CN111034615A

CN111034615A - 一种矾根“提拉米苏”快速繁殖的组织培养方法

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Publication number: CN111034615A
Application number: CN201911335712.8A
Authority: CN
Inventors: 林巧玲; 高丽; 张学超; 于运乐; 高睿琦; 辛培培
Original assignee: Beijing Huaxiang Flower Science And Technology Research Institute Co ltd
Current assignee: Beijing Huaxiang Flower Science And Technology Research Institute Co ltd
Priority date: 2019-12-21
Filing date: 2019-12-21
Publication date: 2020-04-21
Anticipated expiration: 2039-12-21
Also published as: CN111034615B

Abstract

本发明涉及一种矾根“提拉米苏”快速繁殖的组织培养方法，涉及植物组织培养的技术领域。本发明以矾根叶柄为外植体，涉及无菌体系建立、诱导愈伤组织、诱导愈伤组织形成不定芽、不定芽增殖、诱导生根、炼苗移栽等步骤，建立起一套完整的矾根“提拉米苏”的组织培养快速繁殖方法，该培养方法具有繁殖速度快、增殖倍率高且污染率低的优点，可在生产过程中快速生产出高质量种苗，对矾根的商业化开发有重要的实际应用价值。

Description

一种矾根“提拉米苏”快速繁殖的组织培养方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养的技术领域，尤其是涉及一种矾根“提拉米苏”快速繁殖的组织培养方法。

背景技术

矾根“提拉米苏”(Heuchera micrantha)，虎耳草科矾根属植物，多年生宿根常绿草本，性耐寒，能够耐受零下20度左右低温，喜半荫环境，不耐强光直射，对各种土壤的适应能力较强，以肥沃疏松的弱酸性土壤为宜。该品种叶片为阔心型，春夏季节叶色为浅绿色带不明显白色斑纹，秋冬季节叶片颜色沿叶脉自内而外颜色依次变红，直至整片叶片变为酒红色，植株样貌随季节发生丰富的色相变化，观赏价值较高，深受园艺爱好者的喜爱。近年来在华北华东地区有大量绿化工程开始将矾根作为良好的耐荫彩叶多年生宿根草本植物使用，常用于花坛色块、自然式花境及林荫地被等场景，具有较为广阔的市场前景。

矾根常规繁殖方式以分株繁殖及叶片扦插繁殖方式为主。分株繁殖是在矾根满盆之后将矾根分株换盆，分株后将获得的矾根小株进行整理，分别上盆栽种。叶片扦插繁殖是将从矾根母株取下的叶片扦插在珍珠岩上，保证珍珠岩的湿润，置于遮荫的地方养护，控制温度在10-30℃之间，1个月左右可以生根。同时，有文献报道用带芽的茎段作为外植体，以芽生芽直接成苗途径进行组织培养来繁殖。

常规的矾根繁殖方法获得的矾根植株繁殖效率低、周期长，不利于大量繁殖种苗。利用带芽的茎段作为外植体繁殖植株，外植体污染率高，且持续取带芽的茎段容易对母株造成较大伤害，且此种繁殖方式获得的不定芽的增殖倍率偏低。因此，上述矾根的繁殖方式中存在繁殖速度慢、增殖倍率低以及污染率高的问题。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种矾根“提拉米苏”快速繁殖的组织培养方法，该培养方法具有繁殖速度快、增殖倍率高且污染率低的优点，可在生产过程中快速生产出高质量种苗，对矾根的商业化开发有重要的实际应用价值。

本发明的上述目的是通过以下技术方案得以实现的：一种矾根“提拉米苏”快速繁殖的组织培养方法，包括无菌体系建立、诱导愈伤组织、诱导愈伤组织形成不定芽、不定芽增殖、诱导生根、炼苗移栽，具体步骤如下，

(1)无菌体系建立：选取生长健壮且无病虫害的母株，自母株上切取新生叶片的叶柄，对叶柄进行消毒，得到消毒后的外植体；

(2)诱导愈伤组织：将(1)得到的外植体接种到诱导愈伤组织的培养基上，培养后得到与外植体一体的愈伤组织；

(3)诱导愈伤组织形成不定芽：将(2)得到的愈伤组织从外植体上切除，并转接到诱导分化形成不定芽的培养基上，培养后得到与愈伤组织一体的不定芽；

(4)不定芽增殖：经(3)得到的健康不定芽从愈伤组织切除，并转接到不定芽增殖的培养基中，培养后得到增殖的小苗；

(5)诱导生根：将(4)得到的3-4cm的小苗转接到诱导生根的培养基上，得到生根的小苗；

(6)炼苗移栽：将(5)得到的小苗炼苗，并移栽到栽种基质上。

通过采用上述技术方案，在取材之前，先对待取材的母株进行消毒，可以预防作为外植体的材料携带母株上的病原体，从根源处降低植物组织培养的污染率；从母株上取下的外植体进行诱导形成愈伤组织，植物细胞具有全能性，因此在培养基和加入培养基的细胞***素和生长素的共同作用下诱导外植体的植物细胞分化形成愈伤组织，形成的愈伤组织细胞脱离了原有器官组织的束缚，在适宜的培养条件下，细胞的全能性能够得以表达；以诱导形成的愈伤组织为基础，在培养基和细胞***素和生长素的共同作用下，诱导愈伤组织分化形成不定芽，由于植物的愈伤组织细胞具有高度的全能性，愈伤组织可分化形成不定芽；将经诱导愈伤组织分化形成的不定芽从愈伤组织上切除下来后，将不定芽转接至不定芽培养基中，接入不定芽培养基中的不定芽具有较高的全能性，在细胞***素和生长素的共同作用下，不定芽增殖分化形成丛生芽；将上一步得到的丛生芽转接至生根培养基中，将丛生芽进一步培养成生根的小苗，生根的小苗即可移栽至栽种基质，进一步生长至幼苗。本发明提供的矾根“提拉米苏”快速繁殖的组织培养方法，较现有的培养方法，不仅繁殖速度快、增殖倍率高，而且污染率低，可在生产过程中快速生产出高质量种苗。

进一步地，步骤(1)中的新生叶片的叶柄是指在母株上生长30-40天的叶片的叶柄。

通过上述技术方案，本发明采用生长期30-40天的叶柄为材料，生长期在该阶段的叶片开展度好且叶柄较为粗壮，相对于生长期在30天内的叶柄，生长期在30-40天的叶柄对消毒剂的耐受能力较强，消毒后叶柄的存活率有较大的提升；此外，该生长期的植物细胞代谢活动旺盛、***能力强，体内激素浓度较高，仅需要使用较低浓度的激素便可以激发外植体进行脱分化，诱导出质量较高的球状胚性愈伤组织，而生长期较久的老叶叶柄，例如两年生或多年生的叶柄，由于其细胞代谢活动较弱，叶柄纤维化程度较高，诱导愈伤组织往往需要使用较高浓度的激素，后期容易造成愈伤组织及不定芽出现玻璃化等问题，玻璃化是指组织培养过程中的特有的一种生理失调或生理病变，使试管苗呈半透明状外观形态异常的现象。因此，采用生长期30-40天的叶柄为材料进行诱导，较采用生长期在30天内或生长期较久的老叶柄，外植体诱导率以及形成的愈伤组织质量明显提高。

进一步地，步骤(1)中从母株上切取新生叶片的叶柄的前7-10天，向母株喷洒灭菌剂。

通过采用上述技术方案，在取材前7-10天向母株提前喷施灭菌剂，可有效减少污染源的干扰；采用叶柄作为外植体，与采用带有顶芽及腋芽的茎段作为外植体相比较，排除了藏匿在茎段内污染源的干扰，同时，灭菌剂可充分对外植体进行消毒，显著降低污染率。

进一步地，灭菌剂为多菌灵，用量为待灭菌体体积的800-1000倍。

通过采用上述技术方案，多菌灵是一种广泛应用的杀菌剂，也是苯菌灵的代谢产物，是一种高效低毒内吸性杀菌剂，有内吸治疗和保护作用，在取材前向母株提前喷施多菌灵，可有效减少污染源的干扰，并且对母株和待取材的叶片均有较好的内吸治疗和保护作用，显著降低了外植体的污染率。

进一步地，步骤(1)中对叶柄的消毒为先用75％酒精消毒，再用消毒剂消毒。

通过采用上述技术方案，用酒精消毒的方式为用酒精棉轻轻擦拭叶柄，可清理掉大量表皮毛并减少上面附带的灰尘及杂菌；与采用叶柄为外植体未进行预消毒处理的方法相比，对叶片进行预消毒处理可有效排除表皮毛附带污染源的干扰，进一步降低外植体的污染率。

进一步地，消毒剂的消毒方式为将待处理的叶柄于0.1％的氯化汞溶液中浸泡6-8min。

通过采用上述技术方案，氯化汞即升汞，可做消毒剂，氯化汞具有消毒作用，能够杀死繁殖体、亲脂性病毒等，在植物组织培养外植体消毒时，汞是高效消毒剂，对外植体携带的病原体等具有很强的杀灭作用，再进一步降低外植体的污染率。

进一步地，步骤(2)中诱导愈伤组织的培养基配方为：MS培养基，6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.1-0.2mg/ml,2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)0.8-1.0mg/ml,蔗糖25-30g/l,琼脂4-4.5g/l，pH值在5.8-6.0；培养温度23-27℃，光照强度1500-1800lux，光照时长9-10h/d。

通过采用上述技术方案，6-BA是一种常见的细胞***素，其主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织的分化；2,4-D是一种常用的诱导愈伤组织的生长素，它对愈伤组织的诱导作用优于其他生长素，缺乏2,4-D是导致直接出芽的原因。在诱导愈伤组织阶段，加入0.1-0.2mg/ml浓度的6-BA，主要起到诱导愈伤组织分化的作用，同时低浓度的6-BA下，外植体的出芽可以受到抑制；同时在MS培养基中还加入了2,4-D，可以有效诱导愈伤组织的形成，0.8-1.0mg/ml的2,4-D对外植体的出芽具有抑制作用。故在此步骤加入0.1-0.2mg/ml的6-BA和0.8-1.0的2,4-D，2,4-D的浓度大于6-BA的浓度，故加入上述浓度的6-BA和2,4-D可以起到较好的对愈伤组织的诱导作用。

进一步地，步骤(3)中诱导分化形成不定芽的培养基配方为：MS培养基，6-BA1.5-2.0mg/ml,2,4-D0.1-0.2mg/ml,蔗糖25-30g/l,琼脂4-4.5g/l，pH值在5.8-6.0；培养温度23-27℃，光照强度1500-1800lux，光照时长9-10h/d。

通过采用上述技术方案，在经过诱导获得愈伤组织的基础上，以愈伤组织为基础诱导分化不定芽，此时加入作为细胞***素的6-BA和作为生长素的2,4-D诱导愈伤组织分化不定芽，由于作为基础的不是外植体，而是外植体分化形成的愈伤组织，因此，加入1.5-2.0mg/ml的6-BA和0.1-0.2mg/ml的2,4-D，两者相对而言，加入的6-BA的浓度远大于加入的2,4-D的浓度，因此6-BA和2,4-D的配合可较好的促进愈伤组织分化形成的不定芽。

进一步地，步骤(4)中不定芽增殖的的培养基配方为：MS培养基，6-BA0.05-0.1mg/ml,萘乙酸(NAA)0.05-0.1mg/ml,蔗糖25-30g/l,琼脂4-4.5g/l，pH值在5.8-6.0；培养温度23-27℃，光照强度1500-1800lux，光照时长9-10h/d。

通过采用上述技术方案，NAA是一种广谱型植物生长调节剂，能促进细胞***与扩大，将经过分化获得的不定芽从愈伤组织上切割下来，放入不定芽增殖培养基中，以分化形成的不定芽为基础增殖不定芽，加入低浓度的细胞***数6-BA，能够促进植物细胞的***和增殖，加入植物生长调节剂NAA，同样具有促进细胞增殖和扩大的作用，因此，在不定芽增殖的培养基中加入0.05-0.1mg/ml的6-BA和0.05-0.1mg/ml的NAA，能够促进不定芽的增殖。

进一步地，步骤(5)中诱导生根的培养基配方为：1/2MS培养基，蔗糖25-30g/l,琼脂4-4.5g/l，pH值在5.8-6.0；培养温度23-27℃，光照强度1500-1800lux，光照时长9-10h/d。

通过采用上述技术方案，将增殖的不定芽移栽至诱导生根的培养基中，不定芽在各培养阶段中积累的激素及自身合成的各类激素的共同作用下，促进增殖后的不定芽生根形成小苗。

本发明提供的矾根“提拉米苏”组织培养快速繁殖方法，较现有的组织培养方法，具有以下优点：

该培养方法具有繁殖速度快、增殖倍率高且污染率低的优点，可在生产过程中快速生产出高质量种苗，对矾根的商业化开发有重要的实际应用价值。

1、外植体污染率显著降低：将母株在温室内培养及取材前提前喷施多菌灵，可有效减少室内外污染源的干扰，采用叶柄作为外植体，与采用带有顶芽及腋芽的茎段作为外植体相比较，排除了藏匿在茎段内污染源的干扰，消毒剂可充分对外植体进行消毒，显著降低污染率；酒精棉轻轻擦拭叶柄，可清理掉大量表皮毛并减少上面附带的灰尘及杂菌，较采用叶柄为外植体未进行预消毒处理的方法，采用本发明可有效排除表皮毛附带污染源的干扰，进一步降低外植体消毒的污染率；

2、外植体存活率、诱导率高：采用生长期30-40天的叶柄为材料，叶片开展度好且叶柄较为粗壮，与生长期30天内的叶柄相比对消毒剂的耐受能力较强，较幼嫩叶柄消毒后存活率有较大提升；该生长期的植物细胞代谢活动旺盛、***能力强，体内激素浓度较高，使用较低浓度的激素即可以激发外植体进行脱分化，诱导出质量较高的球状胚性愈伤组织，二年生(多年生)老叶柄细胞代谢活动较弱，叶柄纤维化程度较高，诱导愈伤组织往往需要使用较高浓度的激素，后期容易造成愈伤组织及不定芽出现玻璃化等问题，采用本发明的方法，外植体诱导率及愈伤组织质量较二年生(多年生)老叶柄有明显提高；

3、诱导出芽用时短、增殖倍率高：以本发明方法诱导愈伤组织的过程中，无需进行暗培养，在上述步骤所述的光照条件下7天左右即可见叶柄两端有明显膨大，15-25天左右即可诱导形成绿色健康的胚性愈伤组织，且愈伤组织转至诱导分芽培养基后，30-40天左右即可诱导出大量健康的不定芽团，整体诱导倍率最高可达20倍及以上，不定芽长势良好，生长健壮，无玻璃化及变异等问题发生，最快45天内即可诱导出不定芽，大大缩短了诱导出芽的时间，能够在短时间内提供大量组培材料，满足快速生产需求；诱导出芽的愈伤组织在切割小芽后，采用本发明诱导出芽的培养基，进行至少两次培养后，仍可继续诱导出芽，出芽质量未出现明显下降。

附图说明

图1是本发明中外植体诱导形成愈伤组织的示意图。

图2是本发明中愈伤组织脱分化形成不定芽团的示意图。

图3是本发明中不定芽团形成大量不定芽的示意图。

图4是本发明中不定芽增殖形成小苗的示意图。

图5是本发明中小苗生根情况的示意图。

具体实施方式

本发明中用到的多菌灵为国光多菌灵，购自四川国光农化股份有限公司；酒精为利尔康75％消毒液500ml，购自山东利尔康医疗科技股份有限公司；氯化汞为购自天津市光复精细化工研究所的氯化汞标准溶液。本发明中用到的矾根“提拉米苏”母株选自北京花乡花卉科技研究所有限公司。

参考图1-图5，本发明提供了一种矾根“提拉米苏”快速繁殖的组织培养方法，主要涉及到无菌体系建立、诱导愈伤组织、诱导愈伤组织形成不定芽、不定芽增殖、诱导生根、炼苗移栽等步骤，具体步骤如下，

1、无菌体系建立：

1)选取生长健壮无病虫害的母株，置于温室内培养，取材前7-10天喷洒800-1000倍的多菌灵；

2)取材时选择切取30-40天的新生叶片的叶柄，流水冲洗10分钟晾干；

3)用含75％酒精的棉花擦拭叶柄，擦净叶柄上的表皮毛，擦拭时注意勿将叶柄擦折，无菌水清洗1-2遍；

4)将材料放入0.1％氯化汞溶液消毒6-8min，无菌水清洗5-8遍，每次震荡3-5min；5)将叶柄切割成1-1.5cm的小段，得到消毒后的外植体。

2、诱导愈伤组织：

将步骤(1)消毒完毕的叶柄平铺接种到诱导愈伤组织的培养基上，该培养基配方为：MS基本培养基，6-BA0.1-0.2mg/ml，2,4-D0.8-1.0mg/ml，蔗糖25-30g/l，琼脂4-4.5g/l，pH值为5.8-6.0；诱导愈伤组织的培养温度为23℃-27℃，光照强度为1500-1800lux，光照时长9-10h/d，培养后得到与外植体一体的愈伤组织。

3、诱导愈伤组织形成不定芽：

将步骤(2)获得的愈伤组织自外植体切离，转接到诱导分化形成不定芽的培养基上，该培养基配方为：MS基本培养基，6-BA1.5-2.0mg/ml，2,4-D0.1-0.2mg/ml，蔗糖25-30g/l，琼脂4-4.5g/l，pH值为5.8-6.0；诱导分化形成不定芽的培养温度为23℃-27℃，光照强度为1500-1800lux，光照时长9-10h/d，培养后得到与愈伤组织一体的不定芽。

4、不定芽增殖：

将步骤(3)获得的健康不定芽从愈伤组织上切除下来，转接到不定芽增殖的培养基中，该培养基配方为：MS基本培养基，6-BA0.05-0.1mg/ml，NAA0.05-0.1mg/ml，蔗糖25-30g/l，琼脂4-4.5g/l，pH值为5.8-6.0；不定芽增殖的培养温度为23℃-27℃，光照强度为1500-1800lux，光照时长9-10h/d，得到增殖的小苗。

5、诱导生根：

将步骤(4)获得的株高在3-4cm的小苗转接到诱导生根培养基上，该培养基配方为为：1/2MS基本培养基，蔗糖25-30g/l，琼脂4.0g/l，pH值为5.8-6.0；诱导生根的培养温度为23℃-27℃，光照强度为1500-1800lux，光照时长9-10h/d，得到生根的小苗。

6、炼苗移栽：

将步骤(5)获得的株高4-5cm、至少有4条根、根长在2cm以上的小苗挑选出来，打开瓶盖炼苗2天；取出并洗净小苗，栽种到105孔穴盘，基质为泥炭土：珍珠岩＝4:1，浇透水并喷洒800-1000倍的多菌灵，避免阳光直射并注意通风良好保温保湿。

本发明提供的矾根“提拉米苏”的培养方法，具有繁殖速度快、增殖倍率高且污染率低的优点，可在生产过程中快速生产出高质量种苗。

以下结合实施例1-3和对比例1-4对本发明作进一步详细说明，实施例1-3和对比例1-4中各检测项目的检测结果见表1。

实施例

实施例1

利用本发明提供的培养方法对其进行快速繁殖，具体步骤如下：

(1)无菌体系建立：选取生长健壮无病虫害的母株，置于温室内培养，取材前7天喷洒1000倍的多菌灵；取材时选择切取生长30天的新生叶片的叶柄，流水冲洗10分钟晾干；用含75％酒精的棉花擦拭叶柄，擦净叶柄上的表皮毛，擦拭时注意勿将叶柄擦折，无菌水清洗2遍；将材料放入0.1％氯化汞溶液消毒6min，无菌水清洗5遍，每次震荡3min，将叶柄切割成1cm的小段，得到消毒后的外植体。

(2)诱导愈伤组织：将步骤(1)消毒完毕的外植体接种平铺接种到诱导愈伤组织的培养基上，培养温度为25℃，光照强度为1500lux，光照时长9h/d，该培养基配方为：MS基本培养基，6-BA0.1mg/ml，2,4-D1.0mg/ml，蔗糖30g/l，琼脂4.5g/l，pH值为5.8，培养7天后，统计愈伤组织诱导率。

(3)诱导愈伤组织形成不定芽：将步骤(2)获得的愈伤组织自外植体切离，转接到诱导分化形成不定芽的培养基上，培养温度为25℃，光照强度为1500lux，光照时长9h/d，该培养基配方为：MS基本培养基，6-BA1.5mg/ml，2,4-D0.1mg/ml，蔗糖30g/l，琼脂4.5g/l，pH值为5.8，培养30天后，形成不定芽团，对每个不定芽团的数量计数，计算不定芽诱导率。

(4)不定芽增殖培养：将步骤(3)获得的健康不定芽团从愈伤组织上切除下来，转接到增殖培养的培养基中，培养温度为25℃，光照强度为1500lux，光照时长9h/d，该培养基配方为：MS基本培养基，6-BA0.05mg/ml，NAA0.1mg/ml，蔗糖30g/l，琼脂4.5g/l，pH值为5.8，培养25天后，计算每个小芽的增殖倍数和增殖率。

(5)诱导生根：将步骤(4)获得的株高在3-4cm的小苗转接到诱导生根培养基上，培养温度为25℃，光照强度为1500lux，光照时长9h/d，该培养基配方为：1/2MS基本培养基，蔗糖30g/l，琼脂4.0g/l，pH值为5.8，培养20天后，对每个小苗的生根数量进行计数，计算诱导生根率。

(6)炼苗移栽：将步骤(5)获得的株高4-5cm、至少有4条根、根长在2cm以上的小苗挑选出来，打开瓶盖炼苗2天；取出并洗净小苗，栽种到105孔穴盘，基质为泥炭土：珍珠岩＝4:1，浇透水并喷洒800倍的多菌灵，注意通风、保温保湿并避免阳光直射，栽种15天后计算成活率。

实施例2

本实施例与实施例1有较多不同之处，本实施例中对矾根“提拉米苏”培养方法的具体步骤如下：

(1)无菌体系建立：选取生长健壮无病虫害的母株，置于温室内培养，取材前7天喷洒800倍的多菌灵；取材时选择切取35天的新生叶柄，流水冲洗10分钟晾干；用含75％酒精的棉花擦拭叶柄，擦净叶柄上的表皮毛，擦拭时注意勿将叶柄擦折，无菌水清洗2遍；将材料放入0.1％氯化汞溶液消毒7min，无菌水清洗5遍，每次震荡3min，将叶柄切割成1.5cm的小段，得到消毒后的外植体。

(2)诱导愈伤组织：将步骤(1)消毒完毕的外植体接种平铺接种到诱导愈伤组织的培养基上，培养温度为25℃，光照强度为1500lux，光照时长9h/d，该培养基配方为：MS基本培养基，6-BA0.1mg/ml，2,4-D0.8mg/ml，蔗糖30g/l，琼脂4.5g/l，pH值为5.8，培养7天后，统计愈伤组织诱导率。

(3)诱导愈伤组织形成不定芽：将步骤(2)获得的愈伤组织自外植体切离，转接到诱导分化形成不定芽的培养基上，培养温度为25℃，光照强度为1500lux，光照时长9h/d，该培养基配方为：MS基本培养基，6-BA1.5mg/ml，2,4-D0.2mg/ml，蔗糖30g/l，琼脂4.5g/l，pH值为5.8，培养30天后，形成不定芽团，对每个不定芽团的数量计数，计算不定芽诱导率。

(4)不定芽增殖培养：将步骤(3)获得的健康不定芽团从愈伤组织上切除下来，转接到增殖培养的培养基中，培养温度为25℃，光照强度为1500lux，光照时长9h/d，该培养基配方为：MS基本培养基，6-BA0.05mg/ml，NAA0.05mg/ml，蔗糖30g/l，琼脂4.5g/l，pH值为5.8，培养25天后，计算每个小芽的增殖倍数和增殖率。

(5)诱导生根：将步骤(4)获得的株高在3-4cm的小苗转接到诱导生根培养基上，培养温度为25℃，光照强度为1500-1800lux，光照时长9h/d，该培养基配方为：1/2MS基本培养基，蔗糖30g/l，琼脂4.0g/l，pH值为5.8，培养20天后，对每个小苗的生根数量进行计数，计算诱导生根率。

实施例3

本实施例与实施例1、实施例2均有较多不同之处，本实施例中对矾根“提拉米苏”培养方法的具体步骤如下：

(1)无菌体系建立：选取生长健壮无病虫害的母株，置于温室内培养，取材前10天喷洒1000倍的多菌灵；取材时选择切取40天的新生叶柄，流水冲洗10分钟晾干；用含75％酒精的棉花擦拭叶柄，擦净叶柄上的表皮毛，擦拭时注意勿将叶柄擦折，无菌水清洗2遍；将材料放入0.1％氯化汞溶液消毒8min，无菌水清洗6遍，每次震荡4min，将叶柄切割成1cm的小段，得到消毒后的外植体。

(2)诱导愈伤组织：将步骤(1)消毒完毕的外植体接种平铺接种到诱导愈伤组织的培养基上，培养温度为27℃，光照强度为1500lux，光照时长10h/d，该培养基配方为：MS基本培养基，6-BA0.2mg/ml，2,4-D1.0mg/ml，蔗糖30g/l，琼脂4.5g/l，pH值为6.0，培养7天后，统计愈伤组织诱导率。

(3)诱导愈伤组织形成不定芽：将步骤(2)获得的愈伤组织自外植体切离，转接到诱导分化形成不定芽的培养基上，培养温度为27℃，光照强度为1500lux，光照时长10h/d，该培养基配方为：MS基本培养基，6-BA2.0mg/ml，2,4-D0.1mg/ml，蔗糖30g/l，琼脂4.5g/l，pH值为6.0，培养30天后，形成不定芽团，对每个不定芽团的数量计数，计算不定芽诱导率。

(4)不定芽增殖培养：将步骤(3)获得的健康不定芽团从愈伤组织上切除下来，转接到增殖培养的培养基中，培养温度为25℃，光照强度为1500lux，光照时长10h/d，该培养基配方为：MS基本培养基，6-BA0.1mg/ml，NAA0.05mg/ml，蔗糖30g/l，琼脂4.5g/l，pH值为6.0，培养25天后，计算每个小芽的增殖倍数和增殖率。

(5)诱导生根：将步骤(4)获得的株高在3-4cm的小苗转接到诱导生根培养基上，培养温度为25℃，光照强度为1500lux，光照时长10h/d，该培养基配方为：1/2MS基本培养基，蔗糖30g/l，琼脂4.0g/l，pH值为6.0，培养20天后，对每个小苗的生根数量进行计数，计算诱导生根率。

对比例

对比例1

对比例1与实施例1的主要步骤基本相同，有部分细节之处不同，不同之处主要在于：

(1)对比例1选用的外植体材料为矾根叶片。

(2)无菌体系建立过程中对外植体的消毒方式有所简化，取材时选择切取30天的新生叶片，流水冲洗10分钟晾干；将材料放入0.1％氯化汞溶液消毒6min，无菌水清洗5遍，每次震荡3min，将叶片切割成1cm²的小片，得到消毒后的外植体。

(3)诱导形成愈伤组织中需培养20天，20天后统计愈伤组织诱导率。

(4)愈伤组织诱导形成不定芽中需培养60天，60天后形成不定芽团，对每个不定芽团的数量计数，计算不定芽诱导率。

对比例2

对比例2与实施例2的主要步骤基本相同，有部分细节之处不同，不同之处主要在于：

(1)对比例2选用的外植体材料为矾根叶片。

(2)无菌体系建立过程中对外植体的消毒方式有所简化，取材时选择切取35天的新生叶片，流水冲洗10分钟晾干；将材料放入0.1％氯化汞溶液消毒7min，无菌水清洗5遍，每次震荡3min，将叶片切割成1cm²的小片，得到消毒后的外植体。

对比例3

对比例3与实施例1的主要步骤基本相同，有部分细节之处不同，不同之处主要在于：

(1)无菌体系建立过程中对外植体的消毒方式有所简化，取材时选择切取30天的新生叶柄，流水冲洗10分钟晾干；将材料放入0.1％氯化汞溶液消毒6min，无菌水清洗5遍，每次震荡3min，将叶片切割成1cm的小段，得到消毒后的外植体。

(2)诱导愈伤组织过程中，培养基配方为：MS基本培养基，6-BA1.0mg/ml，NAA0.5mg/ml，蔗糖30g/l，琼脂4.5g/l，pH值为5.8，培养40天后，统计愈伤组织诱导率。

(3)诱导愈伤组织形成不定芽的过程中，培养基配方为：MS基本培养基，6-BA1.0mg/ml，2,4-D0.1mg/ml，蔗糖30g/l，琼脂4.5g/l，pH值为5.8，培养60天后，形成不定芽团，对每个不定芽团的数量计数，计算不定芽诱导率。

对比例4

对比例4与实施例2的主要步骤基本相同，有部分细节之处不同，不同之处主要在于：

(1)无菌体系建立过程中对外植体的消毒方式有所简化，取材时选择切取35天的新生叶柄，流水冲洗10分钟晾干；将材料放入0.1％氯化汞溶液消毒7min，无菌水清洗5遍，每次震荡3min，将叶片切割成1cm的小段，得到消毒后的外植体。

(2)诱导愈伤组织过程中，培养基配方：MS基本培养基，6-BA1.0mg/ml，NAA1.0mg/ml，蔗糖30g/l，琼脂4.5g/l，pH值为5.8，培养30天后，统计愈伤组织诱导率。

(3)诱导愈伤组织形成不定芽的过程中，培养基配方为：MS基本培养基，6-BA1.0mg/ml，2,4-D0.1mg/ml，蔗糖25-30g/l，琼脂4-4.5g/l，pH值为5.8，培养25天后，形成不定芽团，对每个不定芽团的数量计数，计算不定芽诱导率。

表1实施例1-3和对比例1-4中各检测项目的检测结果

上述实施例1-3中均以新生叶片的叶柄作为外植体，而对比例1和对比例2是利用新生叶片作为外植体，通过上述检测结果可知，以叶柄作为外植体时，诱导形成愈伤组织和诱导愈伤组织形成不定芽的时间均比以叶片作为外植体时所用的时间明显缩短；另外，由叶柄作为外植体时形成的愈伤组织多为球状胚性愈伤组织，愈伤组织质量比以叶片作为外植体时形成的愈伤组织质量高，后期球状胚性愈伤组织脱分化形成大量不定芽，不定芽诱导效果明显。实施例1-3与对比例3-4相比，对比例3-4中诱导愈伤组织的过程中，培养基中加入的是6-BA和NAA。通过上述检测结果可知，在诱导愈伤组织形成的过程中加入6-BA和2,4-D与加入6-BA和NAA相比，2，4-D对诱导形成愈伤组织的效果更加明显，可短时间内诱导形成较高质量的球状胚性愈伤组织，诱导出大量的不定芽且诱导形成不定芽时间较短。另外，在初代培养过程中使用的细胞***素种类对不定芽继代培养的增殖率有较显著影响，使用细胞***素2，4-D有利于提高继代培养不定芽增殖率。由实施例1-3和对比例1-4相比较可知，培养基中添加的各类生长素及细胞***素对矾根“提拉米苏”影响不大，无需添加激素，即可达到较好的生根效果。

通过上述实施例和对比例的对比，本发明提供的诱导矾根“提拉米苏”快速繁殖的组织培养方法，该方法使矾根“提拉米苏”得繁殖速度加快、增殖倍率提高，而且大大降低了污染率，对矾根的商业化开发有重要的实际应用价值。

本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种矾根“提拉米苏”快速繁殖的组织培养方法，其特征在于，包括无菌体系建立、诱导愈伤组织、诱导愈伤组织形成不定芽、不定芽增殖、诱导生根、炼苗移栽，具体步骤如下，

（1）无菌体系建立：选取生长健壮且无病虫害的母株，自母株上切取新生叶片的叶柄，对叶柄进行消毒，得到消毒后的外植体；

（2）诱导愈伤组织：将（1）得到的外植体接种到诱导愈伤组织的培养基上，培养后得到与外植体一体的愈伤组织；

（3）诱导愈伤组织形成不定芽：将（2）得到的愈伤组织从外植体上切除，并转接到诱导分化形成不定芽的培养基上，培养后得到与愈伤组织一体的不定芽；

（4）不定芽增殖：经（3）得到的健康不定芽从愈伤组织切除，并转接到不定芽增殖的培养基中，培养后得到增殖的小苗；

（5）诱导生根：将（4）得到的3-4cm的小苗转接到诱导生根的培养基上，得到生根的小苗；

（6）炼苗移栽：将（5）得到的小苗炼苗，并移栽到栽种基质上。

2.根据权利要求1所述的一种矾根“提拉米苏”快速繁殖的组织培养方法，其特征在于：步骤（1）中的新生叶片的叶柄是指在母株上生长30-40天的叶片的叶柄。

3.根据权利要求1所述的一种矾根“提拉米苏”快速繁殖的组织培养方法，其特征在于：步骤（1）中从母株上切取新生叶片的叶柄的前7-10天，向母株喷洒灭菌剂。

4.根据权利要求3所述的一种矾根“提拉米苏”快速繁殖的组织培养方法，其特征在于：灭菌剂为多菌灵，用量为待灭菌体体积的800-1000倍。

5.根据权利要求1所述的一种矾根“提拉米苏”快速繁殖的组织培养方法，其特征在于：步骤（1）中对叶柄的消毒为先用75%酒精消毒，再用消毒剂消毒。

6.根据权利要求5所述的一种矾根“提拉米苏”快速繁殖的组织培养方法，其特征在于：消毒剂的消毒方式为将待处理的叶柄于0.1%的氯化汞溶液中浸泡6-8min。

7.根据权利要求1所述的一种矾根“提拉米苏”快速繁殖的组织培养方法，其特征在于：步骤（2）中诱导愈伤组织的培养基配方为：MS培养基，6-苄氨基腺嘌呤(6-BA) 0.1-0.2mg/ml,2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) 0.8-1.0mg/ml,蔗糖 25-30g/l, 琼脂4-4.5g/l，pH值在5.8-6.0；培养温度23-27℃，光照强度1500-1800lux，光照时长9-10h/d。

8.根据权利要求1所述的一种矾根“提拉米苏”快速繁殖的组织培养方法，其特征在于：步骤（3）中诱导分化形成不定芽的培养基配方为：MS培养基，6-BA 1.5-2.0mg/ml,2,4-D0.1-0.2mg/ml,蔗糖 25-30g/l, 琼脂4-4.5g/l，pH值在5.8-6.0；培养温度23-27℃，光照强度1500-1800lux，光照时长9-10h/d。

9.根据权利要求1所述的一种矾根“提拉米苏”快速繁殖的组织培养方法，其特征在于：步骤（4）中不定芽增殖的的培养基配方为：MS培养基，6-BA 0.05-0.1mg/ml,萘乙酸（NAA）0.05-0.1mg/ml,蔗糖 25-30g/l, 琼脂4-4.5g/l，pH值在5.8-6.0；培养温度23-27℃，光照强度1500-1800lux，光照时长9-10h/d。

10.根据权利要求1所述的一种矾根“提拉米苏”快速繁殖的组织培养方法，其特征在于：步骤（5）中诱导生根的培养基配方为：1/2 MS培养基，蔗糖 25-30g/l, 琼脂4-4.5g/l，pH值在5.8-6.0；培养温度23-27℃，光照强度1500-1800lux，光照时长9-10h/d。