条带、漩涡、线、三角形、矩形、圆形、弧形、棋盘格、方格、对角线、箭头、正方形和/或交叉影线。
布局或图案可以相对于所限定的区域中的凹陷部14的密度(即，凹陷部14的数目)来表征。例如，凹陷部14可以以约200万每mm2的密度存在。密度可以被调节为不同的密度，包括例如至少约100每mm2、约1,000每mm2、约10万每mm2、约100万每mm2、约200万每mm2、约500万每mm2、约1000万每mm2、约5000万每mm2或更大的密度。可选择地或另外地，密度可以被调节为不大于约5000万每mm2、约1000万每mm2、约500万每mm2、约200万每mm2、约100万每mm2、约10万每mm2、约1,000每mm2、约100每mm2或更小。还应理解，基底12上的凹陷部14的密度可以在选自以上范围的下限值中的一个和上限值中的一个之间。作为示例，高密度阵列可以被表征为具有被分隔小于约100nm的凹陷部14，中等密度阵列可以被表征为具有被分隔约400nm至约1μm的凹陷部14，并且低密度阵列可以被表征为具有被分隔大于约1μm的凹陷部14。虽然已经提供了示例性密度，但应理解，可以使用具有任何合适的密度的基底。
布局或图案可以也或可选择地以平均间距来表征，平均间距即从凹陷部14的中心到相邻间隙区域16的中心的间距(中心到中心的间距)。图案可以是规则的，使得围绕平均间距的变化的系数是小的，或者图案可以是非规则的，在这种情况下，变化的系数可以是相对大的。在任一情况下，平均间距可以是例如至少约10nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约100μm或更大。可选择地或另外地，平均间距可以是例如至多约100μm、约10μm、约5μm、约1μm、约0.5μm、约0.1μm或更小。位点的特定图案的平均间距可以在选自以上范围的下限值中的一个和上限值中的一个之间。在示例中，凹陷部14具有约1.5μm的间距(中心到中心的间距)。虽然已经提供了示例性的平均间距值，但应理解，可以使用其他平均间距值。
在图2A至图2E中示出的示例中，凹陷部14是阱14’，并且因此图案化基底12在其表面包括阱14’的阵列。阱14’可以是微阱或纳米阱。每个阱14’的尺寸可以通过其体积、阱开口面积、深度和/或直径来表征。
每个阱14’可以具有能够限制液体的任何体积。最小体积或最大体积可以被选择，例如以适应对流动池的下游使用所预期的吞吐量(例如，多重性)、分辨率、分析物组成或分析物反应性。例如，体积可以是至少约1×10-3μm3、约1×10-2μm3、约0.1μm3、约1μm3、约10μm3、约100μm3或更大。可选择地或另外地，体积可以是至多约1×104μm3、约1×103μm3、约100μm3、约10μm3、约1μm3、约0.1μm3或更小。应理解，官能化的涂层可以填充阱14’的体积的全部或部分。在单独的阱14’中的涂层的体积可以大于上文指定的值、小于上文指定的值或在上文指定的值之间。
可以基于与上文针对阱体积所阐述的标准类似的标准来选择由表面上的每个阱开口占据的面积。例如，表面上的每个阱开口的面积可以是至少约1×10-3μm2、约1×10-2μm2、约0.1μm2、约1μm2、约10μm2、约100μm2或更大。可选择地或另外地，面积可以是至多约1×103μm2、约100μm3、约10μm2、约1μm2、约0.1μm2、约1×10-2μm2或更小。由每个阱开口占据的面积可以大于上文指定的值、小于上文指定的值或在上文指定的值之间。
每个阱14’的深度可以是至少约0.1μm、约1μm、约10μm、约100μm或更大。可选择地或另外地，深度可以是至多约1×103μm、约100μm、约10μm、约1μm、约0.1μm或更小。每个阱14’的深度可以大于上文指定的值、小于上文指定的值或在上文指定的值之间。
在一些情况下，每个阱14’的直径可以是至少约50nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约10μm、约100μm或更大。可选择地或另外地，直径可以是至多约1×103μm、约100μm、约10μm、约1μm、约0.5μm、约0.1μm或更小(例如，约50nm)。每个阱14’的直径可以大于上文指定的值、小于上文指定的值或在上文指定的值之间。
图案化基底12可以暴露于一系列工艺，以便在凹陷部14中添加表面化学物质20、22。
虽然未示出，但应理解，图案化基底12可以暴露于等离子体灰化，以便清洁和活化表面。例如，等离子体灰化工艺可以除去有机材料并且引入表面羟基或羧基基团。其他合适的清洁工艺可以用于部分地取决于基底12的类型来清洁基底12。例如，可以用氧化剂或苛性溶液(caustic solution)进行化学清洁。应理解，如果叠氮化物官能分子可以附接至表面上的–OH官能团，则可以不使用另外的基底表面制备。
图案化基底12(在图2A中示出)然后可以暴露于这样的工艺，该工艺将制备表面12以用于沉积叠氮化物官能分子以形成聚合物层20(图2C)，或者以用于沉积第二示例的接枝混合物以形成官能化的层24(图2E)。在示例中，图案化基底12可以暴露于硅烷化，该硅烷化将硅烷或硅烷衍生物18(图2B)附接至图案化基底12表面。硅烷化跨过表面，包括在凹陷部14、14’中(例如，在底表面上和沿着侧壁)和在间隙区域16上，引入硅烷或硅烷衍生物18。
硅烷化可以使用任何硅烷或硅烷衍生物18来完成。硅烷或硅烷衍生物18的选择可以部分地取决于待用于形成聚合物层20(在图2C中示出)或在第二接枝混合物中使用的叠氮化物官能化的分子，因为可以合意的是在硅烷或硅烷衍生物18和聚合物层20或第二接枝混合物中的叠氮化物官能化的分子之间形成共价键。用于将硅烷或硅烷衍生物18附接至基底12的方法可以取决于被使用的硅烷或硅烷衍生物18而变化。在本文中阐述了若干个示例。
在示例中，硅烷或硅烷衍生物18是(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)或(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)(即，X-RB-Si(ORC)3，其中X是氨基，RB是-(CH2)3-，并且RC是乙基或甲基)。在该示例中，基底12的表面可以用(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)或(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)预处理，以将硅共价地连接至表面上的一个或更多个氧原子(而不意图通过机制来保持，每个硅可以键合至一个、两个或三个氧原子)。该化学地处理的表面被烘烤以形成胺基团单层。然后胺基团与磺基-HSAB反应以形成叠氮基衍生物。在21℃用1J/cm2至30J/cm2的能量的UV活化产生活性氮烯物质，该活性氮烯物质可以容易地经历与PAZAM(例如，叠氮化物官能化的分子)的多种***反应。
也可以使用其他硅烷化方法。合适的硅烷化方法的示例包括气相沉积、YES方法、旋涂或其他沉积方法。本文描述了可以用于使基底12硅烷化的方法和材料的一些示例，尽管应该理解，可以使用其他方法和材料。
在利用YES CVD烘箱的示例中，图案化基底12被放置在CVD烘箱中。室可以被通风，并且然后硅烷化循环开始。在循环期间，硅烷或硅烷衍生物的容器可以被保持在合适的温度(例如，对于降冰片烯硅烷约120℃)，硅烷或硅烷衍生物的蒸气管线被保持在合适的温度(例如，对于降冰片烯硅烷约125℃)，并且真空管线被保持在合适的温度(例如，约145℃)。
在另一个示例中，硅烷或硅烷衍生物18(例如，液体降冰片烯硅烷)可以沉积在玻璃瓶内，并且放置在带有图案化基底12的玻璃真空干燥器内。然后可以将干燥器抽真空至在从约15毫托至约30毫托的范围内的压力，并且放置于在从约60℃至约125℃的范围内的温度的烘箱内。允许硅烷化进行，并且然后将干燥器从烘箱中取出，在空气中冷却并且通风。
气相沉积、YES方法和/或真空干燥器可以与多种硅烷或硅烷衍生物18一起使用，硅烷或硅烷衍生物18诸如包括本文公开的不饱和部分的示例的那些硅烷或硅烷衍生物18。作为示例，当硅烷或硅烷衍生物18包括环烯烃不饱和部分时，可以使用这些方法，所述环烯烃不饱和部分诸如降冰片烯、降冰片烯衍生物(例如，包含代替碳原子中的一个的氧或氮的(杂)降冰片烯)、反式环辛烯、反式环辛烯衍生物、反式环戊烯、反式环庚烯、反式环壬烯、双环[3.3.1]壬-1-烯、双环[4.3.1]癸-1(9)-烯、双环[4.2.1]壬-1(8)-烯以及双环[4.2.1]壬-1-烯。任何的这些环烯烃可以被例如R基团取代，所述R基团诸如氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。降冰片烯衍生物的示例包括[(5-双环[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基硅烷。作为其他示例，当硅烷或硅烷衍生物18包括环炔烃不饱和部分时，可以使用这些方法，所述环炔烃不饱和部分诸如环辛炔、环辛炔衍生物或双环壬炔(例如，双环[6.1.0]壬-4-炔或其衍生物、双环[6.1.0]壬-2-炔或双环[6.1.0]壬-3-炔)。这些环炔烃可以被本文描述的任何R基团取代。
如图2B中所示，硅烷或硅烷衍生物18的附接形成硅烷化的图案化基底，包括硅烷化的凹陷部和硅烷化的间隙区域。
在图2C中示出的示例中，硅烷化的图案化基底然后可以暴露于将在硅烷化的凹陷部和硅烷化的间隙区域上形成聚合物层20的工艺。
如本文描述的，叠氮化物官能化的分子(用于形成聚合物20)的示例包括PAZAM，或被官能化以与图案化晶片12和随后施加的引物22(作为催化活性复合体的一部分)相互作用的任何其他分子。叠氮化物官能化的分子可以存在于溶液中。在示例中，溶液包括在乙醇和水的混合物中的PAZAM。聚合物层20可以使用任何合适的技术形成在硅烷化的图案化晶片的表面上(即，形成到硅烷化的凹陷部和硅烷化的间隙区域上)。使用旋涂或浸渍涂布或浸涂、或叠氮化物官能化的分子在正压或负压下的流动、或其他合适的技术，叠氮化物官能化的分子可以沉积在图案化基底12的表面上。得到的层20在图2C中示出。
将聚合物层20附接到硅烷化的凹陷部和硅烷化的间隙区域(即，18)可以是通过共价键合。聚合物层20与硅烷化的凹陷部的共价连接有助于在多种用途期间在最终形成的流动池的整个寿命中将聚合物层20保持在凹陷部14、14’中。以下是在硅烷或硅烷衍生物18和聚合物层20之间可能发生的反应的一些示例。
当硅烷或硅烷衍生物18包括降冰片烯或降冰片烯衍生物作为不饱和部分时，降冰片烯或降冰片烯衍生物可以经历与PAZAM的叠氮化物/叠氮基基团的1,3-偶极环加成反应。
当硅烷或硅烷衍生物18包括环辛炔或环辛炔衍生物作为不饱和部分时，环辛炔或环辛炔衍生物可以经历与PAZAM的叠氮化物/叠氮基的应变促进的叠氮化物-炔烃1,3-环加成(SPAAC)反应。
当硅烷或硅烷衍生物18包括双环壬炔作为不饱和部分时，由于双环环体系中的应变，双环壬炔可以经历与PAZAM的叠氮化物类似的SPAAC炔烃环加成。
虽然未示出，但应理解，在该方法的一些示例中，图案化基底12可以不暴露于硅烷化。而是，图案化基底12可以暴露于等离子体灰化，并且然后叠氮化物官能化的分子可以直接旋涂(或以其他方式沉积)在等离子体灰化的图案化基底12上以形成聚合物层20。在该示例中，等离子体灰化可以产生表面活化剂(例如，-OH基团)，该表面活化剂可以将聚合物层20粘附至图案化基底12。在这些示例中，选择聚合物层20，使得其与由等离子体灰化产生的表面基团反应。
在涂布之后，叠氮化物官能化的分子还可以暴露于固化工艺，以跨过整个图案化基底(即，在凹陷部和间隙区域上)形成聚合物层20。在示例中，将叠氮化物官能化的分子固化可以在从室温(例如，约25℃)至约60℃的范围内的温度发生，持续在从约5分钟至约2小时的范围内的时间。
硅烷化且涂布的图案化基底(在图2C中示出)可以暴露于清洁工艺。该工艺可以利用水浴和声处理。水浴可以被保持在从约22℃至约45℃的范围内的相对低的温度。在另一个示例中，水浴温度在从约25℃至约30℃的范围内。
然后将硅烷化且涂布的图案化基底暴露于抛光，以从硅烷化的间隙区域中除去聚合物层20的部分。硅烷化、涂布且抛光的图案化基底在图2D中示出。硅烷或硅烷衍生物18的邻近间隙区域16的部分可以作为抛光的结果被除去或者可以不被除去。因此，在图2D和图2E中，硅烷或硅烷衍生物18的邻近间隙区域16的部分以阴影(phantom)示出，因为它们可以在抛光之后至少部分地保留或者它们可以在抛光之后被除去。当这些硅烷化的部分被完全地除去时，应理解，下面的基底12被暴露。
抛光工艺可以用温和的化学浆料(包括，例如，研磨剂、缓冲液、螯合剂、表面活性剂和/或分散剂)来进行，该温和的化学浆料可以从间隙区域16中除去薄聚合物层20，并且在一些情况下除去硅烷或硅烷衍生物18的至少一部分，而不有害地影响在这些区域处的下面的基底12。可选择地，抛光可以用不包含研磨颗粒的溶液来进行。
化学浆料可以用于化学机械抛光***以抛光图2C中示出的硅烷化且涂布的图案化基底的表面。抛光头/抛光垫或其他抛光工具能够从间隙区域16中抛光聚合物层20，同时将聚合物层20留在凹陷部14、14’中，并且使下面的基底12至少大体上完好。作为示例，抛光头可以是Strasbaugh ViPRR II抛光头。
如上文提及的，抛光可以用抛光垫和不含任何研磨剂的溶液来进行。例如，抛光垫可以与不含研磨颗粒的溶液(即，不包括研磨颗粒的溶液)一起使用。
抛光从间隙区域16中除去聚合物层20的部分(并且在一些情况下除去硅烷或硅烷衍生物18的至少一部分)，并且将聚合物层20的部分留在硅烷化的凹陷部中，如图2D中所示。同样如上文提及的，在抛光完成之后，间隙区域16可以保持被硅烷化。换句话说，在抛光之后，硅烷化的间隙区域可以保持完好。可选择地(如由18的阴影部分所指示的)，作为抛光的结果，硅烷或硅烷衍生物18可以从间隙区域16中除去。
虽然未示出，但应理解，硅烷化、涂布且抛光的图案化基底(在图2D中示出)可以暴露于清洁工艺。该工艺可以利用水浴和声处理。水浴可以被保持在从约22℃至约30℃的范围内的相对低的温度。硅烷化、涂布且抛光的图案化基底还可以被旋干，或经由另一种合适的技术来干燥。
然后，可以将图2D中示出的硅烷化、涂布且抛光的图案化基底暴露于接枝工艺，以便将引物22接枝至凹陷部14、14’中的聚合物层20。在该示例中，接枝可以通过浸泡涂布、喷涂、水坑分配或通过将使催化活性物质的引物22附接至凹陷部14、14’中的至少一些中的聚合物层20的另一种合适的方法来完成。这些示例性技术中的每一种利用包含催化活性物质的本文公开的第一示例的接枝混合物。这些物质引入待接枝的引物22和用于叠氮化物-炔烃环加成反应的Cu+催化剂两者。
浸泡涂布可以包括将图案化基底(在其凹陷部14、14’中具有聚合物层20)浸没到一系列温度受控的浴中。浴还可以是流动受控的和/或覆盖有氮气覆盖层(nitrogenblanket)。浴可以包括第一示例的接枝混合物。在整个多种浴中，引物22将附接至在凹陷部中的至少一些中的聚合物层20。在示例中，涂布且抛光的图案化基底将被引入第一浴中，第一浴包括第一示例的接枝混合物，其中叠氮化物-炔烃环加成反应发生以附接引物22；并且然后图案化基底将被移动至另外的浴以用于洗涤。图案化基底可以用机械臂(roboticarm)或手动地从浴到浴移动。干燥***还可以用于浸泡涂布。
喷涂可以通过将第一示例的接枝混合物直接喷涂至涂布且抛光的图案化基底上来完成。喷涂的基底可以在从约0℃至约70℃的范围内的温度孵育持续多达约60分钟。在孵育之后，可以使用例如旋涂机来稀释和除去第一示例的接枝混合物。
水坑分配可以根据汇集旋出法(pool and spin off method)来进行，并且因此可以用旋涂机完成。第一示例的接枝混合物可以(手动地或经由自动化工艺)施加至涂布且抛光的图案化基底。所施加的第一示例的接枝混合物可以被施加至涂布且抛光的图案化基底的整个表面或跨过该整个表面展开。第一示例的接枝混合物涂布的图案化基底可以在从约0℃至约90℃的范围内的温度孵育持续多达约90分钟的时间。在孵育之后，可以使用例如旋涂机来稀释和除去第一示例的接枝混合物。
引物22从催化活性物质接枝至聚合物层20上形成官能化的层24，如图2E中所示。
在所述方法的另一个示例中，聚合物20与引物22不分开地施加。而是，包含叠氮化物-炔烃反应产物的第二示例的接枝混合物可以用于以单一工艺形成官能化的层24。
参考回到图2B，硅烷化的图案化基底可以暴露于抛光，以从硅烷化的间隙区域中除去硅烷或硅烷衍生物18的部分。该工艺留下硅烷化的凹陷部14、14’。
然后，第二示例的接枝混合物可以施加至硅烷化且抛光的图案化基底。第二示例的接枝混合物的施加可以通过浸泡涂布、喷涂、水坑分配或通过另一种合适的方法来完成。叠氮化物-炔烃反应产物的任何未反应的叠氮化物官能团与凹陷部14、14’中的至少一些中的硅烷或硅烷衍生物18反应，如先前参考图2C描述的。在示例中，叠氮化物-炔烃反应产物包括附接至引物22的炔烃的PAZAM(例如，聚合物20)，并且PAZAM的任何未反应的叠氮化物能够与硅烷或硅烷衍生物18反应，以便将叠氮化物-炔烃反应产物附接至图案化基底12。不同于包括多个步骤以形成官能化的层24的第一示例的接枝混合物(在图2C-图2E中描述)，使用第二示例的接枝混合物使得能够以单次施加(从图2B到图2E)形成官能化的层24(例如，附接有引物22的层20)。
在涂布之后，叠氮化物-炔烃反应产物还可以暴露于固化工艺，以在凹陷部区域中形成官能化的层24。在示例中，将叠氮化物-炔烃反应产物固化可以在从室温(例如，约25℃)至约60℃的范围内的温度发生，持续在从约5分钟至约2小时的范围内的时间。
可以进行表面化学物质20、22的施加(即，官能化的层24的形成)，使得图案化基底12的结合区域保持暴露。图案化基底12的结合区域通常位于图案化基底12的间隙区域16中的一些上，其中盖将结合至图案化基底12。当图案化基底是晶片时，结合区域可以限定由晶片形成的若干流动池的边界。当图案化基底是管芯时，结合区域可以限定被形成的一个流动池的外部边界。
因此，方法100的一些示例包括将盖结合至图案化基底12的结合区域，以形成与凹陷部14、14’选择性流体连通的流动通道。当图案化基底12是晶片时，盖的不同区域可以至少部分地限定使用晶片形成的相应的流动通道。当图案化基底12是管芯时，盖可以限定被形成的一个或更多个流动通道。
盖可以是对朝向凹陷部14、14’中的表面化学物质20、22的激发光透明的任何材料。作为示例，盖可以是玻璃(例如，硼硅酸盐、熔融二氧化硅等)、塑料或类似物。合适的硼硅酸盐玻璃的可商购的示例是从Schott NorthAmerica,Inc.可获得的D
Figure BDA0002350231600000321
合适的塑料材料即环烯烃聚合物的可商购的示例是从Zeon Chemicals L.P.可获得的
Figure BDA0002350231600000322
产品。
盖可以使用任何合适的技术结合至图案化基底12的结合区域，所述合适的技术诸如激光结合、扩散结合、阳极结合、共晶结合、等离子体活化结合、玻璃熔块结合或本领域已知的其他方法。在示例中，间隔层可以用于将盖结合至图案化基底12的结合区域。间隔层可以是将使图案化基底12的间隙区域16中的至少一些(例如，结合区域)和盖密封在一起的任何材料。
在一个示例中，间隔层可以是辐射吸收材料，辐射吸收材料吸收在由盖和/或图案化基底透射的波长处的辐射。所吸收的能量又在间隔层和盖之间以及在间隔层和图案化基底之间形成结合。这种辐射吸收材料的示例是在约1064nm处吸收的来自DuPont(USA)的黑色
Figure BDA0002350231600000323
(含炭黑的聚酰亚胺)。应理解，聚酰亚胺可以在不添加炭黑的情况下使用，除了波长将必须被改变为被天然聚酰亚胺材料显著吸收的波长(例如，480nm)。作为另一个示例，当用在532nm处的光辐照时，聚酰亚胺CEN JP可以被结合。当间隔层是辐射吸收材料时，间隔层可以被定位在盖和图案化基底之间的界面处，使得间隔层接触期望的结合区域。可以施加压缩(例如，约100PSI的压力)，同时将合适波长处的激光能量施加至界面(即，辐射吸收材料被辐照)。激光能量可以从顶部和从底部两者施加至界面，以便实现合适的结合。
在另一示例中，间隔层可以包括与其接触的辐射吸收材料。辐射吸收材料可以施加在间隔层和盖之间的界面处以及在间隔层和图案化基底之间的界面处。作为示例，间隔层可以是聚酰亚胺，并且单独的辐射吸收材料可以是炭黑。在该示例中，单独的辐射吸收材料吸收激光能量，该激光能量形成间隔层和盖之间以及间隔层和图案化基底之间的结合。在该示例中，可以在相应的界面处施加压缩，同时将合适波长处的激光能量施加至界面(即，辐射吸收材料被辐照)。
当图案化基底12是晶片时，间隔层和侧壁(盖的侧壁或连接至盖的侧壁)可以将一个流动通道与相邻的流动通道物理地分隔，并且可以位于晶片的***处。当图案化基底12是管芯并且被形成的流动池将要包括单个流动通道或泳道(lane)时，间隔层和侧壁(盖的侧壁或连接至盖的侧壁)可以位于管芯的***以限定流动通道并且密封流动池。当图案化基底12是管芯并且形成的流动池将要包括多个隔离的流动通道(例如，八个或四个流动通道)时，间隔层和侧壁(盖的侧壁或连接至盖的侧壁)可以将一个流动通道/泳道与相邻的流动通道/泳道物理地分隔，并且可以位于管芯的***处。然而，应理解，取决于实施方式，间隔层和侧壁可以位于任何期望的区域中。
当图案化基底12是管芯时，盖的结合形成流动池。当图案化基底是晶片时，方法100可以包括另外的加工，诸如在盖被结合之后的切割。在一个示例中，盖可以结合至图案化基底12，并且切割形成单独的流动池。
如上文提及的，表面化学物质20、22(官能化的层24)还可以添加至非图案化基底12’，并且将参考图3A至图3D来描述这些示例。对于非图案化基底12’，连续表面将包括在图2A至图2E的阱14’中发现的相同的表面化学物质20、22。本文公开的任何基底可以用作非图案化基底12’，除了非图案化基底12’不包括凹陷部14或间隙区域16。在该示例性方法中，盖26(在图3B中示出)在开始时结合至非图案化基底12’，以形成流动通道30。盖26可以是本文描述的任何材料并且以本文描述的任何配置。盖26也可以经由本文描述的任何技术结合至非图案化基底12’。
在图3B中示出的示例中，盖26包括与侧壁29一体地形成的顶部部分27。侧壁29通过间隔层28结合至非图案化基底12’的结合区域。结合区域可以在非图案化基底12’的***处或者在其中形成流动通道30的边界是合意的任何区域处。在其他示例中，间隔层28可以形成侧壁，并且可以附接至至少大体上平面的盖26。
盖26(包括侧壁29)和非图案化基底12’一起限定流动通道30。流动通道30可以用于例如选择性地引入流体，以便形成表面化学物质20、22，以及用于选择性地将反应组分或反应物引入表面化学物质20、22，以便在流动通道30内引发指定的反应。
在形成聚合物层20(在图3C中示出)之前，所述方法可以包括将非图案化基底12’(经由流过工艺)暴露于清洁工艺和/或另一工艺(例如，硅烷化)，该清洁工艺和/或另一工艺准备非图案化基底12’的暴露表面，以用于随后叠氮化物官能化的分子的沉积(以形成层20)或第二示例的接枝混合物的沉积(以形成官能化的层24)。
在图3B中示出了非图案化基底12’的硅烷化。在该示例中，硅烷化将硅烷或硅烷衍生物18附接至存在于流动通道30中的非图案化晶片表面12’的暴露部分。
硅烷化可以使用任何硅烷或硅烷衍生物18来完成。硅烷或硅烷衍生物18的选择可以包括官能团，该官能团可以与叠氮化物官能化的分子的叠氮化物形成共价键(用于形成图3C中示出的聚合物层20)，或者与第二示例的接枝混合物中的叠氮化物-炔烃反应产物的叠氮化物形成共价键(用于形成图3D中示出的官能化的层24)。用于将硅烷或硅烷衍生物18附接至基底12’的方法可以是流过工艺。
如图3C中所示，在该示例中，聚合物层20然后形成在硅烷或硅烷衍生物18上，或者形成在已经被沉积以准备流动通道30内的非图案化基底12’的暴露表面的其他化学物质上。
可以使用本文描述的任何叠氮化物官能化的分子。在该示例中，聚合物层形成可以通过流过工艺来完成。在流过工艺中，叠氮化物官能化的分子可以通过相应的输入端口被引入流动通道30中，并且可以被固化。聚合物层20将形成在非图案化基底12’的暴露表面上，并且不发生抛光。
如图3D中所示，使用包含催化活性物质的第一示例的接枝混合物，将引物22接枝至流动通道30中的聚合物层20。在该示例中，接枝可以通过流过工艺来完成。在流过工艺中，本文描述的第一示例的接枝混合物可以通过相应的输入端口引入流动通道30中，可以在流动通道中保持持续足以使铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成反应发生的时间(即，孵育时期)，这将引物22附接至聚合物层20以形成官能化的层24。然后，第一示例的接枝混合物可以从相应的输出端口除去。在引物附接之后，另外的流体可以被引导到流动通道，以洗涤现在官能化的流动通道30。图3D中示出了该示例中的得到的流动池10。
在所述方法的另一个示例中，聚合物20与引物22不分开地施加。而是，包含叠氮化物-炔烃反应产物的第二示例的接枝混合物可以用于以单一工艺形成官能化的层24。
在该示例中，第二示例的接枝混合物然后可以施加至图3B中示出的硅烷化的非图案化基底。第二示例的接枝混合物的施加可以通过流过工艺来完成。叠氮化物-炔烃反应产物的任何未反应的叠氮化物官能团与硅烷或硅烷衍生物18反应，如本文先前描述的。在示例中，叠氮化物-炔烃反应产物包括附接至引物22的炔烃的PAZAM(例如，聚合物20)，并且PAZAM的任何未反应的叠氮化物能够与硅烷或硅烷衍生物18反应，以便将叠氮化物-炔烃反应产物附接至非图案化基底12。不同于包括多个步骤以形成官能化的层24(在图3C-图3D中描述)的第一示例的接枝混合物，使用第二示例的接枝混合物使得能够以单次施加(从图3B到图3D)形成官能化的层24(例如，附接有引物22的层20)。还可以进行官能化的层24的固化。
虽然未示出，但应理解，图案化基底12或非图案化基底12’可以包括入口端口和出口端口，它们将流体地接合其他端口(未示出)，用于将流体引导到相应的流动通道中(例如，从试剂匣(reagent cartridge)或其他流体储存***)和引导出流动通道(例如，引导至废物除去***)。
也虽然未示出，但应理解，一些示例的流动池可以通过一种或更多种固定机制(例如，粘合剂、结合剂(bond)、紧固件以及类似物)直接附着至检测装置(未示出)并且因此与检测装置物理接触。检测装置可以包括CMOS装置(其包括多个堆叠层，包括例如硅层、介电层、金属-介电层、金属层等)和光学部件。光学部件可以被布置成使得检测装置的光学传感器至少大体上与检测装置的单个光学波导和流动池的单个凹陷部14、14’内或流动通道30内的表面化学物质20、22对齐，并且因此与它们可操作地相关联。
也虽然未示出，但应理解，代替被结合至盖26，官能化的基底(在其上或在其凹陷部14中具有表面化学物质20、22)可以结合至另一官能化的基底，该另一官能化的基底在其上或在其凹陷部中具有表面化学物质20、22。两个官能化的表面可以面向彼此，并且可以具有限定在其间的流动通道。间隔层和合适的结合方法可以用于将官能化的基底中的两个结合在一起。
本文公开的流动池可以用于多种测序方法或测序技术，包括通常被称为合成测序(SBS)、循环阵列测序、连接法测序、焦磷酸测序诸如此类的技术。利用任何这些技术，并且在使用图案化基底的示例中，由于官能聚合物层20和附接的测序引物22存在于官能化的凹陷部(即，在其上具有表面化学物质20、22的14、14’)中，而不是存在于间隙区域16上，所以扩增将被限于官能化的凹陷部。在其他示例中，扩增可以跨过整个流通池通道(例如，通道30)发生。
作为一个示例，合成测序(SBS)反应可以在***上运行，该***诸如来自Illumina(San Diego,CA)的HISEQTM、HISEQXTM、MISEQTM、NOVASEQTM或NEXTSEQTM测序***。在SBS中，监测核酸引物沿核酸模板的延伸，以确定模板中的核苷酸的序列。潜在的化学过程可以是聚合(例如，通过聚合酶催化)或连接反应(例如，通过连接酶催化)。在特定的基于聚合酶的SBS工艺中，荧光标记的核苷酸以模板依赖方式添加至引物22(从而使引物22延伸)，使得添加至引物22的核苷酸的顺序和类型的检测可以用于确定模板的序列。例如，为了引发第一SBS循环，一个或更多个标记的核苷酸、DNA聚合酶等可以被递送到流动通道30中/通过流动通道30递送等等，流动通道30容纳引物22的阵列。可以通过成像事件来检测官能化的凹陷部(即，在其上具有表面化学物质20、22的14、14’)，其中引物延伸引起标记的核苷酸被并入。在成像事件期间，照明***(未示出)可以向官能化的凹陷部(即，在其上具有表面化学物质20、22的14、14’)提供激发光。
在一些示例中，核苷酸还可以包括可逆终止性质，在核苷酸已经被添加至引物22后，该可逆终止性质终止进一步的引物延伸。例如，具有可逆终止子部分的核苷酸类似物可以被添加至引物22，使得随后的延伸不能发生，直到去封闭剂(deblocking agent)被递送以除去该部分。因此，对于使用可逆终止的示例，去封闭试剂可以被递送至流动通道30等(在检测发生之前或之后)。
洗涤可以在多种流体递送步骤之间发生。SBS循环然后可以重复n次以将引物22延伸n个核苷酸，从而检测长度n的序列。
虽然已经详细描述了SBS，但应理解，本文描述的流动池可以与其他测序方案一起使用以用于基因分型，或者可以用于其他化学应用和/或生物应用。
为了进一步说明本公开内容，本文给出了实施例。应理解，这些实施例出于说明性目的被提供并且不应被解释为限制本公开内容的范围。
非限制性工作实施例
实施例1
在pH 10的0.5M碳酸钠缓冲液中制备0.25M Cu2S颗粒和10μM炔烃-P5引物和炔烃-P7引物的混合物。该混合物被允许在60℃的温度孵育持续约1小时的时间。在不过滤的情况下，将10μM的接枝混合物(被称为E1，以及本文公开的第一示例的接枝混合物的示例)暴露于在图案化基底的阱中包含PAZAM的图案化基底泳道/通道。
制备三种比较性接枝混合物。作为两个比较性示例，制备具有抗坏血酸盐(CE1)或不具有抗坏血酸盐(CE2)的炔烃-P5引物和炔烃-P7引物、CuSO4(作为催化剂)和N,N,N′,N″,N″-五甲基二亚乙基三胺的接枝混合物。作为第三个比较性示例(CE3)，制备炔烃-P5引物和炔烃-P7引物的接枝混合物。在这些比较性接枝混合物中的每一种中，溶剂是0.5M碳酸钠缓冲液。将10μM的每种比较性接枝混合物暴露于在图案化基底的阱中包含PAZAM的相应的图案化基底泳道/通道。
进行CFR测定，以比较使用具有本文公开的催化活性物质的接枝混合物(E1)和比较性接枝混合物(CE1、CE2、CE3)的引物的接枝。在CFR测定期间，引物接枝的表面在缓冲溶液中暴露于荧光标记(Cal Fluor Red)的互补寡核苷酸。这些寡核苷酸结合至表面结合的引物，并且多余的CFR被洗掉。然后在荧光检测器中扫描表面以测量表面上的CFR强度，以提供表面上的引物的浓度和健康状况的定量测量。在测量之后，用温和的碱溶液除去寡核苷酸，并且重新扫描表面以确证所有CFR被除去。
图4中示出了示例性流动池和比较性流动池的在相对强度单位方面的强度结果。CE1的相对强度在从约0.182至0.209的范围内，并且示例性Cu2S接枝混合物(E1)的相对强度在从约0.175至0.205的范围内。如所描绘的，包含催化活性物质的示例性接枝混合物E1在引物接枝方面与包含铜催化剂、稳定配体和抗坏血酸盐的比较性接枝混合物CE1一样有效。示例性接枝混合物E1在接枝引物方面相比于比较性示例CE2和CE3还有效得多。
示例性流动池E1和比较性示例流动池CE1被用于将PhiX基因组测序，并且被测试通过过滤器的簇的百分比(％)、品质得分(Q30)、一个测序循环之后的强度、对齐的百分比和错误率(％)。％通过过滤器(PF)是用于描述簇的度量，该簇通过纯洁阈值(chastitythreshold)并且用于进一步加工和测序数据的分析。较高的％通过过滤器导致测序数据的合适品质的非空阱的收率提高。Q30、对齐的百分比和错误率是品质度量。更特别地，Q30相当于在1000次中1次不正确碱基调用的概率。这意味着碱基调用准确度(即，正确碱基调用的概率)是99.9％。99％的较低的碱基调用准确度(Q20)将具有1/100的不正确碱基调用概率，这意味着每100个碱基对测序读取将可能包含一个错误。当测序品质达到Q30时，几乎所有的读取将是完美的，具有零错误和零歧义。结果在表1中示出。
表1
Figure BDA0002350231600000381
Figure BDA0002350231600000391
这些结果指示，使用具有催化活性物质的第一示例的接枝混合物(E1)接枝的引物对于测序表现得同样好或更好。
本实施例中的结果是被接枝和测试的泳道/通道的四个图像块(imagetile)的平均值。
实施例2
在pH 10的0.5M碳酸钠缓冲液中制备0.25M Cu2S颗粒和10μM炔烃-P5引物和炔烃-P7引物的混合物。三种混合物被制备并且允许在60℃的温度孵育持续不同的时间段，包括15分钟、30分钟和60分钟。在过滤之后，将10μM的每种接枝混合物(本文公开的第一示例的接枝混合物的示例)暴露于在图案化基底的阱中包含PAZAM的图案化基底泳道/通道。
图5中示出了示例性流动池的在相对强度单位相对于孵育(或提取)时间方面的强度结果。这些示例的相对荧光强度在从约0.036至约0.152的范围内。如所描绘的，引物接枝的有效性随着孵育时期的增加而增加。这指示，当混合物被允许孵育更久时，形成更多的催化活性物质。
实施例3
制备不同的混合物以说明本文公开的示例产生催化活性物质。比较性混合物1包含在测试之前未被过滤的在水中的硫化亚铜(I)。另一种比较性混合物2包含在水中的硫化亚铜(I)，该硫化亚铜(I)然后在测试之前被过滤。示例包含在水中的Cu2S颗粒以及炔烃-P5引物和炔烃-P7引物。每种混合物被允许在60℃的温度孵育持续约1小时的时间，其在测试之前被过滤。
对每种混合物进行动态光散射。结果在图6A(比较性混合物1)、图6B(比较性混合物2)和图6C(示例性混合物)中示出。图6A中的结果指示存在微米尺寸的硫化亚铜(I)颗粒，并且图6B中的结果指示在过滤期间除去微米尺寸的硫化亚铜(I)颗粒。图6C中的结果指示催化活性物质在进行过滤之后存在。
附加说明
应认识到，前述概念和下文更详细讨论的另外的概念的所有组合(条件是这样的概念不是相互不一致的)被设想为本文公开的发明主题的一部分。特别地，出现在本公开内容结尾处的所要求保护的主题的所有组合被设想为是本文公开的发明主题的一部分。还应认识到，也可以出现在通过引用并入的任何公开内容中的本文中明确采用的术语应当被赋予与本文公开的特定概念最一致的含义。
在整个说明书中对“一个示例”、“另一个示例”、“示例”诸如此类的提及意指关于该示例描述的特定要素(例如，特征、结构和/或特性)被包括在本文描述的至少一个示例中，并且可以存在于其他示例中或可以不存在于其他示例中。此外，应理解，用于任何示例的所描述的要素可以在多种示例中以任何合适的方式组合，除非上下文另外清楚地规定。
应理解，本文提供的范围包括所陈述的范围和所陈述的范围内的任何值或子范围。例如，从约500nm至约45μm的范围应被解释为不仅包括从约500nm至约45μm的明确叙述的限值，而且包括单独的值诸如约708nm、约945nm、约35μm等，以及子范围诸如从约825nm至约29μm，从约950nm至约40μm等。此外，当使用“约”和/或“大体上”来描述值时，它们意指涵盖从所陈述的值的微小变化(多达+/-10％)。
虽然已经详细地描述了若干示例，但应理解，可以修改所公开的示例。因此，前述描述被认为是非限制性的。

Claims (33)

1.一种催化活性物质，包括：
硫化亚铜(I)矿物颗粒；以及
在不存在光的情况下通过配位键直接结合至所述硫化亚铜(I)矿物颗粒的表面的炔烃官能化的分子。
2.如权利要求1所述的催化活性物质，其中所述硫化亚铜(I)矿物颗粒选自由辉铜矿、久辉铜矿和蓝辉铜矿组成的组。
3.如权利要求1或2所述的催化活性物质，其中所述炔烃官能化的分子是引物，所述引物具有附接在所述引物的5’末端的炔烃官能团。
4.一种制备***的方法，包括在硫化亚铜(I)矿物的存在下，使炔烃官能化的分子与叠氮化物官能化的分子反应，其中：
所述硫化亚铜(I)矿物与所述炔烃官能化的分子在不存在光的情况下通过配位键结合以形成催化活性物质。
5.如权利要求4所述的方法，其中：
所述催化活性物质与所述叠氮化物官能化的分子反应，以将所述催化活性物质与所述叠氮化物官能化的分子偶联。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中在使所述硫化亚铜(I)矿物与所述炔烃官能化的分子结合之前，所述方法还包括向所述炔烃官能化的分子添加相对于所述炔烃官能化的分子化学计量过量的所述硫化亚铜(I)矿物。
7.如权利要求4或5所述的方法，其中所述硫化亚铜(I)矿物与所述炔烃官能化的分子的结合包括：
形成所述硫化亚铜(I)矿物、所述炔烃官能化的分子和所述炔烃官能化的分子的溶剂的混合物；以及
将所述混合物保持在高于所述溶剂的凝固点且低于所述溶剂的沸点的温度持续多达50天的时间。
8.如权利要求7所述的方法，其中：
所述溶剂选自由以下组成的组：水、碳酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液和二甲基亚砜；并且
所述混合物的pH在从4至12的范围内。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述保持包括将所述混合物加热至在从30℃至60℃的范围内的温度，持续在从30分钟至90分钟的范围内的时间。
10.如权利要求4或5所述的方法，其中在使所述炔烃官能化的分子或所述催化活性物质与所述叠氮化物官能化的分子反应之前，所述方法还包括在流动池基底的表面上形成所述叠氮化物官能化的分子的层，并且其中使所述炔烃官能化的分子或所述催化活性物质与所述流动池基底的所述表面上的所述叠氮化物官能化的分子的所述层反应。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述炔烃官能化的分子或所述催化活性物质存在于液体混合物中，并且其中所述液体混合物流经所述流动池基底的所述表面上的所述叠氮化物官能化的分子的所述层。
12.如权利要求10所述的方法，其中在形成所述层之前，所述方法还包括将硅烷或硅烷衍生物附接至所述流动池基底的所述表面，以形成硅烷化表面。
13.如权利要求5所述的方法，还包括在使所述催化活性物质与所述叠氮化物官能化的分子反应之前，从所述催化活性物质中过滤未反应的硫化亚铜(I)矿物。
14.如权利要求4所述的方法，其中所述硫化亚铜(I)矿物具有在从500nm至45μm的范围内的平均粒度。
15.如权利要求4所述的方法，其中所述方法在没有配体配位并且不暴露于还原剂的情况下进行。
16.一种接枝混合物，包含：
包含炔烃官能团的引物；
溶剂；以及
硫化亚铜(I)矿物，
其中所述炔烃官能团待与所述硫化亚铜(I)矿物的表面在不存在光的情况下通过配位键结合，以在所述接枝混合物中形成催化活性物质。
17.如权利要求16所述的接枝混合物，还包含叠氮化物官能化的分子，其中所述叠氮化物官能化的分子待与由所述硫化亚铜(I)矿物介导的所述炔烃官能团反应。
18.如权利要求17所述的接枝混合物，其中所述叠氮化物官能化的分子是聚合物。
19.如权利要求18所述的接枝混合物，其中所述聚合物在基底的表面上，任选地其中所述基底是流动池。
20.如权利要求16至19中任一项所述的接枝混合物，其中所述接枝混合物包含相对于所述引物化学计量过量的所述硫化亚铜(I)矿物。
21.如权利要求16所述的接枝混合物，其中所述接枝混合物包含：
从1μM至20μM的所述引物；以及
从0.1M至3M的所述硫化亚铜(I)矿物。
22.如权利要求16至19中任一项所述的接枝混合物，其中所述硫化亚铜(I)矿物选自由辉铜矿、久辉铜矿和蓝辉铜矿组成的组，并且具有在从500nm至45μm的范围内的平均粒度。
23.一种将引物接枝至流动池表面的方法，包括：
在硫化亚铜(I)矿物的存在下，使炔烃官能化的引物与所述流动池表面上的叠氮化物官能化的分子反应，
其中：所述硫化亚铜(I)矿物与所述炔烃官能化的引物在不存在光的情况下通过配位键结合以形成催化活性物质。
24.如权利要求23所述的方法，其中：
所述催化活性物质与所述叠氮化物官能化的分子反应，以将所述催化活性物质与所述流动池表面上的所述叠氮化物官能化的分子偶联。
25.如权利要求23所述的方法，其中在使所述硫化亚铜(I)矿物与所述炔烃官能化的引物结合之前，所述方法还包括向所述炔烃官能化的引物添加相对于所述炔烃官能化的引物化学计量过量的所述硫化亚铜(I)矿物。
26.如权利要求23所述的方法，其中所述硫化亚铜(I)矿物与所述炔烃官能化的引物的结合包括：
形成所述硫化亚铜(I)矿物、所述炔烃官能化的引物和所述炔烃官能化的引物的溶剂的混合物；以及
将所述混合物保持在高于所述溶剂的凝固点且低于所述溶剂的沸点的温度持续多达50天的时间。
27.如权利要求26所述的方法，其中：
所述溶剂选自由以下组成的组：水、碳酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液和二甲基亚砜；并且
所述混合物的pH在从4至12的范围内。
28.如权利要求26或27所述的方法，其中所述保持包括将所述混合物加热至在从30℃至60℃的范围内的温度，持续在从30分钟至90分钟的范围内的时间。
29.如权利要求24所述的方法，其中在使所述催化活性物质与所述流动池表面上的所述叠氮化物官能化的分子反应之前，所述方法还包括在所述流动池表面上形成所述叠氮化物官能化的分子的层，并且其中使所述催化活性物质与所述流动池表面上的所述叠氮化物官能化的分子的所述层反应。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述催化活性物质存在于液体混合物中，并且其中所述液体混合物流经所述流动池表面上的所述叠氮化物官能化的分子的所述层。
31.如权利要求29或30所述的方法，其中在形成所述层之前，所述方法还包括将硅烷或硅烷衍生物附接至所述流动池表面，以形成硅烷化表面。
32.如权利要求29所述的方法，其中所述叠氮化物官能化的分子的所述层是聚(N-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)。
33.如权利要求24所述的方法，还包括在使所述催化活性物质与所述流动池表面上的所述叠氮化物官能化的分子反应之前，从所述催化活性物质中过滤未反应的硫化亚铜(I)矿物。
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