CN111050766A - Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶的抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及ROCK1和/或ROCK2的抑制剂。还提供了可用于治疗疾病的抑制ROCK1和/或ROCK2的方法。
Description
技术领域
本发明涉及ROCK1和/或ROCK2的抑制剂。还提供了可用于治疗疾病的抑制ROCK1和/或ROCK2的方法。
背景技术
Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)为丝氨酸/苏氨酸激酶家族的成员。已经鉴别出了两种同工型ROCK1和ROCK2。这两种同工型均由Rho GTPase的GTP结合形式激活，并且在被激活时磷酸化多种下游底物。ROCK在许多细胞过程中都起着重要作用，所述细胞过程包括平滑肌细胞收缩、细胞增殖、粘附和迁移。正因如此，ROCK抑制剂在多种病理病况中具有潜在的治疗适用性，所述病理病况包括例如哮喘、癌症、***功能障碍、青光眼、胰岛素抵抗、肾衰竭、肺动脉高压、神经元变性和骨质疏松症。
ROCK为细胞骨架动力学和细胞运动的关键的细胞内调控因子。Rho激酶通过磷酸化调控RhoA的许多下游靶标，包括例如肌球蛋白轻链、肌球蛋白轻链磷酸酶结合亚基和LIM激酶2。这些底物调控肌动蛋白丝组织和收缩性。在平滑肌细胞中，ROCK介导钙敏化和平滑肌收缩。ROCK的抑制阻断5-HT和去氧肾上腺素激动剂诱导的肌肉收缩。当引入非平滑肌细胞中时，ROCK诱导应力纤维形成并且为RhoA所介导的细胞转化所需的。ROCK参与多种细胞过程，包括但不限于细胞粘附、细胞运动和迁移、生长控制、细胞收缩和胞质***。ROCK还参与Na/H交换转运***激活、应力纤维形成、内收蛋白激活以及生理过程例如血管收缩、支气管平滑肌收缩、血管平滑肌和内皮细胞增殖、血小板聚集等。
动物模型中ROCK活性的抑制已经证明了Rho激酶抑制对于人疾病的治疗的许多益处。这些包括心血管疾病例如高血压、动脉粥样硬化、再狭窄、心脏肥大、高眼压、脑缺血、脑血管痉挛、******功能障碍、中枢神经***病症例如神经元变性和脊髓损伤以及瘤形成的模型。已显示ROCK活性的抑制抑制了肿瘤细胞生长和转移、血管生成、动脉血栓形成病症例如血小板聚集和白细胞聚集、哮喘、眼内压的调控和骨吸收。患者中ROCK活性的抑制对于控制蛛网膜下腔出血后的脑血管痉挛和局部缺血、降低眼内压、通过小梁网组织的松弛增加眼房水流出、改善流向视神经的血流以及保护健康的神经节细胞具有益处。
已经产生了聚焦于CNS中ROCK的活性的大量体内数据。已在许多中枢神经***病症中记录了ROCK途径的异常激活。例如，轴突生长和突触可塑性取决于肌动蛋白细胞骨架的结构调控。Rho-ROCK级联在突触可塑性方面、在树突形态发生和稳定性方面以及在生长锥运动和塌陷方面起着关键作用。此外，多种轴突生长抑制分子会聚于神经元中的RhoA/ROCK上，使其成为CNS病症干预的吸引人的途径。
Nogo受体(NgR)(连同其他复合成员，包括LINGO-1)和它们的配体可能是神经突起生长的被最充分表征并且有效的抑制剂。在通过髓磷脂相关抑制剂的受体激活下游的一些最早事件为RhoA和ROCK的上调。这些事件导致收缩性增加，并对成熟神经元中的轴突生长具有强烈的抑制作用。因此，抑制这种信号级联的可能性提供了脊髓和视神经损伤的非常有前景的治疗策略。神经退行性病况如亨延顿氏病和阿尔茨海默氏病(AD)也因为对NgR信号传导的抑制有应答而正被研究。不仅NgR家族成员与APP加工相关，而且在AD脑中NgR和Nogo的亚细胞定位也发生了变化。
阿尔茨海默氏病(AD)是老年人痴呆的最常见原因，是一种进行性神经退行性病症，其涉及许多认知功能的逐渐下降包括记忆障碍(Selkoe，2001)。突触丧失通常在AD病理中被观察到并且为AD的突触功能障碍的标志(Tanzi和Bertram，2005)。低聚的β-淀粉样蛋白肽与突触可塑性的丧失和神经网络功能障碍有关。突触可塑性取决于树突棘中肌动蛋白细胞骨架的结构调控。Rho-ROCK级联在突触可塑性方面、在树突形态发生和稳定性方面以及在生长锥运动和塌陷方面起着关键作用。(Govek等人，2005；Linseman和Loucks，2008)。多项研究表明，ROCK激酶可诱导毒性β-淀粉样蛋白肽的生成，并且此外，ROCK的抑制可抑制毒性肽加工。在前馈机制中，β-淀粉样蛋白增加了Rho GTPase活性，从而通过ROCK激活抑制了神经突起生长和突触形成(Petratos等人，2008)。因此，ROCK抑制剂可具有预防突触和神经元变性以及促进AD中再生过程的潜力。Herskowitz等人的最新研究表明，ROCK敲减降低aβ水平。这些作用表明，需要高ROCK选择性抑制剂来提供阿尔茨海默氏病(AD)的有效治疗。在AD的啮齿动物模型中测试了模型化合物SR3677，设法通过改变BACE-1分布和淀粉样蛋白前体蛋白(APP)向溶酶体的运输来展示ROCK抑制对于AD的使用。直接腹膜内注射到海马中之后，由于其口服PK特性差(5％F，并且半衰期小于1小时)并且缺乏脑渗透性，因此SR3677具有降低sAPPβ的有前景的作用。
亨廷顿氏病(HD)是一种破坏性的、不可治疗的、显性遗传性神经退行性疾病，其特征在于精神障碍、运动障碍和痴呆。亨延顿基因产物Htt蛋白的错误折叠和聚集导致HD病理(Shao和Diamond，2007)。已开发出非常少的针对HD治疗的基于机制的治疗引导。尽管科学研究仍在进行中，但多条证据表明，ROCK抑制可构成针对HD的有效治疗。在HD的小鼠模型中，ROCK抑制显著降低可溶性Htt水平，逆转聚集体形成，神经突收缩并且防止神经元细胞死亡(Deyts等人，2009；Li等人，2009)。在果蝇(Drosophila)研究中获得了相似的结果，其中ROCK的抑制控制了Htt聚集(Shao等人，2008a；Shao等人，2008b)。ROCK信号传导途径是HD的有前景的治疗靶标。
ROCK信号传导还与帕金森氏病和肌萎缩侧索硬化(ALD)有关。参见，例如，
L.等人(2012).“Inhibition of rho kinase enhances survival ofdopaminergic neurons and attenuates axonal loss in a mouse model ofParkinson′s disease.”Brain.135(11)：3355-70。
ROCK磷酸化多种下游底物，包括肌球蛋白轻链(MLC，在苏氨酸18和丝氨酸19处)和肌球蛋白轻链磷酸酶(MYPT1，在苏氨酸853处)，以驱动球状G肌动蛋白聚合成丝状F肌动蛋白并且装配肌动球蛋白收缩机构。已经认识到，这种途径可能是导致若干CNS病症例如脊髓损伤、中风和AD的发病机理。在成人CNS中，由于存在髓磷脂相关轴突生长抑制剂，所以损伤的轴突再生不良。髓磷脂相关抑制剂例如髓磷脂相关糖蛋白(MAG)、Nogo、少突胶质细胞-髓磷脂糖蛋白(OMgp)和排斥导向分子(RGM)限制了受损脑和脊髓中的轴突再生。各种髓磷脂相关抑制剂的共同机制为它们全部都激活Rho及其下游效应激酶ROCK以抑制神经突起生长。
在中枢神经***(CNS)病症中，通过小分子阻断Rho/ROCK途径为理想策略。然而，血脑屏障(BBB)虽然在脑稳态中起着关键作用，但也显著阻碍了大多数小分子抑制剂的渗透。随着对开发用于治疗CNS疾病的选择性并且有效的抑制剂的兴趣日益浓厚，迫切需要ROCK 1和/或ROCK 2的抑制剂，特别是那些穿越血脑屏障的抑制剂。
发明内容
在一方面，本发明提供式I化合物：
其中：
A选自由以下组成的组
R1选自由以下组成的组：低级烷基、取代的低级烷基、C3-C6环烷基、取代的C3-C6环烷基、R10R11N(CR12R13)c-、R10O(CR12R13)c-、W(CR12R13)d-和R10R11N-C(＝O)-(CR12R13)c-；
每个R10独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R11独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R12独立地选自H和低级烷基；
每个R13独立地选自H和低级烷基；
另外或替代地，连接至同一碳原子的R12和R13可一起形成C3-C6环烷基；
W为具有1至3个环杂原子的3至7元杂环；
c为2至4；
d为1至4；
R2选自由以下组成的组：芳基、杂芳基、芳烷基和杂环基，它们中的每一个可为未取代的或任选地被1至3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RO2C-、芳基-O-和杂芳基-O-；
替代地，R1和R2一起形成单环基团或双环基团，其中所述单环基团具有4至7个环原子，包括至多2个环杂原子，并且双环基团具有8至10个环原子，包括至多3个环杂原子，并且其中单环基团和双环基团为未取代的或任选地被1至3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、氨基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、芳基和杂芳基；
R3选自H、低级烷基、取代的低级烷基和RR′N-(C2-4烷基)-；
R4选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RR′N-(C2-4烷基)-和RR′N-(C2-4烷基)-O-；
R5选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
替代地，R3和R5一起形成具有5至7个环原子的环状基团，包括2-3个环杂原子，其中所述环状基团为未取代的或任选地被1至3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、氨基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、芳基和杂芳基；
a为0或1；
b为0至2；
以及
每个R和R′独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基，或者替代地，R和R′一起形成5至6元杂环。
本发明包括药物组合物，其包含本发明的化合物和药学上可接受的载体。
本发明包括组合物，其包含本发明的大体上纯的化合物及其药学上可接受的盐、立体异构体或水合物以及药学上可接受的载体。
在一方面，本发明提供一种在哺乳动物中抑制ROCK的方法，所述方法包括施用有效量的一种或多种式I化合物。本发明提供一种治疗患有疾病的患者的方法，所述方法包括向需要此类治疗的患者施用治疗有效量的式I化合物。在某些此类实施方案中，式I化合物抑制ROCK2。在某些此类实施方案中，式I化合物选择性地抑制ROCK2。根据本发明治疗的非限制性疾病和病况包括中枢神经***病症例如神经元变性和脊髓损伤、心血管疾病例如高血压、动脉粥样硬化、再狭窄、心脏肥大、高眼压、脑缺血、脑血管痉挛、******功能障碍、动脉血栓性病症例如血小板聚集和白细胞聚集、哮喘、眼内压的调控和骨吸收。在瘤形成中，ROCK的抑制抑制了肿瘤细胞生长和转移以及血管生成。
本发明提供一种治疗受试者的中枢神经***病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式I化合物。中枢神经***病症包括但不限于神经元变性或脊髓损伤以及亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化(ALS)或多发性硬化症。
本发明提供一种治疗受试者的自身免疫病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式I化合物。自身免疫病症包括但不限于类风湿性关节炎(多发性硬化症)、***性红斑狼疮(SLE；狼疮)、牛皮癣、克罗恩氏病、特应性皮炎、湿疹或移植物抗宿主病(GVHD)。
本发明提供一种治疗受试者的心血管病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式I化合物。心血管病症包括但不限于高血压、动脉粥样硬化、心绞痛、动脉阻塞、外周动脉疾病、外周循环病症、脑海绵状畸形、再狭窄、心脏肥大、高眼压、脑缺血、脑血管痉挛、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或***功能障碍。
本发明提供一种治疗受试者的炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式I化合物。炎症包括但不限于哮喘、心血管炎症、肾炎症或动脉硬化。
本发明提供一种治疗受试者的动脉血栓形成病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式I化合物。动脉血栓形成病症的非限制性实例为血小板聚集或白细胞聚集。
本发明提供一种治疗受试者的纤维化病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式I化合物。纤维化病症的非限制性实例为：：肺纤维化，包括囊性和特发性肺纤维化；放射诱发的肺损伤；肝纤维化，包括肝硬化；心脏纤维化，包括动脉纤维化；心内膜心肌纤维化；陈旧性心肌梗死；动脉僵硬；动脉粥样硬化；再狭窄；关节纤维化；克罗恩氏病；骨髓纤维化；佩罗尼氏病；肾源性***性纤维化；进行性块状纤维化；腹膜后腔纤维化；硬皮病/***性硬化症；纵隔纤维化；瘢痕疙瘩和增生性瘢痕；神经胶质瘢痕形成；或肾纤维化。
本发明提供一种维持上皮稳定性的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的式I化合物。
本发明提供一种治疗受试者的青光眼或调控眼内压的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式I化合物。青光眼的非限制性实例包括原发性开角型青光眼、急性闭角型青光眼、色素性青光眼、新生血管性青光眼、先天性青光眼、正常眼压性青光眼或继发性青光眼。
本发明提供一种治疗受试者的肿瘤性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式I化合物。肿瘤性疾病包括但不限于淋巴瘤、癌、白血病、肉瘤或母细胞瘤，如鳞状细胞癌、小细胞肺癌、垂体癌、食道癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠道癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、脑癌、子宫内膜癌、睾丸癌、胆管癌、胆囊癌、胃癌、黑色素瘤或头颈部癌。
本发明还提供一种治疗受试者的代谢综合征、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、2型糖尿病或葡萄糖耐受不良的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式I化合物。
此外，本发明提供一种治疗受试者的骨质疏松症或促进骨形成的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式I化合物。
本发明提供一种治疗具有血管生成成分的眼部病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的式I化合物和血管生成抑制剂。此类眼部病症的非限制性实例包括年龄相关性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管(CNV)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、虹膜新生血管、葡萄膜炎、新生血管性青光眼或早产儿视网膜病变(ROP)。
附图说明
图1a。代表性Z′-Lyte测定结果。本发明的ROCK抑制剂对ROCK的两种同工型均显示低至一位数的纳摩尔效力。
图1b。A7R5细胞内ELISA测定。用9点2倍连续稀释的化合物处理A7R5细胞，并确定ppMlc(T18/S19)水平以计算化合物的细胞IC50值。本发明的代表性化合物在细胞内得到小于200nM的IC50。
图1c。ROCK抑制剂可以通过ACTA2启动子驱动的荧光素酶报告基因细胞测定法有效地排序。将稳定表达ACTA2A启动子驱动的荧光素酶的NIH3T3细胞铺板在96孔板中至汇合，并用9点连续稀释的化合物以及TGFβ1处理24小时。测量荧光素酶活性，并计算化合物的IC50。本发明的代表性化合物显示出小于200nM的IC50。
图1d。用实施例2的化合物处理120分钟后，对SVEC4-10细胞裂解物进行蛋白质印迹以可视化ppMlc(T18/S19)和pMYPT(T853)水平。用所述化合物处理SVEC4-10细胞，并通过蛋白质印迹可视化磷酸化蛋白。代表性化合物在110nM下有效阻断了ROCK靶标MLC和MYPT1磷酸化。
图2a和2b，ROCK抑制剂在培养的人少突胶质细胞/神经元祖细胞中以剂量依赖性方式促进神经突起生长。在有或没有ROCK抑制剂的情况下，体外培养人少突胶质细胞/神经元祖细胞3天。
图2c和2d。ROCK抑制剂增强神经元细胞分化和成熟。将人少突胶质细胞/神经元祖细胞培养14天。ROCK抑制剂显著促进成熟神经元细胞标记物βIII微管蛋白表达并改善了神经突起生长。图2c，代表性图像；图2d，神经突长度的定量。
图2e、2f和2g。ROCK抑制剂阻断硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)对神经突起生长的抑制作用。将人少突胶质细胞/神经元祖细胞在涂布0.3mg/ml CSPG的板上培养3天。通过IncuCyte NeuroTrack软件模块对神经突长度进行定量。通过ANOVA进行72小时时间点的统计分析。图2e，代表性图像；图2f，神经突长度时程；图2g，72小时治疗时神经突长度的定量。
图3a、3b、3c、3d和3e。ROCK抑制剂保护神经元细胞免受Aβ1-42诱导的细胞死亡。将人少突胶质细胞/神经元祖细胞与ROCK抑制剂预孵育30分钟，然后暴露于10.5μM Aβ1-42。将IncuCyte Annexin V Red试剂添加到培养基中以标记细胞凋亡。通过IncuCyte S3软件分析神经突长度和Annexin V阳性总面积。图3a，用Aβ1-42以及化合物或不连同化合物处理的人少突胶质细胞/神经元祖细胞的代表性图像。图3b。annexin v阳性总面积时程；图3c，神经突长度时程；图3d，annexin v阳性总面积剂量应答；图3e，神经突长度剂量应答定量。
图4。ROCK抑制剂降低NIH3T3小鼠成纤维细胞系中TGFβ1诱导的纤维化基因表达。在有或没有TOCK抑制剂存在的情况下，用TGFβ1处理NIH3T3细胞24小时，并通过TaqmanqPCR定量mRNA表达。图4a，αSMA；图4b，CTGF，图4c，CCN1 mRNA。
图4d，ROCK抑制剂抑制TGFβ1诱导的CCN1分泌。用ROCK抑制剂处理CCD18Lu人肺成纤维细胞，并用TGFβ1刺激40小时，然后用ELISA法测量分泌的CCN1水平。
图5a。ROCK抑制剂在肺纤维化小鼠模型中具有活性。在博来霉素诱导的肺损伤模型中，用ROCK抑制剂处理21天后，用马森三色法染色以可视化小鼠肺中纤维化的肺切片的代表性图像。
图5b。肺纤维化的体内模型中ROCK抑制剂的阳性活性的定量。支气管肺泡灌洗液中的Ashcroft纤维化指数、α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)百分比阳性面积和总白细胞计数获自用实施例2的化合物治疗的博来霉素肺纤维化模型中的小鼠肺。
图6a。ROCK抑制剂在肺纤维化小鼠模型中具有治疗活性。在博来霉素诱导的肺损伤模型中，用ROCK抑制剂治疗性处理后，用马森三色法染色以可视化小鼠肺中纤维化的肺切片的代表性图像。
图6b。在对来自博来霉素诱导的肺损伤模型中ROCK抑制剂和媒介物治疗的小鼠的图像进行的组织病理学分析中纤维化指数的降低的定量。
图7a。在组胺诱导的血管通透性小鼠模型中，ROCK抑制稳定内皮屏障功能。相对于对照化合物(沙丁胺醇)，在ROCK抑制剂和媒介物治疗小鼠的皮肤中由组胺所诱导的伊文思蓝染料外渗的代表性图像。在组胺注射前1小时施用单剂量化合物后，ROCK抑制剂诱导血管屏障稳定。
图7b。在通过组胺注射诱导毛细血管渗漏后，ROCK抑制剂治疗的小鼠皮肤中斑点面积大小和伊文思蓝色染料量的减少的定量。
具体实施方式
ROCK抑制剂
根据本发明的化合物包括具有式I的那些：
其中：
A选自由以下组成的组
R1选自由以下组成的组：低级烷基、取代的低级烷基、C3-C6环烷基、取代的C3-C6环烷基、R10R11N(CR12R13)c-、R10O(CR12R13)c-、W(CR12R13)d-和R10R11N-C(＝O)-(CR12R13)c-；
每个R10独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R11独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R12独立地选自H和低级烷基；
每个R13独立地选自H和低级烷基；
另外或替代地，连接至同一碳原子的R12和R13可一起形成C3-C6环烷基；
W为具有1至3个环杂原子的3至7元杂环；
c为2至4；
d为1至4；
R2选自由以下组成的组：芳基、杂芳基、芳烷基和杂环基，它们中的每一个可为未取代的或任选地被1至3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RO2C-、芳基-O-和杂芳基-O-；
替代地，R1和R2一起形成单环基团或双环基团，其中所述单环基团具有4至7个环原子，包括至多2个环杂原子，并且双环基团具有8至10个环原子，包括至多3个环杂原子，并且其中单环基团和双环基团为未取代的或任选地被1至3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、氨基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、芳基和杂芳基；
R3选自H、低级烷基、取代的低级烷基和RR′N-(C2-4烷基)-；
R4选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RR′N-(C2-4烷基)-和RR′N-(C2-4烷基)-O-；
R5选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
替代地，R3和R5一起形成具有5至7个环原子的环状基团，包括2-3个环杂原子，其中所述环状基团为未取代的或任选地被1至3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、氨基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、芳基和杂芳基；
a为0或1；
b为0至2；
以及
每个R和R′独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基，或者替代地，R和R′一起形成5至6元杂环。
在本发明的某些实施方案中，提供了式II化合物：
其中：
R1选自由以下组成的组：低级烷基、取代的低级烷基、C3-C6环烷基、取代的C3-C6环烷基、R10R11N(CR12R13)c-、R10O(CR12R13)c-、W(CR12R13)d-和R10R11N-C(＝O)-(CR12R13)c-；
每个R10独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R11独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R12独立地选自H和低级烷基；
每个R13独立地选自H和低级烷基；
另外或替代地，连接至同一碳原子的R12和R13可一起形成C3-C6环烷基；
W为具有1至3个环杂原子的3至7元杂环；
c为2至4；
d为1至4；
R2选自由以下组成的组：芳基、杂芳基、芳烷基和杂环基，它们中的每一个可为未取代的或任选地被1至3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RO2C-、芳基-O-和杂芳基-O-；
替代地，R1和R2一起形成单环基团或双环基团，其中所述单环基团具有4至7个环原子，包括至多2个环杂原子，并且双环基团具有8至10个环原子，包括至多3个环杂原子，并且其中单环基团和双环基团为未取代的或任选地被1至3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、氨基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、芳基和杂芳基；
R3选自H、低级烷基、取代的低级烷基和RR′N-(C2-4烷基)-；
R4选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RR′N-(C2-4烷基)-和RR′N-(C2-4烷基)-O-；
b为0至2；
以及
每个R和R′独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基，或者替代地，R和R′一起形成5至6元杂环。
在本发明的某些实施方案中，提供了式III化合物：
其中
环A为5或6元芳族环，其任选地含有0至2个环杂原子；
R3选自H、低级烷基、取代的低级烷基和RR′N-(C2-4烷基)-；
R4选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RR′N-(C2-4烷基)-和RR′N-(C2-4烷基)-O-；
b为0至2；
R6选自由以下组成的组：H、卤代基、低级烷基、取代的低级烷基、低级烷氧基、氨基、羟基和羧基；
R7选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、氨基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′NCO-、RCONH-和RCONR′-；
每个R和R′独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基，或者替代地，R和R′一起形成5至6元杂环；以及
m为1或2。
在本发明的某些实施方案中，提供了式IV化合物：
其中
环B为5或6元芳族环，其任选地含有0至2个环杂原子；
R3选自H、低级烷基、取代的低级烷基和RR′N-(C2-4烷基)-；
R4选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RR′N-(C2-4烷基)-和RR′N-(C2-4烷基)-O-；
b为0至2；
R8选自由以下组成的组：H、卤代基、低级烷基、取代的低级烷基、低级烷氧基、氨基、羟基和羧基；
R9选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、氨基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基和羧基、RR′NCO-、RCONH-和RCONR′-；
每个R和R′独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基，或者替代地，R和R′一起形成5至6元杂环；以及
m为1至3。
在本发明的某些实施方案中，提供了式V化合物：
其中：
R1选自由以下组成的组：低级烷基、取代的低级烷基、C3-C6环烷基、取代的C3-C6环烷基、R10R11N(CR12R13)c-、R10O(CR12R13)c-、W(CR12R13)d-和R10R11N-C(＝O)-(CR12R13)c-；
每个R10独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R11独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R12独立地选自H和低级烷基；
每个R13独立地选自H和低级烷基；
另外或替代地，连接至同一碳原子的R12和R13可一起形成C3-C6环烷基；
W为具有1至3个环杂原子的3至7元杂环；
c为2至4；
d为1至4；
R4选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RR′N-(C2-4烷基)-和RR′N-(C2-4烷基)-O-；
b为0至2；
每个R21独立地选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RO2C-、芳基-O-和杂芳基-O-；
每个R和R′独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基，或者替代地，R和R′一起形成5至6元杂环；以及
n为0至3。
在本发明的某些实施方案中，提供了式VI化合物：
其中；
R1选自由以下组成的组：低级烷基、取代的低级烷基、C3-C6环烷基、取代的C3-C6环烷基、R10R11N(CR12R13)c-、R10O(CR12R13)c-、W(CR12R13)d-和R10R11N-C(＝O)-(CR12R13)c-；
每个R10独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R11独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R12独立地选自H和低级烷基；
每个R13独立地选自H和低级烷基；
另外或替代地，连接至同一碳原子的R12和R13可一起形成C3-C6环烷基；
W为具有1至3个环杂原子的3至7元杂环；
c为2至4；
d为1至4；
每个R22独立地选自H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RO2C-、芳基-O-和杂芳基-O-；
每个R和R′独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基，或者替代地，R和R′一起形成5至6元杂环。
在本发明的某些实施方案中，提供了式VII化合物：
其中：
环A为5或6元芳族环，其任选地含有0至2个环杂原子；
R3选自H、低级烷基、取代的低级烷基和RR′N-(C2-4烷基)-；
R4选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RR′N-(C2-4烷基)-和RR′N-(C2-4烷基)-O-；
b为0至2；
R6选自由以下组成的组：H、卤代基、低级烷基、取代的低级烷基、低级烷氧基、氨基、羟基和羧基；
R7选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、氨基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′NCO-、RCONH-和RCONR′-；
每个R和R′独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基，或者替代地，R和R′一起形成5至6元杂环；以及
m为1或2。
在本发明的某些实施方案中，提供了式VIII化合物：
其中
环B为5或6元芳族环，其任选地含有0至2个环杂原子；
R3选自H、低级烷基、取代的低级烷基和RR′N-(C2-4烷基)-；
R4选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RR′N-(C2-4烷基)-和RR′N-(C2-4烷基)-O-；
b为0至2；
R8选自由以下组成的组：H、卤代基、低级烷基、取代的低级烷基、低级烷氧基、氨基、羟基和羧基；
R9选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、氨基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基和羧基、RR′NCO-、RCONH-和RCONR′-；
每个R和R′独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基，或者替代地，R和R′一起形成5至6元杂环；以及
m为1至3。
在本发明的某些实施方案中，提供了式IX化合物：
其中：
R1选自由以下组成的组：低级烷基、取代的低级烷基、C3-C6环烷基、取代的C3-C6环烷基、R10R11N(CR12R13)c-、R10O(CR12R13)c-、W(CR12R13)d-和R10R11N-C(＝O)-(CR12R13)c-；
每个R10独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R11独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R12独立地选自H和低级烷基；
每个R13独立地选自H和低级烷基；
另外或替代地，连接至同一碳原子的R12和R13可一起形成C3-C6环烷基；
W为具有1至3个环杂原子的3至7元杂环；
c为2至4；
d为1至4；
R4选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RR′N-(C2-4烷基)-和RR′N-(C2-4烷基)-O-；
b为0至2；
每个R21独立地选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RO2C-、芳基-O-和杂芳基-O-；
每个R和R′独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基，或者替代地，R和R′一起形成5至6元杂环；以及
n为0至3。
在本发明的某些实施方案中，提供了式X化合物：
其中：
R1选自由以下组成的组：低级烷基、取代的低级烷基、C3-C6环烷基、取代的C3-C6环烷基、R10R11N(CR12R13)c-、R10O(CR12R13)c-、W(CR12R13)d-和R10R11N-C(＝O)-(CR12R13)c-；
每个R10独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R11独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R12独立地选自H和低级烷基；
每个R13独立地选自H和低级烷基；
另外或替代地，连接至同一碳原子的R12和R13可一起形成C3-C6环烷基；
W为具有1至3个环杂原子的3至7元杂环；
c为2至4；
d为1至4；
每个R22独立地选自由以下组成的组：卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、氨基、C1-C3全氟烷基和C1-C3全氟烷氧基；以及
n为0至3。
在式I至X的优选实施方案中，R1被选择为低级烷基或取代的低级烷基。在某些实施方案中，R1为C1至C3烷基，并且还更优选地，R1为甲基或乙基。
术语“烷基”是指饱和脂族基团，包括直链烷基、支链烷基、环烷基(脂环族)基团、烷基取代的环烷基和环烷基取代的烷基。在优选的实施方案中，直链或支链烷基在其主链中具有8个或更少的碳原子(例如，对于直链为C1-C8，对于支链为C3-C8)，并且更优选为6个或更少。同样，优选的环烷基在其环结构中具有3-8个碳原子，并且更优选在环结构中具有3至6个碳。
除非另外指定碳的数目，否则如本文所用的“低级烷基”是指如上所定义但是具有1至4个碳并且更优选地1至3个碳原子的烷基。在优选的实施方案中，本文称为烷基的取代基为低级烷基。低级烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、环丙基和环丁基。
术语“环烷基”是指在环中具有3至8个碳的饱和碳环基团。环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
术语“取代的烷基”是指如上所定义并且具有1至3个取代基的烷基。取代基选自由以下组成的组：卤代基、羟基、低级烷氧基、氨基、低级烷基氨基、硝基、氰基、全氟低级烷基、全氟低级烷氧基和羧基。
“取代的低级烷基”是指如上所定义并且具有1至3个取代基的低级烷基。取代基选自由以下组成的组：卤代基、羟基、低级烷氧基、氨基、硝基、氰基、全氟低级烷基、全氟低级烷氧基和羧基。
“取代的环烷基”例如“取代的C3-C6环烷基”是指如上所定义并且具有1至3个取代基的环烷基。取代基选自由以下组成的组：卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、氨基、硝基、氰基、全氟低级烷基、全氟低级烷氧基和羧基。
如本文所用，术语“卤素”或“卤代基”是指-F、-Cl、-Br或-I，并且优选地为F、Cl或Br。
如本文所用，术语“烷氧基(alkoxyl)”或“烷氧基(alkoxy)”是指通过氧原子连接的如上所定义的烷基。代表性烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。术语“低级烷氧基”是指其中低级烷基通过氧原子键合的烷氧基取代基，其中“低级烷基”部分如上所定义。
术语“胺”和“氨基”是指未取代的和取代的胺，例如可以由以下通式表示的部分：
其中R和R′各自独立地选自H和低级烷基。
如本文所用的术语“芳基”包括可包含零至四个杂原子的5和6元单环芳族基团，例如苯、芘、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、***、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。在环结构中具有杂原子的那些芳基还可被称为“芳基杂环”或“杂芳基”基团。芳族环可以在一个或多个环位置处被如上所述的此类取代基取代。术语“芳基”还包括具有两个或更多个环的多环***，其中两个或更多个碳是两个相邻的环所共有的(环为“稠合环”)，其中至少一个环是芳族的。
如本文所用的术语“芳烷基”是指被芳基取代的烷基。优选地，烷基为如上所述的低级烷基。
术语“杂环”或“杂环基”是指具有4至7个环原子并且包括1至3个环杂原子的非芳族杂环。
如本文所用，术语“杂原子”意指除碳或氢以外的任何元素的原子。优选的杂原子为氮、氧和硫。最优选的为氮和氧。
如本文所用，每个表达的定义例如烷基、m、n、R1、R2等，当在任何结构中出现多于一次时，旨在独立于其在同一结构中其他位置的定义。
应当理解，“取代”或“被...取代”包括隐含前提条件，即这种取代是根据被取代的原子和取代基的允许的化合价，并且所述取代能产生稳定的化合物，例如不会自发地进行转变，诸如通过重排、环化、消除等进行转变的化合物。
如本文所用，术语“取代的”预期包括有机化合物的所有可允许的取代基。在广义方面，可允许的取代基包括有机化合物的非环状的和环状的、支链的和非支链的、碳环的和杂环的、芳族的和非芳族的取代基。说明性取代基包括例如上文所述的那些。可允许的取代基可以是一个或多个取代基并且对于适当的有机化合物而言是相同或不同的。出于本发明的目的，杂原子诸如氮可以具有氢取代基和/或本文所述的有机化合物的满足杂原子的化合价的任何可允许的取代基。本发明并不旨在以任何方式受到有机化合物的可允许的取代基的限制。
如本文所用的短语“保护基”意指临时取代基，其保护潜在的反应性官能团免于不希望的化学转化。这样的保护基的实例分别包括羧酸的酯、醇的甲硅烷基醚以及醛和酮的缩醛和缩酮。已经综述了保护基化学领域(Greene，T.W.；Wuts，P.G.M.Protective Groupsin Organic Synthesis，第二版；Wiley：New York，1991)。
本发明的某些化合物可以特定的几何或立体异构形式存在。本发明设想所有此类化合物包括顺式和反式异构体、R和S对映异构体、非对映异构体、(D)异构体、(L)异构体、其外消旋混合物以及它们的其他混合物均落在本发明的范围内。另外的非对称碳原子可以存在于取代基例如烷基中。所有此类异构体以及其混合物都包括在本发明中。本发明还设想用原子的同位素对化合物进行取代，例如用氚取代氢等。
在一方面，本发明提供了作为ROCK抑制剂的式I-X化合物。ROCK以两种形式存在：ROCK 1(ROCKβ；p160-ROCK)和ROCK 2(ROCKα)。在一些实施方案中，式I-X化合物选择性地抑制ROCK1。在一些实施方案中，式I-X化合物选择性地抑制ROCK2。在一些实施方案中，式I-X化合物对于ROCK1和ROCK2的抑制是非选择性的。在本发明的上下文中，选择性意指抑制剂对一种激酶表现出的IC50与对另一激酶的IC50相比降低了至少2倍、至少5倍、至少10倍或至少25倍。
确定激酶抑制的方法是本领域已知的。例如，可以通过测量底物的酶特异性磷酸化来确定酶的激酶活性和测试化合物的抑制能力。商业测定和试剂盒是可获得的并且可以使用。例如，可以使用
测定(Molecular Devices)来确定激酶抑制。这种测定方法涉及使用荧光标记的肽底物。感兴趣的激酶对标记肽的磷酸化通过磷酸基和三价金属之间的特异性、高亲和力相互作用促进了肽与基于三价金属的纳米粒子的结合。接近纳米粒子导致荧光偏振增加。激酶抑制剂对激酶的抑制防止了底物的磷酸化，从而限制了荧光标记底物与纳米粒子的结合。这样的测定可以与微孔测定形式兼容，从而允许同时确定多种化合物的IC50。
治疗疾病的方法
在本发明的一个方面，提供了一种治疗患有疾病的患者的方法，所述方法包括向需要这种治疗的患者施用治疗有效量的本发明的化合物。如本文所用的短语“治疗有效量”意指在适用于任何医学治疗的合理的利益/风险比(例如适用于任何医学治疗的合理副作用)下在动物中的至少一种细胞亚群中有效产生某一所需治疗作用的化合物、材料或包含本发明化合物的组合物的量。
CNS病症
式I-X化合物表现出有效的血脑屏障(BBB)渗透和向中枢神经***组织的分布。因此，本发明的化合物可用于治疗中枢神经***病症以及得益于穿过BBB的能力的病症例如某些眼部病症。此类病症可涉及神经元变性或神经组织的物理损伤，包括但不限于亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、巴滕病、痴呆、脊髓性肌萎缩症、运动神经元病、脊髓小脑性共济失调、急性或慢性疼痛、痴呆、神经元变性、脊髓损伤、脑血管痉挛或多发性硬化症。
心血管
抑制ROCK和/或ROCK介导的磷酸化的本发明化合物可用于治疗患有涉及ROCK功能的心血管和非心血管疾病的患者，所述疾病例如高血压、肺动脉高压、动脉粥样硬化、再狭窄、冠心病、心脏肥大、高眼压、视网膜病变、缺血性疾病、脑缺血、脑血管痉挛、******功能障碍、外周循环病症、外周动脉闭塞性疾病、青光眼(例如，调控眼内压)、纤维化肺、纤维化肝、纤维化肾、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、成人呼吸窘迫综合征、中枢神经***病症例如神经元变性和脊髓损伤。此外，本发明的ROCK抑制剂可用于治疗动脉血栓形成病症例如血小板聚集和白细胞聚集以及骨吸收。
在本发明的一个实施方案中，化合物用于治疗脑海绵状畸形(CCM)。CCM为由渗漏的扩张毛细血管簇组成的血管病变，并与包括癫痫发作和中风的中枢神经***(CNS)病症相关。血管完整性的丧失被认为涉及RhoA的激活和ROCK的激活，导致细胞骨架稳定性改变和血管通透性增加。本发明的化合物抑制ROCK激活并恢复血管内皮功能。
青光眼
在本发明的一个实施方案中，式I-X化合物用于治疗青光眼。两种最常见的原发性开角型青光眼和急性闭角型青光眼的特征在于高眼压。色素性青光眼和先天性青光眼的特征还在于流体流出减少和眼内压(IOP)高。正常眼压性青光眼被认为是由于另一种机制，特别是向视神经的血液流动不良。继发性青光眼可能是由损伤、感染、炎症、肿瘤或白内障引起的，并且还与长期使用类固醇、***性高血压、糖尿病性视网膜病和视网膜中央静脉阻塞有关。除ROCK抑制剂外，具有新生血管成分的青光眼还可受益于血管生成抑制剂的施用。
炎症
本发明提供一种治疗受试者的炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式I-X化合物。炎症包括但不限于哮喘、心血管炎症、肾炎症、动脉粥样硬化和动脉硬化以及败血症。可以通过本发明的方法治疗的其他炎性病况包括纤维化病况(包括例如特发性肺纤维化、NASH、硬皮病、全身性硬化和肝硬化)。
自身免疫病症
本发明提供一种治疗受试者的自身免疫病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式I-X化合物。自身免疫病症包括但不限于类风湿性关节炎、多发性硬化症、***性红斑狼疮(SLE；狼疮)、牛皮癣、克罗恩氏病、特应性皮炎、湿疹或移植物抗宿主病(GVHD)、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性坏死性出血性白质脑炎、艾迪生氏病、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性病、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性自主神经异常、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性***、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性荨麻疹、轴突和神经元神经病、巴娄病、白塞病、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯特曼病(Castleman disease)、乳糜泻(Celiacdisease)、恰加斯病(Chagas disease)、慢性疲劳综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、查格-施特劳斯综合征(Churg-Strausssyndrome)、瘢痕性天疱疮/良性粘膜天疱疮、克罗恩氏病、科干综合征(Cogans syndrome)、冷凝集素病、先天性心传导阻滞(Congenital heart block)、柯萨奇病毒性心肌炎(Coxsackie myocarditis)、CREST病、特发性混合型冷球蛋白血症、脱髓鞘性神经病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克氏病(Devic′s disease)(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德雷斯勒氏综合征(Dressler’s syndrome)、子宫内膜异位症、嗜酸性食管炎、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、实验性***反应性脑脊髓炎、伊文氏综合征(Evans syndrome)、纤维肌痛、纤维化肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞心肌炎、肾小球肾炎、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture′s syndrome)、肉芽肿伴多血管炎(GPA)(以前称为韦格纳氏肉芽肿(Wegener′s Granulomatosis))、葛瑞夫兹氏病(Graves′disease)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本氏脑炎(Hashimoto′s encephalitis)、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、亨-合二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、妊娠疱疹、低丙种球蛋白血症(Hypogammaglobulinemia)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、IgG4相关硬化性疾病、免疫调节脂蛋白、包涵体肌炎、间质性膀胱炎、幼年型关节炎、幼年型糖尿病(1型糖尿病)、幼年型肌炎、川崎综合征(Kawasaki syndrome)、蓝伯-伊顿综合征(Lambert-Eatonsyndrome)、白细胞碎裂性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、木样结膜炎、线状IgA病(LAD)、狼疮(SLE)、莱姆病(Lyme disease)、慢性梅尼埃病(chronic Meniere′s disease)、显微镜下多血管炎、混合性***病(MCTD)、莫伦氏溃疡(Mooren′s ulcer)、穆-哈二氏病(Mucha-Habermann disease)、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(戴维斯氏)、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性天疱疮、视神经炎、复发性风湿症(Palindromicrheumatism)、PANDAS(伴有链球菌感染的小儿自身免疫性神经精神障碍(PediatricAutoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with Streptococcus))、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、帕罗综合征(Parry Romberg syndrome)、帕森-特纳综合征(Parsonnage-Turner syndrome)、睫状体平坦部炎(Pars planitis)(外周葡萄膜炎)、天疱疮、外周神经病变、周围性脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I型、II型和III型自身免疫性多腺综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、孕酮性皮炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍、雷诺现象(Raynauds phenomenon)、反应性关节炎、反射***感神经营养障碍、赖特氏综合征(Reiter′s syndrome)、复发性多软骨炎、不安腿综合征、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病(Sarcoidosis)、施密特综合征(Schmidt syndrome)、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征(Sjogren′s syndrome)、***和睾丸自身免疫、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克氏综合征(Susac′s syndrome)、交感性眼炎、大动脉炎(Takayasu′sarteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、托洛萨-亨特综合征(Tolosa-Hunt syndrome)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎、未分化***病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、皮肤病水疱和白癜风。
根据本发明，通过ROCK抑制靶向Th17(IL-17分泌)细胞提供了一种用于治疗Th17细胞介导的疾病的方法，所述疾病包括但不限于自身免疫病症例如RA、MS、SLE、牛皮癣和克罗恩氏病以及在人体内的GVHD。在本发明的一个实施方案中，ROCK抑制剂为式I-X化合物。
肿瘤性疾病
本发明的ROCK抑制剂抑制肿瘤细胞生长和转移以及血管生成，并且可用于***性疾病。肿瘤性疾病包括由异常或不受控制的细胞***引起的任何恶性生长或肿瘤，并可能通过淋巴***或血流蔓延到身体的其他部位。肿瘤性疾病包括但不限于淋巴瘤(通常为恶性的淋巴组织肿瘤)、癌(任何源自上皮组织的恶性肿瘤)、白血病(血液形成组织的恶性肿瘤；特征在于白细胞异常增殖)、肉瘤(通常由***(骨骼或肌肉等)引起的恶性肿瘤)和母细胞瘤(前体细胞的恶性肿瘤)。非限制性实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、垂体癌、食道癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠道癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、大肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、脑癌、子宫内膜癌、睾丸癌、胆管癌、胆囊癌、胃癌、黑素色瘤和各种类型的头颈部癌。
胰岛素抵抗
在本发明的一个实施方案中，ROCK抑制剂用于减少或预防胰岛素抵抗或恢复胰岛素敏感性。因此，在一个实施方案中，本发明的化合物用于促进或恢复胰岛素依赖性葡萄糖摄取。在本发明的另一个实施方案中，本发明的ROCK抑制剂用于促进或恢复葡萄糖耐量。在本发明的另一个实施方案中，本发明的ROCK抑制剂用于治疗代谢综合征。在另一个实施方案中，本发明的ROCK抑制剂用于减少或预防高胰岛素血症。在本发明的一个实施方案中，ROCK抑制剂用于治疗糖尿病(特别是2型糖尿病)。本发明的ROCK抑制剂还可以用于促进或恢复胰岛素介导的血管平滑肌细胞(VSMC)松弛。
血管生成
本发明提供了用于治疗具有血管生成成分的疾病和病症的方法和化合物。根据本发明，在某些实施方案中，通过向受试者施用有效量的ROCK抑制剂来治疗此类疾病和病症。根据本发明，还可以通过施用有效量的rho激酶抑制剂和有效量的血管生成抑制剂来治疗此类疾病和病症。根据本发明，以这种方式治疗具有血管生成成分的眼部疾病和病症。在一个实施方案中，本发明提供一种治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)的方法，AMD以“干”和“湿”形式出现。AMD的“温”形式由于异常的血管生长(新生血管)而导致视力下降。这些视网膜血管的出血、渗漏和瘢痕形成最终导致对光感受器的不可逆损伤。干形式是视网膜色素上皮层萎缩造成的，视网膜色素上皮层萎缩通过眼睛中部的光感受器(视杆和视锥)损失而导致视力下降。在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗脉络膜新生血管(CNV)的方法。脉络膜新生血管是这样的过程，在所述过程中，新血管在脉络膜中通过布鲁赫膜(Bruchmembrane)生长并侵入视网膜下空间，并且除其他原因之外是年龄相关性黄斑变性、近视和眼外伤的症状。在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗糖尿病性黄斑水肿(DME)的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗继发于视网膜分支静脉阻塞(BRVO)或视网膜中央静脉阻塞(CRVO)的黄斑水肿的方法。在其他实施方案中，待治疗的疾病包括但不限于感染性和非感染性视网膜新生血管、感染性和非感染性角膜新生血管、虹膜新生血管、葡萄膜炎、新血管性青光眼和早产儿视网膜病变(ROP)。治疗方法可以是预防性的，例如避免角膜移植后角膜新生血管，或调节小梁切除术中的伤口愈合过程。这些疾病和病症可以特征在于具有血管生成成分。根据本发明，通过施用ROCK抑制剂和血管生成抑制剂来治疗此类疾病。
因此，在一个这样的实施方案中，所述疾病或病症为AMD，并且需要AMD治疗的受试者被施用一定量的有效治疗AMD的ROCK抑制剂。在另一个实施方案中，受试者被使用以有效治疗AMD的量的ROCK抑制剂和血管生成抑制剂。在一些实施方案中，血管生成抑制剂为VEGFR2拮抗剂。在某些此类实施方案中，VEGFR2拮抗剂结合VEGF。在其他此类实施方案中，VEGFR2拮抗剂与VEGFR2结合。此类VEGFR2结合抑制剂包括与VEGFR2的胞外域结合的剂，包括但不限于抗体及其VEGFR2结合片段，以及与VEGFR2的胞内域相互作用并阻断VEGFR2依赖性信号转导的激活的剂。VEGFR2拮抗剂还包括与其他细胞成分相互作用以阻断VEGFR2依赖性信号转导的剂。在本发明的其他实施方案中，对如上所述的具有血管生成成分的其他眼部疾病和病症进行类似治疗。
根据本发明，将ROCK抑制剂和血管生成抑制剂以有效治疗或预防以过度血管生成为特征的病理病况的量施用于受试者。涉及例如血管形成和/或炎症的此类病况包括动脉粥样硬化、类风湿性关节炎(RA)、血管瘤、血管纤维瘤和牛皮癣。血管生成性疾病的其他非限制性实例为早产儿视网膜病变(晶状体后纤维增生(retrolental fibroplastic))、角膜移植排斥、与屈光手术并发症有关的角膜新生血管、与隐形眼镜并发症有关的角膜新生血管、与翼状胬肉和复发性翼状胬肉有关的角膜新生血管、角膜溃疡病以及非特异性眼表疾病、胰岛素依赖型糖尿病、多发性硬化症、重症肌无力、克罗恩氏病、自身免疫性肾炎、原发性胆汁性肝硬化、急性胰腺炎、异位排异反应、过敏性炎症、接触性皮炎和迟发型超敏反应、炎性肠病、败血性休克、骨质疏松症、骨关节炎、神经元炎症引起的认知缺陷、奥韦综合征(Osler-Weber syndrome)、再狭窄以及包括巨细胞病毒感染的真菌、寄生虫和病毒感染。
本发明提供了泛ROCK抑制剂(即，抑制ROCK1和ROCK2的化合物)。一项研究发现，与非肿瘤样肝相比，ROCK2在肝细胞癌中经常过表达，而ROCK1表达没有改变。可以从用ROCK2选择性抑制剂进行的治疗受益的其他癌症包括但不限于结肠癌和膀胱癌。相比之下，已经观察到ROCK1表达水平在乳腺肿瘤中更高。可以测试任何癌症以确定ROCK1和/或ROCK2是否过表达，并据此进行治疗。在某些情况下，ROCK1和ROCK2同工型在调控某些下游靶标时显示相似性，而且两种同工型似乎都不占优势。在此类情况下，泛ROCK抑制剂可能是优选的。
与其他药剂的组合
本发明的化合物可以有利地与第二剂一起施用于有需要的患者。当ROCK抑制剂与第二剂一起施用时，ROCK抑制剂和第二剂可以顺序或伴随施用。顺序意指施用一种剂一段时间后，再施用另一药剂，然后再施用第一剂。当顺序施用剂时，一种剂的水平在施用第二剂时可能不维持在治疗有效水平，反之亦然。伴随意指即使各剂不是同时施用的，第一剂和第二剂也是根据使两种剂维持在大致上治疗有效水平的计划表来施用的。每种剂可以单剂量或多剂量施用，并且剂量可按任何计划表施用，包括但不限于每天两次、每天一次、每周一次、每两周一次和每月一次。
本发明还包括辅助施用。辅助施用意指除了已经施用以治疗疾病或疾病症状的第一剂之外，还向患者施用第二剂。在一些实施方案中，辅助施用涉及向第一剂的施用不足以治疗疾病或疾病症状的患者施用第二剂。在其他实施方案中，辅助施用涉及向疾病已经通过施用第一剂而被有效治疗的患者施用第二剂，期望辅助治疗改善治疗结果。在一些实施方案中，施用第一剂和第二剂的作用是协同的。在一些实施方案中，与单独施用任一剂相比，施用第一剂和第二剂预防复发或延长直到复发为止的时间。在一些实施方案中，施用第一剂和第二剂允许第一剂和第二剂的施用剂量和/或频率减少。
可以与本发明的化合物组合施用的抗炎药和免疫抑制剂包括类固醇药物(例如糖皮质激素(例如，***))、FK506(他克莫司)、环孢素、芬戈莫德(fingolimod)、干扰素(例如IFNβ或IFNγ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)结合蛋白(例如英夫利昔单抗(Remicade)、依那西普(Enbrel)或阿达木单抗(Humira))、麦考酚酸、MMF、甲氨蝶呤、NSAID、他汀类药物、西罗莫司/替西罗莫司/依维莫司、阿巴西普(Orencia)、阿那白滞素(Kineret)、赛妥珠单抗(Cimzia)、戈利木单抗(Simponi)、依奇珠单抗(Taltz)、那他珠单抗(Tysabri)、利妥昔单抗(Rituxan)、苏金单抗(Cosentyx)、托珠单抗(Actemra)、优特克单抗(Stelara)、维多珠单抗(Entyvio)、巴利昔单抗(Simulect)、达克珠单抗(Zinbryta)、莫罗单抗(OrthocloneOKT3)、Jakafi(鲁索替尼)、Xeljanz(托法替尼)和Otezla(阿普斯特)。
在本发明的一个实施方案中，将本发明的ROCK抑制剂和抗肿瘤剂施用于有需要的受试者。在另一个实施方案中，将本发明的ROCK抑制剂和血管生成抑制剂施用于有需要的受试者。在另一个实施方案中，将本发明的ROCK抑制剂和抗炎剂施用于有需要的受试者。在又另一个实施方案中，施用本发明的ROCK抑制剂和免疫抑制剂。第二剂可以是但不限于小分子、抗体或其抗原结合片段或放射。
抗肿瘤剂包括但不限于细胞毒性化学治疗剂、靶向的小分子和生物分子以及放射。除了本发明的ROCK抑制剂以外，可以施用以用于肿瘤治疗的化合物和剂包括以下：伊立替康、依托泊苷、喜树碱、5-氟尿嘧啶、羟基脲、他莫昔芬、紫杉醇、卡培他滨、卡铂、顺铂、博来霉素、达霉素、吉西他滨、阿霉素、达柔比星、环磷酰胺和放射疗法，放射疗法可以是外部的(例如，外束放射疗法(EBRT))或内部的(例如，近距离治疗(BT))。
靶向小分子和生物分子包括但不限于信号转导途径的成分的抑制剂，例如酪氨酸激酶调节剂和受体酪氨酸激酶抑制剂，以及与肿瘤特异性抗原结合的剂。实例包括：表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂，包括吉非替尼、厄洛替尼和西妥昔单抗；HER2抑制剂(例如，曲妥珠单抗、曲妥珠单抗美坦新(曲妥珠单抗-DM1；T-DM1)和帕妥珠单抗)；抗VEGF抗体和片段(例如，贝伐单抗)；抑制CD20的抗体(例如，利妥昔单抗、替伊莫单抗)；抗VEGFR抗体(例如，雷莫芦单抗(IMC-1121B)、IMC-1C11和CDP791)；抗PDGFR抗体；和伊马替尼。小分子激酶抑制剂可以对特定的酪氨酸激酶具有特异性，或者可以是两种或更多种激酶的抑制剂。例如，化合物N-(3，4-二氯-2-氟苯基)-7-({[(3aR，6aS)-2-甲基八氢环戊[c]吡咯-5-基]甲基}氧基)-6-(甲氧基)喹唑啉-4-胺(也称为XL647、EXEL-7647和KD-019)为几种受体酪氨酸激酶(RTK)包括EGFR、EphB4、KDR(VEGFR)、Flt4(VEGFR3)和ErbB2的体外抑制剂，还为SRC激酶抑制剂，其参与导致肿瘤对某些TKI无应答的途径。
达沙替尼(BMS-354825；Bristol-Myers Squibb，New York)为另一种口服可生物利用的ATP位点竞争性Src抑制剂。达沙替尼还靶向Bcr-Abl(经FDA批准用于患有慢性粒细胞性白血病(CML)或费城染色体阳性(Ph+)急性淋巴细胞白血病(ALL)的患者)以及c-Kit、PDGFR、c-FMS、EphA2和Src家族激酶。Src和Bcr-Abl的另外两种口服酪氨酸激酶抑制剂为博舒替尼(SKI-606)和塞卡替尼(AZD0530)。
根据本发明，可以将血管生成抑制剂与本发明的化合物联合施用于受试者。血管生成抑制剂包括任何抑制新血管生长的物质。例如，血管生成抑制剂包括VEGF、PlGF和VEGF受体的拮抗剂，包括本文所公开的抗体。VEGF拮抗剂减少或阻断细胞中与VEGF相关的功能。VEGF拮抗剂可通过与VEGF结合并阻断与其受体的结合而作用于VEGF，和/或可作用于参与VEGF介导的信号转导的另一种细胞组分。类似地，VEGFR2拮抗剂为通过与VEGFR2结合并阻断配体与VEGFR2底物结合或相互作用来减少或阻断VEGFR2介导的信号转导的剂，或为作用于另一种细胞组分以减少或阻断VEGFR2介导的信号转导的剂。因此，血管生成抑制剂包括抗VEGFR2抗体以及但不限于VEGF、VEGFR1、VEGFR2、PDGF、PDGFR-β、神经纤毛蛋白-1(NRP1)和补体的拮抗剂。
血管生成抑制剂包括阻断由例如VEGF、PDGF、VEGF或PDGF受体的配体或补体介导的信号转导的细胞内剂。抑制血管生成抑制剂的细胞内剂包括但不限于以下。舒尼替尼(Sutent；SU11248)为VEGFR1-VEGFR3、PDGFRα和PDGFRβ、干细胞因子受体(cKIT)、Flt-3和集落刺激因子-1受体(CSF-1R)的泛特异性小分子抑制剂。阿西替尼(AG013736；Inlyta)为抑制VEGFR-1-VEGFR-3、PDGFR和cKIT的另一种小分子酪氨酸激酶抑制剂。西地尼布(AZD2171)为VEGFR-1-VEGFR-3、PDGFRβ和cKIT的抑制剂。索拉非尼(Nexavar)为几种酪氨酸蛋白激酶包括VEGFR、PDGFR和Raf激酶的另一种小分子抑制剂。帕唑帕尼(Votrient；GW786034)抑制VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3、cKIT以及PDGFR。福瑞替尼(GSK1363089；XL880)抑制VEGFR2和MET。CP-547632为VEGFR-2和碱性成纤维细胞生长因子(FGF)激酶的有效抑制剂。E-3810(6-(7-((1-氨基环丙基)甲氧基)-6-甲氧基喹啉-4-基氧基)-N-甲基-1-萘酰胺)在纳摩尔范围内抑制VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3以及FGFR-1和FGFR-2激酶。布立尼布(BMS-582664)为还抑制FGF受体信号传导的VEGFR-2抑制剂。CT-322(Adnectin)为基于人纤连蛋白结构域并且结合VEGFR2并抑制VEGFR2激活的小蛋白。凡德他尼(Caprelas；Zactima；ZD6474)为VEGFR2、EGFR和RET酪氨酸激酶的抑制剂。X-82(Xcovery)为通过生长因子受体VEGFR和PDGFR进行信号传导的小分子吲哚酮抑制剂。
药物组合物
在一方面，本发明提供了药学上可接受的组合物，其包含与一种或多种药学上赋形剂一起配制的治疗有效量的一种或多种式I-X化合物。如下所述，本发明的药物组合物可以被特别配制来以固体或液体形式施用，包括适合于以下的那些：(1)口服施用，例如，灌服剂(水性或非水性溶液或混悬液)、片剂(例如以颊、舌下和全身吸收为目标的片剂)、大丸剂、粉剂、颗粒剂、用于向舌施用的糊剂；(2)肠胃外施用，例如作为例如无菌溶液或混悬液或缓释制剂通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射；(3)局部应用，例如作为霜剂、软膏或控释贴剂或应用于皮肤的喷雾剂；(4)***内或直肠内，例如作为子宫帽、霜剂或泡沫；(5)舌下；(6)经眼；(7)透皮；或(8)经鼻。
本文使用短语“药学上可接受的”指代在合理的医学判断范围内适于与人和动物的组织接触的具有毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症、与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用的短语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸)或溶剂包封材料，其涉及将主题化合物从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一器官或身体的另一部分。每种载体在与制剂的其他成分相容且对患者无害的意义上必须是“可接受的”。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；和(22)药物制剂中使用的其他无毒相容性物质。
如上所述，本发明化合物的某些实施方案可含有碱性官能团，例如氨基或烷基氨基，并且因此能够与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。在这方面，术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐。这些盐可以在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或者通过使本发明的游离碱形式的纯化的化合物与合适的有机或无机酸分别反应，并在随后的纯化过程中分离由此形成的盐来制备。代表性盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等(参见，例如，Berge等人(1977)“Pharmaceutical Salts”，J.Pharm.Sci.66：1-19)。
主题化合物的药学上可接受的盐包括化合物的常规无毒盐或季铵盐，例如来自无毒有机或无机酸的盐。例如，此类常规无毒盐包括：来源于无机酸的那些盐，所述无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；以及由有机酸制备的盐，所述有机酸诸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯基乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸等。
在其他情况下，本发明的化合物可含有一个或多个酸性官能团，并且因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情况下，术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的相对无毒的无机和有机碱加成盐。这些盐同样可以在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或通过将游离酸形式的纯化化合物与合适的碱(例如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)，与氨，或与药学上可接受的有机伯、仲或叔胺单独反应来制备。代表性碱金属或碱土金属盐包括锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等(参见，例如，Berge等人，同上)。
润湿剂、乳化剂和润滑剂例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于所述组合物中。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
本发明制剂包括适于口服、经鼻、局部(包括经颊和舌下)、直肠、***和/或肠胃外施用的那些制剂。制剂可方便地以单位剂型存在并且可通过药学领域中熟知的任何方法来制备。可与载体材料组合以制备单剂量形式的活性成分的量会随被治疗的受试者特别是施用方式而变化。可与载体材料组合以制备单剂量形式的活性成分的量通常是产生疗效的所述化合物的量。通常，在100％中，这个量将在约0.1％至约99％、优选地约5％至约70％、最优选地约10％至约30％的活性成分的范围内。
在某些实施方案中，本发明的制剂包含选自由以下组成的组的赋形剂：环糊精、纤维素、脂质体、胶束形成剂(例如胆汁酸)和聚合物载体(例如聚酯和聚酸酐)；和本发明化合物。在某些实施方案中，前述制剂使本发明的化合物具有口服生物利用度。
制备这些制剂或组合物的方法包括以下步骤：使本发明的化合物与载体以及任选地一种或多种辅助成分结合的步骤。一般来说，通过将本发明的化合物与液体载体、或细分的固体载体、或两者均匀地并且密切地结合，然后必要时使产物成形来制备制剂。
适合用于口服施用的本发明制剂可为如下形式：胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂、粉剂、颗粒剂或为水性液体或非水性液体中的溶液剂或混悬剂、或为水包油或油包水乳剂、或为酏剂或糖浆剂、或为软锭剂(pastille)(使用惰性基质，例如明胶和甘油，或蔗糖和***胶)和/或为漱口剂等，均包含预定量的作为活性成份的本发明化合物。还可将本发明化合物以大丸剂、糖饵剂(electuary)或糊剂施用。
在用于口服施用的本发明的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉剂、颗粒剂、小丸剂等)中，将活性成分与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合，所述药学上可接受的赋形剂包括药学上可接受的载体，例如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或以下任一种：(1)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或***胶；(3)保温剂，如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)缓溶剂，如石蜡；(6)吸收促进剂，例如季铵化合物和表面活性剂，例如泊洛沙姆和月桂基硫酸钠；(7)润湿剂，例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯和非离子表面活性剂；(8)吸收剂，例如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠、硬脂酸锌、硬脂酸钠、硬脂酸及其混合物；(10)着色剂；和(11)控释剂，如交聚维酮或乙基纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可以包含缓冲剂。在使用此类赋形剂如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等的软和硬壳的明胶胶囊中还可采用类似类型的固体组合物作为填充剂。
片剂可通过压制或模制来制备，任选地含有一种或多种辅助成分。可使用粘合剂(例如明胶或羟丙基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羧甲基淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂制备压制片剂。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂湿润的粉末状化合物的混合物来制备。
可任选使本发明医药组合物的片剂和其他固体剂型例如糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂具有刻痕或用包衣材料和胶囊壳(例如制药领域熟知的肠溶衣和其他包衣)来制备。还可使用例如用于提供所需释放特征的不同浓度的羟丙基纤维素、其他聚合物基质、脂质体和/或微球将它们配制成用于提供其中所含活性成分的缓释或控释。它们可以被配制成用于快速释放，例如冷冻干燥。可通过例如过滤通过截留细菌的滤膜或通过在使用前即刻掺入为可溶解于无菌水或一些其他无菌注射介质的无菌固体组合物形式的灭菌剂将它们灭菌。这些组合物还可任选包含遮光剂并且还可为仅在或优先在胃肠道的某一部分任选以延迟方式释放所述活性成分的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。所述活性成分还可为微包封形式并且适当地包含一种或多种上述赋形剂。
用于口服施用本发明化合物的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除活性成分以外，液体剂型可含有通常在本领域中使用的惰性稀释剂，例如像水或其他溶剂、溶解剂和乳化剂诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油以及芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨醇酐的脂肪酸酯及其混合物。
除了稀释剂，所述口服组合物还可包含其他赋形剂例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。
除活性化合物之外，悬浮液还可包含悬浮剂，例如像乙氧基化异十八醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂以及黄蓍胶及其混合物。
用于直肠或***施用的本发明药物组合物的制剂可作为栓剂呈现，所述栓剂可通过将一种或多种本发明化合物与一种或多种适合的无刺激性赋形剂或载体(包括，例如，可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯)混合来制备，所述栓剂在室温下为固体，但在体温下为液体并且因此在直肠或***腔中将会熔化并且释放活性化合物。
适合用于***施用的本发明制剂还包括包含本领域已知的适合的此类载体的***栓剂、止血栓、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂。
用于局部或透皮施用本发明化合物的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏、糊剂、霜剂、洗液、凝胶剂、溶液、贴剂以及吸入剂。可在无菌条件下将所述活性化合物与药学上可接受的载体以及与可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
除本发明活性化合物之外，所述软膏、糊剂、霜剂和凝胶剂可包含赋形剂，如动物和蔬菜脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌或其混合物。
除本发明化合物之外，粉剂和喷雾剂可包含赋形剂如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂可额外地包含常规推进剂，如氯氟烃和挥发性未取代的烃(如丁烷和丙烷)。
透皮贴剂具有提供向身体受控递送本发明化合物的附加优点。此类剂型可通过将化合物溶解或分散于适当的介质中来制备。吸收促进剂也可用于增加化合物穿过皮肤的通量。这种通量的速率可通过提供速率控制膜或通过将化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制。
眼用制剂、眼用软膏、粉剂、溶液等也认为在本发明范围内。
适合用于肠胃外施用的本发明的药物组合物包含一种或多种本发明化合物以及一种或多种药学上可接受的无菌等渗水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液或在使用之前可被重构成无菌注射溶液或分散液的，所述无菌注射溶液或分散液可包含糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使所述制剂与预期接受者的血液等渗的溶质或者悬浮剂或增稠剂。
可用于本发明的医药组合物中的适合水性和非水性载剂的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其适合混合物、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。适当流动性可例如通过使用包衣材料(如卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持所需粒径和通过使用表面活性剂来维持。
这些组合物还可含有其他赋形剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。微生物对本发明化合物的作用的预防可通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保。还可合乎需要的是在组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等。另外，可通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射药物形式的延迟吸收。
在一些情况下，为了延长药物的作用，需要减缓皮下注射或肌肉内注射的药物的吸收。这可通过使用具有低水溶性的结晶或无定形材料的液态悬浮剂来实现。药物的吸收速率则取决于其溶解速率，溶解速率进而可取决于晶体大小和晶形。可替代地，通过将药物溶解或悬浮于油媒介物中来完成肠胃外施用的药物形式的延迟吸收。
可注射储库式形式通过在可生物降解聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成主题化合物的微胶囊化基质来形成。取决于药物与聚合物的比率和所采用的具体聚合物的性质，可控制药物释放的速率。其他可生物降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备药性持久的可注射制剂。
当将本发明的化合物作为药物施用于人和动物时，它们可以本身或作为药物组合物来给予，所述药物组合物包含例如0.1至99％(更优选地，10至30％)的活性成分以及药学上可接受的载体。
施用途径和剂量
本发明制剂可以口服、肠胃外、局部或直肠给予。当然，它们以适合每种施用途径的形式给予。例如，它们以片剂或胶囊形式，通过注射、吸入、洗眼剂、软膏、栓剂等施用，通过注射、输注或吸入施用；通过洗剂或软膏局部施用；和通过栓剂经直肠施用。口服施用是优选的。
如本文所用的短语“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”意指除了肠内施用和局部施用以外的、通常通过注射进行的施用模式，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内以及胸骨内注射和输注。
如本文所用的短语“全身施用”、“全身性地施用”、“外周施用”和“外周地施用”意指化合物、药物或其他材料除直接施用到中枢神经***中之外的施用，使得其进入到患者的***，并且因此经受代谢以及其他类似过程，例如皮下施用。
这些化合物可以通过任何合适的施用途径施用于人类和其他动物以进行治疗，包括口服、经鼻(例如通过喷雾剂)、经直肠、***内、肠胃外、脑池内和局部(例如通过粉剂、软膏剂或滴剂)包括颊和舌下。
不论选择何种施用途径，都可以通过本领域技术人员已知的常规方法将可以合适的水合形式使用的本发明的化合物和/或本发明的药物组合物配制成药学上可接受的剂型。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能有所变化，以便获得对于特定患者、组合物和施用模式有效达到期望治疗反应而对患者不具毒性的活性成分的量。
选择的剂量水平取决于多种因素，包括使用的本发明的特定化合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、使用的特定化合物的***或代谢速率、吸收的速率和程度、治疗的持续时间、与使用的特定化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、病状、综合的健康状态和先前的病史和在医学领域众所周知的类似因素。
具有本领域中的普通技艺的医师或兽医能够容易地判定和开具有效量的所需医药组合物。例如，医生或兽医可在水平低于达到期望治疗效果所需的水平下开始在药物组合物中采用的本发明化合物的剂量，并逐渐增加剂量直到达到所需效果。
一般来说，本发明化合物的适合日剂量将为化合物有效产生治疗效果的最低剂量的量。所述有效剂量将通常取决于上述因素。通常，当用于指示的止痛作用时，用于患者的本发明化合物的口服、静脉内、脑室内和皮下剂量的范围为每天每千克体重约0.0001至约100mg。
在某些实施方案中，每天、每隔一天、每隔两天、每三天、一周一次、一周两次、一周三次或每两周一次向受试者施用一定剂量的化合物或组合物。必要时，活性化合物的有效日剂量可任选以单位剂型以在全天内以适当间隔分开施用的两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量施用。在一些实施方案中，化合物或组合物的一次或多次剂量施用2天、3天、5天、7天、14天或21天。在某些实施方案中，化合物或组合物的剂量施用1个月、1.5个月、2个月、2.5个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间。
上述施用计划表仅出于说明目的提供，且不应视为限制性的。本领域普通技术人员将容易理解，所有剂量都在本发明的范围内。
接受这种治疗的患者为任何有需要的动物，包括灵长类动物，特别是人，以及其他哺乳动物，例如马、牛、猪和绵羊；以及一般的家禽和宠物。
用于本发明方法的化合物可以原样或与药学上可接受的载体混合施用，并且还可以与抗微生物剂如青霉素、头孢菌素、氨基糖苷和糖肽联合施用。因此，联合治疗包括以使首先施用化合物的治疗效果在随后化合物施用时不完全消失的方式依次、同时和分别施用活性化合物。
本发明的活性化合物向动物饲料中的添加优选地通过制备包含有效量的活性化合物的合适的饲料预混合物并将预混合物掺入到完整给粮中来完成。
替代地，可以将含有活性成分的中间浓缩物或饲料补充剂共混到饲料中。这些饲料预混合物和完整给粮的制备和施用方式在参考书中有描述(例如“Applied AnimalNutrition”，W.H.Freedman和CO.，San Francisco，U.S.A.，1969或“Livestock Feeds andFeeding”O and B books，Corvallis，Ore.，U.S.A.，1977)。
可使用微乳化技术来改善亲脂性(水不溶性)药剂的生物利用度。实例包括Trimetrine(Dordunoo，S.K.，等人，Drug Development and Industrial Pharmacy，17(12)，1685-1713，1991)和REV 5901(Sheen，P.C.，等人，J Pharm Sci 80(7)，712-714，1991)。尤其，微乳化通过优先将吸收引导至淋巴***而不是循环***，从而绕过肝脏来提供增强的生物利用度，并且防止化合物在肝胆循环中被破坏。
受控释放
本发明制剂的释放特性取决于包封材料、包封药物的浓度和释放调节剂的存在。可使用例如仅在低pH(如在胃中)或较高pH(如在肠中)释放的pH敏感包衣将释放操作为pH依赖性。肠溶衣可用于防止释放在通过胃之前发生。可使用包封在不同材料中的氰胺的多重包衣或混合物以获得在胃中初步释放，然后在肠道中稍后释放。释放也可以通过包括盐或成孔剂来操作，这些盐或成孔剂可以增加水吸收或药物通过从胶囊中扩散而释放。改变药物溶解度的赋形剂也可用于控制释放速率。还可以掺入增强基质降解或从基质释放的剂。它们可被添加到药物中，作为单独相(即作为颗粒)添加，或可以根据化合物而共溶解于聚合物相中。降解增强剂的类型包括：无机盐，例如硫酸铵和氯化铵；有机酸，例如柠檬酸、苯甲酸和抗坏血酸；无机碱，例如碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸锌和氢氧化锌；和有机碱，例如硫酸鱼精蛋白、精胺、胆碱、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺；以及表面活性剂，例如
和
将为基质增加微结构的成孔剂(即水溶性化合物，如无机盐和糖)作为颗粒加入。范围应在1％与30％之间(w/w聚合物)。
还可以通过改变颗粒在肠中的停留时间来控制摄取。这可以例如通过用粘膜粘附聚合物包衣粒子或选择粘膜粘附聚合物作为包封材料来实现。实例包括具有游离羧基的大多数聚合物，例如壳聚糖、纤维素和尤其聚丙烯酸酯(如本文所用，聚丙烯酸酯是指包括丙烯酸酯基团和修饰的丙烯酸酯基团例如氰基丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物)。
应了解并且预期，本领域技术人员可对本文中所公开的本发明原理作出改变，并且此类修改意图被包括在本发明范围内。以下实施例进一步说明本发明，但不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。本文中引用的所有参考文献以引用的方式整体并入本文。
实施例
实施例1
所有溶剂和试剂都可以商购获得并按原样使用。在Bruker仪器(300MHz或400MHz)上记录在所述氚代溶剂中的1H NMR谱图。化学位移以ppm给出，并且耦合常数以赫兹给出。通过快速色谱法使用220-400目硅胶或通过反相HPLC使用CH3CN/水作为溶剂纯化所有最终化合物。在硅胶60F-254(0.25nm厚度)板上进行薄层色谱法。用紫外光和/或在乙醇中的10％磷钼酸完成可视化。在Waters LCT或Applied Biosystems API 3000质谱仪上获得标称(低分辨率)质谱。在Waters LCT或Agilent TOF质谱仪上获得高分辨率质谱(HRMS)。所有其他LC-MS实验均在与Agilent单四极杆质谱仪联用的Agilent 1100 HPLC上进行。通过LC-MS在230nM和254nM波长下确定化合物纯度。此处报告的所有最终化合物的纯度均≥95％。
一般程序A
EDCI偶联：将具有通式结构1的化合物(1当量)、EDCI(1当量)、HOBt(0.2当量)和DIEA(2当量)溶解于DMF中，在25℃下搅拌5分钟。然后向混合物中加入胺(1当量)。将混合物在25℃下搅拌16小时。将混合物倒入水中并且用EtOAc萃取。将合并的有机相用盐水洗涤、经Na2SO4干燥、过滤并在减压下浓缩以得到残余物。通过柱色谱法纯化残余物以获得具有通式结构2的化合物。
HATU偶联：将具有通式结构1的化合物(1当量)、HATU(1.25当量)和DIPEA(1.5当量)溶解于DMF中，在23℃下搅拌15分钟。将1H-吲唑-5-胺(1当量)引入反应混合物中，并将溶液在23℃下再继续搅拌16小时。将反应混合物用水稀释并且用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤、经Na2SO4干燥、过滤并在减压下浓缩以得到粗物质，将其在硅胶上纯化以得到所需的具有通式结构2的化合物。
Boc脱保护：将具有通式结构2的化合物溶解于DCM中，并将在二噁烷中的4N HCl引入溶液中。将反应混合物在23℃下搅拌1小时。将反应混合物在减压下浓缩以得到粗反应混合物，将其通过反相制备型HPLC进行纯化以得到所需的具有通式结构3的化合物。
苄基去除：将具有通式结构2的化合物(1当量)和浓HCl(1.2当量)溶解于MeOH中并添加10％无水Pd/C。将反应混合物在H2的气氛(1atm)下在50℃下搅拌5小时。将反应混合物过滤并将滤液在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过反相制备型HPLC进行纯化以得到所需的具有通式结构3的化合物。
一般程序B
将具有通式结构4的化合物(1当量)溶解于CCl4中，并在室温下加入AIBN(0.1当量)，然后加入NBS(1.2当量)。将反应温度升至60℃，并继续搅拌16小时。过滤出反应混合物，并在减压下除去溶剂。粗物质5不经过另外的纯化即用于下一步骤。
将在THF中的具有通式结构5的化合物(1当量)和烷基胺(2当量)在70℃下搅拌16小时。将反应混合物在减压下浓缩，并通过硅胶色谱法纯化物质以得到具有通式结构6的化合物。
将NaOH(2当量)引入含有溶解于MeOH/H2O混合物中的具有通式结构6的化合物(1当量)的反应容器中。将反应物在20℃下搅拌16小时。减压下除去溶剂。将粗残余物溶解于水(10mL)中，并小心地用6N HCl中和直至pH＝8。过滤悬浮液，并且收集固体并干燥，以得到具有通式结构7的化合物。
将具有通式结构7的化合物(1当量)、HATU(1.25当量)和DIPEA(2当量)溶解于DMF中，并在20℃下搅拌15分钟。将1H-吲唑-5-胺(1当量)引入反应混合物中，并在20℃下搅拌15.8小时。用水稀释反应物，并用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水(15mL)洗涤、经Na2SO4干燥、过滤并在减压下浓缩。通过反相制备型HPLC纯化粗反应混合物，以得到具有通式结构8的化合物。
实施例2
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺
按照一般方案A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺(77％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.09(brs，1H)，8.20(s，1H)，7.99(s，2H)，7.62(d，J＝8.8Hz，2H)，7.53(d，J＝8.4Hz，2H)，7.27(t，J＝8.0Hz，1H)，7.08-7.04(m，2H)，6.86(dd，J＝8.0，2.4Hz，1H)，4.23(s，1H)，3.76(s，3H)，2.30(s，3H)。MS(ES+)m/e 337.0(M+H)+。
实施例3
(R)-N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺
按照一般方案A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺(77％)。通过SFC(Chiralpak AD-H柱)分离对映异构体。流动相：在CO2中的具有0.1％NH4OH的55％EtOH，流速70g/min。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.09(brs，1H)，8.20(s，1H)，7.99(s，2H)，7.62(d，J＝8.8Hz，2H)，7.53(d，J＝8.4Hz，2H)，7.27(t，J＝8.0Hz，1H)，7.08-7.04(m，2H)，6.86(dd，J＝8.0，2.4Hz，1H)，4.23(s，1H)，3.76(s，3H)，2.30(s，3H)。MS(ES+)m/e 337.0(M+H)+。[α]D＝+102.3(c＝0.5，CH3OH，25℃)。
实施例4
(S)-N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺
按照一般方案A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺(77％)。通过SFC(Chiralpak AD-H柱)分离对映异构体。流动相：在CO2中的具有0.1％NH4OH的55％EtOH，流速70g/min。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.09(brs，1H)，8.20(s，1H)，7.99(s，2H)，7.62(d，J＝8.8Hz，2H)，7.53(d，J＝8.4Hz，2H)，7.27(t，J＝8.0Hz，1H)，7.08-7.04(m，2H)，6.86(dd，J＝8.0，2.4Hz，1H)，4.23(s，1H)，3.76(s，3H)，2.30(s，3H)。MS(ES+)m/e 337.0(M+H)+。[α]D＝-97.2(c＝0.5，CH3OH，25℃)。
实施例5
2-(4-氯苯基)-2-(甲氨基)-N-(4-(吡啶-4-基)苯基)乙酰胺
按照一般方案B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈黄色固体的2-(4-氯苯基)-2-(甲氨基)-N-(4-(吡啶-4-基)苯基)乙酰胺(24％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.06(s，1H)，9.62(brs，2H)，8.78(d，J＝6.4Hz，2H)，8.02(d，J＝7.2Hz，2H)，7.96(d，J＝8.8Hz，2H)，7.77(d，J＝8.8Hz，2H)，7.62(s，4H)，5.16(s，1H)，2.55(s，3H)。MS(ES+)m/e 352.0(M+H)+。
实施例6
2-(4-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)-N-(4-(吡啶-4-基)苯基)乙酰胺
按照一般方案B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈灰白色固体的2-(4-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)-N-(4-(吡啶-4-基)苯基)乙酰胺(16％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.93(s，1H)，9.66-9.27(m，2H)，8.77(d，J＝6.4Hz，2H)，8.02(d，J＝6.4Hz，2H)，7.96(d，J＝8.7Hz，2H)，7.78(d，J＝8.7Hz，2H)，7.52(d，J＝8.8Hz，2H)，7.08(d，J＝8.8Hz，2H)，5.03(s，1H)，3.79(s，3H)，2.67(s，3H)。MS(ES+)m/e 348.0(M+H)+。
实施例7
2-(甲氨基)-N-(4-(吡啶-4-基)苯基)-2-(对甲苯基)乙酰胺
按照一般方案B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的2-(甲氨基)-N-(4-(吡啶-4-基)苯基)-2-(对甲苯基)乙酰胺(28％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.25(brs，1H)，8.59(dd，J＝4.4，1.6Hz，2H)，8.32(s，1H)，7.81-7.76(m，4H)，7.68(dd，J＝4.4，1.6Hz，2H)，7.37(d，J＝8.0Hz，2H)，7.16(d，J＝8.0Hz，2H)，4.21(s，1H)，2.29(s，3H)，2.28(s，3H)。MS(ES+)m/e 332.1(M+H)+。
实施例8
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(2-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺
按照一般方案B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(2-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺(32％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.98(brs，1H)，8.21(s，1H)，7.99(s，2H)，7.64(d，J＝8.4Hz，2H)，7.54(d，J＝8.4Hz，2H)，7.38(d，J＝7.6Hz，1H)，7.30(t，J＝8.0Hz，1H)，7.03(d，J＝8.4Hz，1H)，6.96(t，J＝7.2Hz，1H)，4.58(s，1H)，3.82(s，3H)，2.33(s，3H)。MS(ES+)m/e 337.1(M+H)+。
实施例9
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(4-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺
按照一般方案B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(2-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺(32％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.60(s，1H)，9.46-9.30(m，2H)，8.01(s，2H)，7.59-7.50(m，6H)，7.07(d，J＝8.8Hz，2H)，4.95-4.94(m，1H)，3.79(s，3H)，2.54(s，3H)。MS(ES+)m/e 337.1(M+H)+。
实施例10
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(乙氨基)-2-(4-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(乙氨基)-2-(4-甲氧基苯基)乙酰胺(16％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.55(s，1H)，7.93(s，2H)，7.59-7.51(m，6H)，7.04(d，J＝8.8Hz，2H)，4.77(s，1H)，3.83(s，3H)，2.98-2.83(m，2H)，1.30(t，J＝7.2Hz，3H)。MS(ES+)m/e 351.1(M+H)+。
实施例11
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(乙氨基)-2-(对甲苯基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(乙氨基)-2-(对甲苯基)乙酰胺(8％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.19(s，1H)，8.18(s，1H)，7.99(s，2H)，7.59(d，J＝8.0Hz，2H)，7.53(d，J＝8.0Hz，2H)，7.38(d，J＝7.6Hz，2H)，7.17(d，J＝8.0Hz，2H)，4.44(s，1H)，2.62-2.54(m，2H)，2.28(s，3H)，1.09(t，J＝7.2Hz，3H)。MS(ES+)m/e 335.1(M+H)+。
实施例12
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(乙氨基)-2-(4-氟苯基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(乙氨基)-2-(对甲苯基)乙酰胺(20％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.76(s，1H)，9.53-9.47(m，2H)，8.01(s，2H)，7.69-7.60(m，2H)，7.59-7.53(m，4H)，7.37(dd，J＝8.8，8.8Hz，2H)，5.14(s，1H)，2.96-2.83(m，2H)，1.22(t，J＝7.2Hz，3H)。MS(ES+)m/e 339.0(M+H)+。
实施例13
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(乙氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈粉红色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(乙氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(20％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.09(s，1H)，8.26(s，1H)，7.99(s，2H)，7.61(d，J＝8.4Hz，2H)，7.53(d，J＝8.4Hz，2H)，7.26(t，J＝8.0Hz，1H)，7.08-7.04(m，2H)，6.86-6.84(m，1H)，4.33(s，1H)，3.76(s，3H)，2.56-2.53(m，2H)，1.08(t，J＝7.2Hz，3H)。MS(ES+)m/e 351.1(M+H)+。
实施例14
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(甲氨基)-2-(间甲苯基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(甲氨基)-2-(间甲苯基)乙酰胺(14％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.05(s，1H)，8.20(s，1H)，7.99(s，2H)，7.63-7.61(m，2H)，7.54-7.52(m，2H)，7.29-7.09(m，3H)，7.10(d，J＝6.8Hz，1H)，4.18(s，1H)，2.31(s，3H)，2.28(s，3H)。MS(ES+)m/e 321.1(M+H)+。
实施例15
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(乙氨基)-2-(3-氟苯基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(乙氨基)-2-(3-氟苯基)乙酰胺(20％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.14(s，1H)，8.17(s，1H)，8.00(s，2H)，7.61-7.59(m，2H)，7.55-7.53(m，2H)，7.43-7.31(m，3H)，7.14-7.09(m，1H)，4.40(s，1H)，2.56-2.53(m，2H)，1.07(t，J＝7.2Hz，3H)。MS(ES+)m/e 339.1(M+H)+。
实施例16
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-氯苯基)-2-(乙氨基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-氯苯基)-2-(乙氨基)乙酰胺(6％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.14(s，1H)，8.19(s，1H)，8.00(s，2H)，7.62-7.53(m，5H)，7.45-7.34(m，3H)，4.39(s，1H)，2.53(m，2H)，1.07(t，J＝7.2Hz，3H)。MS(ES+)m/e 355.1(M+H)+。
实施例17
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(4-氯苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(4-氯苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺(8％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.11(s，1H)，8.21(s，1H)，7.99(s，2H)，7.62-7.60(m，2H)，7.54-7.49(m，4H)，7.43-7.41(m，2H)，4.25(s，1H)，2.28(s，3H)。MS(ES+)m/e 341.0(M+H)+。
实施例18
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-氟苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-氟苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺(23％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.14(s，1H)，8.18(s，1H)，7.99(s，2H)，7.63-7.60(m，2H)，7.55-7.53(m，2H)，7.43-7.31(m，3H)，7.15-7.10(m，1H)，4.30(s，1H)，2.29(s，3H)。MS(ES+)m/e 325.1(M+H)+。
实施例19
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(4-氟苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈灰白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(4-氟苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺(25％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.11(s，1H)，8.20(s，2H)，7.99(s，2H)，7.62-7.50(m，6H)，7.21-7.17(m，2H)，4.27(s，1H)，2.29(s，3H)。MS(ES+)m/e 325.1(M+H)+。
实施例20
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-氯苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈灰白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-氯苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺(3％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.13(s，1H)，8.33(s，2H)，7.99(s，2H)，7.63-7.61(m，2H)，7.56-7.53(m，3H)，7.45-7.34(m，3H)，4.26(s，1H)，2.28(s，3H)。MS(ES+)m/e 341.0(M+H)+。
实施例21
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(甲氨基)-2-(对甲苯基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈黄色油状物的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(甲氨基)-2-(对-甲苯基)乙酰胺(12％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.88(s，1H)，10.01(s，1H)，8.11(s，1H)，7.86(s，1H)，7.63-7.61(m，2H)，7.54-7.52(m，2H)，7.35(d，J＝8.0Hz，2H)，7.15(d，J＝8.0Hz，2H)，4.16(s，1H)，2.28(s，6H)。MS(ES+)m/e 321.1(M+H)+。
实施例22
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(4-氯苯基)-2-(乙氨基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(4-氯苯基)-2-(乙氨基)乙酰胺(6％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.13(s，1H)，8.23(s，1H)，7.99(s，2H)，7.61-7.50(m，6H)，7.43-7.41(m，2H)，4.38(s，1H)，2.57-2.54(m，2H)，1.07(t，J＝7.2Hz，3H)。MS(ES+)m/e 355.1(M+H)+。
实施例23
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-氟-4-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-氟-4-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺(5％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.86(s，1H)，10.03(s，1H)，7.99(s，2H)，7.60(d，J＝8.8Hz，2H)，7.52(d，J＝8.8Hz，2H)，7.32(d，J＝12.8Hz，1H)，7.23(d，J＝8.8Hz，1H)，7.12(t，J＝8.8Hz，1H)，4.15(s，1H)，3.80(s，3H)，2.67(s，1H)，2.25(s，3H)。MS(ES+)m/e 353.2(M+H)+。
实施例24
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-(二氟甲氧基)苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈灰白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-(二氟甲氧基)苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺(18％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.12(s，1H)，8.16(s，1H)，7.99(s，2H)，7.62-7.60(m，2H)，7.55-7.53(m，2H)，7.44-7.05(m，5H)，4.28(s，1H)，2.29(s，3H)。MS(ES+)m/e 373.3(M+H)+。
实施例25
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-甲氧基乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-(二氟甲氧基)苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺(12％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.18(s，1H)，8.16(s，1H)，7.99(s，2H)，7.61-7.53(m，4H)，7.27(t，J＝4.6Hz，1H)，7.06-7.03(m，2H)，6.87-6.84(m，1H)，4.40(s，1H)，3.75(s，3H)，3.44(t，J＝5.2Hz，2H)，3.24(s，3H)，2.67(t，J＝5.2Hz，2H)。MS(ES+)m/e 381.3(M+H)+。
实施例26
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-((2-(甲氨基)乙基)氨基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-((2-(甲氨基)乙基)氨基)乙酰胺(29％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.49(s，1H)，7.91(s，2H)，7.58-7.52(m，4H)，7.31(t，J＝8.0Hz，1H)，7.10-7.08(m，2H)，6.92-6.89(m，1H)，4.43(s，1H)，3.81(s，3H)，3.14-3.04(m，2H)，2.92-2.81(m，2H)，2.71(s，3H)。MS(ES+)m/e 380.3(M+H)+。
实施例27
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(甲氨基)-2-(2-甲基苯并[d]噻唑-6-基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(甲氨基)-2-(2-甲基苯并[d]噻唑-6-基)乙酰胺(6％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.34(s，1H)，8.16(d，J＝6.4Hz，2H)，8.00-7.94(m，3H)，7.63-7.54(m，5H)，4.67(s，1H)，2.81(s，3H)，2.40(s，3H)。MS(ES+)m/e 378.3(M+H)+。
实施例28
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-(二甲氨基)苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈黄色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-(二甲氨基)苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺(17％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.11(s，1H)，8.19(s，1H)，7.98(s，2H)，7.62-7.51(m，4H)，7.15(t，J＝8.0Hz，1H)，6.87(s，1H)，6.76(d，J＝7.2Hz，1H)，6.66-6.63(m，1H)，4.25(s，1H)，2.89(s，6H)，2.32(s，3H)。MS(ES+)m/e 350.3(M+H)+。
实施例29
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(2-甲氧基吡啶-4-基)-2-(甲氨基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(2-甲氧基吡啶-4-基)-2-(甲氨基)乙酰胺(2％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.12(s，1H)，8.15(s，1H)，8.12(d，J＝5.6Hz，1H)，7.98(s，2H)，7.61-7.52(m，4H)，7.07(d，J＝4.4Hz，1H)，6.91(s，1H)，4.24(s，1H)，3.83(s，3H)，2.28(s，3H)。MS(ES+)m/e 338.2(M+H)+。
实施例30
3-(2-((4-(1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)-1-(甲氨基)-2-氧乙基)苯甲酸甲酯
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的3-(2-((4-(1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)-1-(甲氨基)-2-氧乙基)苯甲酸甲酯(15％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.71(s，1H)，9.65-9.51(m，2H)，8.25(s，1H)，8.07(d，J＝8.0Hz，1H)，8.00(s，2H)，7.86(d，J＝8.0Hz，1H)，7.69(t，J＝7.6Hz，1H)，7.59-7.52(m，4H)，5.15(s，1H)，3.89(s，3H)，2.54(s，3H).MS(ES+)m/e 365.3(M+H)+。
实施例31
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(4-(二甲氨基)苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的甲基N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(4-(二甲氨基)苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺(4％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.90(s，2H)，7.57-7.50(m，4H)，7.30(d，J＝8.8Hz，2H)，6.76(d，J＝8.8Hz，2H)，4.15(s，1H)，2.91(s，6H)，2.37(s，3H)。MS(ES+)m/e 350.3(M+H)+。
实施例32
3-(2-((4-(1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)-1-(甲氨基)-2-氧乙基)苯甲酸
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的3-(2-((4-(1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)-1-(甲氨基)-2-氧乙基)苯甲酸(15％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.15(s，1H)，8.23(s，1H)，8.07(s，1H)，7.98(s，2H)，7.86(d，J＝7.6Hz，1H)，7.70(d，J＝8.4Hz，1H)，7.61(d，J＝8.8Hz，2H)，7.53(d，J＝8.4Hz，2H)，7.47(t，J＝7.6Hz，1H)，4.33(s，1H)，2.29(s，3H)。MS(ES+)m/e 351.3(M+H)+。
实施例33
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲基-1H-吲唑-6-基)-2-(甲氨基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲基-1H-吲唑-6-基)-2-(甲氨基)乙酰胺(8％)。1HNMR(400MHz，CD3OD)δ7.93(s，2H)，7.89(d，J＝8.4Hz，1H)，7.78(s，1H)，7.58-7.54(m，4H)，7.33(d，J＝8.8Hz，1H)，5.12(s，1H)，2.69(s，3H)，2.57(s，3H)。MS(ES+)m/e 361.3(M+H)+。
实施例34
4-(2-((4-(1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)-1-(甲氨基)-2-氧乙基)苯甲酸甲酯
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈灰白色固体的4-(2-((4-(1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)-1-(甲氨基)-2-氧乙基)苯甲酸甲酯(11％)。1HNMR(400MHz，CD3OD)δ8.17(dd，J＝6.8，2.0Hz，2H)，7.92(s，2H)，7.74(d，J＝8.4Hz，2H)，7.58-7.53(m，4H)，5.07(s，1H)，3.92(s，3H)，2.70(s，3H)。MS(ES+)m/e 365.1(M+H)+。
实施例35
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)-2-(甲氨基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈黄色油状物的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)-2-(甲氨基)乙酰胺(4％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.02(d，J＝1.2Hz，1H)，7.92(s，2H)，7.86(d，J＝8.4Hz，1H)，7.75(dd，J＝8.0，1.6Hz，1H)，7.59-7.52(m，4H)，5.21(s，1H)，2.84(s，3H)，2.71(s，3H)。MS(ES+)m/e 361.2(M+H)+。
实施例36
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-((3-甲氧基丙基)氨基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈灰白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-((3-甲氧基丙基)氨基)乙酰胺(21％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.55(s，2H)，7.72-7.65(m，4H)，7.44(t，J＝7.6Hz，1H)，7.26-7.25(m，2H)，7.09(dd，J＝8.0，2.0Hz，1H)，5.15(s，1H)，3.85(s，3H)，3.51(t，J＝5.6Hz，2H)，3.35(s，3H)，3.30-3.08(m，2H)，2.03-1.98(m，2H)。MS(ES+)m/e 395.3(M+H)+。
实施例37
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-乙氧基乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-乙氧基乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(8％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.89(s，1H)，10.09(s，1H)，8.12(s，1H)，7.87(s，1H)，7.60(d，J＝8.4Hz，2H)，7.54(d，J＝8.8Hz，2H)，7.27(t，J＝8.0Hz，1H)，7.04-7.02(m，2H)，6.85(dd，J＝8.0，2.0Hz，1H)，4.33(s，1H)，3.75(s，3H)，3.48-3.41(m，4H)，2.66-2.63(m，2H)，1.11(t，J＝7.2Hz，3H)。MS(ES+)m/e 395.3(M+H)+。
实施例38
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((3-(二甲氨基)丙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈灰白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((3-(二甲氨基)丙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(4％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.93(s，2H)，7.60-7.53(m，4H)，7.30(t，J＝8.0Hz，1H)，7.09-7.08(m，2H)，6.90(dd，J＝8.4，1.6Hz，1H)，4.34(s，1H)，3.82(s，3H)，2.68-2.61(m，2H)，2.48-2.42(m，2H)，2.30(s，6H)，1.83-1.74(m，2H)。MS(ES+)m/e 408.3(M+H)+。
实施例39
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-(二甲氨基)-2-氧乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-(二甲氨基)-2-氧乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(7％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.87(brs，1H)，10.18(s，1H)，8.16(s，1H)，7.99(s，2H)，7.62(d，J＝8.8Hz，2H)，7.53(d，J＝8.4Hz，2H)，7.28(t，J＝8.0Hz，1H)，7.06-7.03(m，2H)，6.87(dd，J＝8.0，2.4Hz，1H)，4.38(s，1H)，3.75(s，3H)，3.38(m，2H)，2.87(s，3H)，2.84(s，3H)。MS(ES+)m/e 408.3(M+H)+。
实施例40
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-异丙氧基乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-异丙氧基乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(28％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.03(s，2H)，7.61-7.55(m，4H)，7.44(t，J＝8.0Hz，1H)，7.23-7.20(m，2H)，7.10-7.07(m，1H)，5.13(s，1H)，3.85(s，3H)，3.74-3.70(m，3H)，3.21-3.13(m，2H)，1.22(dd，J＝6.4，3.2Hz，6H)。MS(ES+)m/e 409.3(M+H)+。
实施例41
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-氨基-2-氧乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-氨基-2-氧乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(6％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.13(s，1H)，8.22(s，1H)，7.99(s，2H)，7.62-7.53(m，4H)，7.45(s，1H)，7.28(t，J＝8.0Hz，1H)，7.12-7.01(m，3H)，6.87(dd，J＝8.0，2.0Hz，1H)，4.34(s，1H)，3.76(s，3H)，3.04(s，2H)。MS(ES+)m/e 380.2(M+H)+。
实施例42
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-((3-(甲氨基)-丙基)氨基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-氨基-2-氧乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(6％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.81(s，1H)，9.70(s，2H)，8.65(s，2H)，8.00(s，2H)，7.56(s，4H)，7.43(t，J＝8.0Hz，1H)，7.22-7.19(m，2H)，7.06(dd，J＝8.0，1.6Hz，1H)，5.11(s，1H)，3.79(s，3H)，2.96-2.90(m，4H)，2.54(s，3H)，2.03-1.96(m，2H)。MS(ES+)m/e 394.3(M+H)+。
实施例43
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((1-甲氧基-2-甲基丙-2-基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((1-甲氧基-2-甲基丙-2-基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(17％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.60(s，1H)，9.23-9.19(m，2H)，7.99(s，2H)，7.58-7.52(m，4H)，7.41(t，J＝8.0Hz，1H)，7.21-7.19(m，2H)，7.04(dd，J＝8.8，2.8Hz，1H)，5.22(s，1H)，3.79(s，3H)，3.42-3.35(m，2H)，3.17(s，3H)，1.33(s，3H)，1.31(s，3H)。MS(ES+)m/e 409.3(M+H)+。
实施例44
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-((2-(甲氨基)-2-氧乙基)氨基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈黄色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-((2-(甲氨基)-2-氧乙基)氨基)乙酰胺(3％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.95(s，2H)，7.59-7.53(m，4H)，7.44(t，J＝8.4Hz，1H)，7.18-7.17(m，2H)，7.16-7.10(m，1H)，5.12(s，1H)，3.84(s，3H)，3.68(s，2H)，2.79(s，3H)。MS(ES+)m/e 394.3(M+H)+。
实施例45
2-(((1H-吡唑-4-基)甲基)氨基)-N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的2-(((1H-吡唑-4-基)甲基)氨基)-N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(1％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.58(s，1H)，9.77(s，2H)，7.99(s，2H)，7.70(s，2H)，7.57(d，J＝8.8Hz，2H)，7.51(d，J＝8.8Hz，2H)，7.43(t，J＝8.0Hz，1H)，7.20-7.17(m，2H)，7.06(dd，J＝8.0，2.0Hz，1H)，4.91(s，1H)，4.01(s，2H)，3.79(s，3H)。MS(ES+)m/e 403.3(M+H)+。
实施例46
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(乙基(2-甲氧基乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(乙基(2-甲氧基乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(19％)。1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ11.21(s，1H)，8.01(s，2H)，7.73(d，J＝8.8Hz，2H)，7.60(d，J＝8.8Hz，2H)，7.47-7.43(m，2H)，7.37(d，J＝8.0Hz，1H)，7.11-7.09(m，1H)，6.03-6.01(m，1H)，3.93-3.80(m，5H)，3.74-3.53(m，3H)，3.42(m，4H)，1.44(t，J＝7.2Hz，3H)。MS(ES+)m/e 409.3(M+H)+。
实施例47
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-甲氧基乙基)(甲基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈灰白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-甲氧基乙基)(甲基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(24％)。1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ10.85(s，1H)，8.01(s，2H)，7.71(d，J＝8.8Hz，2H)，7.61(d，J＝8.4Hz，2H)，7.46(t，J＝8.0Hz，1H)，7.41(s，1H)，7.33(d，J＝7.6Hz，1H)，7.11(dd，J＝8.0，2Hz，1H)，5.80(d，J＝4.4Hz，1H)，3.95-3.92(m，2H)，3.87(s，3H)，3.72-3.60(m，2H)，3.42(s，3H)，3.06(s，3H)。MS(ES+)m/e 395.3(M+H)+。
实施例48
N-(2-(2-(二甲氨基)乙氧基)-5-氟-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-甲氧基乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈灰白色固体的N-(2-(2-(二甲氨基)乙氧基)-5-氟-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-甲氧基乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(13％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.94(s，1H)，9.92(s，1H)，9.66(s，2H)，8.07(s，2H)，7.87(d，J＝12.4Hz，1H)，7.46-7.39(m，2H)，7.23-7.19(m，2H)，7.07(dd，J＝8.0，6.0Hz，1H)，5.36(s，1H)，4.44-4.35(m，2H)，3.80(s，3H)，3.66-3.64(m，2H)，3.63-3.49(m，2H)，3.31(s，3H)，3.07-3.00(m，2H)，2.76(s，6H)。MS(ES+)m/e 486.3(M+H)+。
实施例49
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-甲氧基乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)-N-甲基乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈黄色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-甲氧基乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)-N-甲基乙酰胺(15％)。1H NMR(400MHz，D2O)δ8.07(s，2H)，7.48(m，2H)，7.27-7.23(m，2H)，6.95(m，2H)，6.68(d，J＝6.8Hz，1H)，6.28(s，1H)，5.02(s，1H)，3.61(m，2H)，3.52(s，3H)，3.30(s，3H)，3.24(s，3H)，3.15-3.11(m，1H)，3.02-2.97(m，1H)。MS(ES+)m/e 395.3(M+H)+。
实施例50
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-((2-吗啉代乙基)氨基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-((2-吗啉代乙基)氨基)乙酰胺(38％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.72(s，1H)，8.00(s，2H)，7.59-7.57(m，4H)，7.42(t，J＝7.6Hz，1H)，7.21-7.17(m，2H)，7.07-7.04(m，1H)，5.09(s，1H)，3.79(m，7H)，3.31-3.12(m，8H)。MS(ES+)m/e 436.3(M+H)+。
实施例51
N-(2-(2-(二甲氨基)乙氧基)-5-氟-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-甲氧基乙基)(甲基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈黄色固体的N-(2-(2-(二甲氨基)乙氧基)-5-氟-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-甲氧基乙基)(甲基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(31％)。1H NMR(400MHz，D2O)δ8.04(s，2H)，7.56-7.48(m，2H)，7.19-7.14(m，4H)，5.27(s，1H)，4.23-4.21(m，1H)，4.11-4.10(m，1H)，3.80(m，5H)，3.50(m，2H)，3.33(m，4H)，3.19-3.16(m，1H)，2.82-2.62(m，9H)。MS(ES+)m/e 500.3(M+H)+。
实施例52
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)乙酰胺(35％)。1H NMR(400MHz，DMOS-d6)δ10.64(s，1H)，8.00(s，2H)，7.57(m，4H)，7.41(t，J＝8.0，1H)，7.19-7.16(m，2H)，7.05-7.03(m，1H)，5.01(s，1H)，3.79(s，3H)，3.44-3.27(m，8H)，1.94(m，4H)。MS(ES+)m/e 420.3(M+H)+。
实施例53
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((1-(甲氧基甲基)环丙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈灰白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((1-(甲氧基甲基)环丙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(27％)。1H NMR(400MHz，DMOS-d6)δ10.65(brs，1H)，9.58(brs，1H)，8.00(s，2H)，7.62-7.52(m，4H)，7.42(t，J＝7.6Hz，1H)，7.24-7.15(m，2H)，7.08-7.02(m，1H)，5.25(s，1H)，3.80(s，3H)，3.64(d，J＝11.6Hz，1H)，3.37(d，J＝11.6Hz，1H)，3.23(s，3H)，1.23-2.21(m，1H)，1.02-0.91(m，1H)，0.89-0.76(m，2H)。MS(ES+)m/e 407.3(M+H)+。
实施例54
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-((2-(2，2，2-三氟乙氧基)乙基)氨基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈灰白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-((2-(2，2，2-三氟乙氧基)乙基)氨基)乙酰胺(6％)。1H NMR(400MHz，DMOS-d6)δ12.86(s，1H)，10.06(s，1H)，8.11(s，1H)，7.86(s，1H)，7.60-7.52(m，4H)，7.26(t，J＝7.9Hz，1H)，7.05-7.02(m，2H)，6.85(dd，J＝8.2，1.8Hz，1H)，4.34(d，J＝7.6Hz，1H)，4.10-4.03(m，2H)，3.75(s，3H)，3.69(t，J＝5.6Hz，2H)，2.68(s，3H)。MS(ES+)m/e 449.2(M+H)+。
实施例55
N-(3-氟-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-甲氧基乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈黄色固体的N-(3-氟-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-甲氧基乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(21％)。1H NMR(400MHz，DMOS-d6)δ10.97(s，1H)，9.64(s，2H)，8.00(d，J＝1.6Hz，2H)，7.70(t，J＝8.0Hz，1H)，7.62(dd，J＝13.2，2.0Hz，1H)，7.41(t，J＝8.0Hz，1H)，7.32(dd，J＝8.4，2.0Hz，1H)，7.24-7.19(m，2H)，7.06-7.03(m，1H)，5.14(s，1H)，3.79(s，3H)，3.64-3.57(m，2H)，3.29(s，3H)，3.09-3.00(m，2H)。MS(ES+)m/e 399.2(M+H)+。
实施例56
N-(3-甲氧基-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-甲氧基乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈黄色固体的N-(3-甲氧基-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-甲氧基乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(17％)。1H NMR(400MHz，DMOS-d6)δ10.79(s，1H)，9.62(s，2H)，8.00(s，2H)，7.58(d，J＝8.4Hz，1H)，7.41(t，J＝8.0Hz，1H)，7.32(d，J＝1.6Hz，1H)，7.26-7.21(m，3H)，7.06-7.02(m，1H)，5.13(s，1H)，3.84(s，3H)，3.79(s，3H)，3.64-3.59(m，2H)，3.30(s，3H)，3.09-3.00(m，2H)。MS(ES+)m/e 411.3(M+H)+。
实施例57
N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(41％)。1H NMR(400MHz，DMOS-d6)δ10.18(s，1H)，8.25(s，1H)，7.99(s，2H)，7.60(d，J＝8.4Hz，2H)，7.53(d，J＝8.8Hz，2H)，7.27(t，J＝8.0Hz，1H)，7.05-7.02(m，2H)，6.86(dd，J＝8.4，2.4Hz，1H)，4.34(s，1H)，3.75(s，3H)，2.65-2.51(m，4H)，2.30(s，6H)。MS(ES+)m/e394.3(M+H)+。
实施例58
(R)-N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-甲氧基乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的(R)-N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-甲氧基乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(12％)。通过SFC(DAICEL CHIRALPAK AS柱)分离对映异构体。流动相：在CO2中的具有0.1％NH4OH的40％EtOH，流速70g/min，得到具有99％对映体纯度的所需化合物。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.18(s，1H)，8.16(s，1H)，7.99(s，2H)，7.61-7.53(m，4H)，7.27(t，J＝4.6Hz，1H)，7.06-7.03(m，2H)，6.87-6.84(m，1H)，4.40(s，1H)，3.75(s，3H)，3.44(t，J＝5.2Hz，2H)，3.24(s，3H)，2.67(t，J＝5.2Hz，2H)。MS(ES+)m/e 381.3(M+H)+。[α]25℃ D＝+114(c＝0.2，在MeOH中)。
实施例59
(S)-N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-甲氧基乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的(S)-N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-甲氧基乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(12％)。通过SFC(DAICEL CHIRALPAK AS柱)分离对映异构体。流动相：在CO2中的具有0.1％NH4OH的40％EtOH，流速70g/min，得到具有99％对映体纯度的所需化合物。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.18(s，1H)，8.16(s，1H)，7.99(s，2H)，7.61-7.53(m，4H)，7.27(t，J＝4.6Hz，1H)，7.06-7.03(m，2H)，6.87-6.84(m，1H)，4.40(s，1H)，3.75(s，3H)，3.44(t，J＝5.2Hz，2H)，3.24(s，3H)，2.67(t，J＝5.2Hz，2H)。MS(ES+)m/e 381.3(M+H)+。(S)-N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-甲氧基乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺。[α]25℃ D＝-103.5(c＝0.2，在MeOH中)。
实施例60
(S)-N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的(S)-N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(41％)。通过SFC(DAICEL CHIRALPAK AS柱)分离对映异构体。流动相：在CO2中的具有0.1％NH4OH的50％EtOH，流速70g/min，得到具有99％对映体纯度的所需化合物。1H NMR(400MHz，DMOS-d6)δ10.18(s，1H)，8.25(s，1H)，7.99(s，2H)，7.60(d，J＝8.4Hz，2H)，7.53(d，J＝8.8Hz，2H)，7.27(t，J＝8.0Hz，1H)，7.05-7.02(m，2H)，6.86(dd，J＝8.4，2.4Hz，1H)，4.34(s，1H)，3.75(s，3H)，2.65-2.51(m，4H)，2.30(s，6H)。MS(ES+)m/e 394.3(M+H)+。[α]25℃ D＝+95.7(c＝0.2，在MeOH中)。
实施例61
(R)-N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺
按照一般程序B进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的(R)-N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)氨基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酰胺(41％)。通过SFC(DAICEL CHIRALPAK AS柱)分离对映异构体。流动相：在CO2中的具有0.1％NH4OH的50％EtOH，流速70g/min，得到具有99％对映体纯度的所需化合物。1H NMR(400MHz，DMOS-d6)δ10.18(s，1H)，8.25(s，1H)，7.99(s，2H)，7.60(d，J＝8.4Hz，2H)，7.53(d，J＝8.8Hz，2H)，7.27(t，J＝8.0Hz，1H)，7.05-7.02(m，2H)，6.86(dd，J＝8.4，2.4Hz，1H)，4.34(s，1H)，3.75(s，3H)，2.65-2.51(m，4H)，2.30(s，6H)。MS(ES+)m/e 394.3(M+H)+。[α]25℃ D＝-92.8(c＝0.2，在MeOH中)。
实施例62
(R)-N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-((2-(甲氨基)乙基)氨基)乙酰胺
步骤1：将化合物(2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)-(1-(3-甲氧基苯基)-2-氧-2-((4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯溶解于EtOH(0.15M)中并添加对甲苯磺酸(2当量)。将溶液在15℃下搅拌20小时。将反应混合物用NaHCO3淬灭，并用EtOAc萃取。将合并的有机部分用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以得到呈黄色固体的(2-((4-(1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)-1-(3-甲氧基苯基)-2-氧乙基)(2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯，产率92％。通过SFC(DAICEL CHIRALPAK OD柱)分离对映异构体。流动相：在CO2中具有0.1％NH4OH的45％EtOH，流速70g/min，得到具有99％对映体纯度的(R)-(2-((2-((4-(1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)-1-(3-甲氧基苯基)-2-氧乙基)(叔丁氧基羰基)氨基)乙基)-(甲基)氨基甲酸叔丁酯。1HNMR(400MHz，DMOS-d6)δδ12.84(s，1H)，10.19(s，1H)，8.04(s，2H)，7.71-7.49(m，4H)，7.37-7.33(m，1H)，7.03-6.89(m，3H)，6.02-5.33(m，1H)，3.76(s，3H)，3.42-2.70(m，7H)，1.55-1.25(m，18H)。
步骤2：将化合物(R)-(2-((4-(1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)-1-(3-甲氧基苯基)-2-氧乙基)(2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯溶解于二氯甲烷中，并加入在二噁烷中的4N HCl。将反应混合物在室温下搅拌4小时并且在减压下浓缩。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的(R)-N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-((2-(甲氨基)乙基)氨基)乙酰胺(12％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δδ8.51(s，1H)，7.91(s，2H)，7.58-7.51(m，4H)，7.31(t，J＝7.6Hz，1H)，7.09-7.08(m，2H)，6.91-6.89(m，1H)，4.42(s，1H)，3.81(s，3H)，3.14-3.04(m，2H)，2.92-2.82(m，2H)，2.72(s，3H)。MS(ES+)m/e 380.4(M+H)+。[α]25℃ D＝-86.02(0.5，在MeOH中)。
实施例63
(S)-N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-((2-(甲氨基)乙基)氨基)乙酰胺
步骤1：将化合物(2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)(1-(3-甲氧基苯基)-2-氧-2-((4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯溶解于EtOH(0.15M)中并添加对甲苯磺酸(2当量)。将溶液在15℃下搅拌20小时。将反应混合物用NaHCO3淬灭，并用EtOAc萃取。将合并的有机部分用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以得到呈黄色固体的(2-((4-(1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)-1-(3-甲氧基苯基)-2-氧乙基)(2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯，产率92％。通过SFC(DAICEL CHIRALPAK OD柱)分离对映异构体。流动相：在CO2中具有0.1％NH4OH的45％EtOH，流速70g/min，得到具有99％对映体纯度的(S)-(2-((2-((4-(1H-吡唑-4-基)苯基)氯基)-1-(3-甲氧基苯基)-2-氧乙基)(叔丁氧基羰基)氨基)乙基)-(甲基)氨基甲酸叔丁酯。1HNMR(400MHz，DMOS-d6)δδ12.84(s，1H)，10.19(s，1H)，8.04(s，2H)，7.71-7.49(m，4H)，7.37-7.33(m，1H)，7.03-6.89(m，3H)，6.02-5.33(m，1H)，3.76(s，3H)，3.42-2.70(m，7H)，1.55-1.25(m，18H)。[α]25℃ D＝-92.8(c＝0.2，在MeOH中)
步骤2：将化合物(S)-(2-((2-((4-(1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)-1-(3-甲氧基苯基)-2-氧乙基)(叔丁氧基羰基)氨基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯溶解于二氯甲烷中，并添加在二噁烷中的4N HCl。将反应混合物在室温下搅拌4小时并且在减压下浓缩。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈白色固体的(S)-N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-((2-(甲氨基)乙基)氨基)乙酰胺(12％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.51(s，1H)，7.91(s，2H)，7.58-7.51(m，4H)，7.31(t，J＝7.6Hz，1H)，7.09-7.08(m，2H)，6.91-6.89(m，1H)，4.42(s，1H)，3.81(s，3H)，3.14-3.04(m，2H)，2.92-2.82(m，2H)，2.72(s，3H)。MS(ES+)m/e 380.4(M+H)+。[α]25℃ D＝+82.43(0.7，在MeOH中)。
实施例64
(S)-N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(4-氯苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺
步骤1：将CbzNH2(3当量)溶解于正丙醇中。将0.4N NaOH(3当量)加入到溶液中，然后一次性加入叔丁基次氯酸盐(1.05当量)。5分钟后，将(DHQ)2PHAL(0.05当量)在正丙醇中的溶液一次性加入到反应混合物中。一次性加入化合物对氯苯乙烯(1当量)的正丙醇溶液，然后加入K2OsO2(OH)4(0.03当量)。将浅绿色溶液在20℃下搅拌1小时。将Na2SO3饱和溶液加入反应混合物中，并将混合物在20℃下搅拌10分钟。分离有机层，并且用EtOAc萃取水相。将合并的有机层用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将残留物通过制备型HPLC(TFA条件)纯化并冷冻干燥，以得到呈白色固体的化合物(S)-(1-(4-氯苯基)-2-羟乙基)氨基甲酸苄酯(62％，94.9％ee)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.34-7.31(m，7H)，7.28-7.22(m，2H)，5.64(s，1H)，5.13-5.05(m，2H)，4.80(s，1H)，3.86-3.78(m，2H)，2.24(m，1H)。
步骤2：在30℃下，在氮气下，向化合物(S)-(1-(4-氯苯基)-2-羟乙基)氨基甲酸酯(1当量)和咪唑(2当量)在DMF中的混合物中一次性加入TBSCl(1.5当量)。将混合物在30℃下搅拌1h。将混合物倒入水中，并用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过硅胶色谱法(SiO2，石油醚/EtOAc＝15/1)纯化残余物，以得到呈无色油状物的(S)-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1-(4-氯苯基)乙基)氨基甲酸苄酯(95％，89.3％ee)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.38-7.25(m，9H)，5.59(s，1H)，5.16-5.07(m，2H)，4.77(s，1H)，3.95(dd，J＝10.0，4.0Hz，1H)，3.75(m，1H)，0.89(s，9H)，-0.03(s，3H)，-0.06(s，3H)。
步骤3：在0℃下，在氮气下，向化合物(S)-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1-(4-氯苯基)乙基)氨基甲酸酯(1当量)在DMF中的溶液中逐份加入NaH(2当量)。将混合物在0℃下搅拌10分钟，然后将MeI(1.5当量)的DMF溶液滴加到混合物中。将混合物温热至20℃并搅拌50分钟。将混合物倒入NH4Cl饱和溶液中，并用EtOAc萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶色谱法(SiO2，石油醚/EtOAc＝20/1)纯化混合物，以得到呈无色油状物的(S)-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1-(4-氯苯基)乙基)(甲基)氨基甲酸苄酯(93％，94.4％ee)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.36-7.19(m，9H)，5.37-5.22(m，1H)，5.19-5.04(m，2H)，4.05(m，2H)，2.80(s，3H)，0.88(s，9H)，0.07(s，6H)。
步骤4：在20℃下，在N2下，向化合物(S)-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1-(4-氯苯基)乙基)(甲基)氨基甲酸酯(1当量)在MeOH/H2O(7∶3)中的混合物中一次性加入KHSO4(4当量)。将水加入反应混合物，并用EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶色谱法(SiO2，石油醚/EtOAc＝2/1)纯化残余物，以得到呈无色油状物的化合物(S)-(1-(4-氯苯基)-2-羟乙基)(甲基)氨基甲酸苄酯(99％，94％ee)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.36-7.20(m，9H)，5.33(dd，J＝8.0，6.4Hz，1H)，5.20(m，2H)，4.17-4.07(m，2H)，2.78(s，3H)。
步骤5：在0℃下，将化合物(S)-(1-(4-氯苯基)-2-羟乙基)(甲基)氨基甲酸酯(1当量)溶解于饱和KH2PO4和MeCN溶液中。在0-5℃下，将NaClO2(2当量)和TEMPO(0.2当量)添加到反应混合物中，然后在0-5℃下，在N2下滴加NaClO(2当量)。混合物变成深紫色，并将反应混合物在10-15℃下搅拌2h。将反应混合物用H2O(100mL)稀释，并将混合物用DCM(100mL×3)萃取。将合并的有机相用盐水(100mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶色谱法(SiO2，石油醚/EtOAc＝1/1，0/1)纯化残余物，以得到呈黄色油状物的化合物(S)-2-(((苄氧基)羰基)(甲基)氨基)-2-(4-氯苯基)乙酸(95％94％ee)。
步骤6：在10℃下，在N2下，向化合物(S)-2-(((苄氧基)羰基)(甲基)氨基)-2-(4-氯苯基)乙酸(1当量)和化合物4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯胺(1.1当量)在THF中的混合物一次性添加DMT-MM(1.05)。将混合物在20℃下搅拌3小时。添加水，并且用EtOAc萃取混合物。将合并的有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过制备型TLC(石油醚/EtOAc＝2∶1)纯化残余物，以得到呈黄色固体的化合物((1S)-1-(4-氯苯基)-2-氧-2-((4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)乙基)-(甲基)氨基甲酸苄酯(59％，86％ee)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.75(s，1H)，7.71(s，1H)，7.40-7.31(m，4H)，7.28-7.18(m，9H)，5.88(s，1H)，5.41(dd，J＝8.8，2.8Hz，1H)，5.16-5.09(m，2H)，4.05-4.00(m，1H)，3.68-3.41(m，1H)，2.80(s，3H)，2.09-2.04(m，2H)，1.66-1.53(m，4H)。
步骤7：在0℃下，在N2下，向化合物((1S)-1-(4-氯苯基)-2-氧-2-((4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)乙基)(甲基)氨基甲酸酯(1当量)在MeCN中的溶液中加入TMSI(8当量)。加入H2O，并将混合物用石油醚萃取。通过制备型HPLC(FA条件)纯化水相，以得到呈白色粉末的(S)-N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(4-氯苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺(9％，87.5％ee)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.08(s，1H)，8.20(s，1H)，7.98(s，2H)，7.61-7.42(m，8H)，4.24(s，1H)，2.27(s，3H)。MS(ES+)m/e 341.0(M+H)+。
实施例65
(R)-N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(4-氯苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺
步骤1：将CbzNH2(3当量)溶解于正丙醇中。将0.4N NaOH(3当量)加入到溶液中，然后一次性加入叔丁基次氯酸盐(1.05当量)。5分钟后，将(DHQD)2PHAL(0.05当量)在正丙醇中的溶液一次性加入到反应混合物中。一次性加入化合物对氯苯乙烯(1当量)的正丙醇溶液，然后加入K2OsO2(OH)4(0.03当量)。将浅绿色溶液在20℃下搅拌1小时。将Na2SO3饱和溶液加入反应混合物中，并将混合物在20℃下搅拌10分钟。分离有机层，并且用EtOAc萃取水相。将合并的有机层用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将残留物通过制备型HPLC(TFA条件)纯化并冷冻干燥，以得到呈白色固体的化合物(R)-(1-(4-氯苯基)-2-羟乙基)氨基甲酸苄酯(71％，94.5％ee)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.76(d，J＝8.4Hz，1H)，7.39-7.10(m，9H)，5.05-4.97(m，2H)，4.87(t，J＝5.6Hz，1H)，4.62-4.56(m，1H)，3.58-3.48(m，2H)。
步骤2：在30℃下，在氮气下，向化合物(R)-(1-(4-氯苯基)-2-羟乙基)氨基甲酸酯(1当量)和咪唑(2当量)在DMF中的混合物中一次性加入TBSCl(1.5当量)。将混合物在30℃下搅拌1h。将混合物倒入水中，并用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过硅胶色谱法(SiO2，石油醚/EtOAc＝15/1)纯化残余物，以得到呈无色油状物的(R)-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1-(4-氯苯基)乙基)氨基甲酸苄酯(71％，90％ee)。
步骤3：在0℃下，在氮气下，向化合物(R)-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1-(4-氯苯基)乙基)氨基甲酸酯(1当量)在DMF中的溶液中逐份加入NaH(2当量)。将混合物在0℃下搅拌10分钟，然后将MeI(1.5当量)的DMF溶液滴加到混合物中。将混合物温热至20℃并搅拌50分钟。将混合物倒入NH4Cl饱和溶液中，并用EtOAc萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶色谱法(SiO2，石油醚/EtOAc＝20/1)纯化混合物，以得到呈无色油状物的(R)-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1-(4-氯苯基)乙基)(甲基)氨基甲酸苄酯(75％，93％ee)。
步骤4：在20℃下，在N2下，向化合物(R)-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1-(4-氯苯基)乙基)(甲基)氨基甲酸酯(1当量)在MeOH/H2O(7∶3)中的混合物中一次性加入KHSO4(4当量)。将水加入反应混合物，并用EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶色谱法(SiO2，石油醚/EtOAc＝2/1)纯化残余物，以得到呈无色油状物的化合物(R)-(1-(4-氯苯基)-2-羟乙基)(甲基)氨基甲酸苄酯(91％，92％ee)。
步骤5：在0℃下，将化合物(R)-(1-(4-氯苯基)-2-羟乙基)(甲基)氨基甲酸酯(1当量)溶解于饱和KH2PO4和MeCN溶液中。在0-5℃下，将NaClO2(2当量)和TEMPO(0.2当量)添加到反应混合物中，然后在0-5℃下，在N2下滴加NaClO(2当量)。混合物变成深紫色，并将反应混合物在10-15℃下搅拌2h。将反应混合物用H2O(100mL)稀释，并将混合物用DCM(100mL×3)萃取。将合并的有机相用盐水(100mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶色谱法(SiO2，石油醚/EtOAc＝1/1，0/1)纯化残余物，以得到呈黄色油状物的化合物(R)-2-(((苄氧基)羰基)(甲基)氨基)-2-(4-氯苯基)乙酸(94％ee)。
步骤6：在10℃下，在N2下，向化合物(R)-2-(((苄氧基)羰基)(甲基)氨基)-2-(4-氯苯基)乙酸(1当量)和化合物4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯胺(1.1当量)在THF中的混合物一次性添加DMT-MM(1.05)。将混合物在20℃下搅拌3小时。添加水，并且用EtOAc萃取混合物。将合并的有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过制备型TLC(石油醚/EtOAc＝2∶1)纯化残余物，以得到呈黄色固体的化合物((1R)-1-(4-氯苯基)-2-氧-2-((4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)乙基)(甲基)氨基甲酸苄酯(83％，87％ee)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.75(s，1H)，7.71(s，1H)，7.40-7.31(m，4H)，7.28-7.18(m，9H)，5.88(s，1H)，5.41(dd，J＝8.8，2.8Hz，1H)，5.16-5.09(m，2H)，4.05-4.00(m，1H)，3.68-3.41(m，1H)，2.80(s，3H)，2.09-2.04(m，2H)，1.66-1.53(m，4H)。
步骤7：在0℃下，在N2下，向化合物((1R)-1-(4-氯苯基)-2-氧-2-((4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)乙基)(甲基)氨基甲酸酯(1当量)在MeCN中的溶液中加入TMSI(8当量)。加入H2O，并将混合物用石油醚萃取。通过制备型HPLC(FA条件)纯化水相，以得到呈白色粉末的(R)-N-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(4-氯苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺(28％，87％ee)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.15(s，1H)，8.14(s，1H)，7.98(s，2H)，7.59(d，J＝8.8Hz，4H)，7.54-7.49(m，4H)，7.44-7.42(m，2H)，4.32(s，1H)，2.30(s，3H)。MS(ES+)m/e 341.3(M+H)+。
实施例66
N-(2-氟-5-甲氧基-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化最终残余物，以得到呈黄色油状物的N-(2-氟-5-甲氧基-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺(1％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.91(s，1H)，9.91(brs，1H)，8.07(s，2H)，7.74(d，J＝7.2Hz，1H)，7.58(d，J＝12.4Hz，1H)，7.27(t，J＝8.0Hz，1H)，7.04-7.01(m，2H)，6.86(dd，J＝7.2，1.6Hz，1H)，4.28(s，1H)，3.80(s，3H)，3.75(s，3H)，2.31(s，3H)。MS(ES+)m/e 385.2(M+H)+。
实施例67
3-(2-((4-(1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)-1-(甲氨基)-2-氧乙基)-N-甲基苯甲酰胺
步骤1：向化合物3-(1-((4-甲氧基苄基)(甲基)氨基)-2-氧-2-((4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)乙基)苯甲酸甲酯(1当量)在MeOH和水中的溶液中加入NaOH(2当量)。将混合物在真空下浓缩。通过制备型HPLC(FA条件)纯化残余物，以得到呈灰白色固体的化合物3-(1-((4-甲氧基苄基)(甲基)氨基)-2-氧-2-((4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)乙基)苯甲酸(58％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.21(s，1H)，8.27(s，1H)，8.15(s，1H)，7.95-7.90(m，2H)，7.88(d，J＝8.0Hz，1H)，7.63-7.55(m，5H)，7.27(d，J＝8.8Hz，2H)，6.89(d，J＝8.8Hz，2H)，5.38(dd，J＝10.4，2.4Hz，1H)，4.33(s，1H)，3.92(d，J＝11.6Hz，1H)，3.73(s，3H)，3.66-3.63(m，1H)，3.51-3.42(m，2H)，2.16-2.09(m，4H)，1.94(s，2H)，1.69-1.65(m，1H)，1.58-1.54(m，2H)。
步骤2：在20℃下，向化合物3-(1-((4-甲氧基苄基)(甲基)氨基)-2-氧-2-((4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)乙基)苯甲酸(1当量)、甲胺(1当量)在CH3CN中的溶液中加入T3P(1.5当量)、DIPEA(1.5当量)。将混合物加热至80℃并搅拌15小时。将反应混合物用H2O稀释并且用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤、经Na2SO4干燥过滤并减压浓缩，以得到呈白色固体的化合物3-(1-((4-甲氧基苄基)(甲基)氨基)-2-氧-2-((4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)乙基)-N-甲基苯甲酰胺。
步骤3：将化合物3-(1-((4-甲氧基苄基)(甲基)氨基)-2-氧-2-((4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)乙基)-N-甲基苯甲酰胺在TFA中的混合物在75℃下搅拌16小时。将混合物在真空下浓缩以得到残余物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化残余物，以得到呈白色固体的3-(2-((4-(1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)-1-(甲氨基)-2-氧乙基)-N-甲基苯甲酰胺(43％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.69(s，1H)，9.61-9.47(m，2H)，8.56(d，J＝4.8Hz，1H)，8.12(s，1H)，8.01(s，2H)，7.93(d，J＝7.6Hz，1H)，7.73(d，J＝8.0Hz，1H)，7.63-7.54(m，5H)，5.09(s，1H)，2.81(s，3H)，2.53(s，3H)。MS(ES+)m/e 364.4(M+H)+。
实施例68
4-(2-((4-(1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)-1-(甲氨基)-2-氧乙基)苯甲酸
步骤1：将化合物4-(1-((4-甲氧基苄基)-(甲基)氨基)-2-氧-2-((4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)乙基)苯甲酸甲酯(1当量)在TFA中的混合物在70℃下搅拌112小时将反应混合物用MeOH稀释并在减压下浓缩以得到残余物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化残余物，以得到呈灰白色固体的化合物4-(2-((4-(1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)-1-(甲氨基)-2-氧乙基)苯甲酸甲酯(19％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.17(dd，J＝6.8，2.0Hz，2H)，7.92(s，2H)，7.74(d，J＝8.4Hz，2H)，7.58-7.53(m，4H)，5.07(s，1H)，3.92(s，3H)，2.70(s，3H)。
步骤2：向化合物4-(2-((4-(1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)-1-(甲氨基)-2-氧乙基)苯甲酸甲酯(1当量)在MeOH和H2O中的溶液中加入NaOH(3当量)。将混合物在30℃下搅拌16小时。用1N HCl将混合物酸化至pH＝5。通过制备型HPLC(FA条件)纯化所得混合物，以得到呈白色固体的4-(2-((4-(1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)-1-(甲氨基)-2-氧乙基)苯甲酸(18％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.13(s，1H)，8.27(s，1H)，7.98(s，2H)，7.90(d，J＝8.4Hz，2H)，7.65-7.50(m，6H)，4.30(s，1H)，2.28(s，3H)。MS(ES+)m/e 351.1(M+H)+。
实施例69
4-(2-((4-(1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)-1-(甲氨基)-2-氧乙基)-N-甲基苯甲酰胺
步骤1：向化合物4-(1-((4-甲氧基苄基)-(甲基)氨基)-2-氧-2-((4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)乙基)苯甲酸甲酯(1当量)在MeOH和H2O中的溶液中加入NaOH(2当量)。将混合物在35℃下搅拌36小时。将反应混合物用H2O稀释。通过制备型HPLC(FA条件)纯化所得溶液，以得到呈白色固体的化合物4-(1-((4-甲氧基苄基)(甲基)氨基)-2-氧-2-((4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)乙基)苯甲酸(70％，98％纯度)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.92(s，1H)，10.19(s，1H)，7.97(d，J＝8.4Hz，2H)，7.88(s，1H)，7.69(d，J＝8.4Hz，2H)，7.65-7.60(m，2H)，7.59-7.52(m，2H)，7.28(d，J＝8.8Hz，2H)，6.90(d，J＝8.4Hz，2H)，5.38(dd，J＝10.0，2.4Hz，1H)，4.33(s，1H)，3.94-3.92(m，1H)，3.74(s，3H)，3.68-3.58(m，1H)，3.54-3.40(m，2H)，2.18-2.03(m，4H)，2.00-1.87(m，2H)，1.75-1.61(m，1H)，1.59-1.48(m，2H)。
步骤2：向化合物4-(1-((4-甲氧基苄基)(甲基)氨基)-2-氧-2-((4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)乙基)苯甲酸(1当量)在MeCN中的溶液中加入T3P(1.5当量)、MeNH2(2.5当量)和DIPEA(4当量)。将混合物在30℃下搅拌36小时。将反应混合物冷却至室温，并通过在15℃下添加H2O来淬灭。将所得混合物用EtOAc稀释，并用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，以得到呈白色固体的化合物4-(1-((4-甲氧基苄基)(甲基)氨基)-2-氧-2-((4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)乙基)-N-甲基苯甲酰胺(98％，87％纯度)。
步骤3：向化合物4-(1-((4-甲氧基苄基)(甲基)氨基)-2-氧-2-((4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)乙基)-N-甲基苯甲酰胺(1当量)在THF和MeOH中的溶液中加入无水Pd/C(0.1当量)和HCl(2当量)。将混合物在H2(1atm)的气氛下、在50℃下搅拌2小时。将混合物冷却至室温并过滤。将滤液在减压下浓缩以得到残余物。通过制备型HPLC(FA条件)纯化残余物，以得到呈白色固体的4-(2-((4-(1H-吡唑-4-基)苯基)氨基)-1-(甲氨基)-2-氧乙基)-N-甲基苯甲酰胺(98％纯度)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.13(s，1H)，8.44-8.36(m，1H)，8.16(s，1H)，7.98(s，2H)，7.80(d，J＝8.4Hz，2H)，7.63-7.58(m，2H)，7.57-7.51(m，4H)，4.30(s，1H)，2.76(d，J＝4.4Hz，3H)，2.29(s，3H)。MS(ES+)m/e364.3(M+H)+。
实施例70
N-(2-(3-(二甲氨基)丙氧基)-5-氟-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化所得残余物，以得到呈白色固体的N-(2-(3-(二甲氨基)丙氧基)-5-氟-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺(13％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.04(d，J＝12.8Hz，1H)，8.00(s，2H)，7.30-7.23(m，2H)，7.03-7.02(m，2H)，6.88(dd，J＝8.4，0.8Hz，1H)，4.20(s，1H)，4.16(t，J＝6.0Hz，2H)，3.79(s，3H)，2.62-2.58(m，2H)，2.45(s，3H)，2.30(s，6H)，2.07-2.00(m，2H)。MS(ES+)m/e 456.4(M+H)+。
实施例71
N-(2-(2-(二甲氨基)乙氧基)-5-氟-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化所得残余物，以得到呈白色固体的N-(2-(2-(二甲氨基)乙氧基)-5-氟-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺(37％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.52(s，2H)，8.04-8.0(m，3H)，7.42(t，J＝8.0Hz，1H)，7.28(d，J＝6.8Hz，1H)，7.24-7.19(m，2H)，7.05(dd，J＝8.8，2.4Hz，1H)，5.43(s，1H)，4.44-4.41(m，1H)，4.27-4.25(m，1H)，3.84(s，3H)，3.41-3.36(m，2H)，2.81(s，6H)，2.65(s，3H)。MS(ES+)m/e 442.4(M+H)+。
实施例72
(R)-N-(2-(2-(二甲氨基)乙氧基)-5-氟-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化所得残余物，以得到呈白色固体的N-(2-(2-(二甲氨基)乙氧基)-5-氟-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺(37％)。通过SFC(DAICEL CHIRALPAK AD柱)分离对映异构体。流动相：在CO2中具有0.1％NH4OH的55％EtOH，流速70g/min，得到具有99％对映体纯度的(R)-N-(2-(2-(二甲氨基)乙氧基)-5-氟-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.05(s，1H)，10.59(s，1H)，9.98-9.96(m，1H)，9.72-9.69(m，1H)，8.08(m，2H)，7.94(d，J＝12.4Hz，1H)，7.47(s，1H)，7.43-7.34(m，3H)，7.04-7.01(m，1H)，6.05(t，J＝6.4Hz，1H)，4.47-4.34(m，2H)，3.79(s，3H)，3.58-3.49(m，2H)，2.83(dd，J＝7.2，5.2Hz，6H)，2.48(s，3H).MS(ES+)m/e 442.3(M+H)+。
实施例73
(S)-N-(2-(2-(二甲氨基)乙氧基)-5-氟-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺
按照一般程序A进行反应。通过反相制备型HPLC纯化所得残余物，以得到呈白色固体的N-(2-(2-(二甲氨基)乙氧基)-5-氟-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺(37％)。通过SFC(DAICEL CHIRALPAK AD柱)分离对映异构体。流动相：在CO2中具有0.1％NH4OH的55％EtOH，流速70g/min，得到具有99％对映体纯度的(S)-N-(2-(2-(二甲氨基)乙氧基)-5-氟-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2-(3-甲氧基苯基)-2-(甲氨基)乙酰胺。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.05(s，1H)，10.59(s，1H)，9.97-9.94(m，1H)，9.71-9.68(m，1H)，8.08(m，2H)，7.94(d，J＝12.4Hz，1H)，7.47(s，1H)，7.43-7.36(m，3H)，7.04-7.02(m，1H)，6.05(t，J＝6.4Hz，1H)，4.48-4.34(m，2H)，3.79(s，3H)，3.58-3.47(m，2H)，2.83(dd，J＝7.2，5.2Hz，6H)，2.48(s，3H).MS(ES+)m/e 442.3(M+H)+。
实施例74
1-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-4-(环丙基甲基)-3-(3-甲氧基苯基)-1，4-二氮杂环庚-2-酮
步骤1：在20℃下，在N2下，向化合物2-(3-甲氧基苯基)-3-氧-1，4-二氮杂环庚烷-1-甲酸苄酯(1当量)和化合物4-(4-碘苯基)-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑(1当量)在二噁烷中的混合物中添加Cs2CO3(4当量)和Xantphos-Pd-G3(0.05当量)。将混合物在100℃下搅拌16小时。将混合物用EtOAc(100mL×4)萃取。将合并的有机相用盐水(100mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶色谱法(SiO2，石油醚/EtOAc＝2/1，1/1)纯化残余物，以得到呈黄色油状物的化合物2-(3-甲氧基苯基)-3-氧-4-(4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)-1，4-二氮杂环庚烷-1-甲酸苄酯(25％)。
步骤2：在N2下，向化合物2-(3-甲氧基苯基)-3-氧-4-(4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)-1，4-二氮杂环庚烷-1-甲酸苄酯(1当量)在MeOH中的溶液中加入无水Pd/C(0.1当量)。将悬浮液在真空下脱气并用H2吹扫多次。将混合物在H2(15psi)下、在20℃下搅拌4小时。过滤反应混合物并且浓缩滤液以得到残余物。通过制备型HPLC(FA条件)纯化残余物，以得到呈白色固体的化合物3-(3-甲氧基苯基)-1-(4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)-1，4-二氮杂环庚-2-酮(67％)。
步骤3：在25℃下，在N2下，向化合物3-(3-甲氧基苯基)-1-(4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)-1，4-二氮杂环庚-2-酮(1当量)和醛(2当量)在MeOH中的混合物中一次性加入TEA(3)。将混合物在25℃下搅拌30分钟。将NaBH(OAc)3(4当量)加入反应物中，并且将反应混合物在25℃下搅拌4小时。将混合物倒入水中并用EtAOc萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶色谱法(SiO2，石油醚/EtOAc＝2/1，1/1)纯化残余物，以得到呈无色油状物的化合物4-(环丙基甲基)-3-(3-甲氧基苯基)-1-(4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)-1，4-二氮杂环庚-2-酮(32％)。
步骤4：在0℃下，在N2下，向化合物4-(环丙基甲基)-3-(3-甲氧基苯基)-1-(4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)-1，4-二氮杂环庚-2-酮(1当量)在DCM中的混合物中加入TFA。将混合物在0℃下搅拌10分钟，并将反应混合物温热至25℃。将反应混合物在25℃下搅拌0.5小时。将反应混合物在45℃下减压浓缩，并通过制备型HPLC纯化残余物，以得到呈灰白色固体的1-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-4-(环丙基甲基)-3-(3-甲氧基苯基)-1，4-二氮杂环庚-2-酮(7％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.99(s，2H)，7.69-7.65(m，2H)，7.45(t，J＝8.0Hz，1H)，7.34-7.30(m，2H)，7.26-7.24(m，2H)，7.09(dd，J＝8.8，1.6Hz，1H)，5.73(s，1H)，4.40(m，1H)，3.99-3.83(m，6H)，3.38-3.32(m，1H)，3.31-3.20(m，1H)，2.38(m，2H)，1.15-1.10(m，1H)，0.78-0.73(m，2H)，0.38-0.34(m，2H).MS(ES+)m/e 417.3(M+H)+。
实施例75
1-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-4-(2-(二甲氨基)乙基)-3-(3-甲氧基苯基)-1，4-二氮杂环庚-2-酮
步骤1：在25℃下，在N2下，向化合物3-(3-甲氧基苯基)-1-(4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)-1，4-二氮杂环庚-2-酮(1当量)和醛(2当量)在MeOH中的混合物中一次性加入TEA(3)。将混合物在25℃下搅拌30分钟。将NaBH(OAc)3(4当量)加入反应物中，并且将反应混合物在25℃下搅拌4小时。将混合物倒入水中并用EtAOc萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶色谱法(SiO2，石油醚/EtOAc＝2/1，1/1)纯化残余物，以得到呈无色油状物的化合物4-(2-(二甲氨基)乙基)-3-(3-甲氧基苯基)-1-(4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)-1，4-二氮杂环庚-2-酮(13％)。
步骤2：在0℃下，在N2下，向化合物4-(2-(二甲氨基)乙基)-3-(3-甲氧基苯基)-1-(4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)-1，4-二氮杂环庚-2-酮(1当量)在DCM中的混合物中加入TFA。将混合物在0℃下搅拌10分钟，并将反应混合物温热至25℃。将反应混合物在25℃下搅拌0.5小时。将反应混合物在45℃下减压浓缩，并通过制备型HPLC纯化残余物，以得到呈黄色固体的1-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-4-(2-(二甲氨基)乙基)-3-(3-甲氧基苯基)-1，4-二氮杂环庚-2-酮(40％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.00(s，2H)，7.68(d，J＝8.8Hz，2H)，7.42(t，J＝8.0Hz，1H)，7.30(d，J＝8.4Hz，2H)，7.19-7.15(m，2H)，6.98(dd，J＝8.0，2.4Hz，1H)，5.06(s，1H)，3.93-3.86(m，4H)，3.77-3.73(m，1H)，3.48-3.35(m，4H)，3.22-3.14(m，2H)，2.94(s，3H)，2.87(s，3H)，2.19-2.17(m，1H)，1.77(m，1H)。MS(ES+)m/e434.3(M+H)+。
实施例76
1-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-3-(3-甲氧基苯基)-4-(2-(甲氨基)乙基)-1，4-二氮杂环庚-2-酮
步骤1：在25℃下，在N2下，向化合物3-(3-甲氧基苯基)-1-(4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)-1，4-二氮杂环庚-2-酮(1当量)和醛(2当量)在MeOH中的混合物中一次性加入TEA(3)。将混合物在25℃下搅拌30分钟。将NaBH(OAc)3(4当量)加入反应物中，并且将反应混合物在25℃下搅拌4小时。将混合物倒入水中并用EtAOc萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶色谱法(SiO2，石油醚/EtOAc＝2/1，1/1)纯化残余物，以得到呈灰白色油状物的化合物(2-(2-(3-甲氧基苯基)-3-氧-4-(4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)-1，4-二氮杂环庚烷-1-基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(77％)。
步骤2：在0℃下，在N2下，向化合物(2-(2-(3-甲氧基苯基)-3-氧-4-(4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)-1，4-二氮杂环庚烷-1-基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(1当量)在DCM中的混合物中加入TFA。将混合物在0℃下搅拌10分钟，并将反应混合物温热至25℃。将反应混合物在25℃下搅拌0.5小时。将反应混合物在45℃下减压浓缩，并通过制备型HPLC纯化残余物，以得到呈白色固体的11-(4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-3-(3-甲氧基苯基)-4-(2-(甲氨基)乙基)-1，4-二氮杂环庚-2-酮(66％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.00(s，2H)，7.67(d，J＝8.4Hz，2H)，7.40(t，J＝8.0Hz，1H)，7.28(d，J＝8.8Hz，2H)，7.16-7.13(m，2H)，7.67(dd，J＝8.4，2.4Hz，1H)，5.03(s，1H)，3.90-3.87(m，1H)，3.84(s，3H)，3.73-3.66(m，1H)，3.39-3.34(m，1H)，3.23-3.08(m，5H)，2.73(s，3H)，2.17-2.14(m，1H)，1.71-1.68(m，1H)。MS(ES+)m/e 420.3(M+H)+。
实施例77
化合物在体外的ROCK抑制活性的确定(Z′lyte测定)：重组ROCK1(氨基酸1-535)和ROCK2(氨基酸1-552)蛋白购自ThermoFisher Scientific。通过Z′-lyte激酶试剂盒(ThermoFisher Scientific)测量化合物活性，并计算IC50。
实施例78
A7R5细胞中化合物ROCK抑制活性的确定：维持大鼠主动脉平滑肌细胞系A7R5细胞，并在DMEM培养基中用10％胎牛血清处理。将细胞以5,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中24小时，并且随后用测试化合物处理90分钟。然后根据细胞内ELISA比色检测试剂金手册(Thermo Scientific)固定和处理细胞。
实施例79
NIH3T3细胞Acta2启动子驱动的荧光素酶测定：建立了稳定表达由人ACTA2基因启动子(-1000-1bp)驱动的荧光素酶报告基因的NIH3T3细胞系(NIH3T3-Acta2-荧光素酶)。将细胞铺板至汇合，并用测试化合物加TGFβ1处理24小时。然后裂解细胞，并使用来自ActiveMotif的LightSwitch荧光素酶试剂盒测量荧光素酶活性。
实施例80
人少突胶质细胞/神经元祖细胞(OPC)的解冻和增殖。回收冷冻保存的人少突胶质细胞/神经元祖细胞(Millipore目录号CS204496)，并在涂有基质胶(BD目录号356324)的T-25烧瓶上，在含有OPC/神经元基础培养基、N21培养基补充剂、重组人bFGF、PDGF-AA和NT-3的扩增培养基中培养。当细胞达到80％汇合时，将3ml Accutase(Millipore SCR005)以1∶4比率应用于传代细胞。将传代培养的细胞维持在扩增培养基中以进行增殖。
实施例81
人少突胶质细胞/神经元祖细胞在24孔板和96孔板中的自发分化。在室温下，用10μg/ml聚-L-鸟氨酸(Sigma目录号P4957)涂板过夜。除去聚-L-鸟氨酸溶液，并用1XPBS冲洗板，添加10μg/ml层粘连蛋白(Millipore目录号CC095)并在37℃孵育至少2小时。将细胞接种在涂布板上的扩展培养基中，并且使其粘附过夜。第二天，除去扩增培养基，并用仅含有OPC/神经元基础培养基和N21培养基补充剂的新鲜制备的自发分化培养基置换。对于14天的培养，每3-4天置换分化培养基。每4小时对细胞进行成像并通过IncuCyte S3活细胞分析***分析神经突长度。分化14天后，将细胞通过4％多聚甲醛固定，并用DAPI和神经元特异性β--III微管蛋白抗体(R&D systems，NL1195R)染色。
实施例82
对96孔板中人少突胶质细胞/神经元祖细胞的硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)测定。与10μg/ml聚-L-鸟氨酸孵育过夜后，在室温下，用10μg/ml层粘连蛋白以及0.3μg/ml CSPG(Millipore CC117)的混合均匀的溶液铺板96孔板持续至少2小时。将细胞以每孔6,000个细胞的密度接种在涂布板上的扩展培养基中。第二天，用含有测试化合物的新鲜自发分化培养基置换扩展培养基。每4小时对细胞进行成像并通过IncuCyte S3活细胞分析***分析神经突长度。
实施例83
对96孔板中人少突胶质细胞/神经元祖细胞的Aβ 1-42诱导的细胞死亡测定。将细胞以每孔8,000个细胞的密度接种在涂布聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白的板上，并保持在扩展培养基中直至第3天，然后将培养基置换为含有测试化合物和IncuCyte Annexin V Red试剂(1∶200稀释)(Essen BioScience目录号4641)的新鲜自发分化培养基。在37℃下预孵育30分钟后，将10.5μM Aβ 1-42(Bachem产品号H-8146)直接添加到预处理溶液中。每2小时通过IncuCyte S3活细胞分析***分析神经突长度和膜联蛋白V阳性总面积。
实施例84
博来霉素诱导的小鼠肺纤维化(治疗性施用)：将雄性C57B/L6小鼠饲养以适应不少于7天。适应期后，将动物随机分到治疗组。在第0天，用5％异氟烷通过吸入10-15分钟来麻醉小鼠，然后通过它们的前牙将它们悬吊在附接到固定的动物手术板上的线上。通过气管内滴注施用50μL生理盐水或博来霉素溶液。将治疗组的小鼠在气管内滴注在无菌生理盐水中的盐酸博来霉素(BLM)2.0U/kg(mg/kg)。在博来霉素施用后第7天，处死媒介物组中的一半动物以建立治疗开始时的纤维化水平的基线。从第7天到第20天，正常对照组的小鼠通过口服每天一次接受生理盐水。从第7天到第20天，治疗组小鼠通过口服给药每天一次接受化合物。在第20天，最后一次给药后2-3小时，处死所有小鼠。经由气管插管用0.8mL含1％BSA和0.6mM EDTA的PBS轻轻灌洗肺。灌洗后，收集每只动物的肺组织。将肺组织分为三部分：右部的大肺叶用10％中性***固定以进行石蜡包埋和组织病理学检查。右部的剩余肺叶被速冻并且制备蛋白质裂解物以用于靶标结合分析。
实施例85
博来霉素诱导的小鼠肺纤维化(预防性施用)：在研究开始之前，对雄性C57B/L6小鼠加耳标并称重。治疗组动物在博来霉素施用前第-1天和博来霉素施用后的所有随后几天用化合物进行治疗。在第0天，疾病组的动物通过口咽途径接受1.5U/kg剂量的博来霉素。非博来霉素对照组接受无菌生理盐水。每天严密监测动物，直到研究结束。博来霉素施用后第21天，对所有动物实施安乐死并收集血液、肺和支气管肺泡灌洗(BAL)液。血液样品用于血浆制备；在BAL液中计数总白细胞；并且将肺固定在10％中性***缓冲液中以用于组织病理学分析。
实施例86
组胺诱导的小鼠血管通透性模型：使7-8周龄的Balb/c雌性小鼠适应至少3天，并随机分组。以剂量100μl/小鼠将动物静脉内注射1％伊文思蓝(Evans Blue)。10分钟后，将疾病组的动物在背部皮内给予在20μl PBS中的1μg组胺，并在施用后20分钟处死。在假对照中将20μl PBS皮内注射到动物背部。通过口服管饲对应地给药媒介物和测试制品。阳性对照沙丁胺醇在伊文思蓝之前15分钟施用。用组胺攻击后20分钟，将动物安乐死。然后将皮肤颠倒，测量病变直径。计算病变面积并以平方毫米表示。直径测量后，从皮肤组织中提取出伊文思蓝染料，并测量光密度。数据是根据伊文思蓝标准曲线中的尖峰计算的。
实施例87
ROCK抑制剂在体外和细胞中有效抑制ROCK激酶活性。如通过A7R5细胞内Elisa测定所测量，本发明的化合物在细胞中抑制ROCK。用9点2倍连续稀释的化合物处理A7R5细胞，并确定ppMlc(T18/S19)水平以计算化合物的细胞IC50。结果在下表1中提供。
表1.
| 化合物 | ppMlc IC50(nM) |
| 实施例2 | 86 |
| 实施例8 | 517 |
下表2提供了本发明化合物的体外和细胞ROCK抑制。通过Z′-lyte激酶试剂盒(ThermoFisher Scientific)测量化合物活性。通过将以1μM化合物处理获得的激酶活性值相对于DMSO对照值进行归一化来计算抑制百分比。使用GraphPad Prism软件，使用从9点连续稀释的化合物处理收集的激酶活性数据计算IC50。如上所述，在A7R5细胞和NIH3T3(Acta2-Luc)细胞中进行了ROCK抑制。
表2
本发明的化合物在2-氨基上具有烷基取代基(任选地被取代)(即，R1为烷基等)，相对于在此位置具有伯氨基的化合物，其与细胞ROCK活性增强有关，并且特别是对于在2-位的低级烷基胺(即R1为低级烷基)来说。
实施例88
ROCK抑制剂穿透血脑屏障。
在2.5mg/kg静脉内药物施用后15分钟和2小时，通过HPLC/MS/MS评估小鼠中选择的ROCK抑制剂的脑和血浆浓度。结果在下表3中提供。
表3.
本发明的ROCK抑制剂在体外和细胞中有效抑制ROCK激酶活性。
如图1a所示，如通过Z′-Lyte试剂盒(ThermoFisher Scientific)所测量，在低于20纳摩尔浓度下的本发明化合物在体外有效抑制ROCK的两种同工型的活性。通过将以化合物处理获得的激酶活性值相对于DMSO对照值进行归一化来计算抑制百分比，然后将其应用于方程[DMSO-(化合物/DMSO)]×100％。使用GraphPad Prism软件的非线性回归曲线拟合函数，使用9点2倍连续稀释的化合物处理所测量的激酶活性数据计算IC50。
进行了A7R5细胞内ELISA测定以确定测试制品的ROCK抑制。用9点2倍连续稀释的化合物处理A7R5细胞，并确定ppMlc(T18/S19)水平以计算化合物的细胞IC50值。本发明化合物显示出IC50小于200nM的活性。参见图1b。用9点2倍连续稀释的化合物处理A7R5细胞，并使用GraphPad Prism软件的非线性回归曲线拟合函数确定ppMlc(T18/S19)水平以计算化合物的细胞IC50值。
ROCK抑制剂可以通过ACTA2启动子驱动的荧光素酶报告基因细胞测定法有效地排序。将稳定表达ACTA2A启动子驱动的荧光素酶的NIH3T3细胞用于测量细胞中ROCK化合物功能性IC50。将细胞铺板在96孔板中至汇合，并用9点连续稀释的化合物以及TGFβ1处理24小时。测量了荧光素酶活性，并使用GraphPad Prism软件的非线性回归曲线拟合函数计算了化合物IC50。本发明的化合物在细胞内得到小于200nM的IC50，见图1c。
在其他细胞类型中测试了化合物ROCK活性。用实施例2的化合物处理Svec 4-10小鼠内皮细胞120分钟，并通过蛋白质印迹法可视化ppMlc(T18/S19)和pMypt(T853)水平。实施例2在110nM下有效阻断了ROCK靶标MLC和MYPT1的磷酸化，见图1d。
实施例89
ROCK抑制剂促进神经突起生长和神经元分化
神经元发育需要高度协调的细胞骨架调控。RhoA/ROCK途径的激活引起细胞骨架变化，例如逆行肌动蛋白流增加和肌动蛋白解聚减少，并最终导致生长锥塌陷，进而抑制神经突起生长和延伸。在这里，我们显示了ROCK抑制剂以剂量依赖性方式促进神经元发芽和神经突起生长。图2a、2b证明了实施例2和实施例17的化合物在人少突胶质细胞/神经元祖细胞培养物中以不同浓度显著增加了神经突长度。实施例2和实施例17还促进神经元分化和成熟，参见图2c、2d。
ROCK抑制剂阻断硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)对神经突起生长的抑制作用。成年哺乳动物CNS神经元在创伤性损伤或神经变性后不自发再生。再生的这种缺乏归因于成年神经元的固有再生能力低和抑制性组织环境。在适宜环境中的主要障碍是由反应性星形胶质细胞所分泌的硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)和由少突胶质细胞产生的髓磷脂相关抑制剂。这些神经胶质细胞源性生长抑制分子在神经元损伤后被上调，在RhoA/ROCK信号传导路径上汇聚到下游并阻断神经再生。促进再生需要使组织环境中的生长抑制因子失活。在这里我们表明，通过阻断胶质细胞生长抑制因子信号通过的Rho/ROCK途径，CSPG对神经突延伸的抑制作用被逆转。图2e显示了第3天的代表性图片。如图2f和2g所示，1μM和3μM实施例2和实施例17在人少突胶质细胞/神经元祖细胞中都显著抵消了0.3mg/ml CSPG介导的神经突起生长停止。通过ANOVA对72小时时间点进行统计分析。
实施例90
ROCK抑制剂保护神经元细胞免受Aβ1-42诱导的细胞死亡。
除了促进神经再生之外，据报道ROCK抑制剂还发挥神经保护作用并延长神经元存活。在这里，我们测试了ROCK抑制剂对Aβ1-42的神经保护作用。将人少突胶质细胞/神经元祖细胞与ROCK抑制剂预孵育30分钟，然后暴露于10.5μM Aβ1-42。将IncuCyte Annexin VRed试剂添加到培养基中以标记细胞凋亡。通过IncuCyte S3拍摄照片，并通过IncuCyte S3基本软件分析膜联蛋白V阳性总面积。代表性图片如图3a所示。通过IncuCyte NeuroTrack软件模块对神经突长度进行定量，见图3b和3c。图3e和3f显示了膜联蛋白V面积和神经突长度的24小时时间点的统计分析，其显示3μM实施例2和实施例17显著保护了Aβ1-42诱导的细胞死亡，而3μM实施例17在Aβ1-42存在下促进了神经突起生长。
实施例91
本发明的ROCK抑制剂减弱了促纤维化基因表达
成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白(αSMA或Acta2)为以致纤维化因子表达增加为例的指示成纤维细胞转分化为更多促纤维化成肌纤维细胞的关键标志。此类促纤维化因子(包括TGFβ信号传导)导致αSMA表达，并有助于成肌纤维细胞分化、增殖和持续存活。如图4a所示，ROCK抑制剂显著降低TGFβ1诱导的αSMA表达。将NIH3T3细胞用TGFβ1以及ROCK抑制剂处理24小时，并通过Taqman qPCR定量mRNA表达。
除了αSMA表达之外，从IPF患者的肺中分离的成肌纤维细胞显示衰老特征。它们对细胞凋亡具有抗性，并且在新陈代谢中具有高活性，持续产生大量的ECM蛋白来驱动纤维化发生。CCN1(或CYR61)和CTGF属于这类蛋白。在TGFβ诱导下用ROCK抑制剂处理人肺成纤维细胞，强烈抑制CTGF和CCN1的表达，见图4b和4C。如图4d所示，通过细胞培养基ELISA测定所证实，分泌的CCN1蛋白也通过ROCK抑制而降低。将CCD18Lu成纤维细胞用ROCK抑制剂以及TGFβ处理40小时。使用来自R&D Systems的人CCN1 ELISA试剂盒测量CCN1含量。这些结果表明，ROCK抑制剂可以在纤维化条件下减弱成肌纤维细胞的促存活、促衰老信号。
实施例92
ROCK抑制剂有效降低博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中的多个纤维化指数
基于本发明的ROCK抑制剂的强抗纤维化细胞活性，在包括博来霉素诱导的肺纤维化的几种纤维化疾病的小鼠模型中评估了此类抑制剂在体内环境中减轻纤维化的能力。气管内滴注博来霉素后，以3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg的剂量向小鼠口服施用ROCK抑制剂。对照动物在相同的每日一次施用计划表中仅接受媒介物。治疗20天后，处死动物，并且取出肺，称重并固定以用于组织病理学评估。图5a显示了来自每个治疗组的在10倍物镜下的马森三色染色的肺切片的代表性图像。尽管在治疗组中仍存在纤维化的肿块形成(箭头)、肺泡隔膜增厚和结状形成(箭)，但与博来霉素诱导的对照组相比，它们所有的严重性较轻。(B＝细支气管)。在此模型中，总体ROCK抑制剂以剂量依赖性方式改善了肺结构和胶原沉积。接受≥10mg/kg剂量的小鼠表现出明显的并且统计学上显著的改善。
通过分别对组织病理学图像、IHC定量和流式细胞术应用Ashcoft评分标准，定量支气管肺泡灌洗液中总体肺纤维化、α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)百分比阳性面积和总白细胞计数的改善。与媒介物治疗的对照相比，施用≥10mg/kg ROCK抑制剂导致纤维化大体上减少和炎性白细胞浸润减少，如通过支气管肺泡灌洗液中较低的组平均纤维化指数、αSMA阳性面积和总白细胞计数所指示。参见图5b。
实施例93
当在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中治疗性施用时，ROCK抑制有效降低纤维化评分。
在气管内滴注博来霉素以诱导肺组织损伤和随后的肺纤维化之后，在博来霉素诱导的模型中评估了ROCK抑制剂在治疗性给药情况中减轻肺纤维化的活性。滴注博来霉素后7天(其允许在治疗开始之前确定纤维化)，用化合物或媒介物对照治疗小鼠。在第20天处死所有小鼠并收集肺。右肺的大肺叶用10％中性***固定，切片并用马森三色染色。在10mg/kg和30mg/kg ROCK抑制剂治疗组中观察到明显的抗纤维化作用，如通过较低的胶原蛋白含量和降低的马森三色染色评分所证明。参见图6a。
定量对照组和治疗组中每只动物的总体肺纤维化的改善。参见图6b。用组平均值和平均值的标准误差(SEM)显示出个别小鼠肺的马森三色染色切片。正常对照小鼠的评分为0。用实施例2化合物治疗的小鼠的肺中的胶原蛋白含量显著较低。
实施例94
在组胺诱导的血管通透性小鼠模型中，ROCK抑制稳定内皮屏障功能。
除了器官上皮所受到的损害之外，在纤维化疾病中，内皮细胞也发生损害，引起内皮屏障的不稳定和毛细血管渗漏，这两者都是纤维化组织的标志。ROCK信号传导途径在受损的内皮细胞中被上调，并导致进一步的屏障不稳定和血管渗漏。ROCK在诱导血管渗漏中的参与允许我们假设ROCK抑制剂的施用可以在体内稳定这种血管屏障功能。我们在组胺诱导的小鼠皮肤血管渗漏模型中测试了单剂量施用后阻断ROCK抑制剂活性的功效。在此模型中，组胺的皮内注射在组胺施用位点迅速诱导伊文思蓝染料的外渗。在组胺注射之前1小时施用实施例2的ROCK抑制剂，以剂量依赖性方式阻断由组胺诱导的血管通透性，这表明除了抗纤维化活性之外，本发明的ROCK抑制还可以用于与诱导的血管通透性有关的疾病。图7a显示了由组胺诱导的伊文思蓝染料外渗的代表性图像。
通过计算皮肤斑点总面积和渗透皮肤的伊文思蓝染料的量来定量化合物功效的程度。用组胺攻击后20分钟，对动物实施安乐死，测量病变直径。计算病变面积并以平方毫米表示。直径测量后，从皮肤组织中提取出伊文思蓝染料，并测量光密度。数据是根据伊文思蓝标准曲线中的尖峰计算的。**p＜0.01对媒介物组，使用单因素ANOVA，随后进行Dunnette事后测试。参见图7b。
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Claims (14)
1.一种具有式I的化合物：
其中：
A选自由以下组成的组
R1选自由以下组成的组：低级烷基、取代的低级烷基、C3-C6环烷基、取代的C3-C6环烷基、R10R11N(CR12R13)c-、R10O(CR12R13)c-、W(CR12R13)d-和R10R11N-C(＝O)-(CR12R13)c-；
每个R10独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R11独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R12独立地选自H和低级烷基；
每个R13独立地选自H和低级烷基；
另外或替代地，连接至同一碳原子的R12和R13可一起形成C3-C6环烷基；
W为具有1至3个环杂原子的3至7元杂环；
c为2至4；
d为1至4；
R2选自由以下组成的组：芳基、杂芳基、芳烷基和杂环基，它们中的每一个可为未取代的或任选地被1至3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RO2C-、芳基-O-和杂芳基-O-；
替代地，R1和R2一起形成单环基团或双环基团，其中所述单环基团具有4至7个环原子，包括至多2个环杂原子，并且所述双环基团具有8至10个环原子，包括至多3个环杂原子，并且其中所述单环基团和双环基团为未取代的或任选地被1至3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、氨基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、芳基和杂芳基；
R3选自H、低级烷基、取代的低级烷基和RR′N-(C2-4烷基)-；
R4选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RR′N-(C2-4烷基)-和RR′N-(C2-4烷基)-O-；
R5选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
替代地，R3和R5一起形成具有5至7个环原子的环状基团，包括2-3个环杂原子，其中所述环状基团为未取代的或任选地被1至3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、氨基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、芳基和杂芳基；
a为0或1；
b为0至2；
以及
每个R和R′独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基，或者替代地，R和R′一起形成5至6元杂环。
2.根据权利要求1所述的化合物，其具有式II：
其中：
R1选自由以下组成的组：低级烷基、取代的低级烷基、C3-C6环烷基、取代的C3-C6环烷基、R10R11N(CR12R13)c-、R10O(CR12R13)c-、W(CR12R13)d-和R10R11N-C(＝O)-(CR12R13)c-；
每个R10独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R11独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R12独立地选自H和低级烷基；
每个R13独立地选自H和低级烷基；
另外或替代地，连接至同一碳原子的R12和R13可一起形成C3-C6环烷基；
W为具有1至3个环杂原子的3至7元杂环；
c为2至4；
d为1至4；
R2选自由以下组成的组：芳基、杂芳基、芳烷基和杂环基，它们中的每一个可为未取代的或任选地被1至3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RO2C-、芳基-O-和杂芳基-O-；
替代地，R1和R2一起形成单环基团或双环基团，其中所述单环基团具有4至7个环原子，包括至多2个环杂原子，并且所述双环基团具有8至10个环原子，包括至多3个环杂原子，并且其中所述单环基团和双环基团为未取代的或任选地被1至3个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、氨基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、芳基和杂芳基；
R3选自H、低级烷基、取代的低级烷基和RR′N-(C2-4烷基)-；
R4选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RR′N-(C2-4烷基)-和RR′N-(C2-4烷基)-O-；
b为0至2；
以及
每个R和R′独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基，或者替代地，R和R′一起形成5至6元杂环。
3.根据权利要求1所述的化合物，其具有式III：
其中
环A为5或6元芳族环，其任选地含有0至2个环杂原子；
R3选自H、低级烷基、取代的低级烷基和RR′N-(C2-4烷基)-；
R4选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RR′N-(C2-4烷基)-和RR′N-(C2-4烷基)-O-；
b为0至2；
R6选自由以下组成的组：H、卤代基、低级烷基、取代的低级烷基、低级烷氧基、氨基、羟基和羧基；
R7选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、氨基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′NCO-、RCONH-和RCONR′-；
每个R和R′独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基，或者替代地，R和R′一起形成5至6元杂环；以及
m为1或2。
4.根据权利要求1所述的化合物，其具有式IV：
其中
环B为5或6元芳族环，其任选地含有0至2个环杂原子；
R3选自H、低级烷基、取代的低级烷基和RR′N-(C2-4烷基)-；
R4选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RR′N-(C2-4烷基)-和RR′N-(C2-4烷基)-O-；
b为0至2；
R8选自由以下组成的组：H、卤代基、低级烷基、取代的低级烷基、低级烷氧基、氨基、羟基和羧基；
R9选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、氨基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基和羧基、RR′NCO-、RCONH-和RCONR′-；
每个R和R′独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基，或者替代地，R和R′一起形成5至6元杂环；以及
m为1至3。
5.根据权利要求1所述的化合物，其具有式V：
其中：
R1选自由以下组成的组：低级烷基、取代的低级烷基、C3-C6环烷基、取代的C3-C6环烷基、R10R11N(CR12R13)c-、R10O(CR12R13)c-、W(CR12R13)d-和R10R11N-C(＝O)-(CR12R13)c-；
每个R10独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R11独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R12独立地选自H和低级烷基；
每个R13独立地选自H和低级烷基；
另外或替代地，连接至同一碳原子的R12和R13可一起形成C3-C6环烷基；
W为具有1至3个环杂原子的3至7元杂环；
c为2至4；
d为1至4；
R4选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RR′N-(C2-4烷基)-和RR′N-(C2-4烷基)-O-；
b为0至2；
每个R21独立地选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RO2C-、芳基-O-和杂芳基-O-；
每个R和R′独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基，或者
替代地，R和R′一起形成5至6元杂环；以及
n为0至3。
6.根据权利要求1所述的化合物，其具有式VI：
其中：
R1选自由以下组成的组：低级烷基、取代的低级烷基、C3-C6环烷基、取代的C3-C6环烷基、R10R11N(CR12R13)c-、R10O(CR12R13)c-、W(CR12R13)d-和R10R11N-C(＝O)-(CR12R13)c-；
每个R10独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R11独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R12独立地选自H和低级烷基；
每个R13独立地选自H和低级烷基；
另外或替代地，连接至同一碳原子的R12和R13可一起形成C3-C6环烷基；
W为具有1至3个环杂原子的3至7元杂环；
c为2至4；
d为1至4；
每个R22独立地选自H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RO2C-、芳基-O-和杂芳基-O-；
每个R和R′独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基，或者替代地，R和R′一起形成5至6元杂环。
7.根据权利要求1所述的化合物，其具有式VII：
其中：
环A为5或6元芳族环，其任选地含有0至2个环杂原子；
R3选自H、低级烷基、取代的低级烷基和RR′N-(C2-4烷基)-；
R4选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′N-、RR′NCO-、RCONH-、RCONR′-、RR′N-(C2-4烷基)-和RR′N-(C2-4烷基)-O-；
b为0至2；
R6选自由以下组成的组：H、卤代基、低级烷基、取代的低级烷基、低级烷氧基、氨基、羟基和羧基；
R7选自由以下组成的组：H、卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、氨基、硝基、氰基、C1-C3全氟烷基、C1-C3全氟烷氧基、羧基、RR′NCO-、RCONH-和RCONR′-；
每个R和R′独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基，或者替代地，R和R′一起形成5至6元杂环；以及
m为1或2。
8.根据权利要求1所述的化合物，其具有式X：
其中：
R1选自由以下组成的组：低级烷基、取代的低级烷基、C3-C6环烷基、取代的C3-C6环烷基、R10R11N(CR12R13)c-、R10O(CR12R13)c-、W(CR12R13)d-和R10R11N-C(＝O)-(CR12R13)c-；
每个R10独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R11独立地选自H、低级烷基和C3-C6环烷基；
每个R12独立地选自H和低级烷基；
每个R13独立地选自H和低级烷基；
另外或替代地，连接至同一碳原子的R12和R13可一起形成C3-C6环烷基；
W为具有1至3个环杂原子的3至7元杂环；
c为2至4；
d为1至4；
每个R22独立地选自由以下组成的组：卤代基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、氨基、C1-C3全氟烷基和C1-C3全氟烷氧基；以及
n为0至3。
9.一种治疗受试者的纤维化病症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至8中任一项所述的化合物。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述纤维化病症选自由以下组成的组：肺纤维化，包括囊性和特发性肺纤维化；放射诱发的肺损伤；肝纤维化，包括肝硬化；心脏纤维化，包括动脉纤维化；心内膜心肌纤维化；陈旧性心肌梗死；动脉僵硬；动脉粥样硬化；再狭窄；关节纤维化；克罗恩氏病；骨髓纤维化；佩罗尼氏病；肾源性***性纤维化；进行性块状纤维化；腹膜后腔纤维化；硬皮病/***性硬化症；纵隔纤维化；瘢痕疙瘩和增生性瘢痕；神经胶质瘢痕形成；或肾纤维化。
11.一种治疗受试者的中枢神经***病症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至8中任一项所述的化合物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述中枢神经***病症选自由以下组成的组：亨延顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、巴滕病、痴呆、脊髓性肌萎缩症、运动神经元病、脊髓小脑性共济失调、急性或慢性疼痛、痴呆、神经元变性、脊髓损伤、脑血管痉挛或多发性硬化症。
13.一种治疗受试者的青光眼的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至8中任一项所述的化合物。
14.一种治疗受试者的炎症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至8中任一项所述的化合物。
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