CN111041049A - 一种基于近红外光控的CRISPR-Cas13a***制备方法及其应用 - Google Patents

一种基于近红外光控的CRISPR-Cas13a***制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于近红外光控的CRISPR‑Cas13a***制备方法及其应用，根据目的基因mRNA的序列设计合成crRNA，将其和纯化的Cas13a蛋白形成Cas13a‑crRNA复合物，通过光敏分子将Cas13a‑crRNA复合物与上转换纳米材料连接在一起获得UCNPs‑Cas13a；再用PEI涂覆UCNPs‑Cas13a得到UCNPs‑Cas13a@PEI；所制备的UCNPs‑Cas13a@PEI附着在真核生物细胞表面并进入细胞，利用UCNPs‑Cas13a@PEI的PEI促进内体逃逸；在NIR激光照射下Cas13a‑crRNA被释放，在目的基因mRNA上寻找与crRNA间隔序列对应的互补序列，crRNA与目的基因mRNA匹配以激活Cas13a的HEPN催化位点剪切mRNA，进而抑制真核生物目的基因表达。

Description

一种基于近红外光控的CRISPR-Cas13a***制备方法及其 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是一种基于近红外光控的CRISPR-Cas13a***制备方法及其应用。
背景技术
伴随着酵母菌、霉菌等食品微生物全基因组测序的完成，快速高效解析基因功能成为科研工作者予以解决的问题。针对该问题，人们运用RNA干扰、CRISPR-Cas9等技术通过抑制基因表达阐释基因功能，但这些方法存在一些不足，如操作复杂，容易产生脱靶效应，抑制效率低等，因此开发新的基因表达抑制方法迫在眉睫。
简便、快速、高效的近红外光控的CRISPR-Cas13a***能够通过近红外光照远程控制Cas13a-crRNA复合物从上转换纳米材料上释放，寻找靶标匹配进而激活Cas13a蛋白的HEPE催化位点，达到切割目的基因mRNA抑制基因表达的目的，为解析基因功能提供新思路和新方法。与其他基因表达抑制工具相比，该方法在时间、空间、效率上更易控制，此外，还可以同时编辑多个基因的mRNA。
利用近红外光控的CRISPR-Cas13a***抑制酵母菌、霉菌等食品微生物合成代谢途径中关键基因的表达，为推动食品生物技术以及代谢工程领域的快速发展提供新方法。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明提出了一种基于近红外光控的CRISPR-Cas13a***制备方法及其抑制真核生物基因表达的应用，利用上转换荧光纳米材料的独特光学性质以及光敏分子连接的Cas13a-crRNA复合物的远程动态调控，采用近红外光控的CRISPR-Cas13a***进行RNA编辑；本发明的方法特异性强、稳定性高，可实现真核生物细胞中目的基因mRNA的降解和基因表达水平的抑制。
本发明所采用的技术方案如下：
一种基于近红外光控的CRISPR-Cas13a***制备方法，根据目的基因mRNA的序列设计合成crRNA，将crRNA和纯化的Cas13a蛋白形成Cas13a-crRNA复合物，通过光敏分子将Cas13a-crRNA复合物与上转换纳米材料连接在一起，获得UCNPs-Cas13a；再使用聚乙烯亚胺PEI涂覆UCNPs-Cas13a的外层得到UCNPs-Cas13a@PEI；
进一步，将所述crRNA设计成gRNA库，编辑多个基因的mRNA，实现对多个基因表达的抑制；
进一步，所述crRNA的序列格式为5’-Cas13a蛋白直接重复序列-crRNA间隔序列-3’；其中，Cas13a蛋白直接重复序列依Cas13a来源而定；
进一步，所述Cas13a蛋白选择LshCas13a蛋白、LwCas13a蛋白或者LbuCas13a蛋白；Cas13a蛋白在crRNA的引导下特异性结合目的基因mRNA并将其剪切，而且以Cas13a和crRNA为主构成简单、快速、高效的CRISPR-Cas13a***可代替RNA干扰作为RNA编辑工具使用。
进一步，所述上转换纳米材料采用一步溶剂热法合成，得到羧基修饰的上转换纳米材料(UCNPS)；
进一步，所述的光敏分子为ONA分子，ONA分子的两端分别连接Cas13a-crRNA复合物和上转换纳米材料；
进一步，所述光敏分子在NIR激光照射下，光敏分子所连接的Cas13a-crRNA复合物从上转换纳米材料上释放，从而实现CRISPR-Cas13a***的动态调控；
一种将上述近红外光控的CRISPR-Cas13a***制备方法制备的CRISPR-Cas13a***应用于非疾病诊断和治疗的抑制真核生物基因表达的用途，其过程为：所述UCNPs-Cas13a@PEI与真核生物细胞表面结合后可通过胞吞作用进入细胞，利用UCNPs-Cas13a@PEI所涂覆的PEI促进内体逃逸；在NIR激光照射下Cas13a-crRNA被释放，在目的基因mRNA上寻找与crRNA间隔序列对应的互补序列，crRNA与目的基因mRNA匹配以激活Cas13a的HEPN催化位点剪切mRNA，进而抑制真核生物目的基因表达。
进一步，所述PEI结构中存在许多胺基，能使内体内渗透压增加，引起离子内流，导致膜胀破，因此能够增强内体逃逸。
本发明的有益效果：
1、本发明公开了一种基于近红外光控的CRISPR-Cas13a***的抑制真核生物基因表达。该方法主要根据目的基因mRNA的序列设计合成crRNA，与Cas13a蛋白形成Cas13a-crRNA复合物，将其与羧基修饰上转换纳米材料通过光敏分子连接，PEI涂覆外层获得UCNPs-Cas13a@PEI，当其与真核生物细胞表面结合，通过胞吞作用进入细胞内，PEI促进内体逃逸，在NIR激光照射下释放的Cas13a-crRNA复合物在目的基因mRNA上寻找crRNA的互补序列，与其匹配以激活Cas13a剪切mRNA，实现目的基因mRNA的降解和表达水平的抑制。该发明将CRISPR-Cas13a***，上转换荧光纳米材料的独特光学性质以及远程动态调控光敏分子连接的Cas13a-crRNA复合物释放，采用近红外光控CRISPR-Cas13a***进行RNA编辑新思路，建立真核生物细胞中基因表达水平抑制的新方法。
2、本发明公开的基于近红外光控的CRISPR-Cas13a***的抑制真核生物基因表达的方法与RNA干扰作用效果相当，但特异性更高，适用范围更广。另外，将crRNA设计成gRNA库，可同时靶向mRNA的多个位点，实现对多个基因表达的抑制；与CRISPR-Cas9编辑技术相比，其不改变编码基因本身，在时间上、空间上和效率上更加可控，而且也可同时修改多个基因、同时靶向多拷贝基因的所有mRNA，更加高效。
3、本发明公开的基于近红外光控的CRISPR-Cas13a***的抑制真核生物基因表达的方法可实现远程操控。在细胞内部，这种递送***经近红外光照射产生可见光加以激活，RNA编辑工具从上转换纳米颗粒上释放，与靶标结合后完成切割，实现降解目的基因mRNA和抑制基因表达水平。
附图说明
图1为UCNPs-Cas13a@PEI的制备流程图；
图2为NIR触发的CRISPR-Cas13a递送***用于RNA编辑的设计原理图；其中，(1)附着于细胞膜，(2)胞吞作用，(3)内体逃逸，(4)从上转换纳米颗粒上释放的RNA编辑工具在细胞质中寻找靶mRNA进行编辑，(5)从上转换纳米颗粒上释放的RNA编辑工具进入细胞核寻找靶mRNA进行编辑；
图3中A为质粒pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a的图谱；B为纯化Cas13a蛋白的SDS-PAGE图；
图4为上转换纳米材料的荧光光谱图和在980nm激光器激发下NaYF4:Yb/Er纳米晶溶液呈现较强的绿色上转换发光。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所提出的基于近红外光控的CRISPR-Cas13a***的抑制真核生物基因表达的方法适用所有真核生物，在本实施例中仅以粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)例作详细说明。
本发明所提出的一种基于近红外光控的CRISPR-Cas13a***制备方法，具体过程如下：
材料准备过程：
1、LwCas13a蛋白的获得：
如图3，使用pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a质粒和大肠杆菌表达***。LwCas13a的表达与纯化过程包含Cas13a蛋白经IPTG诱导表达以及镍柱纯化、SUMO酶切去除His、透析、离子交换四步纯化，测定获得的较纯Cas13a蛋白浓度，在本实施例中，Cas13a选用LwCas13a。
2、crRNA的制备：
在本实施例中，以粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)内源基因glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Tdh1(tdh1)转录产物作为目的基因mRNA进行编辑，具体过程为：采用化学合成法制备crRNA。crRNA序列格式为5’-Cas13a蛋白直接重复序列-crRNA间隔序列-3’，其中，间隔序列设计的长度为21-28核苷酸，其与目的基因mRNA中的一段序列互补；Cas13a蛋白直接重复序列依Cas13a来源而定；当Cas13a为LshCas13a时，直接重复序列为5’-GGCCACCCCAAUAUCGAAGGGGACUAAAAC-3’；当Cas13a为LwCas13a时，直接重复序列为5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAAC-3’；当Cas13a为LbuCas13a时，直接重复序列为5’-GACCACCCCAAAAATGAAGGGGACTAAAAC-3’。
由于本实施例中Cas13a选用LwCas13a，因此crRNA序列为5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGGAUGAAUGAUCUAUACAGAAGCGAUGC-3’；在crRNA序列的5’端添加T7启动子序列(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)。根据crRNA合成转录模板dsDNA，tdh1-crRNA-1：5’-TAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACGGATGAATGATCTATACAGAAGCGATGC-3’，tdh1-crRNA-2:5’-GCATCGCTTCTGTATAGATCATTCATCCGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’；其中，tdh1-crRNA-1和tdh1-crRNA-2由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。将这两条DNA链进行退火，然后使用HiScribe T7Quick High Yield RNA Synthesis试剂盒在37℃下与T7 RNA Polymerase Mix一起温育过夜。用RNA Cleanup&Concentration Kit纯化crRNA，Nanodrop 2000测定浓度。
3、上转换纳米材料的合成：
使用一步溶剂热法合成上转换纳米粒子(UCNPS)，将1.2mmol RECl3(Y：Yb：Er＝80：18：2)，2.4mmol NaCl和0.8g PAAs溶解在20mL乙二醇中并充分混匀形成透明溶液。将5mmolNH4F溶解在15mL乙二醇中，在搅拌条件下逐滴加入到上述透明液中。所得混合物转移到反应釜中200℃保持1.5h。冷却至室温离心收集产物，用乙醇和蒸馏水洗涤3次，置于烘箱中60℃干燥，得到羧基修饰的UCNPS。
4.基于上部分所准备的材料制备UCNPs-Cas13a@PEI：
如图1，将纯化的Cas13a蛋白和crRNA按摩尔比1：2混合形成Cas13a-crRNA复合物，通过光敏分子ONA将Cas13a-crRNA复合物与上转换纳米材料连接在一起，获得UCNPs-Cas13a；再使用聚乙烯亚胺PEI(即Polyethylenimine)涂覆UCNPs-Cas13a的外层得到UCNPs-Cas13a@PEI。
基于上述制备方法所制备的UCNPs-Cas13a@PEI，本发明还提出了一种将上述近红外光控的CRISPR-Cas13a***制备方法制备的CRISPR-Cas13a***应用于非疾病诊断和治疗的抑制真核生物基因表达的用途，具体过程如图2所示：UCNPs-Cas13a@PEI先附着于粟酒裂殖酵母细胞表面，再通过胞吞作用进入细胞；由于PEI结构中存在许多胺基，能使内体内渗透压增加，引起离子内流，导致膜胀破，因此UCNPs-Cas13a@PEI所涂覆的PEI能促进内体逃逸。
NIR激光照射S.pombe细胞表面，在NIR激光照射下，上转换纳米材料充当“纳米换能器”，能将NIR光(980nm)转变成绿光(如图4)，以裂解ONA分子，从而将ONA分子连接的Cas13a-crRNA复合物从上转换纳米材料上释放，Cas13a-crRNA复合物在细胞质和细胞核内寻找目的基因mRNA上的匹配片段，crRNA与目的基因mRNA结合激活Cas13a蛋白的HEPE催化位点以切割mRNA，实现目的基因mRNA的降解和表达水平的抑制。
为了验证本发明所提出的基于近红外光控的CRISPR-Cas13a***的抑制真核生物基因表达的方法的效果，以未编辑的S.pombe作为对照组，编辑的S.pombe为实验组，提取两者细胞总RNA进行qRT-PCR，比较tdh1基因的表达水平，计算基因表达抑制效率。所用引物序列tdh1-F：5’-TGCCTAGCATCGCTTCTGTA-3’，tdh1-R：5’-CATCAATGACGAGCTTACCAT-3’。
基因tdh1表达水平的抑制会使有丝***细胞周期异常和营养细胞裂解，从而降低酵母细胞生长速率。在S.pombe中实施基于近红外光控的CRISPR-Cas13a***能以不同的效率抑制基因表达，该方法作为一种新的RNA编辑工具为在真核生物中操纵目的基因mRNA提供了平台。
另外，在本实施例中仅对某一个基因进行抑制表达，如当需要同时抑制多个基因的表达，可以将crRNA设计成gRNA库，编辑多个基因的mRNA。
以上实施例仅用于说明本发明的设计思想和特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，本发明的保护范围不限于上述实施例。所以，凡依据本发明所揭示的原理、设计思路所作的等同变化或修饰，均在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于近红外光控的CRISPR-Cas13a***制备方法，其特征在于，根据目的基因mRNA的序列设计合成crRNA，将crRNA和纯化的Cas13a蛋白形成Cas13a-crRNA复合物，通过光敏分子将Cas13a-crRNA复合物与上转换纳米材料连接在一起，获得UCNPs-Cas13a；再使用聚乙烯亚胺PEI涂覆UCNPs-Cas13a的外层得到UCNPs-Cas13a@PEI。
2.根据权利要求1所述的一种基于近红外光控的CRISPR-Cas13a***制备方法，其特征在于，所述crRNA的序列格式为5’-Cas13a蛋白直接重复序列-crRNA间隔序列-3’；其中，Cas13a蛋白直接重复序列依Cas13a来源而定。
3.根据权利要求2所述的一种基于近红外光控的CRISPR-Cas13a***制备方法，其特征在于，所述Cas13a蛋白选择LshCas13a蛋白、LwCas13a蛋白或者LbuCas13a蛋白。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种基于近红外光控的CRISPR-Cas13a***制备方法，其特征在于，所述上转换纳米材料采用一步溶剂热法合成，得到羧基修饰的上转换纳米材料。
5.根据权利要求4所述的一种基于近红外光控的CRISPR-Cas13a***制备方法，其特征在于，所述光敏分子在NIR激光照射下，光敏分子所连接的Cas13a-crRNA复合物从上转换纳米材料上释放，从而实现CRISPR-Cas13a***的动态调控。
6.根据权利要求5所述的一种基于近红外光控的CRISPR-Cas13a***制备方法，其特征在于，所述的光敏分子为ONA分子，ONA分子的两端分别连接Cas13a-crRNA复合物和上转换纳米材料。
7.根据权利要求6所述的一种基于近红外光控的CRISPR-Cas13a***制备方法，其特征在于，将所述crRNA设计成gRNA库，编辑多个基因的mRNA，实现对多个基因表达的抑制。
8.一种将权利要求7所述近红外光控的CRISPR-Cas13a***制备方法制备的CRISPR-Cas13a***应用于非疾病诊断和治疗的抑制真核生物基因表达的用途，其特征在于，将UCNPs-Cas13a@PEI与真核生物细胞表面结合后通过胞吞作用进入细胞，利用UCNPs-Cas13a@PEI所涂覆的PEI促进内体逃逸；在NIR激光照射下Cas13a-crRNA被释放，在目的基因mRNA上寻找与crRNA间隔序列对应的互补序列，crRNA与目的基因mRNA匹配以激活Cas13a的HEPN催化位点剪切mRNA，进而抑制真核生物目的基因表达。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述PEI结构中存在许多胺基，能使内体内渗透压增加，引起离子内流，导致膜胀破，因此能够增强内体逃逸。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113876736A (zh) * 2021-09-30 2022-01-04 重庆市荣昌区人民医院 一种近红外响应的仿生纳米制剂及其制备方法与应用
CN114703258A (zh) * 2022-06-06 2022-07-05 深圳大学 一种基于光激活的一锅式rpa-crispr核酸检测方法及***
CN114774389A (zh) * 2022-04-11 2022-07-22 天津市天津医院 基于光控型CRISPR/Cas13d基因编辑***的基因编辑方法、组合物及应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015057671A1 (en) * 2013-10-14 2015-04-23 The Broad Institute, Inc. Artificial transcription factors comprising a sliding domain and uses thereof
CN104805078A (zh) * 2014-01-28 2015-07-29 北京大学 用于高效基因组编辑的rna分子的设计、合成及其应用
CN107557455A (zh) * 2017-09-15 2018-01-09 国家纳米科学中心 一种基于CRISPR‑Cas13a的特异性核酸片段的检测方法
CN108285905A (zh) * 2017-12-15 2018-07-17 国家纳米科学中心 一种基于CRISPR-Cas13a的抑制真核细胞中基因表达水平的方法及其应用
WO2019040664A1 (en) * 2017-08-22 2019-02-28 Salk Institute For Biological Studies RNA TARGETING METHODS AND COMPOSITIONS
CN109971790A (zh) * 2019-04-01 2019-07-05 南京大学 一种近红外光调控基因编辑方法
CN110205360A (zh) * 2019-05-07 2019-09-06 江苏大学 一种基于CRISPR/Cas13a的食源性致病菌核酸纳米荧光痕量检测方法
CN110241182A (zh) * 2019-05-07 2019-09-17 江苏大学 猝灭荧光rna标志物合成方法及应用于食源性致病菌检测的方法
CN110527697A (zh) * 2018-05-23 2019-12-03 中国科学院上海生命科学研究院 基于CRISPR-Cas13a的RNA定点编辑技术

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210222164A1 (en) * 2016-06-29 2021-07-22 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas systems having destabilization domain
CN110468153B (zh) * 2018-05-11 2022-12-06 华东师范大学 一种远红光调控的基于CRISPR/Cas9***的基因组转录装置、构建方法及应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015057671A1 (en) * 2013-10-14 2015-04-23 The Broad Institute, Inc. Artificial transcription factors comprising a sliding domain and uses thereof
CN104805078A (zh) * 2014-01-28 2015-07-29 北京大学 用于高效基因组编辑的rna分子的设计、合成及其应用
WO2019040664A1 (en) * 2017-08-22 2019-02-28 Salk Institute For Biological Studies RNA TARGETING METHODS AND COMPOSITIONS
CN107557455A (zh) * 2017-09-15 2018-01-09 国家纳米科学中心 一种基于CRISPR‑Cas13a的特异性核酸片段的检测方法
CN108285905A (zh) * 2017-12-15 2018-07-17 国家纳米科学中心 一种基于CRISPR-Cas13a的抑制真核细胞中基因表达水平的方法及其应用
CN110527697A (zh) * 2018-05-23 2019-12-03 中国科学院上海生命科学研究院 基于CRISPR-Cas13a的RNA定点编辑技术
CN109971790A (zh) * 2019-04-01 2019-07-05 南京大学 一种近红外光调控基因编辑方法
CN110205360A (zh) * 2019-05-07 2019-09-06 江苏大学 一种基于CRISPR/Cas13a的食源性致病菌核酸纳米荧光痕量检测方法
CN110241182A (zh) * 2019-05-07 2019-09-17 江苏大学 猝灭荧光rna标志物合成方法及应用于食源性致病菌检测的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PAN，Y.等: "Near-infrared upconversion–activated CRISPR-Cas9 system: A remote-controlled gene editing platform", 《SCIENCE ADVANCES》 *
刘贵生等: "与众不同的核酸酶Cas13a:编辑RNA的新CRISPR平台及其进展 ", 《湖北农业科学》 *
彭利君等: "核酸检测和基因编辑的新工具:CRISPR/Cas13*** ", 《临床检验杂志》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113876736A (zh) * 2021-09-30 2022-01-04 重庆市荣昌区人民医院 一种近红外响应的仿生纳米制剂及其制备方法与应用
CN113876736B (zh) * 2021-09-30 2022-11-29 重庆市荣昌区人民医院 一种近红外响应的仿生纳米制剂及其制备方法与应用
CN114774389A (zh) * 2022-04-11 2022-07-22 天津市天津医院 基于光控型CRISPR/Cas13d基因编辑***的基因编辑方法、组合物及应用
CN114774389B (zh) * 2022-04-11 2023-09-29 天津市天津医院 基于光控型CRISPR/Cas13d基因编辑***的基因编辑方法、组合物及应用
CN114703258A (zh) * 2022-06-06 2022-07-05 深圳大学 一种基于光激活的一锅式rpa-crispr核酸检测方法及***

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