CN111041064A - 一种体外评价car-t杀伤活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种体外评价CAR‑T杀伤活性的方法。针对目前CAR‑T细胞体外杀伤活性检测方法涉及同位素安全性、操作繁琐等问题，为了更加方便、简单的实现CAR‑T细胞体外杀伤活性的检测，本申请构建一种能够在体外评价CAR‑T杀伤功能的细胞株，并提供一种运用RTCA检测CAR‑T体外杀伤活性的方法，该方法能够高效、灵敏、连续性的体外检测CAR‑T细胞杀伤活性，从而为CAR‑T细胞的后续治疗效果提供保障。

Description

一种体外评价CAR-T杀伤活性的方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种体外评价CAR-T杀伤活性的方法。
背景技术
免疫细胞的肿瘤杀伤活性的体外评价过程都涉及到免疫细胞和肿瘤细胞两种细胞存在，因此不能采取传统的细胞增殖活性检测手段(如MTT、ATP等方法)直接进行检测，而要采用不同的标记手段。目前采用的评价方法，包括以下这几种：(1)放射性同位素51Cr释放检测，同位素51Cr释放是最经典的评价CAR-T免疫细胞对肿瘤细胞杀伤的细胞毒性检测方法，51Cr可特异性标记目标肿瘤细胞，洗涤并离心去除多余51Cr后，加入CAR-T免疫细胞共同培养，免疫细胞启动杀伤程序后，将目标肿瘤细胞裂解，51Cr随之释放到上清中，使用Gamma计数仪或液闪计数仪检测释放到上清中的51Cr含量评价杀伤活性；(2)BATDA DELIFA时间分辨荧光检测，BATDA的检测原理与同位素51Cr释放的方法相似，通过特异性乙酰酯化的荧光探针BATDA标记目标肿瘤细胞，酯化的BATDA可穿透细胞膜随后被活细胞内的乙酰酯酶去乙酰化，去乙酰化的TDA不能再次透过细胞膜而滞留的细胞内，加入CAR-T免疫细胞，裂解后的目标肿瘤细胞将TDA释放到上清中，与时间分辨荧光探针Eu结合形成Eu-TDA复合物，最终通过检测该复合物的时间分辨荧光信号评价免疫细胞杀伤活性。
上面CAR-T细胞体外杀伤活性检测方法涉及同位素安全性、操作繁琐等问题，为了更加方便、简单的实现CAR-T细胞体外杀伤活性的检测，本申请提供了一种全新的实时无标记细胞分析技术(RealTime Cellular Analysis，RTCA)检测CAR-T细胞体外杀伤活性。实时无标记细胞分析技术(RealTime Cellular Analysis，RTCA)采用特殊工艺，将微电子细胞传感器芯片整合到表面适于细胞贴附与生长的细胞检测板的底部或细胞浸润迁移板的微孔膜，用以构建实时、动态、定量跟踪细胞形态和增殖分化等改变的细胞阻抗检测传感***。当贴壁生长在微电极表面的细胞引起贴壁电极界面阻抗的改变时，这种改变与细胞的实时功能状态改变成相关性，通过实时动态的电极阻抗检测可以获得细胞生理功能相关的生物信息，包括细胞生长、伸展、形态变化、浸润及迁移、死亡和贴壁等。目前RTCA应用在细胞增殖检测、化合物及细胞因子介导的细胞毒作用、细胞迁移及浸润检测、细胞质量控制、细胞粘附及伸展检测、受体介导的信号通路检测、细胞与细胞相互作用(共培养)、病毒介导的细胞病变(病毒CPE)检测、NK细胞介导的细胞杀伤作用检测、药物筛选应用、药物心肌细胞毒性检测等各方面，但是目前还未曾有研究将其应用到CAR-T体外杀伤活性检测方面，原因是CAR-T主要的治疗靶标是表达某种靶标抗原的血液肿瘤，而血液肿瘤细胞多为悬浮细胞，无法满足RTCA只能检测贴壁细胞信号的要求。为了克服上述问题，本申请创造性的将CAR-T细胞在治疗血液***肿瘤时针对的靶标抗原表达在贴壁的肿瘤细胞上，构建一种过表达CAR-T靶标抗原的贴壁肿瘤细胞株，在CAR-T体内治疗开始前，运用这种贴壁肿瘤细胞作为靶细胞，CAR-T作为效应细胞，进行体外共培养，并利用RTCA技术高效、灵敏、连续性的检测贴壁肿瘤细胞的贴壁信号，由此来体外评价CAR-T的杀伤活性，从而为CAR-T的后续体内治疗效果提供依据。
发明内容
本发明的目的在于构建一种能够在体外评价CAR-T杀伤功能的细胞株，并提供一种运用RTCA检测CAR-T的体外杀伤活性的方法，具体步骤为：
(1)制备并培养表达靶标抗原的贴壁细胞，所述靶标抗原为待检测CAR-T特异性识别的靶标抗原；
(2)向含有贴壁细胞的培养体系中加入待检测的CAR-T细胞；
(3)采用RTCA检测CAR-T细胞对贴壁细胞的杀伤作用。
进一步，制备并培养稳定表达靶标抗原的贴壁细胞。具体包括：贴壁细胞的复苏，载体的构建，细胞的转染。优选的，还包括转染结束后的细胞筛选。
载体的构建是将目的基因(表达靶标抗原的基因)构建到载体上。
细胞的转染分为瞬时转染与稳定转染。优选稳定转染。
用于转染细胞的方式有很多，包括病毒转染、脂质体转染、电转和基因枪法等。
优选的，贴壁细胞选自下列细胞中的一种或几种：J82、JEG-3、KMST-6、KB、LAN-5、MKN45、MeWo、MDA-MB-468、ME-180、MES-SA、MG-63、MRC-5、MT-2、Hep3b、HEP2、HeLa、HCT116、HepG2、H1299、HITB5、G401、GOTO、NCI-H441、H4、NCI-H187、HBL-100、HASMCs、HaCaT、HCA-7、hAECs、RKO、RH-18、SK-BR-3、Saos-2、SiHa、SHEP、SK-LMS-1、SK-N-SH、SK-N-AS、SK-N-MC、SKOV3、SK-N-BE(2)、SMMC-7721、SK-UT-1、NB324K、NCI-H23、NCI-H460、NCI-H295、NCI-H358、NHDF、NHBE、NT2、NHFF、NT2-D1、OVCAR-3、PANC1、HMEC-1、HT-29、Hs68、HS-578T、HMVEC-L、HuH-7、HT1080、HUVEC,HUAEC、HuTu-80、IMR-32、IMR-90、CaSki、Colo205、SNB19、SW620、SW480、T47D、T98G、TSA201、SK-N-BE(2)-C、BEAS-2B、A549、A204、A875、A498、A-431、ARPE-19、ACHN、CWR22RVL、DU145、Daoy、LNCaP、MDA-MB-453、MAGI-CCR5、MDA-MB-231、MCF-10、MCF-7、UOK257、U373MG、U87,U87MG、U251、U-2OS、BOSC 23、C3A、C33、BT549、CIR,HMy2.CIR、Calu-3、Caco-2、Calu-6、Capan-2、C4-2、CCD-1064SK、OV2008、293EBNA、A2780、9HTE、5637、EBC-1、ES-2、SRA01/04、FLP-IN-293、FLP-INT-REX 293。
进一步，贴壁细胞为肿瘤细胞。
优选的，肿瘤细胞为实体肿瘤细胞系。
所述肿瘤细胞选自肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、***、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤、垂体瘤、膀胱癌、骨髓瘤、神经细胞瘤、胶质瘤、皮肤癌、颅内动脉瘤、***癌细胞等。
进一步，靶标抗原为血液肿瘤细胞表面表达的抗原。
CAR-T细胞还可以是在细胞表面表达CAR的免疫细胞，优选的，免疫细胞为T细胞、CIK细胞、NK细胞、TIL细胞或DC细胞等。
进一步，贴壁细胞和CAR-T细胞的比例为：1:5-5:1。优选的，贴壁细胞和CAR-T细胞的比例为：1:5、1:1、5:1。
进一步，靶标抗原为CD19。
构建一种能够在体外评价CD19 CAR-T杀伤功能的细胞株，并提供一种运用RTCA检测CD19 CAR-T的体外杀伤活性的方法，具体步骤为：
(1)制备并培养表达CD19的贴壁细胞；
(2)向步骤(1)的贴壁细胞的培养体系中加入待检测的CD19 CAR-T细胞；
(3)采用RTCA检测CD19 CAR-T细胞对贴壁细胞的杀伤作用。
进一步，制备并培养稳定表达CD19的贴壁细胞，具体包括：贴壁细胞的复苏，含CD19载体的构建，细胞的转染；优选的，还包括转染结束后的细胞筛选。
进一步，细胞的转染为病毒转染、脂质体转染、电转或基因枪法转染。
采用RTCA检测CAR-T细胞对贴壁细胞的杀伤作用具体包括：
(1)向检测板中加入培养基并测定背景阻抗值。
(2)收集对数期的表达靶标抗原的贴壁细胞并计数，调整细胞悬液浓度，向检测板中加入表达靶标抗原的贴壁细胞，室温超净台内静置。
(3)将加入表达靶标抗原的贴壁细胞的检测板放入检测台上，进行实时动态的细胞增殖检测。
(4)待靶细胞贴壁后，向各培养孔中分别加入效应细胞：阴性对照组加入非特异性CAR-T细胞，实验组加入靶标抗原CAR-T细胞，空白对照组不加CAR-T细胞悬液，并继续进行检测，即可获得实时的细胞效应曲线。
采用RTCA检测CD19 CAR-T细胞对贴壁细胞的杀伤作用具体包括：
(1)向检测板中加入培养基并测定背景阻抗值。
(2)收集对数期的表达CD19的贴壁细胞并计数，调整细胞悬液浓度，向检测板中加入表达CD19的贴壁细胞，室温超净台内静置。
(3)将加入表达CD19的贴壁细胞的检测板放入检测台上，进行实时动态的细胞增殖检测。
(4)检测10-30小时后，向各培养孔中分别加入阴性对照组：表达CD19的贴壁细胞+非特异性CAR-T细胞，实验组：表达CD19的贴壁细胞+CD19 CAR-T细胞，空白对照组为表达CD19的贴壁细胞不加CAR-T细胞，并继续进行检测，即可获得实时的细胞效应曲线。
CAR-T疗法即为免疫疗法的一种，属于细胞过继免疫治疗，它是将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部作为胞外部分以及天然TCR复合物和共刺激分子的融合信号域作为胞内部分，在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法导入患者的T细胞，使其表达嵌合抗原受体，即CAR。患者的T细胞被“重编码”后，能够生成大量肿瘤特异性的CAR-T细胞，从而特异性识别靶抗原，杀伤靶细胞。CAR-T细胞在体内及体外均具有对特定肿瘤抗原的高度亲和性和对表达抗原的肿瘤细胞的高效杀伤性。且患者对CAR-T细胞免疫疗法的耐受性较好。
与B细胞血液肿瘤免疫治疗相关的抗原：CD19是B细胞表面的跨膜蛋白，是B淋巴细胞表面的一种功能受体分子，与B细胞活化、信号转导及生长调节密切相关。在不同分化阶段的B淋巴细胞表面均有特异性表达，95％以上的非霍奇金淋巴瘤和B淋巴细胞白血病均表达CD19抗原，可以作为CAR-T细胞治疗的靶点。
附图说明
图1是SKBR3细胞、SKBR3-CD19-GFP细胞GFP荧光照片；
图2是流式细胞术检测未经单克隆筛选之前SKBR3-CD19-GFP细胞CD19表达情况；
图3是流式细胞术检测经单克隆筛选之后SKBR3-CD19-GFP细胞CD19表达情况；
图4是采用RTCA衡量CD19 CAR-T细胞的杀伤能力图；
图5是MDA-MB-231细胞、MDA-MB-231-CD19-GFP细胞GFP荧光照片；
图6是流式细胞术检测MDA-MB-231-CD19-GFP细胞CD19的表达情况；
图7是采用RTCA衡量CD19 CAR-T细胞的杀伤能力图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1
一、实验材料：
SKBR3细胞；CD19病毒LV-CD19(26043-1)(吉凯基因)；感染增强剂polybrene(吉凯基因)；puromycin(vicmed)；PE-CD19流式抗体(三箭生物)；DMEM培养基(Hyclone)(含10％FBS)；
仪器：流式细胞仪(BD)；RTCA(安捷伦生物)；显微镜(奥林巴斯)。
二、实验方法：
1、CD19病毒感染SKBR3细胞。
通过感染预实验确定病毒对SKBR3细胞的最佳感染条件(包括接种细胞量、感染试剂及感染后换液时间等)和感染复数(MOI)。具体操作步骤如下：
(1)感染前一天，用DMEM培养基(含10％FBS)将生长状态良好的SKBR3细胞制备密度为3.75×105个/ml的细胞悬液，将细胞悬液按2ml/孔(7.5×105细胞/孔)接种于6孔板中，接种2个孔；
(2)37℃培养16-24h后，其中一个孔按MOI＝17感染LV-CD19(26043-1)病毒，加Polybrene(感染增强剂)增强病毒感染效率，另外一孔作为溶剂对照孔；
(3)感染24h后补加培养基，保持细胞活性；
(4)感染24h后，感染孔和对照孔加入2μg/ml的Puromycin进行药物筛选；
(5)药筛至溶剂对照组细胞完全死亡；
(6)感染后约72h，用荧光成像观察感染效率。
2、CD19过表达验证：
(1)荧光成像实验
感染了CD19病毒的SKBR3细胞用荧光显微镜确认细胞GFP荧光表达，以检测病毒感染效率。
(2)流式细胞术实验
流式细胞仪检测过表达CD19的SKBR3细胞中CD19的表达量，具体步骤如下：
1)用胰酶细胞消化液消化SKBR3-CD19-GFP细胞，用含有10％FBS的DMEM培养基中和消化；
2)1000rpm离心5min，1×PBS洗两遍细胞，100μl 1×PBS重悬细胞，调整细胞密度至1×106/100μl；
3)每100μl的细胞样品中加入5μl PE直标的CD19流式抗体以标记细胞表面CD19，避光，冰上孵育30min；
4)1×PBS洗细胞两遍以除去未结合的抗体，300μl 1×PBS重悬细胞，流式细胞仪检测细胞膜表面CD19的表达量。
3、SKBR3-CD19-GFP细胞单克隆化。
(1)流式分选SKBR3-CD19-GFP中CD19以及GFP强阳性的细胞，使其以单克隆形式生长，以筛选出高表达CD19的SKBR3细胞，提高CD19+ SKBR3细胞的阳性率。
(2)流式细胞仪检测过表达CD19的SKBR3单克隆细胞CD19的表达量。4、RTCA判断通过以SKBR3-CD19-GFP(或简称为SKBR3-CD19)细胞作为靶细胞来衡量CD19 CAR-T细胞杀伤功能的可行性。
(1)向E-Plate检测板中加入培养基并测定背景阻抗值。
(2)收集对数期的SKBR3、SKBR3-CD19细胞并计数，调整细胞悬液浓度至4×105个/ml，向E-Plate检测板中加入50μl的SKBR3、SKBR3-CD19细胞，室温超净台内放置30min。
(3)将加入SKBR3-CD19细胞的E-Plate检测板放入检测台上(检测台预先放入培养箱中)，进行实时动态的细胞增殖检测。
(4)检测20h后，向各培养孔中分别加入阴性对照组：SKBR3+CD19 CAR-T细胞(1:5)、SKBR3-CD19+BCMA CAR-T细胞(1:5)，实验组：SKBR3-CD19+CD19 CAR-T细胞(1:5)、空白对照组SKBR3-CD19不加CAR-T细胞，并继续进行检测，即可获得实时的细胞效应曲线。
三、实验结果
1、CD19病毒感染SKBR3细胞：GFP荧光结果显示，CD19病毒成功感染SKBR3细胞(具体见图1)。
2、流式细胞仪检测过表达CD19的SKBR3细胞CD19的表达量：
(1)SKBR3-CD19-GFP未经单克隆筛选之前，SKBR3-CD19-GFP混合克隆细胞CD19表达量约为80％以上(具体见图2)。
(2)SKBR3-CD19-GFP经单克隆筛选之后，SKBR3-CD19-GFP单克隆细胞CD19表达量达到97％以上，SKBR3-CD19-GFP细胞株构建成功(具体见图3)。
3、RTCA：以SKBR3-CD19-GFP细胞作为靶细胞来衡量CD19 CAR-T细胞的杀伤功能。结果显示：从实验开始至加入效应细胞CD19 CAR-T细胞及对照效应细胞BCMA CAR-T细胞之前，靶细胞SKBR3细胞和SKBR3-CD19-GFP细胞正常增殖，在第20h加入效应细胞及对照效应细胞，加入效应细胞后20h开始出现杀伤功能。CD19 CAR-T细胞特异性杀伤SKBR3-CD19-GFP细胞的效应明显强于其它非特异性杀伤。CD19 CAR-T细胞可特异性杀伤SKBR3-CD19-GFP细胞，说明将SKBR3-CD19-GFP细胞作为靶细胞来衡量CD19 CAR-T细胞的杀伤功能是可行的(具体见图4)。
实施例2
一、实验材料：
MDA-MB-231细胞；CD19病毒LV-CD19(26043-1)(吉凯基因)；感染增强剂polybrene(吉凯基因)；puromycin(vicmed)；PE-CD19流式抗体(三箭生物)；DMEM培养基(Hyclone)(含10％FBS)；
仪器：流式细胞仪(BD)；RTCA(安捷伦生物)；显微镜(奥林巴斯)。
二、实验方法：
1、CD19病毒感染MDA-MB-231细胞。
通过感染预实验确定病毒对MDA-MB-231细胞的最佳感染条件(包括接种细胞量、感染试剂及感染后换液时间等)和感染复数(MOI)。具体操作步骤如下：
(1)感染前一天，用DMEM培养基(含10％FBS)将生长状态良好的MDA-MB-231细胞制备密度为3.75×105个/ml的细胞悬液，将细胞悬液按2ml/孔(7.5×105细胞/孔)接种于6孔板中，接种2个孔；
(2)37℃培养16-24h后，其中一个孔按MOI＝10感染LV-CD19(26043-1)病毒，加Polybrene(感染增强剂)增强病毒感染效率，另外一孔作为溶剂对照孔；
(3)感染24h后补加培养基，保持细胞活性；
(4)感染24h后，感染孔和对照孔加入2μg/ml的Puromycin进行药物筛选；
(5)药筛至溶剂对照组细胞完全死亡；
(6)感染后约72h，用荧光成像观察感染效率。
2、CD19过表达验证：
(1)荧光成像实验
感染了CD19病毒的MDA-MB-231细胞用荧光显微镜确认细胞GFP荧光表达，以检测病毒感染效率。
(2)流式细胞术实验
流式细胞仪检测过表达CD19的MDA-MB-231细胞中CD19的表达量，具体步骤如下：
1)用胰酶细胞消化液消化MDA-MB-231-CD19-GFP细胞，用含有10％FBS的DMEM培养基中和消化；
2)1000rpm离心5min，1×PBS洗两遍细胞，100μl 1×PBS重悬细胞，调整细胞密度至1×106/100μl；
3)每100μl的细胞样品中加入5μl PE直标的CD19流式抗体以标记细胞表面CD19，避光，冰上孵育30min；
4)1×PBS洗细胞两遍以除去未结合的抗体，300μl 1×PBS重悬细胞，流式细胞仪检测细胞膜表面CD19的表达量。
3、RTCA判断通过以MDA-MB-231-CD19-GFP(或简称为MDA-MB-231-CD19)细胞作为靶细胞来衡量CD19 CAR-T细胞杀伤功能的可行性。
(1)向E-Plate检测板中加入培养基并测定背景阻抗值。
(2)收集对数期的MDA-MB-231、MDA-MB-231-CD19细胞并计数，调整细胞悬液浓度至4×105个/ml，向E-Plate检测板中加入50μl的MDA-MB-231、MDA-MB-231-CD19细胞，室温超净台内放置30min。
(3)将加入MDA-MB-231-CD19细胞的E-Plate检测板放入检测台上(检测台预先放入培养箱中)，进行实时动态的细胞增殖检测。
(4)检测20h后，向各培养孔中分别加入阴性对照组：MDA-MB-231+CD19CAR-T细胞(1:5)、MDA-MB-231-CD19+BCMA CAR-T细胞(1:5)，实验组：MDA-MB-231-CD19+CD19 CAR-T细胞(1:5)、空白对照组MDA-MB-231-CD19不加CAR-T细胞，并继续进行检测，即可获得实时的细胞效应曲线。
三、实验结果
1、CD19病毒感染MDA-MB-231细胞：GFP荧光结果显示，CD19病毒成功感染MDA-MB-231细胞(具体见图5)。
2、流式细胞仪检测过表达CD19的MDA-MB-231细胞CD19的表达量：
MDA-MB-231-CD19-GFP细胞CD19表达量达到95％以上，MDA-MB-231-CD19-GFP细胞株构建成功(具体见图6)。
3、RTCA：以MDA-MB-231-CD19-GFP细胞作为靶细胞来衡量CD19 CAR-T细胞的杀伤功能。结果显示：从实验开始至加入效应细胞CD19 CAR-T细胞及对照效应细胞BCMA CAR-T细胞之前，靶细胞MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231-CD19-GFP细胞正常增殖，在第20h加入效应细胞及对照效应细胞，加入效应细胞后10h开始出现杀伤功能。CD19 CAR-T细胞特异性杀伤MDA-MB-231-CD19-GFP细胞的效应明显强于其它非特异性杀伤。CD19 CAR-T细胞可特异性杀伤MDA-MB-231-CD19-GFP细胞，说明将MDA-MB-231-CD19-GFP细胞作为靶细胞来衡量CD19 CAR-T细胞的杀伤功能是可行的(具体见图7)。

Claims (10)

1.构建一种能够在体外评价CAR-T杀伤功能的细胞株，并提供一种运用RTCA检测CAR-T的体外杀伤活性的方法，具体步骤为：
(1)制备并培养表达靶标抗原的贴壁细胞，所述靶标抗原为待检测CAR-T特异性识别的靶标抗原；
(2)向含有贴壁细胞的培养体系中加入待检测的CAR-T细胞；
(3)采用RTCA检测CAR-T细胞对贴壁细胞的杀伤作用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，制备并培养稳定表达靶标抗原的贴壁细胞，具体包括：贴壁细胞的复苏，载体的构建，细胞的转染；优选的，还包括转染结束后的细胞筛选。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，细胞的转染为病毒转染、脂质体转染、电转或基因枪法转染。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，贴壁细胞为肿瘤细胞，优选的，肿瘤细胞选自下列肿瘤中的一种或几种：肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、***、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤、垂体瘤、膀胱癌、骨髓瘤、神经细胞瘤、胶质瘤、皮肤癌、颅内动脉瘤、***癌细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，贴壁细胞选自下列细胞中的一种或几种：J82、JEG-3、KMST-6、KB、LAN-5、MKN45、MeWo、MDA-MB-468、ME-180、MES-SA、MG-63、MRC-5、MT-2、Hep3b、HEP2、HeLa、HCT116、HepG2、H1299、HITB5、G401、GOTO、NCI-H441、H4、NCI-H187、HBL-100、HASMCs、HaCaT、HCA-7、hAECs、RKO、RH-18、SK-BR-3、Saos-2、SiHa、SHEP、SK-LMS-1、SK-N-SH、SK-N-AS、SK-N-MC、SKOV3、SK-N-BE(2)、SMMC-7721、SK-UT-1、NB324K、NCI-H23、NCI-H460、NCI-H295、NCI-H358、NHDF、NHBE、NT2、NHFF、NT2-D1、OVCAR-3、PANC1、HMEC-1、HT-29、Hs68、HS-578T、HMVEC-L、HuH-7、HT1080、HUVEC,HUAEC、HuTu-80、IMR-32、IMR-90、CaSki、Colo205、SNB19、SW620、SW480、T47D、T98G、TSA201、SK-N-BE(2)-C、BEAS-2B、A549、A204、A875、A498、A-431、ARPE-19、ACHN、CWR22RVL、DU145、Daoy、LNCaP、MDA-MB-453、MAGI-CCR5、MDA-MB-231、MCF-10、MCF-7、UOK257、U373MG、U87,U87MG、U251、U-2OS、BOSC23、C3A、C33、BT549、CIR,HMy2.CIR、Calu-3、Caco-2、Calu-6、Capan-2、C4-2、CCD-1064SK、OV2008、293EBNA、A2780、9HTE、5637、EBC-1、ES-2、SRA01/04、FLP-IN-293、FLP-IN T-REX293。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，靶标抗原为血液肿瘤细胞表面表达的抗原。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，表达靶标抗原的贴壁细胞和待检测CAR-T细胞的比例为：1:5-5:1；优选的，表达靶标抗原的贴壁细胞和待检测CAR-T细胞的比例为：1:5、1:1、5:1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用RTCA检测CAR-T细胞对贴壁细胞的杀伤作用具体包括：
(1)向检测板中加入培养基并测定背景阻抗值。
(2)收集对数期的表达靶标抗原的贴壁细胞并计数，调整细胞悬液浓度，向检测板中加入表达靶标抗原的贴壁细胞，室温超净台内静置。
(3)将加入表达靶标抗原的贴壁细胞的检测板放入检测台上，进行实时动态的细胞增殖检测。
(4)检测10-30小时后，向各培养孔中分别加入阴性对照组：表达靶标抗原的贴壁细胞+非特异性CAR-T细胞，实验组：表达靶标抗原的贴壁细胞+靶标抗原CAR-T细胞，空白对照组不加CAR-T细胞，并继续进行检测，即可获得实时的细胞效应曲线。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，CAR-T细胞还可以是在细胞表面表达CAR的免疫细胞，优选的，免疫细胞为T细胞、CIK细胞、NK细胞、TIL细胞或DC细胞。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的方法，其特征在于，靶标抗原为CD19。
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